1

Instrukcje do ćwiczeń

Chemia Lipidów i Białek Laboratorium

Specjalizacja CHEMIA ŻYWNOŚCI

I rok CHEMII II stopnia

Opracowanie dr hab. Agnieszka Wojtkielewicz,

dr Agnieszka Hryniewicka

Białystok 2015

2

Wymagania

AMINOKWASY i BIAŁKA (ćw.1 i 2)

1. Budowa, podział, właściwości fizyczne i chemiczne (w tym reakcje

charakterystyczne) aminokwasów.

2. Budowa, podział, właściwości fizyczne i chemiczne białek.

3. Enzymy jako katalizatory reakcji biochemicznych.

LIPIDY I (ćw. 3 i 4)

1. Budowa oraz właściwości fizyczne i chemiczne kwasów tłuszczowych

i triacylogliceroli:

a) reakcja hydrolizy

b) reakcja autooksydacji

c) reakcja uwodornienia

d) addycja halogenów

2. Proces jełczenia. Liczba kwasowa i nadtlenkowa – wyznaczanie i zastosowanie

3. Metody izolacji tłuszczów.

LIPIDY II (ćw. 5, 6, 7)

1. Definicja, budowa, podział lipidów ze szczególnym uwzględnieniem steroidów

2. Liczba jodowa – wyznaczanie i zastosowanie.

3. Zmydlanie tłuszczów. Mydła i detergenty – budowa i działanie.

4. Budowa i rola biologiczna cholesterolu

3

Ćwiczenie 1

Analiza aminokwasów

Sprzęt:

probówki szklane

łaźnia wodna

palnik gazowy

Odczynniki:

- próbka nabiału ok. 10 g (twaróg, jogurt lub mleko) – należy przynieść na zajęcia

1% wodne roztwory aminokwasów: glicyny i proliny

1% wodne roztwory albuminy

1% roztwory aminokwasów: tyrozyny i tryptofanu w 0,1 M HCl

0,1% świeże roztwory aminokwasów: cysteiny i cystyny w 0,1 M HCl

0,1% roztwór ninhydryny w 50% etanolu

stężony HNO3

stężony H2SO4

2M roztwór CH3COOH

10% roztwór NaOH

20% roztwór NaOH

stężony NH3 aq.

1% wodny roztwór nitroprusydku sodu Na2[Fe(CN)5NO]

siarczan amonu

10% roztwór NaNO2

40% roztwór formaldehydu (formalina)

0,25M roztwór CuSO4

mocznik

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie poniższych reakcji charakterystycznych

z konkretnymi aminokwasami jak również z przyniesioną próbką nabiału.

1. Reakcja ninhydrynowa

Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do aldehydów z jednoczesną

dekarboksylacją, a potem deaminacją. Powstały amoniak daje z ninhydryną barwny związek –

fioletowo-niebieski produkt zwany purpurą Ruhemanna.

Dodatni odczyn ninhydrynowy dają również inne związki, które zawierają grupę α-aminową,

np. sole amonowe, aminocukry, amoniak, aminy I-rzędowe, peptydy i białka po hydrolizie.

Aminokwasy takie jak prolina i hydroksyprolina, które nie zawierają grupy α-aminowej, dają

w reakcji z ninhydryną produkt o barwie żółtej.

Do probówek odmierzyć po 1 ml roztworów aminokwasów: glicyny i proliny, a następnie

dodać po 0,5 ml etanolowego roztworu ninhydryny. Probówki ogrzać do wrzenia we wrzącej

łaźni wodnej obserwując pojawienie się charakterystycznego zabarwienia.

4

2. Reakcja ksantoproteinowa

Aminokwasy aromatyczne (tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan) ulegają reakcji nitrowania.

Reakcja ta zachodzi dla aminokwasów wolnych jak i związanych w białku. Czynnikiem

nitrującym jest jon nitroniowy NO2+. Mieszanina nitrująca, nitruje wszystkie aminokwasy,

natomiast stężony kwas azotowy ma zdolność nitrowania związków zawierających

aromatyczne pierścienie skondensowane (np. tryptofan) oraz fenyloalaniny. Produkty reakcji

nitrowania mają barwę żółtą. Alkalizacja roztworu prowadzi do otrzymywania soli sodowych

charakteryzujących się barwą pogłębioną, aż do żółto-pomarańczowej.

Do probówek odmierzyć po 1 ml roztworów: tyrozyny, tryptofanu, glicyny i białka albuminy,

a następnie dodać pod dygestorium po 1 ml stężonego kwasu azotowego(V). Probówki

ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut, oziębić pod bieżącą wodą i dodać po 4 ml

20% roztworu NaOH (reakcja silnie egzotermiczna). Zaobserwować, w których probówkach

roztwór zabarwi się na kolor żółto-pomarańczowy.

3. Wykrywanie grup tiolowych

Grupy tiolowe obecne w aminokwasach wolnych i związanych w białkach reagują

z nitroprusydkiem sodu w środowisku amoniakalnym. Otrzymany związek kompleksowy ma

czerwono-fiołkową barwę.

Do 3 probówek odmierzyć po 1 ml roztworów: cysteiny, cystyny i albuminy, dodać po 1 ml

1% roztworu nitroprusydku sodu, a następnie siarczanu amonu do nasycenia roztworu.

Zalkalizować próby, dodając ok. 1-2 ml amoniaku (pod dygestorium) pojawienie się

czerwono-fiołkowego zabarwienia prób oznacza dodatni wynik na obecność grup tiolowych.

4. Deaminacja aminokwasów kwasem azotowym(III)

Aminokwasy pod wpływem kwasu azotowego(III), tworzącego się in statu nascendi, ulegają

reakcji deaminacji, której produktami są: azot cząsteczkowy (wydzielający się w formie

gazowej) oraz odpowiedni hydroksykwas.

W probówce zmieszać 1 ml NaNO2 z 1 ml roztworu CH3COOH, ogrzewać 1 minutę w łaźni

wodnej. Odczekać, aż zmniejszy się wydzielanie gazu o żółtej barwie (tlenki azotu) i dodać

do probówki 2 ml roztworu glicyny. Trzymając probówkę w drewnianej łapie wytrząsać

i obserwować wydzielanie się azotu – produktu gazowej reakcji deaminacji.

5

5. Wykrywanie pierścienia indolowego w tryptofanie

W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami, między innymi z kwasem

glioksalowym lub aldehydem mrówkowym dając barwne produkty kondensacji.

Do trzech probówek odmierzyć kolejno po 1 ml roztworów: tryptofanu, glicyny, albuminy,

następnie dodać 0,5 ml formaliny i wymieszać. Do każdej probówki dodać powoli po ściance

lekko pochylonej probówki – 1 ml stężonego H2SO4 (nie wstrząsać!) i ogrzewać we wrzącej

łaźni wodnej. Pojawienie się ciemnoczerwono-brunatnego pierścienia na granicy faz oznacza

dodatni wynik na obecność tryptofanu.

6. Reakcja biuretowa

Biuret (dimocznik, H2N-CO-NH-CO-NH2) tworzy w środowisku zasadowym fioletowy

kompleks z solami miedzi(II). Reakcja ta jest charakterystyczna dla związków zawierających

więcej niż jedno wiązanie peptydowe w cząsteczce (peptydy i białka).

Do suchej probówki nr 1 wsypać szczyptę mocznika, ogrzać nad palnikiem gazowym.

Mocznik topi się, a następnie rozkłada. Po skrzepnięciu otrzymanej masy probówkę należy

ochłodzić i dodać około 1 ml wody destylowanej. Poczekać aż skrzepnięta masa się rozpuści,

do kolejnych dwóch probówek dodać po 1 ml roztworów: albuminy oraz glicyny. Do

roztworów: biuretu (probówka nr 1), albuminy i glicyny dodać po 1 ml roztworu NaOH,

wymieszać starannie, wkraplać wodny roztwór siarczanu miedzi(II), w wyniku czego

powstaje związek kompleksowy o fioletowym zabarwieniu.

W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych prób, z uwzględnieniem swoich

obserwacji i schematu reakcji.

6

Ćwiczenie 2

Oznaczanie i właściwości fizykochemiczne białek. Enzymy.

1. Oznaczanie kazeiny w metodą formylkową Wolkera

Sprzęt:

kolba stożkowa 100 ml

pipety

biureta 50 ml

Odczynniki:

mleko (śmietanka lub jogurt) 10 ml

formaldehyd, roztwór 20% (v/v)

0,1 M roztwór NaOH

fenoloftaleina, roztwór alkoholowy 2%

W I etapie oznaczenia zobojętnia się próbkę roztworem wodorotlenku sodu wobec

fenoloftaleiny (do pH > 8,3). Zobojętnieniu ulegają wówczas wolne grupy -aminowe

aminokwasów w łańcuchu białkowym. W II etapie oznaczenia dodaje się formaldehyd, który

blokując grupy -aminowe lizyny (przemiana grup –NH2 do –N=CH2) powoduje uwalnianie

z nich jonów H+. Uwolnione jony H

+ odmiareczkowuje się roztworem wodorotlenku sodu.

Do kolby stożkowej odmierzyć pipetą 10 ml mleka (śmietanki lub jogurtu), dodać 0,5 ml

fenoloftaleiny (12 kropli) i miareczkować 0,1 M roztworem NaOH do uzyskania lekko

różowego zabarwienia. Następnie dodać 2 ml formaldehydu i miareczkować ponownie 0,1 M

roztworem NaOH do momentu uzyskania lekko różowego zabarwienia próbki, utrzymującego

się przez 30 sekund. Procentową zawartość kazeiny w mleku (X) obliczyć wg wzoru:

gdzie: 1.57 – współczynnik przeliczeniowy dla kazeiny,

VNaOH – objętość NaOH zużytego do miareczkowania po dodaniu formaldehydu [ml].

2. Denaturacja białek

Sprzęt:

probówki

Odczynniki:

roztwór albuminy

1% roztwór FeCl3

2% roztwór Pb(CH3COO)2

2% roztwór CuSO4

1% roztwór kwasu octowego

NaCl

etanol 96%

7

a) Strącanie białek za pomocą kationów (soli metali ciężkich)

Do 3 probówek zawierających po 2 ml roztworu albuminy o pH zasadowym dodać po 15

kropli:

- 1% roztworu FeCl3 (do pierwszej probówki),

- 2% roztworu Pb(CH3COO)2 (do drugiej probówki),

- 2% roztworu CuSO4 (do trzeciej probówki).

Obserwować strącający się osad.

b) Denaturacja cieplna

Do 1 ml roztwory albuminy dodać 1 kroplę 1% roztworu kwasu octowego i ogrzewać do

wrzenia.

Tworzy się biały kłaczkowaty osad, który staje się wyraźny po dodaniu niewielkiej ilości

(około 6 kropli) roztworu NaCl.

c) Działanie alkoholu

Do dwóch probówek nalać po 1 ml roztworu albuminy i dodać po 2 ml 96% etanolu.

Sprawdzić rozpuszczalność osadu otrzymanego w pierwszej probówce w wodzie, przez

dodanie ok. 5 ml wody i wstrząśnięcie probówki. Po około 40 min. sprawdzić

rozpuszczalność osadu tylko w drugiej probówce.

3. Enzymy

Sprzęt:

probówki

pipetki plastikowe

tarka, nóż

zlewka

Odczynniki:

3% nadtlenku wodoru H2O2 (czyli wody utlenionej)

0,3% nadtlenku wodoru H2O2

0,5% pirogalol

sok z ziemniaka

sok z korzenia imbiru lub chrzanu

a) Wykrywanie obecności katalazy w ziemniaku

Przygotować dwie probówki. Do pierwszej nalać 1 ml 3% roztworu H2O2, a następnie dodać

kilka kropli wyciśniętego soku z ziemniaka. Katalaza ziemniaka powoduje szybki rozkład

8

H2O2 do H2O i O2, co uwidacznia się gwałtownym wydzielaniem pęcherzyków tlenu. Do drugiej

probówki nalać 2 ml surowego soku z ziemniaka i gotować go na wrzącej łaźni wodnej przez 5

min. Po schłodzeniu probówki dodać kilka kropli H2O2. Brak pęcherzyków tlenu świadczy o

inaktywacji katalazy.

b) Aktywność peroksydazy

Przygotować 3 probówki. Do pierwszej nalać 1 ml soku z korzenia imbiru (lub chrzanu), do

drugiej probówki 1 ml soku z imbiru, który należy 3-5 minut gotować w łaźni wodnej.

Natomiast do trzeciej probówki wlewamy 1 ml wody destylowanej. Następnie do każdej

probówki dodać 1 ml 0,3% H2O2 i 1 ml 0,5% pirogalolu. Zaobserwować zmiany zachodzące

w kolejnych probówkach.

W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń,

z uwzględnieniem swoich obserwacji i wniosków.

9

Ćwiczenie 3

Ocena jakościowa tłuszczów. Wpływ ogrzewania na właściwości tłuszczów.

Sprzęt:

zlewka 100 ml x 2

kolba stożkowa 250 ml x 2

cylinder 100 ml

biureta 50 ml x 2

Odczynniki:

smalec

olej słonecznikowy

0.1 M roztwór wodny KOH

etanol + eter dietylowy 1:1 (v/v)

fenoloftaleina 1% roztwór alkoholowy

chloroform

kwas octowy lodowaty

jodek potasu, świeży roztwór nasycony, wolny od jodanów i wolnego jodu

0,001 M roztwór tiosiarczanu sodu

roztwór skrobi 1%

Oznaczyć liczbę kwasową i nadtlenkową smalcu oraz oleju słonecznikowego. Następnie

ogrzewać ok. 100 g tłuszczu:

a) Tradycyjnie, w zlewce na płaszczu grzejnym, doprowadzając tłuszcz do temperatury

180 °C. Kontynuować ogrzewanie przez 15 minut kontrolując termometrem

temperaturę tłuszczu.

b) Stosując ogrzewanie mikrofalowe przez 15 minut (moc 600-700 W).

Oznaczyć liczbę kwasową i nadtlenkową tłuszczy po ogrzewaniu.

Oznaczanie liczby kwasowej (wg normy PN-ISO 660)

Liczba kwasowa wyraża ilość miligramów wodorotlenku potasu potrzebną do zobojętnienia

wolnych kwasów tłuszczowych (KT) zawartych w 1 g badanego tłuszczu. Liczba kwasowa jest

miarą zawartości wolnych KT, czyli określa stopień hydrolizy tłuszczu.

Badane tłuszcze stałe podgrzać do temperatury nieco wyższej od punktu zestalenia. Odważyć

10 g tłuszczu do kolby stożkowej i dodać 50 ml mieszaniny alkoholu i eteru. Klarowny

roztwór miareczkować roztworem KOH wobec fenoloftaleiny do uzyskania różowego

zabarwienia utrzymującego się przez ok. 1 minutę. Liczbę kwasową obliczyć wg wzoru:

gdzie: CKOH – stężenie roztworu wodorotlenku potasu [mmol/ml]

VKOH – objętość roztworu wodorotlenku potasu zużytego do miareczkowania [ml]

1

0

MKOH – masa molowa wodorotlenku potasu (56,1 mg/mmol)

m – masa tłuszczu [g]

Oznaczanie liczby nadtlenkowej (wg normy PN-ISO 3960)

Liczba nadtlenkowa LOO oznaczana dla tłuszczu informuje o zawartości w próbce

pierwotnych produktów utlenienia lipidów, tj. wodoronadtlenków. Liczba nadtlenkowa jest to

ilość cm3 mianowanego roztworu tiosiarczanu sodu potrzebna do zmiareczkowania jodu

wydzielonego z roztworu jodku potasu w wyniku działania nadtlenków zawartych w 1 kg

tłuszczu. Ilość nadtlenków w próbce, która utlenia jodek potasu w warunkach oznaczenia,

wyraża się jako miliekwiwalenty aktywnego tlenu zawarte w kilogramie tłuszczu [mEq O/kg

tłuszczu] dokładnie w chwili pomiaru.

Badane tłuszcze stałe podgrzać do temperatury nieco wyższej od punktu zestalenia. Odważyć

2 g tłuszczu do kolby stożkowej i dodać 10 ml chloroformu, rozpuścić przez mieszanie.

Dodać 15 ml CH3COOH lodowatego oraz 1 ml nasyconego KI. Kolbę natychmiast zamknąć

korkiem, mieszać 1 minutę, a następnie odstawić w ciemne miejsce na 5 minut. Dodać 75 ml

wody i 5 kropli roztworu skrobi. Zawartość kolby natychmiast miareczkować roztworem

tiosiarczanu sodu do uzyskania odbarwienia trwającego co najmniej pół minuty. Analogiczne

oznaczenie przeprowadzić dla próby ślepej (powtórzyć wszystkie czynności bez dodawania

tłuszczu).

Liczbę nadtlenkową, wyrażoną w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kg tłuszczu,

obliczyć wg wzoru:

gdzie: 1000 - współczynnik przeliczeniowy liczby cm3 zużytego Na2S2O3 na milirównoważniki tlenu

w 1 kg tłuszczu

VNa2S2O3 - objętość roztworu tiosiarczanu sodu użytego do oznaczenia [cm3]

V0 - objętość roztworu tiosiarczanu sodu użytego do oznaczenia [cm3]

CNa2S2O3 - stężenie molowe tiosiarczanu sodu [mol/dm3]

m - masa tłuszczu [g]

W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń, z

uwzględnieniem celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków. Podać prawdopodobne

produkty powstające podczas jełczenia oksydatywnego.

1

1

Ćwiczenie 4

Hydroliza oleju roślinnego

Sprzęt:

mieszadło magnetyczne

element mieszający

łaźnia olejowa

kolba okrągłodenna 250 ml

kolba okrągłodenna 100 ml

rozdzielacz 250 ml

cylinder miarowy 100 ml

lejek Buchnera

kolba ssawkowa

erlenmajerka 100 ml

Hydroliza oleju roślinnego

W kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml umieścić 15 g oleju roślinnego, 3.45 g

wodorotlenku potasu i 30 ml gliceryny. Kolbę ogrzewać przez 5 minut w łaźni olejowej

w temperaturze 160 °C zapewniając mieszanie. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej

(mieszanina zaczyna krzepnąć) dodać 90 ml rozcieńczonego HCl (75 ml wody i 15 ml

stężonego HCl), doprowadzając do pH = 1. Wytrącony osad wraz z roztworem przenieść do

rozdzielacza, kolbę przemyć eterem dietylowym. Mieszaninę ekstrahować eterem dietylowym

(3 x 30 ml). Warstwę organiczną przemyć nasyconym roztworem NaCl, osuszyć nad

siarczanem sodu. Po odsączeniu odparować rozpuszczalnik. Zważyć surowy kwas oleinowy

zanieczyszczony kwasami wielonienasyconymi (linolowym, linolenowym).

Wyodrębnienie kwasu oleinowego

Otrzymany produkt przenieść do kolby 100 ml, dodać 16.5 g mocznika i 75 ml metanolu.

Mieszaninę ogrzać do rozpuszczenia osadu, przesączyć, roztwór pozostawić do krystalizacji.

Otrzymane kryształy (kompleks kwasu oleinowego z mocznikiem) odsączyć, a następnie

rozpuścić w 35 ml wody i ekstrahować eterem naftowym (3 x 20 ml). Warstwę organiczną

przemyć nasyconym roztworem NaCl, osuszyć nad siarczanem sodu, odsączyć, odparować.

Zważyć produkt (gęstniejący olej o t.t. 16 °C i obliczyć wydajność procesu).

W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń,

z uwzględnieniem celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków.

Odczynniki:

olej rzepakowy 15 g

gliceryna 30 ml

KOH

eter dietylowy 90 ml

stężony HCl 15 ml

NaCl

Na2SO4

mocznik – metanol

eter naftowy

1

2

Ćwiczenie 5

Izolacja kwasów tłuszczowych z migdałów/ wiórków kokosowych

Sprzęt:

zestaw do destylacji z parą wodną

kolba okrągłodenna 250 ml x 2

chłodnica zwrotna

lejek

rozdzielacz 250 ml

Pozyskanie olejku migdałowego lub kokosowego można dokonać macerując materiał roślinny

eterem naftowym (metoda A) lub destylując go z parą wodną (metoda B).

Metoda A

Rozdrobnione migdały (w płatkach, 15 g) lub wiórki kokosowe oraz 100 ml eteru naftowego

umieścić w kolbie 250 ml zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną. Ogrzewać w temperaturze

wrzenia przez godzinę. Następnie ochłodzić mieszaninę, przesączyć. Kolbę przepłukać

octanem etylu w celu wymycia wszystkich tłuszczowych pozostałości i dołączyć do

przesączu. Całość odparować, zważyć.

Metoda B

Zmontować zestaw do destylacji z parą wodną. W kolbie umieścić 15 g migdałów w płatkach

lub wiórków kokosowych. Destylację (pod wyciagiem) kontynuować do uzyskania 150 ml

destylatu o mleczobiałej barwie. Destylat ekstrahować chloroformem (4 x 50 ml). Warstwę

organiczną osuszyć nad Na2SO4, odparować i zważyć.

Odczynniki:

15 g migdałów lub wiórków kokosowych

chloroform

eter dietylowy

eter naftowy

octan etylu

metanol

etanol

Na2SO4

1

3

Rys. 1. Zestaw do destylacji I

Rys. 2. Zestaw do destylacji II

W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń,

z uwzględnieniem celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków.

1

4

Ćwiczenie 6

Zmydlanie i oznaczenie liczby jodowej oleju kokosowego i migdałowego

Sprzęt:

kolba okrągłodenna 250 ml

chłodnica

biureta 50 ml

kolba stożkowa 250 ml

zlewka 250 ml

cylinder 100 ml

Otrzymywanie mydła

Rozpuścić olejek kokosowy lub migdałowy w 30 ml alkoholu etylowego w kolbie 250 ml

i dodać 45 ml roztworu zawierającego odpowiednią ilość wodorotlenku sodu (na 1 g olejku -

0.25 g NaOH) w mieszaninie etanol : woda (9:1 v/v). Otrzymaną mieszaninę należy ogrzewać

w temperaturze wrzenia przez 2 godziny. Po ochłodzeniu otrzymane mydło przenosi się

łopatką do zlewki zawierającej 110 ml wody z pokruszonym lodem. Następnie należy

przesączyć, osuszyć i zważyć.

Oznaczenie liczby jodowej metodą Morgoschesa

Liczba jodowa stanowi ilość gramów jodu, którą mogą przyłączyć nienasycone kwasy

tłuszczowe zawarte w 100 g tłuszczu. Jej wartość jest miarą zawartości w tłuszczu

nienasyconych kwasów tłuszczowych. Im wyższa wartość liczby jodowej, tym większa

zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych. Nadmiar nieprzereagowanego jodu usuwa

się poprzez odmiareczkowanie roztworu kwasów tłuszczowych roztworem tiosiarczanu sodu.

Próbkę badanego tłuszczu 0,2 g (olejek migdałowy) lub 1 g (olejek kokosowy) umieścić w

kolbie stożkowej na 250 ml, dodać 15 ml alkoholu metylowego, a następnie 10 ml 0,2 M

alkoholowego roztworu jodu. Roztwór dokładnie wymieszać i natychmiast dodać 100 ml

wody destylowanej i odstawić pod przykryciem nie dłużej niż na 5 minut. Po tym czasie

nieprzereagowany jod odmiareczkować 0,1 M Na2S2O3 wobec 2 ml skrobi, którą należy

dodać pod koniec miareczkowania (gdy roztwór uzyska jasnożółta barwę). Zakończyć

Odczynniki:

olejek kokosowy lub migdałowy

etanol

NaOH

0.1 M Na2S2O3

jod

skrobia

1

5

miareczkowanie gdy roztwór uzyska mleczną barwę. Analogiczne oznaczenie przeprowadzić

dla próby ślepej (powtórzyć wszystkie czynności bez dodawania tłuszczu w metanolu).

Liczbę jodową obliczyć wg wzoru:

gdzie: 1,269 – wartość gramorównoważnika jodu (126,92 g) w odniesieniu do 100 g tłuszczu

V0 – liczba ml Na2S2O3 zużyta w próbie kontrolnej

V1 – liczba ml Na2S2O3 zużyta w oznaczeniu właściwym

m – masa tłuszczu [g]

W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń,

z uwzględnieniem celu doświadczenia, celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków.

Podać schemat reakcji otrzymywania mydła z kwasu laurynowego i oleinowego oraz addycji

jodu do kwasu oleinowego.

1

6

Ćwiczenie 7

Izolacja i wykrywanie cholesterolu z żółtka jaja kurzego

Sprzęt:

zlewka 100 ml 2x

bagietka

kolba okrągłodenna 250 ml

lejek

płytki chromatograficzne

komory chromatograficzne

probówki

Odczynniki:

jajo kurze

etanol-eter dietylowy (2:1, v/v)

eter dietylowy

aceton

chloroform

cholesterol - wzorzec

kwas siarkowy stężony

bezwodnik octowy

roztwór bromu w lodowatym kwasie octowym

Izolacja cholesterolu

Dokładnie oddzielić żółtko od białka i zalać je w zlewce 75 ml mieszaniny etanol-eter

dietylowy (2:1, v/v). Rozmieszać żółtko szklaną bagietką i pozostawić mieszaninę

w temperaturze pokojowej na ok. 10 min., od czasu do czasu mieszając. Mieszaninę odsaczyć

na sączku karbowanym do suchej kolby kulistej, a przesącz odparować na wyparce (temp.

łaźni poniżej 50 °C). Żółtą pozostałość rozpuścić w 10 ml eteru dietylowego. Otrzymany

roztwór wkroplić powoli, mieszając, do zlewki zawierającej 30 ml acetonu. Wytrącony osad

surowych lecytyn odsaczyć na sączku karbowanym. Przesącz odparować, a pozostałość

rozpuścić w chloroformie i zachować do TLC i reakcji probówkowych.

Na płytkę chromatograficzną nanieść próbki osadu, przesączu i wzorzec cholesterolu.

Rozwinąć w układzie oraz heksan-octan etylu (7:3). Wywołać: w parach jodu oraz kwasie

siarkowym.

1

7

Wykrywanie cholesterolu

Reakcje probówkowe na obecność cholesterolu w przesączu. Powtórzyć z wzorcem

cholesterolu rozpuszczonym w chloroformie.

Próba Salkowskiego: Do 2 ml roztworu cholesterolu dodać powoli po ściance probówki 1 ml

stężonego kwasu siarkowego. Kwas fluoryzuje na zielono, a warstwa organiczna barwi się na

czerwono.

Próba Liebermana-Burcharda: Do 1 ml roztworu cholesterolu dodać 10 kropli bezwodnika

octowego i kroplę kwasu siarkowego. Pojawia się czerwone zabarwienie, przechodzące przez

niebieskie w zielone.

Próba Windausa: Do 1 ml chloroformowego roztworu cholesterolu dodać kroplami roztwór

bromu w lodowatym kwasie octowym. Obserwować zanikanie barwy bromu.

W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych prób, z uwzględnieniem swoich

obserwacji i schematu reakcji.