5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 1/37
EKSPRESI HETEROLOGUS GEN INTERFERON ALFA 2
MANUSIA: ISOLASI, KLONING, DAN SEKUENSING
YEMIMA SURYANI
JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR
2 0 0 1
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 2/37
RINGKASAN
YEMIMA SURYANI. Ekspresi Heterologus Gen Interferon A lfa 2 Manusia: Isolasi, Kloning, da n
Sekuensing Gen Interferon A lfa Manusia (Heterologous Expression of Interferon Alpha 2 Gene:
Isolation, Cloning, and Sequencing). Dibimbing oleh SULlSTlYANI, I MADE ARTIKA, dan
HERAWATISUDOYO.
Interferon alfa 2 m an usia (H u-IF No :.2) merupakan zat antivirus dan antitumor yang Lelah diakui
penggunaannya untuk m engobati berbagai penyakit keganasan dan penyakit akibat virus. Penggunaannya
di Indonesia masih terbatas karena harga obar ini d i lu ar ja ng ka ua n kernampuan masyarakat. Penelitian in i
bertujuan mengisolasi gen Hu-IFNu2 yang pada akhirnya akan diekspresikan untuk tujuan produksi
p ro te in I FN o:.2 dalam skala industri,
Penelitian diawali dengan studi bioinformatika untuk menentukan urutan nukleotida gen Hu-IFNo:.2
dan daerah sekitarnya. Data yang diperoleh digunakan sebagai landasan dalam merancang sepasang
prim er yang digunakan untuk mengisolasi ge n tersebut dari DNA genom manusia dengan teknik peR
(Polymerase Chain Reaction). D ari p ro se s ini d ip ero leh fragmen DNA b eru ku ra n 797 ph y an g m er up ak an
kandidat gen H u-IFN o:.2• Fragmen DNA disisipkan ke dalam vektor pGEM®-T, dilanjutkan dengan
transformasi ke dalam sel E. coli. D ari sepuluh koloni transforrnan yang plasmidnya diisolasi da n ukuran
insert-ivy» diperiksa dengan teknik peR, ternyata sernbilan k olo ni m em ilik i ukuran insert yang sesuai(1.047 pb). U ru ta n n uk leo tid a kandidat gen Hu-IFNu2 tersebut diperiksa menggunakan Big Dye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI) serta dianalisis menggunakan Automatic DNA
Sequencer AB! Prism 377. Hasil a na lis is m enunju kk an bahwa bcnar gen yang diisolasi rnerupakan ge n
Hu-IFNo: .2• Gcn ini siap untuk disubklon ke dalam suatu vekror ckspresi untuk mcnghasilkan protein
1FNcx2.
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 3/37
THESHEPHeRD's PSALM
The Lord is my shepherd; I shall not want.
He maketh me to lie down in green pastures:
He leadeth me beside the still waters.
He restoreth my soul: he leadeth me in the paths of
righthousness for his name's sake.
Yea, though I walk through the valley of the shadow of death, I
will fear no evil:
For thou art with me; thy rod and thy staff they comfort me.
Thou preparest a table before me in the presence of mine
enemies: thou antoinest my head with oil; my cup runneth
over.
Surely goodness and mercy shall followme all the days of my
life: and I will dwell in the house of the Lord forever.\
Psalm 23
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 4/37
EKSPRESI HETEROLOGUS GEN INTERFERON ALFA 2
MANUSIA: ISOLASI, KLONING, DAN SEKUENSING
YEMIMA SURYANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk mernperoleh gelar
Sarjana Sainspada
Program Studi Kimia
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2001
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 5/37
Judul : E ksp resi H eterolog us G en Interfero n A lfa 2 M anu sia: Isolasi, K lon in g, d an
Sekuensing
: Y ern im a S ury an i
: 001497047Nama
NIM
Menyetujui ,
Ph.D. 11'.1 M ade Artika, M .Sc., Ph.D
Pernbimbing II
P ernbim bing III
Tanggal lulus: I 7 . A U G 2 0 0 1
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 6/37
RIWAYATHIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 16 April 1979 sebagai anak tunggal dari pasangan Adi
Suryono dan Jusijanti.
Pada tahun 1997 penulis lulus dari SMU Kristen I Jakarta dan pada tahun yang sama penulis masuk
IPB pada Fakultas MIPA Program Studi Kimia melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Pada
tahun 2000 penulis melaksanakan praktik lap~ngan di Badan Tennga Nuklir Nasional Pasar Jumat, Jakarta
dan pada tahun 2001 penulis melaksanakan penelitian di Lembaga Biologi Molekul Eijkman, Jakarta.
Selarna mengikuti perkuliahan penulis pernah menjadi asisten mata kuliah Kimia Dasar I pada tahun
ajaran 1999/2000, Kimia Dasar II pada tahun ajaran 1999/2000, dan Biokimia I pada tahun ajaran
200012001.
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 7/37
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Bapa yang Maim Kasih atas segala karunia-Nya, sehingga
karya ilmiah ini bisa diselesaikan dengan baik. Penelitian ini yang berjudul Ekspresi Heterologus Gen
Interferon Alfa 2 Manusia: Isolasi, Kloning, dan Sekuensing Gen Inteferon Alfa 2 Manusia dilaksanakan
dad bulan Februari sampai Mei 2001 di Lembaga Biologi Molekul Eijkman, Jakarta. Penelitian lIll
seluruhnya didanai oleh Lembaga Biologi Molekul Eijkman.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang Lelah membantu penyelesaian karya ilmiah
ini, antara lain Prof. Sangkot Marzuki, M.D., Ph.D selaku Direktur Lembaga Eijkman yang telah
mengizinkan penulis rnelakukan penelitian, If. I Made Artika M.App.Sc., Ph.D, dr. Herawati Sudoyo,
M.S., Ph.D, dan drh, Sulistiyani, M.Sc., Ph.D selaku pembimbing yang banyak memberi saran dan
bimbingan yang berharga bagi penulis. Di samping itu ungkapan terima kasih ini juga diberikan kepada
Kak Anna, Kak Helena, Kristi, Puji, Oge, Dodi, Debby, Yadi, Iskandar, dan seluruh star LembagaEijkrnan alas bantuan dan sarannya, Selain itu penults juga mcngucapkan tcrima kasih kepada Eva, Eno,
Benny, dan sernua ternan angkatan 34 alas segala dukungan dan persahabatannya, Ungkapan terirna kasih
juga disampaikan kcpada papa, mama, dan Rahel untuk scgala doa, kasih, dan dukungannya,
Semoga karya ilmiah ini dapat bcrmanfaat,
Jakarta, Juli 200 I
Yemima Suryani
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 8/37
DAFTARISI
Halaman
DAFfAR TABEL........................................... ~ viii
DAFTAR GAMBAR......................................... VIII
DAFTAR LAMPIRAN.......................................................... \,111
PENDAHULUAN .
TINJAUAN PUSTAKA
Interferon ..
Struktur dan Keragaman Gen Interferon Manusia............................ 2
Interferon Alfa 2.............. .. .. 3
PolymeraseChainReactioll.......................................................................... 3
Kloning..................................................................................................... 4
Sekuensing................................... 6
BAHAN DAN METODE
Bahan 7
Peralatan 7
Garis Besar Kcgiatan..................................................................................... I)
Studi Bioinformatika............................................... 8
Isolasi DNA Genom......... 8
Pengukuran Kadar dan Kemurnian DNA.............................................. 9
PolymeraseChainReaction............................ 9
Deteksi Prod uk peR dengan Elektroforesis Gel Agarosa.. 9
Pemurnian Produk peR " ... . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Ligasi Produk peR dengan Vektor pGEM®-T....................................... 10
Transforrnasi ke daIam SeI E. coli........................................................... 10
SeJeksi dan Isolasi Plasmid Rekombinan.................................................. 10
Sekuensing Hasil Kloning.................................................................. II
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA Genom: Kadar dan Keruurnian DNA............................................... I 1
Amplifikasi Gen Interferon Alfa 2 Manusia........................................................ 12
Kloning.................................................................................................. 1 4
Sekuensing..... 16
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan............................. 17
Saran................................................. 17
DAFTAR PUSTAKA........................................................................ 17
LAMPI RAN . 20
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 9/37
DAFTAR TABEL
Halarnan
I. K lasifikasi interferon........ 2
2. Ciri-ciri urnum gen IFN manusia.......................... 2
DAFTAR GAMBAR
Halaman
I. Tahapan reaksi pada teknik Polymerase Chain ReactiOIl.......... 4
L Tahapan teknik kloning............................................................ 4
3. Konsrruksi plasmid pGEM®-T........................................................................ 5
4. Contoh pernisahun fragmcn-Iragmcn DNA clan sckuensnya...................................... 7
5. Diagram alir metode penelitian IFNA 2..................... 8
6. Program PCR untuk amplifikasi gcn IFNA 2....................................................... 9
7. Program PCR untuk konfirmasi ukuran insert plasmid rckombinan...................................... I !
8. Program peR untuk sekuensing...................................................................... I I
9. S tratcgi am plifikasi gen 1FNa2.................................................................... .... 12
1 0. H as il amp lifik as i DNA sam pel dengan prim er IF-2 dan IR -2 pada 3 suhu annealing ... . .. .. . 13
II. C aw an petri berisi medium LB yang mengandung ampisiIin, IPTG, dan X-gal . 15
12. Hasil PCR sepuluh koloni . 16
13. Daerah pertemuan antara vektor pGEM®-T dengan salah satu ujung insert . 16
14. Perbandingan sekuens sam pel dengan sekuens standar 1FNa2 , IFNo:.2b, dan IFNazc ..... 17
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
I. Daftarprimer yang digunakan................. 20
2. Perhitungan kadar dan kemurnian DNA......................................... 21
3. Perbandingan sebagian sekuens IFN~ dengan sebagian sekuens IFNa yang lain.,; 22
4. Elektroforegram hasil perunutan sekuens gcn IFNa2dengan primer IF-2...................... 23
5. H asil konfirrnasi sekuens sam pel dengan standar Y 11834......... 24
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 10/37
6. Sekuens keseluruhan IFNa2 hasil isolasi....... 25
7. Urutan nukleotida gen Hu-1FNa2dan asam amino yang disandinya............................ 26
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 11/37
PENDAHULUAN
Akhir-akhir ini sem akin banyak manusia yang
terserang penyakit tumor dan penyakit yang
diinduksi oleh virus. Daya tahan tubuh yang
lemah mengakibatkan tubuh mudah terserang
penyakit. T eknik pengobatan yang digunakan
secara luas saat ini belum m enunjukkan hasil
yang cukup memuaskan karena tingkat
kesembuhan penderita penyakit tersebut masih
relatif rendah, terutama untuk penyakit tumor
ganas (kanker),
Sejak dua dekade terakhir, para peneliti di
negara-negara maju mengembangkan suatu
teknik pengobatan menggunakan zat-zat irnun
(kekebalan) yang diproduksi oJeh tubuh manusia
secara alam i pada kondisi tertentu, Zat-zat imun
tersebut diharapkan akan rnengobati tepa! pada
sasaran da n sesedikit mun gk in m en im b ulk an efek
sarnping. Salah satu zat irnun yang telah banyak
dimanfaatkan di negara-negara maju adalah
interferon alfa 2 manusia (M illar et al., J 996;
AgarwaJa & Kirkwood, (995).
Interferon alfa 2 (IF Nu 2) m eru pak an salah
satu jcnis protein yang disintesis oleh sistem
kekebalan tubuh apabila tubuh terserang virus
dan tum or. Efek yang ditim bulkan oleh IFN O'.z ini
adalah penghambatan replikasi virus dan
penghancuran sel yang terserang virus atau
tumor. Hasil-hasil penelitian menunjukkan
bahwa IFNu2 efektif untuk rnereduksi tumor dan
mengobati berbagai m acarn jenis penyakit yangdiinduksi o le h v ir us .
1FNu2 telah diakui oleh U.S. Food and Drug
Administration sebagai salah satu obat antitumor
dan antivirus pada bulan Juni 1986 dan telah
banyak diproduksi oleh negara-negara maju
(Gut terman, 1994). Pengiriman dan pemasaran
IFNu2 dari luar negeri ke Indonesia memerlukan
biaya yang sangat m ahal, Jalan keluar yang dapat
ditempuh untuk mengatasi rnasalah tersebut
adalab swasembada , IFNu2 di Indonesia.
Swasembada 1FNu2 di' Indonesia selama ini
belum diusahakan karen a terdapat beberapa
kendala utama, antara lain adalah keterbatasan
teknologi, sumber daya manusia, dan biaya,
Teknologi DNA rekornbinasi y an g d ip erlu ka n
untuk produksi IFNu2 baru dimanfaatkan di
Indonesia dalam beberapa tahun terakhir,
sehingga sumber daya manusia Indonesia yang
menggeluti bidang ini masih terbatas. Selain itu
biaya yang diperlukan juga cukup mahal.
Akibatnya sampai saat ini IFNO '.z belum
dimanfaatkan secara luas di Indonesia, padahal
kebutuhan akan 1FNu2 sernakin meningkat
seiring dengan meningkatnya jum lah penderita
penyakit tum or dan penyakit yang diinduksi oleh
VIruS.
Penelitian ini rnerupakan tahap awal dari
serangkaian peneiitian tentang IFNcxz yang
bertujuan untuk rnemproduksi 1FNu2 dengan
teknik DNA rekombinasi melalui ekspresi gen
1FNu2 dalam suatu vektor ekspresi, Adapun
tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi
gen IFNu2 dan menyimpannya dalam vektor
pGEM;!i )-T. Tahapan penelitian yang dilakukan
secara garis besar melipuri isolasi DNA genom
rnanusia dari darah vena, amplifikasi gen IFNo:z
dari DNA genom manusia dengan teknik peR
(Polymerase Chain Reaction), kloning gen
tersebut, da n konfirrnasi sekuensnya dcngan
teknik sekucnsing.
Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini
adalah tersedianya gen 1FNu2 dalam vektor
pGEM6'-T yang siap untuk dipindahkan
(disubklon) ke dalam suatu vektor ekspresi.
Keberhasilan procluksi 1FN uz akan m endukung
terciptanya swasembada obat antivirus dan
antitumor di Indonesia. Selanjutnya 1F Nu2 hasil
ekspresi dapat dimanfaatkan secara luas untuk
mengobati penyakit tumor dan penyakit akibat
virus. Dcngan dem ikian diharapkan jum lah
penderita penyakit tumor dan penyakit yang
disebabkan oleh virus di Indonesia akan
berkurang.
TINJAUAN PUSTAKA
Interferon
Interferon (lFN) dipublikasikan pertam a kali
oleh Isaacs dan Lindenmann pada tahun 1957
da n dinamai oleh mereka berdasarkan
kemampuan senyawa tersebut untuk mengganggu
replikasi dari berbagai macarn : virus. Pada
dasarnya IFN merupakan sekelompok protein
dan glikoprotein yang diproduksi olehselmamalia dalam rangka merespon sejumlah
penginduksi (Sattayasai, 1990). M ereka berfungsi
untuk menghambat replikasi virus yang masuk ke
dalam sel, menghambat proliferasi sel-sel
vertebrata, dan mengatur respon kekebalan
(Stites et al., 1994). K etiga fungsi ini berkaitan
erat satu sama lain karena dalam rnenjalankan
tugasnya, IFN tidak langsung menyerang virus
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 12/37
yang rnenginfeksi sel-sel tubuh, melainkan
menyerang sel inang yang terinfeksi virus
sedernikian rupa, sehingga sel-sel tersebut tidak
dapat lagi ditempati oleh virus tersebut. SeIain
e fe k a nt iv ir us , IFN juga memiliki efek antitumor.
Sel-sel tumor lebih sensitif terhadap IFN
dibandingkan dengan sel-sel normal karena
kemungkinan besar IFN merupakan tumor
supressor yang potensial. H al ini m encerrninkan
kemampuan IFN untuk mengatur ekspresi gen-
gen yang spesifik dan aktivitas metaboIik pacta
sel-sel sasaran. Tipe-tipe IFN yang dapat
menginduksi efek antivirus dan antitumor pad a
sel-sel vertebrata disajikan pada Tabel I.
Terdapat tiga jenis lFN , yairu IFNo:., IFN~, dan
IFNy. IFNa. dan IFN~ sifatnya m irip, yaitu tahan
terhadap kondisi asarn dan keduanya
menggunakan reseptor yang sama, sehingga
digolongkan sebagai IFN t ipe, I, sedangkan IFNy
berbeda dengan kedua tipc IFN yang lain karena
tidak tahan terhadap kondisi as am dan
menggunakan rcscptor yang bcrhcda, schinggu
digolongkan ke dalam IFN tipc II.
Tabel I. K lasifikasi interferon (IFN)
Tire P enginduk si S el yang m em produ ksi
IFN
C I. Virus L eu ko si t ( kemun gk in an
K om po ne n m u kr of ng )
Llmfoblnstoid
p Virus Se l p ad a j ar in g an p ad at
y Stimulus S el T (dibantu o le h ma kr of u g)
anligenik
Su rnb er .D ij kman s & Silli!IU, 1985
Antara tahun 1979 da n 1982, sekucns DNA
manusia yang menyandi kode genetik untuk
pernbentukan IFNo:., IFNP, dan IFNy diperoleh
dengan teknik kloning, Akibatnya penggolongan
pada Tabel 1 yang awalnya hanya didasarkan
pada kriteria serologis, kernudian dinyatakan
keabsahannya oleh data asam nukleat penyusun
masing-rnasing tipe IFN. Teknik kloning tersebut
dilakukan dengan cam rnemasukkan gen IFN ke
dalam plasmid E. coli, sehingga gen IFN tersebut
dapat diekspresikan di dalam E. coli. Beberapagen IFN juga dimasukkan ke dalam vektor yang
memungkinkan ekspresi gen tersebut di dalam sel
rnamalia atau di dalam sel ragi (Gray et al.,
1982).
2
Struktur dan Keragaman Gen InterferonManusla
Gen IFN dari beberapa spesies hewan
(manusia, tikus, dan sapi) Lelah diklon dan
dianalisis, tetapi hanya gen IFN manusia yang
paling banyak diketahui saat ini. Beberapa
karakteristik gen IFN manusia (Hu-IFN) dan
protein yang dihasilknnnya disajikan pada Tabcl
2.
TabeI 2. Ciri-ciri umum gen IFN manusia
Panjung Panjang
Tipe Jumluh 1 1 1 1 1 " 0 1 1 mature peptida Leuik
IFN Gell Protein Sinyal
(au) (aa)
CI > 13 o 165 .166 D Krouuisom
\)
~ 0 16 6 21 Kromusosu
<)
'Y 3 14 6 20 Kromusum
12
S umbc r: D ijk ma ns & BilliutI, IlJl i :' i
Pada genom manusia terdapat paling scdikit
13 gcn IFNa. dan 6 pseudogcn dengan homologi
se ku en s n uk le otid an ya 85-95% (Lawn et al.,
198 I). Enam buah pseudogen tersebut kadang-
kadang tidak digolongkan ke dalam gen IFNa,
letapi digolongkan ke dalam kelornpok tersendiri
yang disebut sebagai IFNw, IFNro sering
dikaitkan dengan IFNa. atau disebut pseudogen
karena susunannya m enyerupai IFNa dan
diproduksi oleh Ieukosit (Stites et al., 1994), Gen
IFNo:. berkelorupok dalam kromosorn 9 dan tidak
memiliki intron (Dijkrnans & Billiau, I985).
Produk gen ini adalah polipeptida dengan 188
atau 189 asarn amino dengan 23 asam amino
pertarnanya merupakan peptida sinyaJ yang
bersifat hidrofobik. Peptida sinyal ini akan
dilepaskan pada saat protein ini ditransportasikan
keluar sci rnenghasilkan INFiX yang terdiri dari
165 atau 166 asam amino. ,
Sampai saat ini hanya satu gen IFN~ manusia
yang diternukan, S arna seperti gen IFNa., gen ini
juga tidak memiliki intron dan terletak dalarnkromosorn 9. Homologi gen IFN~ dengan gen
IFNa. hanya sekitar 45 %, tetapi struktur um um
gen IFN~ mirip dengan IFNa. Gen ini mcnyandi
187 asam amino dengan 21 asarn am ino
pertam anya m erupakan peptida sinyal,
Gen IFNy hanya merniliki sedikit kerniripan
dengan gen IFNo:. dan IFN~. Gen IFNy terletak
pada kromosom 12 dan merniliki 3 intron dalam
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 13/37
dacrah penyandi pro tein. Gen ini m enyandi
p ro te in d en ga n 166 asam am ino dengan 20 asam
am ino pertam anya m erupakan peptida sinyal.
Interferon A lfa 2
IFNa2 rnerupakan produk salah satu gen
IFNu. 1FNu2 merupakan protein yang terdiri
dari 189 asam am ino dengan 23 asam amino
pertamanya merupakan peptida sinyal, Hasil
penelitian menunjukkan bahwa 1FNa2 im
berperan dalam pengobatan beberapa penyakit,
an tara lain myeloma (M andelli, 1990), chronic
myeloid leukimia (Talpaz et al., 1991), Kaposi's
sarcoma (Borden, 1998), follicular lymphoma
(Solal-Ccligny et al., 1993), terapi penderita
hepatitis C (Colier et al., 20 0 I), da n
penyembuhan pasien setelah o pe rasi m elan om a
(Kirkwood et al., 1996).
M enurut K aluz et al. (1994), 1FN u2 tcrd iri
alas tiga buah subvarian , yaitu 1FNu2 a, 1FNa2 b,
dan 1FNa2 e. Sekuens ketiga subvarian tersebut
san gal m irip. Perbedaan sekuens ketiganya
terletak pada nukleotida ke-137 dan nukleotida
ke-17 0. Basa nitogen dari nukleotida ke-137 pada
IFNu2 a diisi oleh adenin (A ), sedangkan pada
IFNu2 b dan 1FNa2 e diisi oleh guanin (G). Basa
nitrogen dari nukleotida ke-17 0 pad a 1FNa2 a
dan 1FNa2 b diisi oleh adenin (A ), sedangkan
pad a 1FNa2 e diisi oleh guanin (0).
Hasil penelitian yang dilakukan oleh Lee et
at. (1995) menggunakan sampeJ darah dari28.000 manusia sehat m enunjukkan bahwa gen
1FNa2 b merupakan sub v arian yang paling
banyak terdapat pada DNA genom sarnpel
tersebut, 1FNu2 e diternui pada sejum lah keeil
sarnpel « 0, I%), sedangkan IFNu2 a tidak
ditem ui pada populasi in i. Gewert et al. (1995)
meneliti subvarian 1FNa2 dari DNA genom
manusia A frika dan Afro-Caribian . Hasil
penelitian tersebut m endukung hasil penelitian
Kaluz et al. (1994) dan Lee et at . (1 99 5), y aitu
bahwa IFNaz mengandung tiga buah subvarian
(IFNu2 a, 1FNa2 b, dan 1FNu2 c) dan IFNu2 b
merupakan subvarian yang paling banyak
ditemui.
Polymerase Chain Reaction
Teknik Polymerase Chai/l Reaction (PCR)
merupakan salah satu teknik utama yang
digunakan pada penelitian ini. Teknik yang
menciptakan terobosan baru di bidang genetika
3
ini m erupakan su atu leknik arn plifik asi seju rnlah
kecil sekuens DNA ill vitro secara sensitif dan
spesifik, Teknik ini diternukan oleh Kary B.
Mullis p ada tah un 198 3 . P en g guna an teknik PCR
in i dalam bidang b io lo gi rno lek uler sernakin
meluas. Penyebabnya adalah kesederhanaan
tek nik tersebut dan ting ginya ting kat kesu ksesan
amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh (Saiki,
1989).
Secara ringkas, teknik PCR dilakukan dengan
cam mencampurkan sampel DNA dengan prim er
olig onukleotida, deoksiribonukieo tida trifosfat
(dNTP), dan enzim terrno stab il Taq DNA
polirnerase dalam larutan bufer yang sesuai,
kemudian menaikkan da n rnenurunkan suhu
cam pu ran secara b erulang selarna beberapa jam
sampa i d ip ero le h ju mlah sekuens DNA yang
diinginkan. S atu sik lu s pa d a tek nik PCR terdiri
d ari tig a tahap, yaitu den aturasi, annealing, da n
ckstcnsi. D cnaturasi dilakukan pada suhu 90-
95°C , sehingga tcrjadi pcm isahan utas ganda
DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang
merupakan cctakan (template) tempat
penempelan prim er dan tempat kerja DNA
polim erase, Selanjutnya subu rcaksi diturunkan
untuk penernpelan primer oligonukleotida pada
sekuens yang komplementer pada molekul DNA
cetakan. Tahap ini d isebut annealing, Suhu
annealing untuk setiap sekuens DNA sifatnya
spesifik dan mcrupakan penentu utama
keberhasilan suatu reaksi PCR. Tahap terakhir
dari satu siklus PCR adalah tahap ekstensi yang
dilakukan pada suhu 7 2°C. Suhu ini m erupakan
suhu optimum untuk kerja enzim Taq DNA
polimerase. Pada tahap ekstensi terjadi sintesis
DNA yang komplernen dengan DNA cetakan.
Ketiga tahap tersebut dilakukan berulang kali
dalam mesin PCR, pada umumnya antara 25
sampai 40 siklus, bergantung kepada jum lah
DNA yang diinginkan. Pada dasarnya reaksi PCR
mengambil pnnsip replikasi DNA, yaitu
pernbukaan rantai D NA utas ganda, penernpelan
prim er, dan perpanjangan rantai DNA bam oleh
DNA polimerase dari arah 5' ke 3'. Hanya saja
pada teknik PCR, tidak rnenggunakan enzim
ligase dan primer RNA (W atson et al., 1992).
Tahap-tahap pada teknik PCR disajikan pada
Gambar !.
Pada awal d itemukannya teknik PCR , DNA
polimerase yang digunakan berasal dari E. coli.
DNA polim erase ini bersifat sangat sensitif
terhadap panas dan rusak pada suhu denaturasi
utas ganda DNA. O leh karena itu enzim tersebut
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 14/37
harus ditambahkan secara manual untuk setiap
sik lus. Hal Ill! berpeluang m engak ibatkan
terjadinya kesalahan apabila beberapa sampel
diam plifikasi seeara sim ultan. Penggunaan DN A
polimerase E.coli kem ud ian digantik an oleh
DNA polimerase yang dim urnikan dari bakteriterrnofilik Thermus aquaticus (Taq). DNA
polim erase tersebut dapat tetap aktif sam pai suhu
95°C (Saiki et al., 1988). Oleh karena kerja Taq
DNA polirnerase tidak dipengaruhi oleh suhu
denaturasi utas ganda DNA, maka ia tidak perlu
ditambahkan pada setiap siklus. M odifikasi in i
mengakibatkan p en ye de rh an aa n p ro se du r karena
pelaksanaan peR dapat dilakukan secara
autornatis. Selain itu spesifisiras, hasil,
sensitivitas, dan panjang sekuens DNA target
yang akan d iam plifikasi ju ga m eningkat,
Primer oligonukleotida yang digunakan
dalam teknik peR hams memenuhi beberapa
syarat, antara la in m em ilik i susunan basa yang
acak , sehingga tidak terjadi polipurin atau
polipirim idin, m em iliki jurnlah purin dan
pirirnidin yang seim bang, mem ilik i titik leleh
yang hampir mendekati satu sama lain, dan
sedikit rnungkin rnerniliki susunan basa yang
komplementer (Saiki, 1989). Pada umumnya
panjang prim er yang digunakan berkisar antara
20 sarnpai 30 basa.
~
~Annealing
Gambar I. Tahapan reaksi pada teknik
Polymerase Chain Reaction
(peR).
4
Kloning
Klon adalah sekumpulan organisme identik
yang berasal dari satu sum ber (A lberts et al.,
1994). Teknik kloning merupakan bagian
terpenting dari teknologi DNA rekornbinasi(Sambrook et al., 1989). Teknik in i meliputi tiga
tahap, yaitu ligasi, transforrnasi, dan seleksi
(Gambar 2). Ligasi adalah pemasukan sekuens
DNA yang diinginkan ke dalam suatu vektor,
transforrnasi adalah pemasukan DNA
rekombinan ke dalam suatu sel kornpeten,
sedangkan seleksi adalah pernilihan sel-sel yang
m engandung D NA rekombinan.
3'~' DNAinsert
~A3'
Klon
G am bar 2. Tahapan teknik kloning.
Ligasi
Ligasi adalah pemasukan sekuens DNA yang
mengandung gen diinginkan ke dalam DNA
genom dari suatu elernen gcnetik yang dapat
bereplikasi sendiri (vektor), yaitu p lasm id ,
bakteriofag, dan yeast artificial chromosomes
(Voet & Voet, 1994). L igasi menghasilkanproduk yang disebut dengan DNA rekombinan,
K loning yang dilakukan pada penelitian in i
menggunakan vektor berupa plasm id. P lasm id
adalah DNA utas ganda sirkular yang berukuran
dari I sampai 25 0 kb dan m em ilik i paling sedikit
satu ori (origin of replication). Adanya ori
m engakibatkan plasm id dapat bereplikasi sendiri
d i dalam sel inangnya dan tidak bergantung pada
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 15/37
kromosom utama sel inang tersebut. Plasmid ini
pada umumnya mengandung satu atau lebih gen
yang menyandi ketahanan (resistensi) terhadap
antibiotika, sehingga sel inang yang mengandung
plasmid dapat bertahan dalam lingkungan yang
mengandung antibiotika tertentu, misalnyaampisilin, tetrasiklin, dan kloramfenikol. Plasmid
yang lazim digunakan dalam teknik kloning
adalah plasmid yang berukuran kurang dari 10 kb
dan terdapat dalam jumlah yang cukup banyak di
dalam satu sel inang (Brown, 1995).
Ligasi menggunakan plasmid alami pada
umumnya dilakukan dengan memo tong plasmid
dan DNA yang akan disisipkan (insert) dengan
enzim restriksi yang sarna, misalnya EcoRI,
kernudian menggabungkan DNA insert dan
plasmid dengan enzim ligase. Pada penelitian ini
vektor yang digunakan berupa plasmid sintetik
yang bernama pGEM®-T. Plasmid ini berukuran
3000 pb dan konstruksinya dapat dilihat pada
Gambar 3. Vektor pGEM®-T memiliki dua buah
ori, gcn ketahanan terhadap ampisilin (Amp'),
basa timin (T) yang menggantung (overhang) di
tengah-tengah gen laeZ, dan beberapa situs
pemotongan enzim restriksi, Penggunaan
pOEM®-T lebih menguntungkan dibandingkan
dengan plasmid yang lain karena plasmid ini
bentuknya sirkular terbuka, sehingga tidak perlu
dipotong dengan enzim restriksi, Pada masing-
masing ujung plasmid yang terbuka terdapat basa
timin (T) yang menggantung (overhang). Kedua
basa ini dimanfaatkan untuk berkomplemendengan ujung-ujung sekuens DNA hasil PCR
yang selalu memiliki sebuah basa adenin (A)
yang menggantung (overhang). Selanjutnya
plasmid dan DNA insert dilekatkan dengan
enzim ligase.
Oambar 3. Konstruksi vektor pOEM-T.
5
Transformasi
Plasmid rekombinan yang dihasilkan dari
hasil ligasi selanjutnya dimasukkan ke dalarn sel
kompeten (sel yang telah memperoleh perlakuan
kimiawi atau perlakuan fisik tertentu yang
meningkatkan kemampuan sel tersebut untuk
mengambil DNA). Proses ini disebut
transformasi.
Transforrnasi produk ligasi ke dalam sci
kompeten dapat dilakukan dengan cam
mencampurkan sci kompeten dengan plasmid
DNA dalam larutan kalsium klorida, lalu
dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42()C
selama 45 detik. Cara lain untuk transformasi
dilakukan dengan metode elektroporasi, yaitu
transfer DNA melalui Iubang semen tara pada
membran sel yang diinduksi oleh pulsa elektrik
pendek (Calvin & Hanawalt, 1988). Boynton et
al. (1988) & Daniell et al. (1990) rnengemukakan
cara transforrnasi rnenggunakan penembakan sel
target dengan mikroproyektil berkecepatan
tinggi. Mikroproyektil tersebut pada umumnya
terbuat dari logarn tungsten atau emas yang
diselubungi oleh produk ligasi dan ditembakkan
dari penembak partikel. Teknik ini dikenal
dengan teknik biolistik dan saat ini telah banyak
diterapkan untuk transformasi produk ligasi ke
dalam berbagai jenis sel, Metode mikroinjeksi
yang dilakukan dengan menginjeksikan molekul
DNA langsung ke dalarn nukleus sci target
menggunakan jarum yang sangat runcing
dikemukakan oleh Hammer et al. (1985) sebagai
salah satu met ode transforrnasi yang dapat
dilakukan terhadap sel hewan. Metode
transformasi yang digunakan pada penelitian ini
adalah metode kejut pa~as (heat shocks.
Seleksi
Tahap terakhir pada teknik kloning adalah
seleksi sel-sel yang mengandung plasmid
rekombinan, Seleksi 10 1 pada umumnya
dilakukan dengan menggunakan media LB yang
mengandung antibiotika, Sel-sel yang tidak
mengandung plasmid tidak akan dapat
berkembang biak pada media Lls-antibiotika,
sedangkan sel-sel yang mengandung plasmid
dapat berkernbang biak dengan baik pada media
tersebut. Antibiotika yang ditambahkan ke dalam
media LB bergantung pada jenis plasmid yang
digunakan. Pada umumnya plasmid yang
digunakan mengandung gen yang menyandi
ketahanan terhadap ampisilin, sehingga media
yang digunakan adalah media LB-ampisilin.
Seleksi dengan rnenggunakan media LB-
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 16/37
ampisilin dapat m embedakan sel-sel yang
mengandung plasm id dengan sel-sel yang tidak
m en ga nd un g p la sm id .
Masalah yang timbul kemudian adalah
memisahkan sel yang mengandung plasmid
rekombinan dengan sci yang mengandung
plasm id tanpa insert, yaitu plasm id yang
mengalami swaligasi (self-ligated vector),
sehingga berbentuk sirku!ar yang dapat pula
masuk ke dalam sel kornpeten. Penye!esaian
masalah ini dapat dilakukan dengan seleksi
plasm id menggunakan aruibiorika kedua atau
rnengggunakan blue-white screening. Metode
yang dipilih bergantung pada jenis plasm id yang
digunakan. Metode seleksi d en ga n an tib io tik a
kcdua diterapkan pada plasm id yang memiliki
m inim al 2 gen yang menyandi ketahanan
L crhadap antibiotika, P ad a m etode seleksi dengan
antiblotika kedua, sel yang tidak m engandung
plasm id rekom binan akan tetap bertum buh, tetapi
sel yang mengandung plasm id rekombinan akan
mati. Untuk seleksi menggunakan blue white
screening, maka digunakan media yang
m en ga nd un g X -g al { 5- br om o- 4-k lo ro -3 -in do lil-
~ -D -galaktopiranosida}, suatu molekul yang
mirip dengan galaktosa dan IPTG (isopropil-
tiogalaktosida) yang merupakan inducer enzim
~-galaktosidase. Apabila sel yang mengandung
plasm id tanpa insert dtumbuhkan pada media
tersebut, rnaka gen laeZ akan terekspresikan da n
enzim ~-ga lak to s ida se akan d ih as ilk an . E nz im in iakan memeeah X -gal dan m enghasilkan senyawa
yang berwarna biru. Apabila sel yang
mengandung plasm id rekombinan ditumbuhkan
pada m edia tersebut, maka gen laeZ tidak akan
diekspresikan da n enzim ~ -galaktosidase tidak
terbentuk. O leh sebab itu, dapat diarnbil
kesimpulan bahwa seleksi menggunakan blue
white screening akan mernberikan warn a biru
untuk sel yang tidak mengandung plasm id
rekombinan dan warna putih untuk sel yang
mengandung plasm id rekornbinan (Brown,
I95).
Sekucnsing
Penentuan sekuens DNA atau RNA yang
menyandi pembentukan protein dan RNA dikenal
dengan teknik sekuensing. Dua buah metode
sekuensing DNA dikembangkan pada tahun
I70-an, yaitu metode Maxam-G ilbert dan
metode Sanger. M etode M axam-G ilbert
didasarkan alas destruksi bas a seeara kim iaw i,
6
sedangkan metode Sanger didasarkan alas
pengham batan sintesis nukleotida akibat adanya
persaingan antara dN TP dengan ddN TP.
Pad a metode Maxam-Gilbert, DNA yang
akan disekuensing ditandai dengan J2p, kemudian
DNA tersebut didenaturasi dan dibagi ke dalam
cmpat tabung reaksi. Masing-masing tabung
direaksikan dengan bahan-bahan yang secara
spesifik melernahkan ikatan antara satu atau dua
dari empat basa yarig terdapat di dalam DNA.
Selanjutnya d itarn bah ka n p ip eridin yang akan
mernutus rantai DNA pada ternpat basa yang
dilernahkan ikatannya tersebut, Hal ini akan
mcnghasilkan sekumpulan fragmen berland a
radioaktif yang panjangnya tergantung pada jarak
aniara Ietak basa yang dihilangkan dengan ujung
molekul yang bcrtand a radioaktif (M axam &
Gilbert, J 97 7 ). Sekuens DNA dapat dibaca dari
has il p er ni sa han fragmen-fragmen yang terbentuk
p ad a g el p o lia kr ilam id a.
Pada metode Sanger, DNA yang akan
disekuensing dibagi ke dalam empat tabung.
M asing-masing tabung berisi prim er bertanda
radioaktif', dNTP, satu jenis ddNTP, dan enzim
DNA polimerase, DNA utas ganda m ula-m ula
didenaturasi menjadi dua buah utas tunggal,
kemudian salah satu utas lunggal D NA ditempeli
prim er yang bertanda radioaktif, dan selanjutnya
oleh kerja enzim DNA polim erase, prim er
diperpanjang dengan dNTP atau ddNTP yang
tersedia. Penempelan ddNTP pada DNA cetakan
sama efisiennya dengan penempelan dNTP pada
DNA cetakan tersebut, Penempelan ddNTP pada
DNA eetakan mengakibatkan penghentian
sintesis utas yang komplementer dengan DNA
cetakan, Hal ini disebabkan karena ddNTP
kehilangan gugus hidroksil pada atom karbon
nornor 3 dari komponen gulanya. Gugus
hidroksil 1 1 1 1 diperlukan untuk penempelan
nukleotida berikutnya untuk pernanjangan utas
komplcmenter. Akibatnya akan dihasilkan
berbagai fragmen bertanda radioaktif yang
berbeda-beda panjangnya (Sanger, 197 7 ).
Pem isahan fragm en-fragm en tersebut dilakukan
dengan gel poliakrilamida (Sanger & Coulson,
1978).
M etode sekuensing yang banyak dilakukan
saat ini adalah m etode Sanger yang dirnodifikasi
untuk m em perbaiki sensitiv itas dan efektivitas
analisisnya, Modifikasinya terletak pada
penggunaan ddNTP yang bertanda zat fluoresen.
Reaksi setiap basa dengan zat warna fluoresen
tersebut akan memberikan sinyal fluoresensi
yang berbeda, sehingga keempat basa terse but
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 17/37
dapat dibedakan. Oleh karena itu, dengan metode
ini, sctiap sampel hanya perlu direaksikan satu
kali (tidak perlu dilakukan pernisahan antara basa
yang saru dengan yang lainnya) dan hasilnya
dapal dipisahkan dengan baik oleh gel
poliakrilamida, Contoh hasil pemisahan fragrnen-[ragmen DNA dengan gel poliakrilamida dan
pernbacaan sekuensnya disajikan pada Gambar 4.
Gel:
. . . G G C G A A T G C G T C C A C A A C G C T A C A G G T G. . . T G C G A A T G C G l C C A C A A C G C T A C A G G T
"6 G C G A A l G C G T C C A C A A C G C T A C A G G
" ' 6 G C G A A T 6 C G T C C A C A A C G C T A C A G
. . . . A G C G A A T G C G T C C A C A A C G C T A C A. . . , .C G C G A A T G C G T C C A C A A C G C T A C. . . . . A G C G A A T G C G T C C A C A A C G C T A
-.T G C G A A T G C G T C C A C A A C G C T. . . . . C G C G A A T G C G T C C A C A A C G C. . . G G C G A A T G C G T C C A C A A C G
. . . .C G C G A A T G C G T C C A C A A C
. . . . 1 1 G C G R A T G C G T C C A C A I I
G I I I I I I l I I I > I I G C G R A T G C 6 T C C A C I I
-C G C G A A T G C G T C C A C
< I I I I i I I I I I I > n G C G A A T G C G T C C n
... C G C G A A T G C G T C C
-C G C G A R T G C G T C. . . . . T G C G A A T G C G T
-G G C G A A T G C G
.... C Q C G A A T G C. . . G G C G A A l G. . . . T G C G A A T
Gambar 4. Contoh hasil pemisahan fragmen-
fragmen DNA dan sekuensnya.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan untuk isolasi DNA
adalah sampel darah vena manusia, larutan
pelisis sel darah merah, Iarutan pelisis sel darah
putih, RNase 5 mg/ml, ammonium asetat 5 M,
isopropanol, etanol 70 %, dan buffer TE (Tris-
HellO mM pH 8,0, EDTA I mM), sedangkan
bahan yang digunakan untuk PCR adalah bufer
PCR (KCI 500 mM, Tris-HCI 100 mM pH 8,4),MgCh 50 mM, dNTP 10 mM, Taq DNA
polimerase 5 unit/p.l, akuabides steril, dan
sepasang primer 40 pmol, Elektroforesis gel
agarosa dilakukan untuk memeriksa hasil PCR.
Adapun bahan yang digunakan untuk
elektroforesis gel agarosa tersebut adalah agarosa
tipe II (Sigma), standar DNA q,X174 DNA/Hae
III, loading buffer (bromfenol biru 0,25%,
sukrosa 40% (w/v)), larutan TBE (Tris-borat 0,09
7
M, EDTA 0,002 M pH 8,0), dan etidium
bromida.
Teknik kloning dilakukan dalarn tiga tahap.
Bahan yang digunakan untuk tahap ligasi adalah
vektor pGEM®-T, enzim ligase, dan bufer,
sedangkan bahan yang digunakan untuk tahaptransforrnasi dan tahap seleksi adalah sel Ecoli
kompeten DH5a, medium Luria Bertani (LB)
cair steril yang terdiri dari bacto tripton, bacto
yeast extract, NaCl, akuabides steril, dan LB
padat yang tersusun dari bahan yang sama seperti
LB cair hanya terdapat penambahan bacto agar,
ampisilin (100 1l1/IllI), IPTG, dan X-gaL
Bahan yang digunakan untuk isolasi plasmid
adalah Larutan I (Tris-HCl pH 7,5, 10 mM
EDTA, 15% sukrosa), Larutan II (0,2 M NaOH,
1% SDS), Lannan III (3 M Na asetat pH 4,6
dalam asam asctat glasial), Iarutan fcnol-
kloroforrn (I: 1), etanol absolut, etanol 70%,bufcr TE, dan RNase. K on firrn asi ha sil kloning
dilakukan dengan teknik PCR, sehingga bahan
yang digunakan sam a scperti bahan PCR umum
hanya primer yang digunakan berbeda, yaitu
primer M 13-1' dan M 13-r.
Bahan yang digunakan untuk sekuensing
adalah p er an gk at p cm urn ia n QIAquick (Qiagen),
etan o] ab solu t, Tris-HC! 10 mM pH 8,5, gel
agarosa 1%, primer T7, SP6, IF-2, dan IR-2,
ready mix (AmpIiTaq, dNTP, dan ddNTP yang
telah diberi senyawa fluoresens), natrium asetat,
loading buffer (50 mg/ml blue dekstran dalam
larutan EDT A 25 mM yang rnengandungdimetilforrnamida dengan nisbah 1:5), TBE,
akrilamida 40%, TEMED (N,N,N'N'-
tetrametilenetilendiamina) dan APS (amonium
persulfat) 10%.
Peralatan
Peralatan yang digunakan untuk PCR adalah
thermocycler peR (GeneAmp® PCR System
9700 Perkin Elmer) dan tabung PCR 50 Ill,
sedangkan untuk elektroforesis gel agarosa
adalah perangkat elektroforesis (Bio Rad),
microwave (Nasional), dan kamera UV (Bio Rad
Gel Doc 1000). Spektrofotometer (Ultraspsec IIl-
Pharmacia) digunakan untuk mengukur kadar
dan kemurnian DNA, sedangkan kolom
QlAquick (Qiagen) digunakan untuk pemurnian
produk PCR dan plasmid basil isolasi. Untuk
sekuensing digunakan Automatic DNA Sequencer
ABlPrism 377 (Perkin EImer). Peralatan lain
yang digunakan adalah tabung mikrofuge
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 18/37
(eppendorf), tabung falcon, pipet m ikro
(eppendorf), sentrifuse (eppendorf ripe 5403,
Sorvall" MC J2V, dan tipe 54l5C berpendingin,
Du Pont), incubator shaker (N ew B runsw ick
Scientific), pornpa vakum (BioRad), penangas air
(Forma Scientific), inkubator (Thermolyne),speed vac (S helb y), da n v ortex (Thermolyne),
Garis Besar Kegiatan
Pcnelitian in i diawali dengan studi
bioinforrnatika yang bertujuan untuk m em peroleh
sekuens DNA manusia yang rnengkode IFNa.2.
Hasil studi bioinform atika tersebut digunakan
untuk mensintesis sepasang primer yang
diperlukan untuk rnengisolasi sekuens IFNa.?
dari DNA genom dengan teknik PCR. DNA
genom diisolasi dari darah vena manusia dcngan
metode Bohringer Maneheim, DNA hasil isolasi
i ni d igunakan sebagai DNA cetakan untuk PCR.
Selanjutnya produk PCR dipisahkan dengan
elektroforesis gel agarosa, A pabila hasil analisis
in i menunjukkan fragrnen D NA diinginkan (yang
menyandi gen IFNa(2), maka DNA in i kemudian
dimurnikan dari komponen-komponen reaksi
PCR dengan menggunakan perangkat QIAquick.
H asil pem urnian disisipkan ke dalam vektor
pGEM®- T melalui reaksi ligasi, sehingga
menghasilkan plasm id rekombinan yang
selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel
bakteri E. coli DH5a. dengan mctode kejut panas
(heat shackedi. S el-se l te rtra nsfo rm asi till
kemudian ditumbuhkan pada media agar LB
y an g m en gan du ng ampisilin, IPTG , dan X -gal
selama semalam . Plasm id DNA rekombinan hasil
kloning diseleksi, lalu diisolasi dengan reknik
m iniprep. U kuran insert dalam plasm id hasil
isolasi dikonfirmasi kembali m enggunakan PCR .
Selanjutnya dua buah plasm id hasil iso la si y an g
m cnunjukkan ukuran insert y an g tep at d ian alisis
dengan teknik sekuensing agar diketahui urutan
nukleotidanya. Secara keseluruhan metode
penelitian disajikan pada G am bar 5.
Studi Bioinformatika
Studi bioinform atika yang dilakukan pada
awa! penelitian bertujuan untuk rnernperoleh
sekuens DNA yang mengkode IFNo:2< Studi ini
dilakukan melalui penelusuran di internet pada
situs Gene Bank National Center for
Biotechnology Information (NCB I) dengan
alarnat www ncbi.nlm .nih.gov. Hasil studi ini
8
digunakan untuk sintesis sepasang prim er untuk
amplifikasi sekuens gcn IFNo:z dengan teknik
PCR.
Iso la si D NA
Seleksi
Isolasi p la sm id r ek omb in an
Gambar 5. Diagram alir metode penelitian
IFNa.z·
Isolasi DNA Genom
DNA genom diisolasi dari darah vena. Darah
vena sebanyak 5 lU I dim asukkan ke dalam tabung
.,falcon 50 m l yang berisi IS m l la ru ta n p elisis sel
darah m erah I x, kem udian diinkubasi selam a 10
menit pada suhu kamar sambil diaduk beberapa
kali. Tabung berisi sampel selanjutnya
disentrifugasi pad a 1.500 rpm selama 1 0 m en it.
Langkah !Ill diulang 2-3 kali sampai
supernatannya jernih. Supernatannya dibuang
da n peletnya diberi 1.250 I.d larutan pelisis sel
darah putih lx, lalu dikocok dengan pipet transfer
sampai larutannya homogen. Sebanyak 5 III
RNAse (5 mg/m l) ditambahkan ke dalam tabung,
lalu diaduk beberapa kali, Inkubasi pada suhu
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 19/37
3i'c dilakukan selama 15 m enit pada penangas
air. U ntuk m engendapkan protein dilakukan
penambahan 833 Jll amonium asetat 5 M ke
dalam tabung, kem udian tabung di-vortcx sarnpai
larutan yang terbentuk terlihat seperti susu.
Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 3.000
rpm , 4°C selama 15 menit, Supcrnatannya
dituang ke tabung baru yang berisi 3850 111
isopropanol dan dikocok sampai DNA-nya
terlihat. Tabung disentrifugasi lagi pada
kecepatan 3000 rpm , 4°C selama 5 menit.
Supernatannya dibuang dan DN A dibilas dengan
4,165 I II e tanol 70 %, I alu d ike ringkan pad a suhu
kamar sclama [ jam . Setelah kering, DNA
d ilaru tk an d alam bufer TE dan diinkubasi pada
suhu 37 °C selama dua jam . DNA hasil isolasi ini
disimpan pada suhu -20 °C .
Pcngukuran Kadar dan Kemurnian DNA
DNA yang diperoleh diukur kadar da n
kernurniannya bcrdasarkan m ctodc Sam brook et
al. (1989). K adar larutan DNA diukur dengan
spektrofotomcter pada panjang gelombang 26 0
nm . Kemurnian larutan DNA dihitung dengan
mernbandingkan absorbanss pada panjang
gelombang 260 nm dengan absorbanss pada
panjang gelornbang 280 nm .
Polymera se Chain R ea cti on (peR)
Gen 1FNu2 dikeluarkan dari DNA genom
rnanusia dengan teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR). Perbanyakan fragrnen DNA
yang mengkode gen 1FNu2 secara in vitro
dilakukan dengan m enggunakan pasangan prim er
oligonukleotida sintetik yang m em batasi daerah
di luar gen tersebut, M etode yang digunakan
untuk teknik PCR ini adalah metode Saiki et al.
(1988). Pasangan prim er yang digunakan adalah
IF-2 dan IR-2 (Lampi ran 1). Komposisi bahan
yang diperlukan untuk 50 )11 volum e reaksi dalam
tabung PCR adalah 2 )11 sam pel D NA ,S III buffer
PC R lax, 1 ,5 ) 11M gCl2 50 mM , 1 )11 dNTP lOmM , 0,5 JlI prim er IF-l 40 pmol, 0 ,5 )11 primer
IR-l 40 pmol, dan 0 ,5 III Taq DNA p olim erase
dalam akuabides steri!. Pembuatan campuran
reaksi ini semuanya dilakukan dalam keadaan
dingin,
Satu siklus PCR terdiri dari tiga tahapan,
y ai tu d en at ur as i, annealing, dan ekstensi. Tahap
denaturasi dilakukan selama 1 menit pada suhu
94°C , tahap annealing dilakukan selama I menit
9
pada suhu 54-56°C , dan lahar ekstensi dilakukan
selama I menit pada 72°C . Pradenaturasi
dilakukan selama 5 menit, sedangkan pada siklus
te ra kh ir d ilak uk an pemanjangan waktu ekstensi
selama [0 rnenit (G ambar 6). Jum lah siklus yang
digunakan untuk mengarnplifikasi ge n 1FNa2
adalah 30 siklus, Dalam hal ini dilakukan
o ptirn asi su hu annealing agar dihasilkan produk
y an g o ptim um.
I
I
94°C I 94°C
5:00: 1:00II
I
I
I
I
I
54-56°C
I ; O ( }
Garnbar 6. Program PCR untuk amplifikasi gen
1FNa2.
Deteksi Produk PCR dengan Elektroforesis
Gel Agarosa
Prod uk PCR diperiksa dengan tcknik
clektroforesis gel agarosa. Gel agarosa dibuat
dengan cara melarutkan 0 ,25 g agarosa dalam 25
1111bufer TBE rnc la lu i p emanasan dengan oven
microwave, lalu sebanyak 2,5 Jll etidium bromida
ditarnbahkan ke dalam larutan ge l agarosa
tersebut. Selanjutnya Iarutan gel dituang ke
dalam wadah cetakan gel horizontal dengan
sejumlah sumur tcmpat aplikasi sampel,kemudian gel dibiarkan membeku selama
setengah jam atau lebih. Setelah beku, ge l
dimasukkan ke dalam perangkat elektroforesis
yang berisi larutan bufer TBE I x . Sebanyak [0
)11 sampel DNA dicampur dengan 2 )11 loading
bufer, kemudian dimasukkan ke dalam sumur-
surnur tem pat aplikasi sam pel. E lektroforesis
dijalankan pada tegangan 80 V selama 48 rnenit.
Untuk rnembandingkan hasil yang diperoleh
digunakan standar DNA ~X174 DNA/Hac III.
V isualisasi pita DNA dilakukan dengan lampu
UV pada panjang gelombang 300 nm . Hasil
visualisasi kemudian direkam denganm enggunakan kam era UV .
Pemurnian Produk peR
Pemurnian produk PCR dilakukan untuk
m enghilangkan sisa-sisa prim er dan pereaksi lain
pada proses PCR. Pemurnian dilakukan dengan
menggunakan perangkat QlAquick PCR
purification. Prod uk PC R dilarutkan dalam bufer
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 20/37
PB sebanyak 5x voJumenya dan dikocok, lalu
dimasukkan ke dalam kolom spin QIAquick da n
disentrifugasi selam a satu m en it p ad a k ec ep ata n
J 2.000 rpm , sehingga supernatannya terpisah ke
bawah dan dibuang. SeJanjutnya ke dalam kolom
ditambahkan 0,75 ml bufer PE , lalu kolomdisentrifugasi kembali pada kecepatan 12.000
rpm selarna satu menit. Supernatannya dibuang
dan kolorn disentrifugasi kem bali pada kecepatan
14.000 rpm selama satu menit.· Kolom
dipindahkan ke dalam tabung eppendorf
m ikrofuge 1,5 m l, lalu ke dalam kolom
ditarnbahkan 20 III bufer EB . Senlrifugasi
dilakukan selarna I m enit pada kccepatan 14.000
rpm , sehingga produk PCR yang telah
d irn urn ikan d ip ero leh pada tabung eppendorf
mikrofuge.
Ligasi Produk peR dengan Vcktor pGEM®-T
Ligasi produk PCR dilakukan menurut
m etode Sam brook et al. (1989) dengan cara
mencampurkan 7 III produk PCR dengan I III
bu fer ligase lOx, I III vektor pGEM®-T, I III
DNA ligase T4, dan 1 III akuabides steriI daJam
tabung eppendorf, Campuran reaksi tersebut
kemudian diinkubasi sernalam pada suhu 4°C
(rnesin PC R). Sebagai pem banding, digunakan
kontrol negatif yang diperlakukan sama seperti
sampel, kecuali tanpa penambahan prod uk PCR
(insert).
Transformasi Se l E. Coli
Pernasukan plasm id rekombinan ke dalam sel
kompeten dilakukan menurut metode Sam brook
et al. (1989). Sebanyak 5 III prod uk ligasi
dicampur dengan 50 III sci E. coli kompeten
(DH5a), dibiarkan dalam es selama 30 men it,
la lu d ik eju tp an as ka n (heat shocked) dalam
penangas air 42°C selama 45 detik . Setelah itu
disimpan dalam es selama 5 menit, dicampur
dengan 800 III media LB cair, lalu diinkubasi
selama I jam 45 menit dalam incubator shaker
pada suhu 37 °C pada keeepatan 200 rpm .
Suspensi sel dipekatkan dengan sentrifugasi pada
kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit dan ± 750
III supernatannya dibuang. Peletnya kcmudian
d isu sp en sikan d en ga n sisa su pe rn atan nya ,
Suspensi ini disebarkan ke media padat LB
yang mengandung arnpisilin , IPTG, dan X -gal
dalam cawan petri sampai rneresap, lalu
diinkubasi semalam pada suhu 37 °C untuk
10
menumbuhkan koloni sel-sel transform an.
Pemekatan dan penanaman suspensi sel pada
media ini dilakukan pada ko ndisi ste ril, yaitu
debt api. S etelah in ku basi, caw an petri ditutup
dengan parafilm dan disimpan dalam peudingin
(4 0Q. Langkah yang sama juga dilakukan un(ukkontrol negatif,
Seleksi dan Isolasi Plasmid Rekornbinan
P eng ujian y an g dilakukan untuk memperoleh
klon positif (yang rnengandung plasmid
rekombinan) diawali dengan mengambil 10
koloni yang dipilih secara acak, kemudian
m asing-m asing koloni ditum buhkan dalarn m edia
LB cair. SeIanjutnya D NA plasm id rekombinan
dari kultur diisolasi dengan prosedur lisis basa
yang tcrmodifikasi ( Sam b ro ok et al., 1983).
Sebanyak 1,5 IIII kultur bakteri yang Lelahdiinkubasi selama sernalam dalam media LB cair
disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama
3 menit . Supcrnatannya kcmudian dibuang dan
peletnya disuspcnsikan kernbali dalarn 10 0 III
Larutan I d an d iin ku ba si dalam es sclama 5
rncnit, Sel dipccahkan dengan mcnambahkan 200
!!l Larutan II, lulu diinkubasi lagi dalam es
selama 5 menit. Selanjulnya 150 III Larutan III
dirambahkan ke dalam carnpuran dan eam puran
diinkubasi lagi dalam cs selama 5 m enit. Setelah
disentrifugasi pada kccepatan 14.000 rpm pada
suhu 4°C selama 15 rnenit, supematan diekstraksi
dengan larutan fenol-kloroform (I: 1), lalu
disentrifugasi kembali pada kecepatan 14.000
rpm pada suhu 4°C selama 5 menit, Lapisan alas
dipindahkan ke dalarn tabung eppendorf baru.
Plasm id DNA diendapkan dengan penambahan 2
x volum e etanol absolut, dikocok dan didiam kan
pada suhu kamar selama 5 men i t, lalu
disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm , suhu
4°C selarna 10 m enit, Pelet yang diperoleh dicuci
dengan etanol 70 0 / 0 , k em ud ian dik ering kan
dengan speed vac dan disuspensikan kernbali
dalam 50 III buffer TE yang mengandung Rnase.
Larutan plasm id rekombinan selanjutnya
disim pan pada suhu "20°C .Plasm id hasil isolasi kernudian diperiksa
ukuran insert-eye dengan teknik PC R. K ornposisi
bahan dalam satu tabung PCR terdiri dari 21 III
dd H 20, 5 III bufer PCR lOx, 1,5 !!I M gCI2 50
mM , I ",-IdNTP 10 mM , 0,5 III prim er M I3-!, 40
pmol, 0 ,5 III prim er M 13-r 40 prnol, 20 III
plasm id hasil isolasi, dan 0 ,5 III enzirn Taq DNA
polim erase. Program peR yang digunakan untuk
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 21/37
konfirm asi ukuran insert p la sm id rek orn bin an
disajikan oleh G am bar 7 . Selanjutnya dipilih du a
klan plasm id rekombinan untuk digunakan pada
an al is is s eku en s in g .
Gambar 7 . Program PCR untuk konfirrnasi
ukuran insert p la sm i d r ek omb in an ,
Sekucnsing Hasil Kloning
Sekuensing dilakukan dalam em pat tahap,
yaitu purifikasi plasm id rekombinan, PCR
sckuensing, etanol presipitasi, dan pernisahan
fragm en-fragm en DN A dengan elektroforesis gel
poliakrilam ida (Sanger, 197 7). Purifikasi plasm id
rekombinan dilakukan dengan perangkat
QIAquick PCi: purification. P ro se du r p em u rn ia n
plasm id rekombinan sama seperti prosedur
pemurnian prod uk PCR, hanya saja pada tahap
awal, selain ditambahkan bufer PB , juga
ditambahkan larutan NaCI 5 M sebanyak 0 ,2 x
v olu me sa mpe l.
PCR sekuensing dilakukan dengan empat
macam reaksi. K eernpat reaksi tersebut
dibedakan dari jenis prim er yang digunakan.
Reaksi pertama m enggunakan prim er SP6, reaksi
yang kedua menggunakan primer T7 , reaksi
ketiga menggunakan primer IF-2, dan reaksi
keempat menggunakan primer IR-2. Campuran
reaksi untuk PCR sekuensing adalah I III larutan
plasm id rekombinan hasil purifikasi (dari klan
positif), I III prim er (SP6 untuk reaksi pertama
T7 untuk reaksi kedua, IF-2 untuk reaksi ketiga,
dan IR -2 untuk reaksi keempat) dengan
konsentrasi 2 pmol/ul, 3 III ready mix
(m en gan du ng Am pliT ag ™ dan dNTP yang telah
dilabel fluaresens), dan 5 J.11 akuabides.
Campuran tersebut diamplifikasi dengan 25siklus PCR. Denaturasi dilakukan pada suhu
96°C selama 10 detik , annealing dilakukan pada
suhu 50°C selam a 5 detik, dan ekstensi dilakukan
pada suhu 60°C selama 4 menit, Pada tahap awal
dilakukan pradenaturasi selam a 3 m enit. P rogram
PCR yang digunakan untuk sekuensing disajikan
pada Gambar 8.
H asil PC R dipresipitasi dengan etanol absolut
dan I J.11 natrium asetat 3 M pH 4,6 dengan
[ [
perbandingan 10:25: I, kem udian dihornogenkan
dengan vortex. Car npur an itu d id iamkan dalam es
selam a 5 m cnit, kem udian disentrifugasi dengan
kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4°C selama 20
menit. Supernatan dibuang dan peletnya dicuci
dengan 250 III etanol 70 % , kemudian
disentrifugasi pad a kecepatan 12.000 rpm pada
suhu 4()C selama [0 menit, Pelet dikeringkan
dengan speed vac selama 7 menit, DNA yang
diperoleh disirnpan pada suhu _20D e.I
I
I
I
I
60 DC I
4:001
3:00 l 0: 101
1
11
1
1
50 DC
0;05
00
G am bar 8. P rogram PC R untuk sekuensing.
Pernisahan fragm en-fragm en D NA dilakukan
dengan elektroforesis poliakrilam ida (PAGE)
(Sanger, 1978). Konsentrasi gel akrilam ida yang
digunakan adalah 4% . G el tersebut dibuat dengan
mencampurkan 18 g urea, 5 m l stok akrilarnida
40% , 0 ,5 g campuran resin , 25 rnl akuabides
steril. Campuran tersebut dilarutkan selama 10
menit dan disaring menggunakan filter 0 ,25
m ikron dan pornpa vakum selama 10 menit,
Selanjutnya ke dalam campuran tersebut
ditambahkan TBE dan akuabides sampai
volumenya 50 m!. Sebanyak 250 J.l1 APS [0%
dan 35 J.11 TEMED ditambahkan ke dalam
cam puran, lalu dengan segera cam puran tersebut
diinjeksikan ke dalarn pelat elektroforesis dengan
menggunakan syringe 50 ml dan dibiarkan
sampai membeku, Buffer yang digunakan
sebagai jernbatan kanduksi adalah TBE. Untuk
pem isahan dengan .elektroforesis akrilam ida,
DNA hasil presipitasi dilarutkan dalam 3 J!l
loading buffer, lalu dipanaskan pada suhu 90 C
selama 2 menit dan segera didinginkan dengan
es. Selanjutnya larutan tersebut dimasukkan ke
dalam sumur-sumur gel dan e1ektroforesis
dijalankan pada tegangan 1 kV , daya 50 W , suhu
51°C , dan daya laser 40 MW selama 7 jam .
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 22/37
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA Genom: Kadar dan Kemurnian
DNA
Sebagai tahap awal isolasi DNA genom
manusia, dilakukan pem isahan an t ara sel-sel
darah putih dengan sel-sel darah merah karen a
DNA genom manusia hanya terdapat di dalam
nukleus sel darah putih, Pem isahan itu dilakukan
dengan penambahan Iaru ta n p elisis se l darah
merah yang diikuti dengan sentrifugasi. Sifat
larutan pelisis sel darah m erah adalah hipotonis.,
sehingga larutan tersebut akan m asuk ke dalarn
sel darah mcrah dan mengakibatkan scl terscbut
pecah, Sclanjutnya D NA genom d ik elu ark an d ari
sel darah putih dengan penambahan larutan
pelisis sci darah putih . Larutan pelisis sel darah
putih m cngandung dua kom poncn utarna perusak
struktur membran, yaitu EDTA dan SOS. EDTA
bcrfungsi untuk rnengkelat lcgam Mg yang
rnerupakan salah satu komponen p en tin g p en ja ga
stabilitas m em bran sel, scdangkan ekor nonpolar
SD S berfungsi untuk menarik fosfolipid yang
merupakan penyusun utama mernbran sel
(B row n, 1995).
DNA genom yang d ik elu ark an d ari dalarn se l
darah putih seIanjutnya dipisahkan dari pengotor.
Dua buah pengo tor utama DNA genom adalah
RNA dan protein . Dcgradasi R NA dilakukan
dcngan penambahan RNase, sedangkan protein
dipisahkan dengan pengendapan olch amonium
asetat. DNA kemudian diendapkan dengan
isopropanol. Pad a tahap akhir, untuk
m em isahkan D NA dari p en go to r-p en gotor m in or,
seperti gararn-garam dan m olekul-m olekul
organik keeil, maka D NA dicuci dengan ctanol
70% (M oore, (998).
DNA hasil isolasi diukur kadar dan
kemurniannya dengan spektrofotorneter pada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (Tabel
3). A bsorbans sam pel pa(ja panjang gelom bang
260 nm adalah 0,084. N ilai in i menunjukkan
jum lah DNA yang terdapat dalam larutan sampel,
sedangkan absorbans sampel pada panjang
gelombang 280 nm sebesar 0 ,048 menunjukkan
jum lah protein pengotor yang terdapat dalam
larutan tersebut. H asil pengukuran m enunjukkan
bahwa DNA hasil isolasi m em iliki kadar yang
eukup tinggi (>500 ng/pJ), yaitu 840 ng/)ll.
Sambrook et al. (1989) mengemukakan bahwa I
nilai absorbans sebanding dengan 50 ng/)ll DNA
utas ganda, 40 ng/)ll DNA utas tunggal, atau 20
12
ng/)ll oligonukleotida utas tunggal. Sam peJ yang
digunakan mcngandung DNA utas ganda,
sehingga kadar DNA sampel diperoleh dari hasil
perkalian antara absorbans pada panjang
gel o m bang 260 nm dengan faktor pengenceran
dan 50 ng/1l1 (L arn pira n 2 ). Kadar DNA dalamsampel diperlukan u ntu k rn em perk ira ka n jumla h
DNA yang digunakan sebagai DNA cetakan
dalam tahap peR . Apabila kadar DNA sampel
cukup tinggi, maka jum lah DNA cetakan yang
digunakan pada tahap pe R tidak perlu banyak,
Nilai kemurnian DNA hasil isolasi adalah
1,75. Nilai in i d ip ero lc h d ari p erb an din ga n antara
absorbans pada panjang gelombang 260 nm
dengan absorbans pada panjang gelombang 28 0
nm . DNA dikatakan murni apabila nilai
kernurniannya bcrkisar antara 1.8-2.0 dcngan
toleransi sebesar 0,05 (Sambrook et (II., 1 98 9).
Karena nilai kcmurnian DNA hasil isolasimendekati nilai idealnya, DNA ini dapat
langsung digunakan pada tahap pe R karena tidak
terlalu rnem pcngaruhi cfisiensi proses peR . N ilai
kernurnian yang rendah menunjukkan bahwa
DNA hasil isolasi lerselubungi oleh protein .
Akibatnya akan tcrjadi penurunan efisiensi
amplifikasi DNA pada tahap peR secara drastis.
Amplifikasi Gen Interferon Alfa 2 Manusia
Teknik peR diawali dengan penentuan
primer yang akan digunakan untuk
mengampliflkasi gcn diinginkan. G en 1FNa2
manusia merupakan salah satu subtipe dari gen
IFNa manusia, Seperti yang telah dikemukakan
sebelumnya, homologi gen Hu-IFNa sangat
tinggi, y aitu 8 5-9 5% (Larnpiran 3). Oleh karena
itu untuk mengamplifikasi gen tersebut
diperlukan sepasang prim er yang sangat spesifik
supaya gen yang teram plifikasi adalah gen 1FNa2
dan bukan subtipe IFNa yang lain . Prim er yang
digunakan untuk tahap amplifikasi ini adalah
prim er IF-2 dan IR-2. Penempelan sepasang
primer tersebut pada gen 1FNa2 manusia
ditunjukkan oleh Gambar 9.
1 . 0 .
Peptida
sinyal
Gen Hu-IFNO :2
G am bar 9. S trategi am plifikasi gen 1FN a2.
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 23/37
M N S M
13
N S M N S
a . b.
x
1 .3 53 p b1 .0 78 p b
872pb
603 p b
x
797 pb
c.
1 .3 53 p b
1.078 pb
S72pb603 p b
x
Gambar 10. Hasil amplifikasi DNA sarnpel dengan prim er IF-2 dan IR -2 pada 3 macam suhu
annealing. Garnbar a, b , dan c berturu t-turut mcnunjukkan hasil amplifikasi pada suhu
annealing 54°C , 55°C , dan 56°C (x mcnunjukkan produk non spesifik yang terbentuk , M
m cnunjukkan m arker atau penanda, N m enunjukkan kontrol ncgatif, dan S m enunjukkan
sampeI).
Hasil amplifikasi DNA genom hasil isolasi
dengan primer IF-2 dan IR -2 ditunjukkan oleh
Gambar 10. G ambar lOa, lOb, dan 10c berturu t-
turut rnenunjukkan basil amplifikasi DNA
dengan teknik PCR pada suhu 54°C , 55°C, dan
56DC. Ketiga gambar tersebut menjelaskan
len lang proses optim asi suhu annealing yang
digunakan pada tahap PCR . Hasil op tim asi
m enunjukkan bahwa suhu annealing y an g p alin g
optimum untuk amplifikasi gen 1FNu2 adalah56°C . Pada suhu ini, intensitas pita prod uk
spesifik yang terbentuk paling rendah bila
dibandingkan dengan kedua suhu lainnya, tetapi
tidak terbentuk produk non spesifik (Gambar
10c). A rnplifikasi gen 1FNu2 dengan primer IF-2
dan IR -2 akan menghasilkan sebuah produk yang
berukuran 7 97 pb. Penempelan prim er IF-2 dan
IR -2 pada subtipe IFNa yang lain juga akan
menghasilkan produk yang juga berukuran
sekitar 7 97 pb. Akibatnya produk non spesifik
yang dihasilkan dari hasil amplifikasi su lit
dibedakan dari produk spesifiknya apabila
sekuens gen yang teramplifikasi adalah sesamasekuens gen subtipe IFN a.
D ari Gambar 10, dapat diamati bahwa
penaikan suhu annealing akan mengurangi
jum lah produk non spesifik yang terbentuk. Hasil
amplifikasi sampel pada suhu annealing 54 D C
menghasilkan pita prod uk spesifik yang
intensitasnya cukup tinggi. Hal in i ditun jukkan
oleh pita yang cukup tebal an tara 603 pb dan 872
pb. Pada suhu tersebut juga terbentuk dua buah
produk non spesifik yang yang berukuran sekitar
250 pb dan 900 pb (Gambar lOa). Selain itu ,
produk non spesifik yang berukuran 900 pb sulit
d ip isahkan dari produk spesifiknya, sehingga
suhu in i tidak optimum. Untuk suhu 55°C ,
intensitas pita produk spesifik maupun non
spesifik yang terbentuk adalah maksimum
(Gambar lOb). Jum lah produk non spesifik yang
terbentuk berkurang (250 pb), tetap i in tensitas
p ita prod uk non spesifik tersebut bertambah.SeJain itu, pita produk spesifik yang terbentuk
terlalu Iebar, rnencakup daerah yang terlalu luas,
sehingga tidak dapat dipastikan apakah pita itu
tersusun dari hasil amplifikasi satu macam gen
IFNa at au be b e rap a gen IFNa. Hasil amplifikasi
gen-gen yang ukurannya berdekatan dapat
berkumpul di satu tempat yang sarna. O leh
karena itu , suhu ini juga dianggap belum
optimum . Pada suhu 56DC in te nsita s p ita p ro du k
spesifik yang terbentuk lebih rendah
dibandingkan dengan dua suhu yang lain karena
penempelan prim er pada DNA cetakan semakin
su lit (Gambar IOc). Suhu ini d ianggap optimumkarena pada suhu in i hanya terbentuk produk
spesifik dan tidak terbentuk produk non spesifik.
Pada tcknik PCR , suhu denaturasi dan suhu
ekstensi pada umumnya tetap, seh ingga suhu
annealing merupakan penentu utama
keberhasilan amplifikasi. Penentuan suhu
annealing didasarkan atas nilai Tm (melting
temperature) prim er yang digunakan untuk
amplifikasi. Perhitungan Tm untuk prim er yang
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 24/37
tersusun oleh ::; 2 0 basa m engacu kepada m etode
yang dikemukakan oleh W allace et al., yaitu
2 (A+T) + 4(G+C), sedangkan perhitungan Tm
untuk primer yang tersusun oleh ~ 20 basa
didasarkan pada metode Breslauer yang dikenal
dengan nama nearest neighbor method. Kedua
primer yang digunakan pada penelitian ini
tersusun alas ~ 20 basa, sehingga nilai Tm
d ih it un g b erd as ark an nearest neighbor method.
Dar i p e rh it ung an tersebut diperoleh nilai Tm IF-2
adalah 5rC, sedangkan nilai Tm IR -2 adalah
49°C . Secara teoritis suhu annealing adalah 5-
IDoC di bawah Tm kedua primer, tetapi pad a
p ra ktek ny a, suh u annealing harus dioptim asi agar
prod uk yang terbentuk hanyalah produk yang
diinginkan. Semakin rendah suhu annealing,
sernakin tinggi efisiensi penernpelan prim er pada
DNA cetakan termasuk penempelan pada
sekuens gen yang tidak spesifik, S eb alik ny a su hu
annealing yang tinggi akan rnengakibatkan
penurunan efisiensi penempelan prim er pacta
DNA cetakan, sehingga prim er hanya akan
menernpel pada sekuens gen yang s pe sif ik , Akan
tetapi suhu annealing yang terlalu tinggi
m enyebabkan prim er sarna sekali tidak dapat
menempel pada utas DNA , bahkan pada utas
D NA yang spesifik sekalipun.
Bahan yang digunakan pada tahap PCR
jumlahnya tertentu agar menghasilkan produk
spesifik yang optim um . M enurut Innis & Gelfand
(1990), jurnlah DNA yang umum digunakan
sebagai DNA cetakan pada tahap PCR adalah
ki I 5 6se uar O ' - \0 molekul. Jum lah molekul DNA
yang terkandung dalam I ug s il '; f/ e copy DNA
genom manusia adalah 3 x 10 '. Kadar DNA
dalam larutan sam pel adalah 840 ng/u], sehingga
volume DNA yang dibutuhkan sebagai cetakan
pada tahap PCR adalah 2 ~ l. V olume ini
sebanding dengan 1,68 ug DNA atau 5,04 x 105
molekul DNA Sementara itu jum lah enzim Taq
DNA polimerase yang direkomendasikan untuk
PCR oleh Law yer et.a l, (1989) berkisar antara 1-
2,5 Unit/IOO ul larutan. Apabila enzim yang
digunakan terlalu berlebih, m aka gen-gen nonspesifik akan teram plifikasi, sedangkan apabila
enzirn yang digunakan terlalu sedikit, m aka
jum lah produk yang dihasilkan kurang m em adai.
Komponen lain yang menentukan proses
amplifikasi sekuens DNA adalah dNTP dan
MgCh. Keempat macam dNTP yang digunakan
pada tahap PCR harus mempunyai jum lah yang
sebanding supaya tidak terjadi kesalahan
penernpelan dNTP pada DNA cetakan.
14
Magnesium (~g) merupakan komponen yang
berperan pentm g pada keseluruhan tahap PCR.
Oleh karena itu jum lah Mg yang tidak tepat akan
mengakibatkan timbulnya produk-produk non
s~ esifik . B agaim anapun juga, jumlah bahan yang
digunakan pada tahap PC R tidak mutlak, letapi
bergan~ung ~epad.a sifat dan kondisi gen yang
akan diam plifikasi. O leh karena itu , keseluruhan
kondisi PCR yang digunakan untuk
m cngam plifikasi suatu gcn harus dioptim asi.
Kloning
Gen hasil amplifikasi dengan PCR harus
dipurifikasi terlebih dahulu sebelum diklon. Hal
ini dilakukan untuk menghilangkan sisa-sisa
primer, prim er dim er, garam, enzim, da n
pengotor-pengotor lain yang dapat m engganggu
proses kloning. Purifikasi dilakukan densan'"m enggunakan kolom silika, Silika dim anfaatkan
karena dapat mcngadsorbsi DNA pada
konscntrasi garam yang tinggi, tidak
mengadsorbsi protein, RNA, dan oligonukleotida
y~ ng panjangnya < 50 pb, sehingga dapat
diperoleh D NA yang m urni.
K loning diawali dengan memasukkan gen
hasil amplifikasi ke dalam vektor pGEM®-T
(Iigasi), Ligasi dapat dilakukan secara langsung,
yaitu tidak perlu melalui pernotongan dengan
e nz im r es tr ik si tertentu karena setiap ujung 3'
gen hasil arnplifikasi dengan PCR rnemiliki
tambahan bas a adenin (A). Penambahan ini
dilakukan oleh enzim Taq D NA polim erase
secara autornatis. Sem entara itu vektor pG EM® -T
mem iliki keistimewaan yang penting, yaitu
mempunyai basa tim in (T) yang menggantung
(overhang), sehingga keduanya dapat sating
berkomplemen dan dilekatkan dengan enzim
ligase. Selanjutnya plasm id rekom binan tersebut
ditransformasikan ke dalam suatu sel E. coli
kom peten, C ara transform asi yang ditem puh pada
penelitian ini adalah m etode kejut panas. M etode
ini dipilih karen a mernbran sel Ecoli mudah
dibuka hanya dengan kejutan panas, Selain itu
metode ini juga sederhana, D engan metode kejut
panas ini, pori-pori sel E. coli akan m em buka
dalam waktu singkat dan siap untuk menerim a
plasm id rekornbinan yang akan masuk.
Keberhasilan tahap transformasi diperiksa
dengan cawan petri berisi m edium LB yang
mengandung ampisilin , IPTG, dan X -gal.
Ampisilin digunakan untuk menapis sel yang
m engandung plasm id dengan sel yang tidak
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 25/37
a.
15
b.
Gambar II. Cawan petri berisi medium LB yang mengandung ampisilin, IPTG, dan X-gal. Gambar a
menunjukkan kontrol negatif, sedangkan Gambar b menunjukkan sampei.
mengandung plasmid, sedangkan !PTG dan X-
gal digunakan untuk membedakan sel yang
mengandung plasmid rekornbinan dengan sel
yang mengandung plasmid kosong. Gambar 11
menunjukkan cawan petri kontrol negatif dan
cawan petri sampel. Masing-masing cawan petri
tersebut berisi medium LB yang mengandung
ampisilin, IPTG, dan X-gal. Semua koloni yang
tumbuh pada cawan petri, baik cawan petri
kontrol negatif, maupun cawan petri sampel
merupakan koloni yang mengandung plasmid
karena sel-sel yang tidak mengandung plasmid
tidak dapat menghasilkan suatu protein yangdapat merubah arnpisilin menjadi suatu senyawa
yang tidak berbahaya bagi E. coli. Gen penyandi
protein yang resisten terhadap ampisilin terdapat
di dalam plasmid. Secara sepintas dapat pula
diamati bahwa jumlah koloni pada cawan petri
kontrol negatif jauh lebih sedikit dibandingkan
dengan jumlah koloni pada cawan petri sampel.
lumlah koloni pada cawan petri kontrol negatif
adalah 9 buah, sedangkan jumlah koloni pada
cawan petri sampel adalah sekitar 150 buah.
Gambar lla menunjukkan cawan petri kontrol
negatif. Kontrol negatif memperoleh perlakuan
yang sarna dengan sampel hanya tidak diberi
insert. Pada cawan petri tersebut dapat diamati
bahwa selain jumlah koloninya sedikit, koloni
yang ada seluruhnya berwarna biru. Hal ini
menunjukkan bahwa tidak terjadi kontaminasi
pada kontrol negatif karena semua koloni sel
yang terbentuk hanya mangandung plasmid
kosong, Gambar lIb menunjukkan bahwa koloni
yang tumbuh pada cawan petri sampel berwarna
putih dan biru. lumlah koloni yang berwama biru
lebih sedikit daripada koloni yang berwarna putih
(30 : 70). Kenyataan ini menunjukkan bahwa
koloni sel yang berisi plasmid kosong jumlahnya
lebih sedikit daripada koloni sel yang berisi
plasmid rekombinan. Adapun sel pada umumnya
akan menerima plasmid yang berbentuk sirkular.
Plasmid yang tidak berligasi dengan insert, untuk
masuk ke dalam sel hams berswaligasi (self-
ligated vector). Swaligasi vektor pGEM®-T agak
sulit terjadi karena seperti yang sudah disebutkan
di atas, setiap ujung 3' vektor pGE~ -T terdapat
basa timin (T) yang menggantung. Untuk
berswaligasi, maka kedua basa T harus saling
berkomplemen. Komplemen ini tidak stabil,
tetapi mungkin terjadi, oleh karenanya koloni sel
yang mengandung plasmid kosong cenderung
lebih sedikit jumlahnya dibandingkan dengan
koloni sel yang mengandung plasmid
rekombinan.
Dari ratusan koloni yang berwarna putih,
dipilih sepuluh buah koloni untuk diperiksa
ukuran insert-nya dengan teknik peR. Gambar
12 menunjukkan bahwa sembilan koloni
memiliki ukuran insert yang sesuai (1.047 pb),
sedangkan satu koloni memiliki ukuran yang
salah (sekitar 500 bp). Produk peR yang
diperoleh tidak berukuran 797 pb karena peR
dilakukan dengan menggunakan sepasang primer
(MI3) yang terletak pada vektor pGEM®-T.
Kedua primer ini berjarak sekitar 125 pb dari
daerah insert, sehingga ukuran produk peR yang
diperoleh merupakan penjumlahan ukuran insert
dengan jumlah nukleotida dari kedua daerah
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 26/37
prim er ke daerah insert. Adanya sebuah koloni
yang berukuran salah menunjukkan bahwa
ternyata pada suhu annealing 56°e masih
terbentuk produk non spesifik y an g b eru ku ra n
M 2 3
16
sekitar 250 pb. Produk non spesifik tersebut tidak
terekam dengan kamera UV karena
k on se ntra sin ya sa ng at ren dah « 50 ng).
4 5 107 8 9
1 .3 53 p b
1 .0 78 p b
872 pb
603 p h
1 .0 47 p b
5 00 p b
Sekuensing
Garnbar 12 . Hasil peR sepuluh kalani (Memarker, 1 -1 0 = nomo r k olo ni).
Dari sernbilan buah koloni yang menunjukkan
ukuran insert yang tepat, dipilih dua buah koloni
untuk disekuensing. Koloni yang dipilih adalah
koloni 5 dan koloni 8. P lasm id dari m asing-m asing
koloni diisolasi dengan prosedur lisis basa
termodifikasi. Selanjutnya dipurifikasi untuk
menghilangkan sisa-sisa bahan yang digunakan
dalam isolasi plasm id karen a bahan-bahan tersebut
akan rnenimbulkan gangguan pada tahap
pernisahan fragm en-fragm en D NA .
peR sekuensing dilakukan dengan beberapa
prim er, yaitu SP6, T7 , IF-2, dan IR-2. SP6 dan T7
tersusun dari o ligonukleotida yang terletak pada
vektor pGEM®-T (terletak di luar insert).
Pemakaian kedua primer ini bertujuan untuk
m elih at ap ak ah insert b en ar-b en ar te rlig asi d en ga n
vektor pGEM ®-T, yaitu dengan membaca sekuens
sambungan antara vektor dengan ujung-ujung
insert. Gambar 13 menunjukkan sebagian
elek troferogram hasil sekuensing dengan prim er
T7 . Pada gam bar tersebut ditunjukkan bahwa insert
teriigasi dengan vektor pG EM ®-T. U jung T (tim in)
dari vektor langsung disambung oleh insert. T7
dim anfaatkan untuk m erunut sekuens insert dari
depan, sedangkan SP6 dimanfaatkan untuk
m erunut sekuens insert dari belakang. Keadaan
sebaliknya dapat terjadi apabila insert terligasi
dengan vektor dalam posisi terbalik. Perunutan
sekuens insert perlu dilakukan dengan
rnenggunakan kedua prim er ini karena kem am puan
mesin Automatic DNA Sequencer Abi Prism 377
untuk rnerunut sekuens suatu gen untuk satu reaksi
(sebuah primer) terbatas. M esin tersebut hanya
dapat merunut sekuens suatu gen sampai sekitar
400-500 pb. Seharusnya penggunaan SP6 dan T7
dapat d igunakan untuk membaca keseluruhan
sekuens insert, tetapi ternyata ban yak basa di
b ag ia n te ng ah insert yan g tid ak dapat terbaca, Oleh
karen a itu d imanfaaikanlah prim er IF-2 dan IR-2.
Prim er IF-2 dan IR-2 merupakan prim er yang
digunakan untuk m engam plifikasi insert, oleh
karenanya kedua prim er terscbut terletak di ujung-
ujung insert. Perunutan sekuens insert
menggunakan kedua primer ini sangat baik.
(Lampiran 4). Bagian yang tidak dapat terbaca
h an ya b ag ian u ju ng -u ju ng insert. Den ga n d er nik ia n
k es elu ru han se ku en s insert dapat dibaca karena
p eru nu ta n s ek uen s insert dengan prim er SP6, TI,
IF -2, dan IR -2 saling m eJengk api.
Gambar 13. Daerah pertemuan antara vektor
pGEM-T dengan salah satu ujung
insert (ditunjukkan oleh landa'" ).
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 27/37
Sekuens kedua koloni tersebut ternyata sarna
persis dengan standar gen IFNO:2 yang terdapat
dalam Genliank dengan kode akses Yl1834
(Lampi ran 5). Hal ini menunjukkan bahwa benar
gen yang diisolasi merupakan gen 1FNu2 manusia.Sekuens keseluruhan gen has il is ol as i dan urutan
asarn amino yang disandi oleh gen 1FNu2 disajikan
pada Lampiran 6 dan 7. Lebih spesifik lagi,
ternyata gen yang dipero1eh merupakan sub varian
b dari IFNo:2. Ini dibuktikan oleh ciri khas gen
IFNO:2 b yang muncul pada gen sam pel, yaitu
adanya basa guanin (G) pada posisi ke-137 dan
basa adenin (A) pada posisi ke-170 (Kaluz et al.,
1994). Kenyataan ini tidak mengherankan karena
IFNO:2 b merupakan subvarian yang paling
dorninan (Lee et aI., 1995). Perbandingan sekuens
sampel dengan IFNuz a, IFNO:2 b, dan IFNO:2 c
disajikan pada Gambar 14. Sekuens gen 1FNu2 a,IFNo:z b, dan IFNo:z c diperoleh dari Genllank
masing-masing dengan kode akses S64979,
S64994, dan S64991.
137 171
'f 'fSampel gagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatg
IFNA 2b gagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatg
IFNA 2a gaaaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatg
IFNA 2c gagaatctctcmtctcctgcttgaaggacagacgtg
Gambar 14. Perbandingan sekuens sampel dengan
sekuens standar IFNo:z a, IFNO:2 b, danIFNo:2c.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Gen yang diisolasi dari DNA genom rnanusia
dengan teknik PCR menggunakan primer IF-2 dan
IR-2 merupakan gen 1FNu2. Konfirmasi diperoleh
dari \1asil sekuensing menggunakan empat buah
primer, yaitu primer SP6, T7, IF-2, dan IR-2. Hasil
sekuensing dikonfirmasi (alignment) denganstandar gen IFNo:z yang terdapat dalam Genllank:
dengan kode akses Y1834. Selanjutnya untuk
mengetahui subvarian IFNuz dari gen tersebut,
maka dilakukan alignment dengan ketiga macam
standar sekuens subvarian IFNO:2 yang ada dalam
GenBank dengan kode akses S64979, S64994, dan
S64991. Hasilnya menunjukkan bahwa gen hasil
isolasi merupakan subvarian b dari IFNo:z. Gen
17
1FNa2 tersebut telah berhasil diklon ke dalam
vektor pGEM®-T.
Teknik PCR yang digunakan pada peneiitian ini
merupakan teknik yang efektif karena dapat
digunakan pada berbagai tahap penelitian, yaitupada tahap amplifikasi sampel, isolasi gen dari
DNA genom, konfirmasi ukuran insert, dan pada
tahap sekuensing, 01eh sebab itu pernanfaatan
teknik PCR pada penelitian irn sangat
menguntungkan.
Saran
Penelitian pendahuluan ini sebaiknya dilanjutkan
dengan ekspresi gen Hu-IFNu2 supaya dapat
dihasilkan protein IFNO:2 yang berrnanfaat sebagai
obat antitumor dan antivirus.
DAFTAR PUSTAKA
Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K.
Roberts & J. D. Watson. 1994. Molecular
Biology of the Cell. Ed. kc-3. Garland
Publishing, New York.
Agarwala, S. S. & J. M. Kirkwood. 1995.
Potential uses of interferon alpha 2 as adjuvan
therapy in cancer. Ann. Surg. Oneal. 2:365-371.
Borden, E. C. 1998. Gene regulation and clinical
roles for interferons in neoplastic disease. TheOncologist 3: 198-203.
Boynton, J. E., N. W. Gillham, E. H. Harris, J.
P. Hosler, A. M. Johnson, A. R. Jones, B. L.
Randolph-Anderson, D. Robertson, T. M.
Klein & K. B. Shark. 1988. Chloroplast
transformation in Chlamydomonas with high
velocity microprojectiles. Science 240: 1534-
1538.
Brown, T. A. 1995. Gene Cloning An
lntroduction. Ed. ke-3. Chapman & Hall,
Madras.
Calvin, N. M. & P.e. Hanawalt. 1988. High
efficiency transformation of bacterial cell by
electroporation. J. Bacteriol. 170:2796-280 l.
Cotler, S. J., D. R. Ganger, S. Kaur, H.
Rosenblate, S. Jakate, D. G. Sulivan, K. W.
Ng, D. R. Gretch & D. M. Jensen. 2001. Daily
interferon therapy for hepatitis C virus infection
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 28/37
in liver transplant recipients. Transplantation
71:261-266.
Daniell, H., J. Vivekananda, B. L. Nielsen, G. N.
Ye, K. K. Tewari & J. C. Sanford. 1990.
Transient foreign gene expression inchloroplast of culture tobacco cells after
biolistic delivery of chloroplast vector. Proc.
Nat!. Acad. Sci. USA 87:88-92.
Dijkmans, R. & A. Billian. 1985. An introduction
to the genes of the interferon system, him. 1-
18. Di dalam 1. Taylor-Papadimitriou
(Penyunting). Interferons Their impact in
Biology and Medicine: an introduction to the
genes of the interferon system. Oxford
University Press, Oxford.
Gray, P. W. D. W. Leung, T. J. Dull, M. Gross,R. M. Lawn, R. McCandliss, P. H. Seeburg,
A. Ullrich, E. Yelverton & P. W. Gray.
1981. Expession of human immune interferon
cDNA in E. coli and monkey cells. Nature
295:503-507.
Gewert, D. R., N. A. Sharp, K. A. Barber, H.
Cooper, D. Tucker, A. P. Lewis, M. Thurs
& J. S. Crowe. 1995. Detection of rare alelic
variants of the interferon-alpha 2 gene in
human genomic DNA. J. interferon Cytokine
Res. 15:403-406.
Gutterman, J. U. 1994. Cytokine therapeutics:
lesson from interferon a. Proc. Natl. A cad.
Sci. USA 91:1198-1205.
Hammer, R. E., V. G. Pursel, C. E. Rexroad, R.
J. Wall, D. J. Bolt, K. M. Elbert, R. D.
Palmiter & R. L. Brinster, 1985. Production
of transgenic rabbits, sheep, and pigs by
microinjection. Nature 315:680-683.
Innis, M. A. & D. H. Gelfand, 1990. Optimization
of PCR, him. 3-12. Di dalam M. A. Innis, D. H.
Gelfand, I. I. Sninsky, & T. I. White(Penyunting). PCR Protocols A Guide to
Methods and Applications. Academic Press,
San Diego.
Kaluz, S., P. Kabat, A. Gibadulinova, J.Vojtassak, N. Fuchsberger & P. Kontsek.
1994. Interferon alpha 2b is the predominant
18
subvariant detected in human genomic DNAs.
Acta Virol. 38:\01-104.
Kirkwood, J. M., M. H. Strawderman &M. S.
Ernstoff. 1996. Interferon alpha-2b adjuvant
therapy of high-risk resected cutaneousmelanoma. 1. Clin. OIlCOI. 14:7-17.
Lawyer, F. C., S. Stoffel, R. K. Saiki, K.
Myambo, K. Drummond & D. H. Gelfand.
1989. Isolation, Characterization and
Expression in Echericia coli of the DNA
polymerase gene from Thermus aquaticus. 1.
BioI. Chem. 264:6427-6437.
Lee, N., D. Ni, R. Brissette, M. Chou, M.
Hussain, D. S. Gill, M. J. Liao & D. Testa.
1995. Interferon-alpha 2 variants in human
genome. J. Interferon Cytokine Res. 15:341-349.
Lawn, R. M.; M. Gross, C. M. Houck, A. E.Franke, P. V. Gray & D. V. Goeddcl. 1981.
DNA sequence of a major human leukocyte
interferon gene. Proc. Nat!. A cad. Sci. USA
78:5435-5439.
MandeUi, F., G. Avvisati & S. Amadori. 1990.
Maintenance treatment with recombinant
interferon alpha 2b in patients with myeloma
responding to conventional induction
chemotherapy. N . Engl. 1. Med. 322: 1430-1434.
Maxam, A. M. & W. Gilbert. 1977. A new
method for sequencing DNA. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74:560-564.
Millar, B. C., J. B. Bell & R. L. Powles. 1996.
Lymphocyte recovery and clinical response in
multiple myeloma patients receiving interferon
alpha 2 beta after injtensive therapy. Br. J.
Cancer 73:236-240.
Moore, D. 1998. Current Protocol in MolecularBiology: manipulation of DNA. John Wiley &
Sons. Canada.
Sattayasai, N. 1990. Immunological studies of
human interferons a: antibodies with
predetermined specificity. Tesis. Department
of Biochemistry, Monash University,
Australia.
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 29/37
19
Saiki, R. K. 1989. PCR Technology Principles &
Appplications for DNA Amplification: the
design and optimization of the PCR. Stockton
Press, London.
Saiki, R. K, D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J.Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis
& H. A. Erlich. 1988. Primer directed
enzymatic amplification of DNA with a
thermostable DNA polymerase. Science
239:487-494.
Sarnbrook, J., E. F. Fritsch & T. Maniatis. [989.
Molecular Cloning A Laboratory Manual. Ed.
Kc-2 . Cold Spring Harbor Laboratory Press,
USA.
Sanger, F., S. Nicklen & A. R. Coulson. 1977.DNA sequencing with chain-terminating
inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-
5467.
Sanger, F & A. R. Coulson. 1978. The use of thin
acrylamide gels for DNA sequencing. FEBS
Lett. 87: 107-110.
Solal-Celigny, P. E. Lepage & N. Brousse. 1993.
Recombinant interferon alpha-2b combined
with a regimen containing doxorubicin in
patient with advanced follicular lymphoma. N.
Engl. J. Med. 329:1608-[614.
Stites, D. P., A. I. Terr & T. G. Parslow. 1994.
Basic and Clinical Immunology. Ed. ke-8.
Appleton & Lange, Norwalk.
Talpaz, M., H. Kantarijan, R. Kurzrock, J. M.
Trujillo & J. U. Gutterman. 1991.
Interferon-alpha produces sustained
cytogenetic responses in chronic mylogenous
leukimia. Ann. Intern. Med. 144:532-538.
Voet, D. & J. G. Voet, 1994. Biochemistry. Ed.
ke-Z, John Wiley & Sons. New York.
Watson, J. D., M. Gilman, J. Wilkowski & M.
Zoller. 1992. Recombinant DNA. Ed. ke-2.
Scientific American Books, New York.
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 30/37
LAMPlRAN
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 31/37
I:: ero ro
!oo !oj}e e
e e :. E .s' 0 : ; . v : ; E EI:: C
]0
o.l o.l ~] ;:l 10. . ! < : . . . . . . . .
10 o.l "0 "0
'" '" · S · S: : ; A ::U U
til
'":1 .s., p., 0.. 0.e :::;
1 : : : 1 : : ::1 ro"0 "0 'U
' "B e ~ ~
. : : : J , : : : J
~ a : :e e0 :1 ro
. . . . . . !oj} tlJ} . . . . . . . . . .
0,,5 .5 ] ]:l
: : r : : : r : til
'" ;:l ;:l: : : ; e
: : : ; c c <!) <!) '0:; . v : ;
<!) o.l ::l ;:l 0 :1 rottl bll btl . . ! < : . . ! < : E Etl 10 10C , - 'V: ; til
'" " " '. . . .
: ; : : l '" <P <Pttl d p : : ; p : : ;!oJ }
"0 "0c c
~
U U 0 0
$
~p., p.,
~ ~
::00'-"
. . . . .<!)
8';::0
Cd, . . . .: ; : : l
. . ! < : N N ("<') ("<') '1" N
: : : > N N N N N N
M MMU M
M M < r ; u < r ;
u u 0 - c 0u
b0 u
~u <
b 0 - c 0< r ; 0 < U
f- <
U < 0 0 f- < E :5u E - < < r ;
8 ~u< u
~ 0< - c u < r ;u 0 t 3 u
S0 u u u
0 < <
E<
~u u < r;
f- < < < r;
U f- < U 0 0. . . . . u 0 < C b
0 0<!) U f- < 0 0 <
< C U u 0 0 u';:: U E - < < C < < < C0
E - < U E - <
~
U U'"c U U ~ u < Cv 0 b
<I' 0 U;:l
0 r - : ; U E -<. ! < :!l,l
i'rl i'rl i'rl i'rl i'rl InJ')
. . . .
.§. . . .0
d. . . . . . . . . . .
E N N 1.0J - . M
~. . . . . . . . . . . . . .
d
~ ~p., : : g : : gz . . . . . [J')
0z , . . . . ; N ('f) . . , ; v -i 0
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 32/37
21
Lampiran 2. Perhitungan kadar dan kemurnian DNA
A2so
"", Faktor Kadar DNA
pengenceran (ng/p.l)
Kemurnian DNA
(A26onn,! A2BOn",)
Sampel 0,084 0,048 200 840 1,75
I. Perhitungan kadar DNA sampel (ng/ill)
KadarDNA = A260nm X faktor pengenceran x 50 ng/ill
= 0,084 x 200 x 50 ng/il!
= 840 ng/u!
2. Kemurnian DNA sampel
Kemurnian = A260 nm /A2 s o nm
= 0,084/ 0,048
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 33/37
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 34/37
)
),.-.
~ . . . . .
Q)
- E)-, . . . .~q.. >.(c)<{
o 0
c < ) c < )
co c000
-[ij r- -0 0
< D a s (j)><{>
"<too
Ql
g JC D
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 35/37
24
Lampiran 5. Hasil konfirmasi sekuens sampel dengan standar Y11834 (Sequence
reference)
CLUSTAL W (1.8) multiple sequence alignment
SAMPEL
STANDAR
------------------CTTTNAATTCCCTTTG-AACATCNACATNGGCCTTGACCTT-
GGCTCACCCATTTCAACCAGTCTAGCAGCATCTGCAACATCTACAATGGCCTTGACCTTT
* * * * ** ****** *** ************
SAMPEL
STANDAR
GCTTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTGAT
GCTTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTGAT
************************************************************
SAMPEL
STANDAR
CTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGG
CTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGG
************************************************************
SAMPEL
STANDAR
AGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAG
AGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAG
************************************************************
SAMPEL
STANDAR
TTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAG
TTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAG
************************************************************
SAMPEL
STANDAR
ATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGAC
ATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGAC
************************************************************
SAMPEL
STANDAR
AAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGG
AAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGG
************************************************************
SAMPELSTANDAR
GTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTTCATTCTGGCTGTGAAGGAAATAGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGA-GGAAATA
************************************* ************** *******
SAMPEL
STANDAR
CTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGT
CTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGT
************************************************************
SAMPEL
STANDAR
TGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAG
TGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAG
************************************************************
SAMPEL
STANDAR
AAGTAAGGAATGAAAACTGGTTCAACATGGAAATGATTTTCATTGATTCGTATGCCAGCT
AAGTAAGGAATGAAAACTGGTTCAACATGGAAATGATTTTCATTGATTCGTATGCCAGCT
************************************************************
SAMPEL
STANDAR
CACCTTTTTATAATCTGCCATTTCAAAGACTCATGGTTCTGCTATGACCATGACACGATT
CACCTTTTTATGATCTGCCATTTCAAAGACTCATGTTTCTGCTATGACCATGACACGATT
*********** *********************** ************************
SAMPEL
STANDAR
TAAATCTTTTCAAATGGTTTTANGAGTATTAATCAACCATTGGATTCAGCTCTTAAGGCA
TAAATCTTTTCAAATGTTTTTAGGAGTATTAATCAAC-ATTGTATTCAGCTCTTAAGGCA
**************** ***** ************** **** *****************
SAMPEL
STANDAR
CTAGTCCC-----------
CTAGTCCCTTACAGAGGAC
********
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 36/37
L am piran 6. Sekuens keseluruhan IFN CX :1hasil isolasi
10 2030 40I I I.II I III I I IIIII II I I I I I II II " I I I I I. II I I
ggctcaccca tttcaaccag tctagcagca tctgcaacat 40
ctacaatggc cttgaccttt gctttactgg tggccctcct 80
ggtgctcagc tgcaagtcaa gctgctctgt gggctgtgat 120
ctgcctcaaa cccacagcct gggtagcagg aggaccttga 160
tgctcctggc acagatgagg ag aatc tctc tttt ctcct g 200
210 220 230 240
I I I" I I IaI I I I.II I I I I I I I I II II II 1111111111
c ttgaa ggac agac atgac t ttg gatt tcc ccagg aggag 240
tttggcaacc agttccaaaa ggctgaaacc atccctgtcc 280t ccatg agat gatc cagca g atct tcaat c tc ttca gcac 320
aaaggactca tctgctgctt gggatgagac cctcctagac 360
aaattctaca ctgaactcta ccagcagctg aatgacctgg 400
410 420 Lt30 Lt40
I I I.II I II I I I I.II I I.I I I I I III II I I I I I I II II I
aag cctgt gt gat acagg gg gtgggggtga cagagactcc 440
cctgatgaag gaggactcca ttctggctgt gaggaaatac 480
ttccaaagaa tcactctcta tctgaaagag aagaaataca 520
gcccttgtgc ctgggaggtt gtcagagcag aaatcatgag 560
atctttttct ttgtcaacaa acttgcaaga aagtttaaga 600
610 620 630 640
I I I I I I•I II I I IIII I I aI II II II I I II I I I I II I I I I
agta agga at g aaaac tggt tcaacatgga aatgattttc 640
attg attc gt a tgcca gctc acctttttat gatctgccat 680
t tcaa agact c atgtt tctg ctatgaccat gacacgattt 720
aaatcttttc aaatgttttt aggagtatta atcaacattg 760
t qttc agctc tt aagg cact agtcccttac agaggac, 797
25
5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 37/37
26
Lampiran 7. Urutan nukleotida gen Hu-IFNCt.2dan asam amino yang disandinya
MALTFALLVALLVLSCK SSC
1 atg gee ttg aee ttt get tta etg gtg gee ete etg gtg etc age tge aag tea age tge
SVGCDLPQ THSLGSRRTLML
61 tet gtg ggc tgt gat ctg ect caa aec cae age etg ggt age agg agg ace ttg atg etc
LAQMRRJSLFSCLKDR HDFG
121 etg gea eag atg agg aga ate tct ett tte tee tge ttg aag gac aga cat gae ttt gga
FPQE EFGNOFQ KAET P V L H
181 ttt eee eag gag gag ttt gge aae eag tte eaa aag get gaa ace ate eet gte ete eat
EM I Q Q IF N L F S TKO S S AA W 0
241 gag atg ate eag cag ate tte aat etc tte age aca aag gae tea tet get get tgg gat
ETLL 0 KFYTELYOOLNDLEA
301 gag aee ete eta gae aaa tte tac aet gaa cte tac eag eag ctg aat gae etg gaa gee
CV IOGVGVT ETPLMKE DSIL
361 tgt gtg ata eag ggg gtg ggg gtg aea gag aet eee etg atg aag gag gac tee att etg
AVRKYFORI TLYLKE KK YSP
421 get gtg agg aaa tae ttc caa aga ate act etc tat etg aaa gag aag aaa tac age cet
CAW EVV RAE 1M RSFSLST NL
481 tgt gee tgg gag gtt gte aga gea gaa ate atg aga tet ttt tet ttg tea aea aac ttg
Q ESLRSKE
541 eaa gaa agt tta aga agt aag gaa tga
Top Related