Zastosowanie kalorymetrii ITCw badaniach białek

Katarzyna Breer

Kalorymetria, czyli ,,mierzenie ciepła’’

• DSC (differential

scanning calorimetry)

• ITC (isothermal titration calorimetry)

www.microcal.com

T – const, p – const 81 M domena SH2 Lck

ligand 0.4mM fosfopeptyd TEGOqYQPQPA

Current Opinion in Structural Biology

Leavitt and Freire 2001

Warianty metody

• Enzym/substrat/inhibitor

• Single injection

• Dysocjacja (dimeru)

Kalorymetr ITC

VP-ITC

• Objętość celki ~1.4 ml

• Objętość strzykawki ~ 270l

• Peltier 2-800C

• Szum 0.5 ncal/s

Jakie informacje można uzyskać z krzywej miareczkowania ITC?

0,0 0,5 1,0 1,5-18

-15

-12

-9

-6

-3

0-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0 20 40 60 80 100 120 140

Time (min)

µca

l/sec

Molar Ratio

kcal

/mol

e of

inje

ctan

t

QL=HL

QML=HML

Hcal

Miareczkowanie ~8 M PNP (cielęce) Guaniną

20 mM Hepes pH 7.0, 250C

Identyczne, nieoddziałujące miejsca wiązania

– frakcja miejsc zajętych – frakcja miejsc wolnych

])[1( LKa

[L]t[L] +

nM]t

QnM]t

·V0HML

2

)1()()1()()(

0

iQiQ

V

dViQiQiQ i

Parametr sigmoidalności

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

Ka=1M-1

H=-15 kcal/molN=1

Maximum Conc. : 3 mM Minimum Conc. : 0.01 mM Optimal Conc. : 0.1 mM Simulated Conc. : 0.03 mM

H (

kcal

/mol

e of

inje

ctan

t)

Molar Ratio

here

C = Ka [M]t

10 < C < 1000

Wiseman et al. 1989

Ka ~108 – 109 M-1

])[1( AK

KK

A

Bapp

Leavitt and Freire 2001

KA ~KB

Proteaza HIV-1

Wiązanie kompetycyjne

])[1( AK

BA

AA

])[1( BK

AB

BB

MAMAAH

MBMBBH

Słaby inhibitor Silny inhibitor

Q(i) = V0 [M]t (HAA(i) + HBB(i))

Sigurskjold 2000

dG (T,p,N) = –SdT + Vdp + idNi

Parametry termodynamiczneU(S,V,N) = TS – pV + N

dU (S,V,N) = TdS – pdV + idNi

Naturalne zmienne ITC to (T,p,N)

G (T,p,N) = U – TS + pV = iNi

dG 0 Proces spontaniczny

Energia chemiczna

G = U + pV – TS = H – TS

Związek entalpii, entropii i energii swobodnej Gibbsa

• Wiązania wodorowe• Oddziaływania van der

Waalsa• Oddziaływania

elektrostatyczne

• Solwatacja

• Wewnętrzne stopnie swobody

dG = dH – TdS

Wkład entalpowy (cieplny)

Wkład entropowy

G = -RTln Ka

N = 0.6

Ka = (4.9 0.4) 106 M-1

Hcal = -14.2 0.1 kcal/mol

S = -5.0 kcal/mol

0,0 0,3 0,6 0,9 1,2

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

Molar RatioH

kca

l/m

ole

of

inje

cta

nt

~8 M PNP

250C, 20 mM Hepes pH 7.0

N = 0.5 0.1

Ka = (11.3 0.9) 106 M-1

0,01 0,1 1

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

c Gua [uM]

F/F

0

~0.2 M PNP

0,0 0,5 1,0 1,5-8

-6

-4

-2

0

2

4

6-0,8

-0,4

0,0

0,4

0,80 30 60 90 120 150 180

Time (min)µ

cal/s

ec

Molar Ratio

H k

cal/m

ole

of

inje

cta

nt

0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,150

100

150

200

250

300

Flu

ore

scence

[A

.U]

DFPP-DG [M]

[M]t = 0.92 M

[M]akt = 0.96 M

Ka = (5.3 2.5) 109 M-

1

• Niezależnie wiążące miejsca

Zachowania nieszablonowe

• Miejsca oddziałujące – kooperacja

])[1( 1

11 LK

[L]t[L] + M]t(n11H1+n22H2)

])[1( 2

22 LK

QtV0(n1H1 + n2H2)

])[1( 21

11 LK

][1

22 LK

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50

-6

-3

0

3

6

H

kca

l/mo

l of

inje

cta

nt

Molar Ratio

Miejsca wiążące niezależnie

0 1 2 3 4

-6

-3

0

3

6

Kooperatywne wiązanie

Miareczkowania PNP ligandem DFPP-DG

20 mM Hepes pH 7.0, 200C

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50

-6

-4

-2

0

2

4

6

H k

cal/m

ol o

f inj

ecta

nt

Molar Ratio

~40 M PNP 29-30 U/mg~20 M PNP ~34-35 U/mg~20 M PNP ~29 U/mg

N = 1.0

Ka = (1.2 0.5) 109 M-1

H = -5.7 0.04 kcal/mol

S = 6.6 kcal/mol

N1 = 0.8

K1 = (6.7 6.4 ) 1010 M-1

H1 = -6.3 0.05 kcal/mol

S1 = 8.2 kcal/mol

N2 = 0.2

K2 = (3.1 2.8) 108 M-1

H2 = 5.8 0.2 kcal/mol

S2 = 17.6 kcal/mol

Analiza van’t Hoff’a

2

0ln

RT

H

T

K

00)(ln)( STHTKRTTG a

R

S

TR

HTKa

00 1)(ln

Ka

Izobara van’t Hoff’a

Entalpia

van’t Hoff’a

)()()( 0HpH TTCTHTH

SpS T

TCTSTS ln)()( 0

T

THC p

)(0

Ka

Entalpia van’t Hoff’a

Polimeraza Klenowa

Datta et al., 2006

s

Hpa T

T

T

T

R

CTK ln1)(ln

Forma całkowa izobary van’t Hoff’a

Cp ~ - (0.9 – 1.2) kcal/(mol K)

Napędzana entropowo TH Napędzana entalpowo TS

Zależność Hcal(T)dla wiązania DFPP-DG przez PNP

• Cp – const.• Cp = -0.202 0.031

kcal/(mol K)

280 285 290 295 300

-8

-7

-6

-5

-4

-3

H k

cal/m

ol o

f inj

ecta

nt

Temperature [K]

Zależność Kas (T)

• Kas ~109-1011 M-1

• Poza zakresem pracy metody

3,32 3,36 3,40 3,44 3,48 3,52 3,5616

18

20

22

24

26

28

30

32

34

ln K

as

1/T [1000/K]

N = 0.9

Ka = (1.4 0.1) 107 M-1

H = -12.0 0.1 kcal/mol

TS = -2.4 kcal/mol

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50

-6

-4

-2

0

2

4

ligand DFPP-DG

H k

cal/m

ol o

f inj

ecta

nt

Molar Ratio

N1 = 1.0

K1 = (0.2 1.7) 1011 M-1

H1 = -6.2 0.1 kcal/mol

TS1 = 7.6 kcal/mol

N2 = 0.1

K2 = (0.4 3.0) 109 M-1

H2 = 9.6 2.6 kcal/mol

S2 = 1.7 kcal/mol

0,0 0,5 1,0 1,5-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

Molar Ratio

H k

ca

l/m

ole

of

inje

cta

nt

ligand Guanina

Zmiany entropii i entalpii

S (T)= Ssolv (T) + Sconf (T) + Sinne(T)

Ssolv (T) = Cpln(T/TS)

H (T) = Hconf (T) + Hintrinsic (T)

Luić et al. 2004

ASAsolvent accessible surface area

H = Hconf + a(T)·ASAap + b(T) ·ASApol

Cp ap < 0 Cp pol > 0

Kompleksy białko – białko

Fab E8 cytochrom c

oraz przeciwciało E8

Mylvaganam et al., 1998

Cp ~ - (0.2 – 0.6)

kcal/(mol K)

Hcal – HvH = const

Miareczkowania proteazy HIV-1 indivinavirem

Przepływ protonów

• Acetate 0.1 kcal/mol• MES 3.7 kcal/mol

• ACES 7.5 kcal/mol

Happ = Hbind + nH+Hion

Todd et al., 2000

Kconf

K1K0

Równowaga dynamiczna

Eftink et al., 1983 log Kconf

Cp

app

jedna forma wiąże

obie formy wiążą ligand

Temperature

Kompleksy białko – DNA

Dragan et al., 2004

Jak projektować inhibitory?

4·109 M-15·1010 M-1

9·1010 M-1 1011 M-1

Muzammil et al., 2007

-14-12-10-8-6-4-2024

kcal/m

ol

G H -TS

Mutant V82F/I84V

-14-12-10-8-6-4-2024

G H -TS

-14-12-10-8-6-4-2024

kcal/m

ol

130x 15x 25x 40x

MDR mutant

-18-15-12-9-6-30369

kcal

/mol

G H -TS

-18-15-12-9-6-30369

700x 50x 20x 20x

Allosteria ,,entropowa”

Białko CAP

Na podstawie widm NMR 2D 1H-15N HSQC

BRAK ZMIAN KONFORMACYJNYCH

s – ms powolne ruchy domen

Podziękowania dla:

Romana Szczepanowskiego

Matthias’a Bochtler’a

• S > 0 woda została wypchnięta z powierzchni kompleksu

• S < 0 może mieć wiele przyczyn i nie koniecznie znaczyć, że hydratacja wzrosła, bądź się nie zmieniła

Energie wiązań:

Elektrostatyczne w wodzie ~1A 20kJ/mol

Wodorowe 4-25 kJ/mol

Hydrofobowe 4 kJ/mol

van der Waalsa 0. 5 kJ/mol