Ekspresi Gen

5/8/2018 Ekspresi Gen - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/ekspresi-gen-559abf8d46705 1/37

EKSPRESI HETEROLOGUS GEN INTERFERON ALFA 2

MANUSIA: ISOLASI, KLONING, DAN SEKUENSING

YEMIMA SURYANI

JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2 0 0 1



RINGKASAN

YEMIMA SURYANI. Ekspresi Heterologus Gen Interferon A lfa 2 Manusia: Isolasi, Kloning, da n

Sekuensing Gen Interferon A lfa Manusia (Heterologous Expression of Interferon Alpha 2 Gene:

Isolation, Cloning, and Sequencing). Dibimbing oleh SULlSTlYANI, I MADE ARTIKA, dan

HERAWATISUDOYO.

Interferon alfa 2 m an usia (H u-IF No :.2) merupakan zat antivirus dan antitumor yang Lelah diakui

penggunaannya untuk m engobati berbagai penyakit keganasan dan penyakit akibat virus. Penggunaannya

di Indonesia masih terbatas karena harga obar ini d i lu ar ja ng ka ua n kernampuan masyarakat. Penelitian in i

bertujuan mengisolasi gen Hu-IFNu2 yang pada akhirnya akan diekspresikan untuk tujuan produksi

p ro te in I FN o:.2 dalam skala industri,

Penelitian diawali dengan studi bioinformatika untuk menentukan urutan nukleotida gen Hu-IFNo:.2

dan daerah sekitarnya. Data yang diperoleh digunakan sebagai landasan dalam merancang sepasang

prim er yang digunakan untuk mengisolasi ge n tersebut dari DNA genom manusia dengan teknik peR

(Polymerase Chain Reaction). D ari p ro se s ini d ip ero leh fragmen DNA b eru ku ra n 797 ph y an g m er up ak an

kandidat gen H u-IFN o:.2• Fragmen DNA disisipkan ke dalam vektor pGEM®-T, dilanjutkan dengan

transformasi ke dalam sel E. coli. D ari sepuluh koloni transforrnan yang plasmidnya diisolasi da n ukuran

insert-ivy» diperiksa dengan teknik peR, ternyata sernbilan k olo ni m em ilik i ukuran insert yang sesuai(1.047 pb). U ru ta n n uk leo tid a kandidat gen Hu-IFNu2 tersebut diperiksa menggunakan Big Dye

Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI) serta dianalisis menggunakan Automatic DNA

Sequencer AB! Prism 377. Hasil a na lis is m enunju kk an bahwa bcnar gen yang diisolasi rnerupakan ge n

Hu-IFNo: .2• Gcn ini siap untuk disubklon ke dalam suatu vekror ckspresi untuk mcnghasilkan protein

1FNcx2.



THESHEPHeRD's PSALM

The Lord is my shepherd; I shall not want.

He maketh me to lie down in green pastures:

He leadeth me beside the still waters.

He restoreth my soul: he leadeth me in the paths of

righthousness for his name's sake.

Yea, though I walk through the valley of the shadow of death, I

will fear no evil:

For thou art with me; thy rod and thy staff they comfort me.

Thou preparest a table before me in the presence of mine

enemies: thou antoinest my head with oil; my cup runneth

over.

Surely goodness and mercy shall followme all the days of my

life: and I will dwell in the house of the Lord forever.\

Psalm 23



EKSPRESI HETEROLOGUS GEN INTERFERON ALFA 2

MANUSIA: ISOLASI, KLONING, DAN SEKUENSING

YEMIMA SURYANI

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk mernperoleh gelar

Sarjana Sainspada

Program Studi Kimia

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2001



Judul : E ksp resi H eterolog us G en Interfero n A lfa 2 M anu sia: Isolasi, K lon in g, d an

Sekuensing

: Y ern im a S ury an i

: 001497047Nama

NIM

Menyetujui ,

Ph.D. 11'.1 M ade Artika, M .Sc., Ph.D

Pernbimbing II

P ernbim bing III

Tanggal lulus: I 7 . A U G 2 0 0 1



RIWAYATHIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 16 April 1979 sebagai anak tunggal dari pasangan Adi

Suryono dan Jusijanti.

Pada tahun 1997 penulis lulus dari SMU Kristen I Jakarta dan pada tahun yang sama penulis masuk

IPB pada Fakultas MIPA Program Studi Kimia melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Pada

tahun 2000 penulis melaksanakan praktik lap~ngan di Badan Tennga Nuklir Nasional Pasar Jumat, Jakarta

dan pada tahun 2001 penulis melaksanakan penelitian di Lembaga Biologi Molekul Eijkman, Jakarta.

Selarna mengikuti perkuliahan penulis pernah menjadi asisten mata kuliah Kimia Dasar I pada tahun

ajaran 1999/2000, Kimia Dasar II pada tahun ajaran 1999/2000, dan Biokimia I pada tahun ajaran

200012001.



PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Bapa yang Maim Kasih atas segala karunia-Nya, sehingga

karya ilmiah ini bisa diselesaikan dengan baik. Penelitian ini yang berjudul Ekspresi Heterologus Gen

Interferon Alfa 2 Manusia: Isolasi, Kloning, dan Sekuensing Gen Inteferon Alfa 2 Manusia dilaksanakan

dad bulan Februari sampai Mei 2001 di Lembaga Biologi Molekul Eijkman, Jakarta. Penelitian lIll

seluruhnya didanai oleh Lembaga Biologi Molekul Eijkman.

Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang Lelah membantu penyelesaian karya ilmiah

ini, antara lain Prof. Sangkot Marzuki, M.D., Ph.D selaku Direktur Lembaga Eijkman yang telah

mengizinkan penulis rnelakukan penelitian, If. I Made Artika M.App.Sc., Ph.D, dr. Herawati Sudoyo,

M.S., Ph.D, dan drh, Sulistiyani, M.Sc., Ph.D selaku pembimbing yang banyak memberi saran dan

bimbingan yang berharga bagi penulis. Di samping itu ungkapan terima kasih ini juga diberikan kepada

Kak Anna, Kak Helena, Kristi, Puji, Oge, Dodi, Debby, Yadi, Iskandar, dan seluruh star LembagaEijkrnan alas bantuan dan sarannya, Selain itu penults juga mcngucapkan tcrima kasih kepada Eva, Eno,

Benny, dan sernua ternan angkatan 34 alas segala dukungan dan persahabatannya, Ungkapan terirna kasih

juga disampaikan kcpada papa, mama, dan Rahel untuk scgala doa, kasih, dan dukungannya,

Semoga karya ilmiah ini dapat bcrmanfaat,

Jakarta, Juli 200 I

Yemima Suryani



DAFTARISI

Halaman

DAFfAR TABEL........................................... ~ viii

DAFTAR GAMBAR......................................... VIII

DAFTAR LAMPIRAN.......................................................... \,111

PENDAHULUAN .

TINJAUAN PUSTAKA

Interferon ..

Struktur dan Keragaman Gen Interferon Manusia............................ 2

Interferon Alfa 2.............. .. .. 3

PolymeraseChainReactioll.......................................................................... 3

Kloning..................................................................................................... 4

Sekuensing................................... 6

BAHAN DAN METODE

Bahan 7

Peralatan 7

Garis Besar Kcgiatan..................................................................................... I)

Studi Bioinformatika............................................... 8

Isolasi DNA Genom......... 8

Pengukuran Kadar dan Kemurnian DNA.............................................. 9

PolymeraseChainReaction............................ 9

Deteksi Prod uk peR dengan Elektroforesis Gel Agarosa.. 9

Pemurnian Produk peR " ... . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Ligasi Produk peR dengan Vektor pGEM®-T....................................... 10

Transforrnasi ke daIam SeI E. coli........................................................... 10

SeJeksi dan Isolasi Plasmid Rekombinan.................................................. 10

Sekuensing Hasil Kloning.................................................................. II

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA Genom: Kadar dan Keruurnian DNA............................................... I 1

Amplifikasi Gen Interferon Alfa 2 Manusia........................................................ 12

Kloning.................................................................................................. 1 4

Sekuensing..... 16

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan............................. 17

Saran................................................. 17

DAFTAR PUSTAKA........................................................................ 17

LAMPI RAN . 20



DAFTAR TABEL

Halarnan

I. K lasifikasi interferon........ 2

2. Ciri-ciri urnum gen IFN manusia.......................... 2

DAFTAR GAMBAR

Halaman

I. Tahapan reaksi pada teknik Polymerase Chain ReactiOIl.......... 4

L Tahapan teknik kloning............................................................ 4

3. Konsrruksi plasmid pGEM®-T........................................................................ 5

4. Contoh pernisahun fragmcn-Iragmcn DNA clan sckuensnya...................................... 7

5. Diagram alir metode penelitian IFNA 2..................... 8

6. Program PCR untuk amplifikasi gcn IFNA 2....................................................... 9

7. Program PCR untuk konfirmasi ukuran insert plasmid rckombinan...................................... I !

8. Program peR untuk sekuensing...................................................................... I I

9. S tratcgi am plifikasi gen 1FNa2.................................................................... .... 12

1 0. H as il amp lifik as i DNA sam pel dengan prim er IF-2 dan IR -2 pada 3 suhu annealing ... . .. .. . 13

II. C aw an petri berisi medium LB yang mengandung ampisiIin, IPTG, dan X-gal . 15

12. Hasil PCR sepuluh koloni . 16

13. Daerah pertemuan antara vektor pGEM®-T dengan salah satu ujung insert . 16

14. Perbandingan sekuens sam pel dengan sekuens standar 1FNa2 , IFNo:.2b, dan IFNazc ..... 17

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

I. Daftarprimer yang digunakan................. 20

2. Perhitungan kadar dan kemurnian DNA......................................... 21

3. Perbandingan sebagian sekuens IFN~ dengan sebagian sekuens IFNa yang lain.,; 22

4. Elektroforegram hasil perunutan sekuens gcn IFNa2dengan primer IF-2...................... 23

5. H asil konfirrnasi sekuens sam pel dengan standar Y 11834......... 24



6. Sekuens keseluruhan IFNa2 hasil isolasi....... 25

7. Urutan nukleotida gen Hu-1FNa2dan asam amino yang disandinya............................ 26



PENDAHULUAN

Akhir-akhir ini sem akin banyak manusia yang

terserang penyakit tumor dan penyakit yang

diinduksi oleh virus. Daya tahan tubuh yang

lemah mengakibatkan tubuh mudah terserang

penyakit. T eknik pengobatan yang digunakan

secara luas saat ini belum m enunjukkan hasil

yang cukup memuaskan karena tingkat

kesembuhan penderita penyakit tersebut masih

relatif rendah, terutama untuk penyakit tumor

ganas (kanker),

Sejak dua dekade terakhir, para peneliti di

negara-negara maju mengembangkan suatu

teknik pengobatan menggunakan zat-zat irnun

(kekebalan) yang diproduksi oJeh tubuh manusia

secara alam i pada kondisi tertentu, Zat-zat imun

tersebut diharapkan akan rnengobati tepa! pada

sasaran da n sesedikit mun gk in m en im b ulk an efek

sarnping. Salah satu zat irnun yang telah banyak

dimanfaatkan di negara-negara maju adalah

interferon alfa 2 manusia (M illar et al., J 996;

AgarwaJa & Kirkwood, (995).

Interferon alfa 2 (IF Nu 2) m eru pak an salah

satu jcnis protein yang disintesis oleh sistem

kekebalan tubuh apabila tubuh terserang virus

dan tum or. Efek yang ditim bulkan oleh IFN O'.z ini

adalah penghambatan replikasi virus dan

penghancuran sel yang terserang virus atau

tumor. Hasil-hasil penelitian menunjukkan

bahwa IFNu2 efektif untuk rnereduksi tumor dan

mengobati berbagai m acarn jenis penyakit yangdiinduksi o le h v ir us .

1FNu2 telah diakui oleh U.S. Food and Drug

Administration sebagai salah satu obat antitumor

dan antivirus pada bulan Juni 1986 dan telah

banyak diproduksi oleh negara-negara maju

(Gut terman, 1994). Pengiriman dan pemasaran

IFNu2 dari luar negeri ke Indonesia memerlukan

biaya yang sangat m ahal, Jalan keluar yang dapat

ditempuh untuk mengatasi rnasalah tersebut

adalab swasembada , IFNu2 di Indonesia.

Swasembada 1FNu2 di' Indonesia selama ini

belum diusahakan karen a terdapat beberapa

kendala utama, antara lain adalah keterbatasan

teknologi, sumber daya manusia, dan biaya,

Teknologi DNA rekornbinasi y an g d ip erlu ka n

untuk produksi IFNu2 baru dimanfaatkan di

Indonesia dalam beberapa tahun terakhir,

sehingga sumber daya manusia Indonesia yang

menggeluti bidang ini masih terbatas. Selain itu

biaya yang diperlukan juga cukup mahal.

Akibatnya sampai saat ini IFNO '.z belum

dimanfaatkan secara luas di Indonesia, padahal

kebutuhan akan 1FNu2 sernakin meningkat

seiring dengan meningkatnya jum lah penderita

penyakit tum or dan penyakit yang diinduksi oleh

VIruS.

Penelitian ini rnerupakan tahap awal dari

serangkaian peneiitian tentang IFNcxz yang

bertujuan untuk rnemproduksi 1FNu2 dengan

teknik DNA rekombinasi melalui ekspresi gen

1FNu2 dalam suatu vektor ekspresi, Adapun

tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi

gen IFNu2 dan menyimpannya dalam vektor

pGEM;!i )-T. Tahapan penelitian yang dilakukan

secara garis besar melipuri isolasi DNA genom

rnanusia dari darah vena, amplifikasi gen IFNo:z

dari DNA genom manusia dengan teknik peR

(Polymerase Chain Reaction), kloning gen

tersebut, da n konfirrnasi sekuensnya dcngan

teknik sekucnsing.

Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini

adalah tersedianya gen 1FNu2 dalam vektor

pGEM6'-T yang siap untuk dipindahkan

(disubklon) ke dalam suatu vektor ekspresi.

Keberhasilan procluksi 1FN uz akan m endukung

terciptanya swasembada obat antivirus dan

antitumor di Indonesia. Selanjutnya 1F Nu2 hasil

ekspresi dapat dimanfaatkan secara luas untuk

mengobati penyakit tumor dan penyakit akibat

virus. Dcngan dem ikian diharapkan jum lah

penderita penyakit tumor dan penyakit yang

disebabkan oleh virus di Indonesia akan

berkurang.

TINJAUAN PUSTAKA

Interferon

Interferon (lFN) dipublikasikan pertam a kali

oleh Isaacs dan Lindenmann pada tahun 1957

da n dinamai oleh mereka berdasarkan

kemampuan senyawa tersebut untuk mengganggu

replikasi dari berbagai macarn : virus. Pada

dasarnya IFN merupakan sekelompok protein

dan glikoprotein yang diproduksi olehselmamalia dalam rangka merespon sejumlah

penginduksi (Sattayasai, 1990). M ereka berfungsi

untuk menghambat replikasi virus yang masuk ke

dalam sel, menghambat proliferasi sel-sel

vertebrata, dan mengatur respon kekebalan

(Stites et al., 1994). K etiga fungsi ini berkaitan

erat satu sama lain karena dalam rnenjalankan

tugasnya, IFN tidak langsung menyerang virus



yang rnenginfeksi sel-sel tubuh, melainkan

menyerang sel inang yang terinfeksi virus

sedernikian rupa, sehingga sel-sel tersebut tidak

dapat lagi ditempati oleh virus tersebut. SeIain

e fe k a nt iv ir us , IFN juga memiliki efek antitumor.

Sel-sel tumor lebih sensitif terhadap IFN

dibandingkan dengan sel-sel normal karena

kemungkinan besar IFN merupakan tumor

supressor yang potensial. H al ini m encerrninkan

kemampuan IFN untuk mengatur ekspresi gen-

gen yang spesifik dan aktivitas metaboIik pacta

sel-sel sasaran. Tipe-tipe IFN yang dapat

menginduksi efek antivirus dan antitumor pad a

sel-sel vertebrata disajikan pada Tabel I.

Terdapat tiga jenis lFN , yairu IFNo:., IFN~, dan

IFNy. IFNa. dan IFN~ sifatnya m irip, yaitu tahan

terhadap kondisi asarn dan keduanya

menggunakan reseptor yang sama, sehingga

digolongkan sebagai IFN t ipe, I, sedangkan IFNy

berbeda dengan kedua tipc IFN yang lain karena

tidak tahan terhadap kondisi as am dan

menggunakan rcscptor yang bcrhcda, schinggu

digolongkan ke dalam IFN tipc II.

Tabel I. K lasifikasi interferon (IFN)

Tire P enginduk si S el yang m em produ ksi

IFN

C I. Virus L eu ko si t ( kemun gk in an

K om po ne n m u kr of ng )

Llmfoblnstoid

p Virus Se l p ad a j ar in g an p ad at

y Stimulus S el T (dibantu o le h ma kr of u g)

anligenik

Su rnb er .D ij kman s & Silli!IU, 1985

Antara tahun 1979 da n 1982, sekucns DNA

manusia yang menyandi kode genetik untuk

pernbentukan IFNo:., IFNP, dan IFNy diperoleh

dengan teknik kloning, Akibatnya penggolongan

pada Tabel 1 yang awalnya hanya didasarkan

pada kriteria serologis, kernudian dinyatakan

keabsahannya oleh data asam nukleat penyusun

masing-rnasing tipe IFN. Teknik kloning tersebut

dilakukan dengan cam rnemasukkan gen IFN ke

dalam plasmid E. coli, sehingga gen IFN tersebut

dapat diekspresikan di dalam E. coli. Beberapagen IFN juga dimasukkan ke dalam vektor yang

memungkinkan ekspresi gen tersebut di dalam sel

rnamalia atau di dalam sel ragi (Gray et al.,

1982).

2

Struktur dan Keragaman Gen InterferonManusla

Gen IFN dari beberapa spesies hewan

(manusia, tikus, dan sapi) Lelah diklon dan

dianalisis, tetapi hanya gen IFN manusia yang

paling banyak diketahui saat ini. Beberapa

karakteristik gen IFN manusia (Hu-IFN) dan

protein yang dihasilknnnya disajikan pada Tabcl

2.

TabeI 2. Ciri-ciri umum gen IFN manusia

Panjung Panjang

Tipe Jumluh 1 1 1 1 1 " 0 1 1 mature peptida Leuik

IFN Gell Protein Sinyal

(au) (aa)

CI > 13 o 165 .166 D Krouuisom

\)

~ 0 16 6 21 Kromusosu

<)

'Y 3 14 6 20 Kromusum

12

S umbc r: D ijk ma ns & BilliutI, IlJl i :' i

Pada genom manusia terdapat paling scdikit

13 gcn IFNa. dan 6 pseudogcn dengan homologi

se ku en s n uk le otid an ya 85-95% (Lawn et al.,

198 I). Enam buah pseudogen tersebut kadang-

kadang tidak digolongkan ke dalam gen IFNa,

letapi digolongkan ke dalam kelornpok tersendiri

yang disebut sebagai IFNw, IFNro sering

dikaitkan dengan IFNa. atau disebut pseudogen

karena susunannya m enyerupai IFNa dan

diproduksi oleh Ieukosit (Stites et al., 1994), Gen

IFNo:. berkelorupok dalam kromosorn 9 dan tidak

memiliki intron (Dijkrnans & Billiau, I985).

Produk gen ini adalah polipeptida dengan 188

atau 189 asarn amino dengan 23 asam amino

pertarnanya merupakan peptida sinyaJ yang

bersifat hidrofobik. Peptida sinyal ini akan

dilepaskan pada saat protein ini ditransportasikan

keluar sci rnenghasilkan INFiX yang terdiri dari

165 atau 166 asam amino. ,

Sampai saat ini hanya satu gen IFN~ manusia

yang diternukan, S arna seperti gen IFNa., gen ini

juga tidak memiliki intron dan terletak dalarnkromosorn 9. Homologi gen IFN~ dengan gen

IFNa. hanya sekitar 45 %, tetapi struktur um um

gen IFN~ mirip dengan IFNa. Gen ini mcnyandi

187 asam amino dengan 21 asarn am ino

pertam anya m erupakan peptida sinyal,

Gen IFNy hanya merniliki sedikit kerniripan

dengan gen IFNo:. dan IFN~. Gen IFNy terletak

pada kromosom 12 dan merniliki 3 intron dalam



dacrah penyandi pro tein. Gen ini m enyandi

p ro te in d en ga n 166 asam am ino dengan 20 asam

am ino pertam anya m erupakan peptida sinyal.

Interferon A lfa 2

IFNa2 rnerupakan produk salah satu gen

IFNu. 1FNu2 merupakan protein yang terdiri

dari 189 asam am ino dengan 23 asam amino

pertamanya merupakan peptida sinyal, Hasil

penelitian menunjukkan bahwa 1FNa2 im

berperan dalam pengobatan beberapa penyakit,

an tara lain myeloma (M andelli, 1990), chronic

myeloid leukimia (Talpaz et al., 1991), Kaposi's

sarcoma (Borden, 1998), follicular lymphoma

(Solal-Ccligny et al., 1993), terapi penderita

hepatitis C (Colier et al., 20 0 I), da n

penyembuhan pasien setelah o pe rasi m elan om a

(Kirkwood et al., 1996).

M enurut K aluz et al. (1994), 1FN u2 tcrd iri

alas tiga buah subvarian , yaitu 1FNu2 a, 1FNa2 b,

dan 1FNa2 e. Sekuens ketiga subvarian tersebut

san gal m irip. Perbedaan sekuens ketiganya

terletak pada nukleotida ke-137 dan nukleotida

ke-17 0. Basa nitogen dari nukleotida ke-137 pada

IFNu2 a diisi oleh adenin (A ), sedangkan pada

IFNu2 b dan 1FNa2 e diisi oleh guanin (G). Basa

nitrogen dari nukleotida ke-17 0 pad a 1FNa2 a

dan 1FNa2 b diisi oleh adenin (A ), sedangkan

pad a 1FNa2 e diisi oleh guanin (0).

Hasil penelitian yang dilakukan oleh Lee et

at. (1995) menggunakan sampeJ darah dari28.000 manusia sehat m enunjukkan bahwa gen

1FNa2 b merupakan sub v arian yang paling

banyak terdapat pada DNA genom sarnpel

tersebut, 1FNu2 e diternui pada sejum lah keeil

sarnpel « 0, I%), sedangkan IFNu2 a tidak

ditem ui pada populasi in i. Gewert et al. (1995)

meneliti subvarian 1FNa2 dari DNA genom

manusia A frika dan Afro-Caribian . Hasil

penelitian tersebut m endukung hasil penelitian

Kaluz et al. (1994) dan Lee et at . (1 99 5), y aitu

bahwa IFNaz mengandung tiga buah subvarian

(IFNu2 a, 1FNa2 b, dan 1FNu2 c) dan IFNu2 b

merupakan subvarian yang paling banyak

ditemui.

Polymerase Chain Reaction

Teknik Polymerase Chai/l Reaction (PCR)

merupakan salah satu teknik utama yang

digunakan pada penelitian ini. Teknik yang

menciptakan terobosan baru di bidang genetika

3

ini m erupakan su atu leknik arn plifik asi seju rnlah

kecil sekuens DNA ill vitro secara sensitif dan

spesifik, Teknik ini diternukan oleh Kary B.

Mullis p ada tah un 198 3 . P en g guna an teknik PCR

in i dalam bidang b io lo gi rno lek uler sernakin

meluas. Penyebabnya adalah kesederhanaan

tek nik tersebut dan ting ginya ting kat kesu ksesan

amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh (Saiki,

1989).

Secara ringkas, teknik PCR dilakukan dengan

cam mencampurkan sampel DNA dengan prim er

olig onukleotida, deoksiribonukieo tida trifosfat

(dNTP), dan enzim terrno stab il Taq DNA

polirnerase dalam larutan bufer yang sesuai,

kemudian menaikkan da n rnenurunkan suhu

cam pu ran secara b erulang selarna beberapa jam

sampa i d ip ero le h ju mlah sekuens DNA yang

diinginkan. S atu sik lu s pa d a tek nik PCR terdiri

d ari tig a tahap, yaitu den aturasi, annealing, da n

ckstcnsi. D cnaturasi dilakukan pada suhu 90-

95°C , sehingga tcrjadi pcm isahan utas ganda

DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang

merupakan cctakan (template) tempat

penempelan prim er dan tempat kerja DNA

polim erase, Selanjutnya subu rcaksi diturunkan

untuk penernpelan primer oligonukleotida pada

sekuens yang komplementer pada molekul DNA

cetakan. Tahap ini d isebut annealing, Suhu

annealing untuk setiap sekuens DNA sifatnya

spesifik dan mcrupakan penentu utama

keberhasilan suatu reaksi PCR. Tahap terakhir

dari satu siklus PCR adalah tahap ekstensi yang

dilakukan pada suhu 7 2°C. Suhu ini m erupakan

suhu optimum untuk kerja enzim Taq DNA

polimerase. Pada tahap ekstensi terjadi sintesis

DNA yang komplernen dengan DNA cetakan.

Ketiga tahap tersebut dilakukan berulang kali

dalam mesin PCR, pada umumnya antara 25

sampai 40 siklus, bergantung kepada jum lah

DNA yang diinginkan. Pada dasarnya reaksi PCR

mengambil pnnsip replikasi DNA, yaitu

pernbukaan rantai D NA utas ganda, penernpelan

prim er, dan perpanjangan rantai DNA bam oleh

DNA polimerase dari arah 5' ke 3'. Hanya saja

pada teknik PCR, tidak rnenggunakan enzim

ligase dan primer RNA (W atson et al., 1992).

Tahap-tahap pada teknik PCR disajikan pada

Gambar !.

Pada awal d itemukannya teknik PCR , DNA

polimerase yang digunakan berasal dari E. coli.

DNA polim erase ini bersifat sangat sensitif

terhadap panas dan rusak pada suhu denaturasi

utas ganda DNA. O leh karena itu enzim tersebut



harus ditambahkan secara manual untuk setiap

sik lus. Hal Ill! berpeluang m engak ibatkan

terjadinya kesalahan apabila beberapa sampel

diam plifikasi seeara sim ultan. Penggunaan DN A

polimerase E.coli kem ud ian digantik an oleh

DNA polimerase yang dim urnikan dari bakteriterrnofilik Thermus aquaticus (Taq). DNA

polim erase tersebut dapat tetap aktif sam pai suhu

95°C (Saiki et al., 1988). Oleh karena kerja Taq

DNA polirnerase tidak dipengaruhi oleh suhu

denaturasi utas ganda DNA, maka ia tidak perlu

ditambahkan pada setiap siklus. M odifikasi in i

mengakibatkan p en ye de rh an aa n p ro se du r karena

pelaksanaan peR dapat dilakukan secara

autornatis. Selain itu spesifisiras, hasil,

sensitivitas, dan panjang sekuens DNA target

yang akan d iam plifikasi ju ga m eningkat,

Primer oligonukleotida yang digunakan

dalam teknik peR hams memenuhi beberapa

syarat, antara la in m em ilik i susunan basa yang

acak , sehingga tidak terjadi polipurin atau

polipirim idin, m em iliki jurnlah purin dan

pirirnidin yang seim bang, mem ilik i titik leleh

yang hampir mendekati satu sama lain, dan

sedikit rnungkin rnerniliki susunan basa yang

komplementer (Saiki, 1989). Pada umumnya

panjang prim er yang digunakan berkisar antara

20 sarnpai 30 basa.

~

~Annealing

Gambar I. Tahapan reaksi pada teknik

Polymerase Chain Reaction

(peR).

4

Kloning

Klon adalah sekumpulan organisme identik

yang berasal dari satu sum ber (A lberts et al.,

1994). Teknik kloning merupakan bagian

terpenting dari teknologi DNA rekornbinasi(Sambrook et al., 1989). Teknik in i meliputi tiga

tahap, yaitu ligasi, transforrnasi, dan seleksi

(Gambar 2). Ligasi adalah pemasukan sekuens

DNA yang diinginkan ke dalam suatu vektor,

transforrnasi adalah pemasukan DNA

rekombinan ke dalam suatu sel kornpeten,

sedangkan seleksi adalah pernilihan sel-sel yang

m engandung D NA rekombinan.

3'~' DNAinsert

~A3'

Klon

G am bar 2. Tahapan teknik kloning.

Ligasi

Ligasi adalah pemasukan sekuens DNA yang

mengandung gen diinginkan ke dalam DNA

genom dari suatu elernen gcnetik yang dapat

bereplikasi sendiri (vektor), yaitu p lasm id ,

bakteriofag, dan yeast artificial chromosomes

(Voet & Voet, 1994). L igasi menghasilkanproduk yang disebut dengan DNA rekombinan,

K loning yang dilakukan pada penelitian in i

menggunakan vektor berupa plasm id. P lasm id

adalah DNA utas ganda sirkular yang berukuran

dari I sampai 25 0 kb dan m em ilik i paling sedikit

satu ori (origin of replication). Adanya ori

m engakibatkan plasm id dapat bereplikasi sendiri

d i dalam sel inangnya dan tidak bergantung pada



kromosom utama sel inang tersebut. Plasmid ini

pada umumnya mengandung satu atau lebih gen

yang menyandi ketahanan (resistensi) terhadap

antibiotika, sehingga sel inang yang mengandung

plasmid dapat bertahan dalam lingkungan yang

mengandung antibiotika tertentu, misalnyaampisilin, tetrasiklin, dan kloramfenikol. Plasmid

yang lazim digunakan dalam teknik kloning

adalah plasmid yang berukuran kurang dari 10 kb

dan terdapat dalam jumlah yang cukup banyak di

dalam satu sel inang (Brown, 1995).

Ligasi menggunakan plasmid alami pada

umumnya dilakukan dengan memo tong plasmid

dan DNA yang akan disisipkan (insert) dengan

enzim restriksi yang sarna, misalnya EcoRI,

kernudian menggabungkan DNA insert dan

plasmid dengan enzim ligase. Pada penelitian ini

vektor yang digunakan berupa plasmid sintetik

yang bernama pGEM®-T. Plasmid ini berukuran

3000 pb dan konstruksinya dapat dilihat pada

Gambar 3. Vektor pGEM®-T memiliki dua buah

ori, gcn ketahanan terhadap ampisilin (Amp'),

basa timin (T) yang menggantung (overhang) di

tengah-tengah gen laeZ, dan beberapa situs

pemotongan enzim restriksi, Penggunaan

pOEM®-T lebih menguntungkan dibandingkan

dengan plasmid yang lain karena plasmid ini

bentuknya sirkular terbuka, sehingga tidak perlu

dipotong dengan enzim restriksi, Pada masing-

masing ujung plasmid yang terbuka terdapat basa

timin (T) yang menggantung (overhang). Kedua

basa ini dimanfaatkan untuk berkomplemendengan ujung-ujung sekuens DNA hasil PCR

yang selalu memiliki sebuah basa adenin (A)

yang menggantung (overhang). Selanjutnya

plasmid dan DNA insert dilekatkan dengan

enzim ligase.

Oambar 3. Konstruksi vektor pOEM-T.

5

Transformasi

Plasmid rekombinan yang dihasilkan dari

hasil ligasi selanjutnya dimasukkan ke dalarn sel

kompeten (sel yang telah memperoleh perlakuan

kimiawi atau perlakuan fisik tertentu yang

meningkatkan kemampuan sel tersebut untuk

mengambil DNA). Proses ini disebut

transformasi.

Transforrnasi produk ligasi ke dalam sci

kompeten dapat dilakukan dengan cam

mencampurkan sci kompeten dengan plasmid

DNA dalam larutan kalsium klorida, lalu

dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42()C

selama 45 detik. Cara lain untuk transformasi

dilakukan dengan metode elektroporasi, yaitu

transfer DNA melalui Iubang semen tara pada

membran sel yang diinduksi oleh pulsa elektrik

pendek (Calvin & Hanawalt, 1988). Boynton et

al. (1988) & Daniell et al. (1990) rnengemukakan

cara transforrnasi rnenggunakan penembakan sel

target dengan mikroproyektil berkecepatan

tinggi. Mikroproyektil tersebut pada umumnya

terbuat dari logarn tungsten atau emas yang

diselubungi oleh produk ligasi dan ditembakkan

dari penembak partikel. Teknik ini dikenal

dengan teknik biolistik dan saat ini telah banyak

diterapkan untuk transformasi produk ligasi ke

dalam berbagai jenis sel, Metode mikroinjeksi

yang dilakukan dengan menginjeksikan molekul

DNA langsung ke dalarn nukleus sci target

menggunakan jarum yang sangat runcing

dikemukakan oleh Hammer et al. (1985) sebagai

salah satu met ode transforrnasi yang dapat

dilakukan terhadap sel hewan. Metode

transformasi yang digunakan pada penelitian ini

adalah metode kejut pa~as (heat shocks.

Seleksi

Tahap terakhir pada teknik kloning adalah

seleksi sel-sel yang mengandung plasmid

rekombinan, Seleksi 10 1 pada umumnya

dilakukan dengan menggunakan media LB yang

mengandung antibiotika, Sel-sel yang tidak

mengandung plasmid tidak akan dapat

berkembang biak pada media Lls-antibiotika,

sedangkan sel-sel yang mengandung plasmid

dapat berkernbang biak dengan baik pada media

tersebut. Antibiotika yang ditambahkan ke dalam

media LB bergantung pada jenis plasmid yang

digunakan. Pada umumnya plasmid yang

digunakan mengandung gen yang menyandi

ketahanan terhadap ampisilin, sehingga media

yang digunakan adalah media LB-ampisilin.

Seleksi dengan rnenggunakan media LB-



ampisilin dapat m embedakan sel-sel yang

mengandung plasm id dengan sel-sel yang tidak

m en ga nd un g p la sm id .

Masalah yang timbul kemudian adalah

memisahkan sel yang mengandung plasmid

rekombinan dengan sci yang mengandung

plasm id tanpa insert, yaitu plasm id yang

mengalami swaligasi (self-ligated vector),

sehingga berbentuk sirku!ar yang dapat pula

masuk ke dalam sel kornpeten. Penye!esaian

masalah ini dapat dilakukan dengan seleksi

plasm id menggunakan aruibiorika kedua atau

rnengggunakan blue-white screening. Metode

yang dipilih bergantung pada jenis plasm id yang

digunakan. Metode seleksi d en ga n an tib io tik a

kcdua diterapkan pada plasm id yang memiliki

m inim al 2 gen yang menyandi ketahanan

L crhadap antibiotika, P ad a m etode seleksi dengan

antiblotika kedua, sel yang tidak m engandung

plasm id rekom binan akan tetap bertum buh, tetapi

sel yang mengandung plasm id rekombinan akan

mati. Untuk seleksi menggunakan blue white

screening, maka digunakan media yang

m en ga nd un g X -g al { 5- br om o- 4-k lo ro -3 -in do lil-

~ -D -galaktopiranosida}, suatu molekul yang

mirip dengan galaktosa dan IPTG (isopropil-

tiogalaktosida) yang merupakan inducer enzim

~-galaktosidase. Apabila sel yang mengandung

plasm id tanpa insert dtumbuhkan pada media

tersebut, rnaka gen laeZ akan terekspresikan da n

enzim ~-ga lak to s ida se akan d ih as ilk an . E nz im in iakan memeeah X -gal dan m enghasilkan senyawa

yang berwarna biru. Apabila sel yang

mengandung plasm id rekombinan ditumbuhkan

pada m edia tersebut, maka gen laeZ tidak akan

diekspresikan da n enzim ~ -galaktosidase tidak

terbentuk. O leh sebab itu, dapat diarnbil

kesimpulan bahwa seleksi menggunakan blue

white screening akan mernberikan warn a biru

untuk sel yang tidak mengandung plasm id

rekombinan dan warna putih untuk sel yang

mengandung plasm id rekornbinan (Brown,

I95).

Sekucnsing

Penentuan sekuens DNA atau RNA yang

menyandi pembentukan protein dan RNA dikenal

dengan teknik sekuensing. Dua buah metode

sekuensing DNA dikembangkan pada tahun

I70-an, yaitu metode Maxam-G ilbert dan

metode Sanger. M etode M axam-G ilbert

didasarkan alas destruksi bas a seeara kim iaw i,

6

sedangkan metode Sanger didasarkan alas

pengham batan sintesis nukleotida akibat adanya

persaingan antara dN TP dengan ddN TP.

Pad a metode Maxam-Gilbert, DNA yang

akan disekuensing ditandai dengan J2p, kemudian

DNA tersebut didenaturasi dan dibagi ke dalam

cmpat tabung reaksi. Masing-masing tabung

direaksikan dengan bahan-bahan yang secara

spesifik melernahkan ikatan antara satu atau dua

dari empat basa yarig terdapat di dalam DNA.

Selanjutnya d itarn bah ka n p ip eridin yang akan

mernutus rantai DNA pada ternpat basa yang

dilernahkan ikatannya tersebut, Hal ini akan

mcnghasilkan sekumpulan fragmen berland a

radioaktif yang panjangnya tergantung pada jarak

aniara Ietak basa yang dihilangkan dengan ujung

molekul yang bcrtand a radioaktif (M axam &

Gilbert, J 97 7 ). Sekuens DNA dapat dibaca dari

has il p er ni sa han fragmen-fragmen yang terbentuk

p ad a g el p o lia kr ilam id a.

Pada metode Sanger, DNA yang akan

disekuensing dibagi ke dalam empat tabung.

M asing-masing tabung berisi prim er bertanda

radioaktif', dNTP, satu jenis ddNTP, dan enzim

DNA polimerase, DNA utas ganda m ula-m ula

didenaturasi menjadi dua buah utas tunggal,

kemudian salah satu utas lunggal D NA ditempeli

prim er yang bertanda radioaktif, dan selanjutnya

oleh kerja enzim DNA polim erase, prim er

diperpanjang dengan dNTP atau ddNTP yang

tersedia. Penempelan ddNTP pada DNA cetakan

sama efisiennya dengan penempelan dNTP pada

DNA cetakan tersebut, Penempelan ddNTP pada

DNA eetakan mengakibatkan penghentian

sintesis utas yang komplementer dengan DNA

cetakan, Hal ini disebabkan karena ddNTP

kehilangan gugus hidroksil pada atom karbon

nornor 3 dari komponen gulanya. Gugus

hidroksil 1 1 1 1 diperlukan untuk penempelan

nukleotida berikutnya untuk pernanjangan utas

komplcmenter. Akibatnya akan dihasilkan

berbagai fragmen bertanda radioaktif yang

berbeda-beda panjangnya (Sanger, 197 7 ).

Pem isahan fragm en-fragm en tersebut dilakukan

dengan gel poliakrilamida (Sanger & Coulson,

1978).

M etode sekuensing yang banyak dilakukan

saat ini adalah m etode Sanger yang dirnodifikasi

untuk m em perbaiki sensitiv itas dan efektivitas

analisisnya, Modifikasinya terletak pada

penggunaan ddNTP yang bertanda zat fluoresen.

Reaksi setiap basa dengan zat warna fluoresen

tersebut akan memberikan sinyal fluoresensi

yang berbeda, sehingga keempat basa terse but



dapat dibedakan. Oleh karena itu, dengan metode

ini, sctiap sampel hanya perlu direaksikan satu

kali (tidak perlu dilakukan pernisahan antara basa

yang saru dengan yang lainnya) dan hasilnya

dapal dipisahkan dengan baik oleh gel

poliakrilamida, Contoh hasil pemisahan fragrnen-[ragmen DNA dengan gel poliakrilamida dan

pernbacaan sekuensnya disajikan pada Gambar 4.

Gel:

. . . G G C G A A T G C G T C C A C A A C G C T A C A G G T G. . . T G C G A A T G C G l C C A C A A C G C T A C A G G T

"6 G C G A A l G C G T C C A C A A C G C T A C A G G

" ' 6 G C G A A T 6 C G T C C A C A A C G C T A C A G

. . . . A G C G A A T G C G T C C A C A A C G C T A C A. . . , .C G C G A A T G C G T C C A C A A C G C T A C. . . . . A G C G A A T G C G T C C A C A A C G C T A

-.T G C G A A T G C G T C C A C A A C G C T. . . . . C G C G A A T G C G T C C A C A A C G C. . . G G C G A A T G C G T C C A C A A C G

. . . .C G C G A A T G C G T C C A C A A C

. . . . 1 1 G C G R A T G C G T C C A C A I I

G I I I I I I l I I I > I I G C G R A T G C 6 T C C A C I I

-C G C G A A T G C G T C C A C

< I I I I i I I I I I I > n G C G A A T G C G T C C n

... C G C G A A T G C G T C C

-C G C G A R T G C G T C. . . . . T G C G A A T G C G T

-G G C G A A T G C G

.... C Q C G A A T G C. . . G G C G A A l G. . . . T G C G A A T

Gambar 4. Contoh hasil pemisahan fragmen-

fragmen DNA dan sekuensnya.

BAHAN DAN METODE

Bahan

Bahan yang digunakan untuk isolasi DNA

adalah sampel darah vena manusia, larutan

pelisis sel darah merah, Iarutan pelisis sel darah

putih, RNase 5 mg/ml, ammonium asetat 5 M,

isopropanol, etanol 70 %, dan buffer TE (Tris-

HellO mM pH 8,0, EDTA I mM), sedangkan

bahan yang digunakan untuk PCR adalah bufer

PCR (KCI 500 mM, Tris-HCI 100 mM pH 8,4),MgCh 50 mM, dNTP 10 mM, Taq DNA

polimerase 5 unit/p.l, akuabides steril, dan

sepasang primer 40 pmol, Elektroforesis gel

agarosa dilakukan untuk memeriksa hasil PCR.

Adapun bahan yang digunakan untuk

elektroforesis gel agarosa tersebut adalah agarosa

tipe II (Sigma), standar DNA q,X174 DNA/Hae

III, loading buffer (bromfenol biru 0,25%,

sukrosa 40% (w/v)), larutan TBE (Tris-borat 0,09

7

M, EDTA 0,002 M pH 8,0), dan etidium

bromida.

Teknik kloning dilakukan dalarn tiga tahap.

Bahan yang digunakan untuk tahap ligasi adalah

vektor pGEM®-T, enzim ligase, dan bufer,

sedangkan bahan yang digunakan untuk tahaptransforrnasi dan tahap seleksi adalah sel Ecoli

kompeten DH5a, medium Luria Bertani (LB)

cair steril yang terdiri dari bacto tripton, bacto

yeast extract, NaCl, akuabides steril, dan LB

padat yang tersusun dari bahan yang sama seperti

LB cair hanya terdapat penambahan bacto agar,

ampisilin (100 1l1/IllI), IPTG, dan X-gaL

Bahan yang digunakan untuk isolasi plasmid

adalah Larutan I (Tris-HCl pH 7,5, 10 mM

EDTA, 15% sukrosa), Larutan II (0,2 M NaOH,

1% SDS), Lannan III (3 M Na asetat pH 4,6

dalam asam asctat glasial), Iarutan fcnol-

kloroforrn (I: 1), etanol absolut, etanol 70%,bufcr TE, dan RNase. K on firrn asi ha sil kloning

dilakukan dengan teknik PCR, sehingga bahan

yang digunakan sam a scperti bahan PCR umum

hanya primer yang digunakan berbeda, yaitu

primer M 13-1' dan M 13-r.

Bahan yang digunakan untuk sekuensing

adalah p er an gk at p cm urn ia n QIAquick (Qiagen),

etan o] ab solu t, Tris-HC! 10 mM pH 8,5, gel

agarosa 1%, primer T7, SP6, IF-2, dan IR-2,

ready mix (AmpIiTaq, dNTP, dan ddNTP yang

telah diberi senyawa fluoresens), natrium asetat,

loading buffer (50 mg/ml blue dekstran dalam

larutan EDT A 25 mM yang rnengandungdimetilforrnamida dengan nisbah 1:5), TBE,

akrilamida 40%, TEMED (N,N,N'N'-

tetrametilenetilendiamina) dan APS (amonium

persulfat) 10%.

Peralatan

Peralatan yang digunakan untuk PCR adalah

thermocycler peR (GeneAmp® PCR System

9700 Perkin Elmer) dan tabung PCR 50 Ill,

sedangkan untuk elektroforesis gel agarosa

adalah perangkat elektroforesis (Bio Rad),

microwave (Nasional), dan kamera UV (Bio Rad

Gel Doc 1000). Spektrofotometer (Ultraspsec IIl-

Pharmacia) digunakan untuk mengukur kadar

dan kemurnian DNA, sedangkan kolom

QlAquick (Qiagen) digunakan untuk pemurnian

produk PCR dan plasmid basil isolasi. Untuk

sekuensing digunakan Automatic DNA Sequencer

ABlPrism 377 (Perkin EImer). Peralatan lain

yang digunakan adalah tabung mikrofuge



(eppendorf), tabung falcon, pipet m ikro

(eppendorf), sentrifuse (eppendorf ripe 5403,

Sorvall" MC J2V, dan tipe 54l5C berpendingin,

Du Pont), incubator shaker (N ew B runsw ick

Scientific), pornpa vakum (BioRad), penangas air

(Forma Scientific), inkubator (Thermolyne),speed vac (S helb y), da n v ortex (Thermolyne),

Garis Besar Kegiatan

Pcnelitian in i diawali dengan studi

bioinforrnatika yang bertujuan untuk m em peroleh

sekuens DNA manusia yang rnengkode IFNa.2.

Hasil studi bioinform atika tersebut digunakan

untuk mensintesis sepasang primer yang

diperlukan untuk rnengisolasi sekuens IFNa.?

dari DNA genom dengan teknik PCR. DNA

genom diisolasi dari darah vena manusia dcngan

metode Bohringer Maneheim, DNA hasil isolasi

i ni d igunakan sebagai DNA cetakan untuk PCR.

Selanjutnya produk PCR dipisahkan dengan

elektroforesis gel agarosa, A pabila hasil analisis

in i menunjukkan fragrnen D NA diinginkan (yang

menyandi gen IFNa(2), maka DNA in i kemudian

dimurnikan dari komponen-komponen reaksi

PCR dengan menggunakan perangkat QIAquick.

H asil pem urnian disisipkan ke dalam vektor

pGEM®- T melalui reaksi ligasi, sehingga

menghasilkan plasm id rekombinan yang

selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel

bakteri E. coli DH5a. dengan mctode kejut panas

(heat shackedi. S el-se l te rtra nsfo rm asi till

kemudian ditumbuhkan pada media agar LB

y an g m en gan du ng ampisilin, IPTG , dan X -gal

selama semalam . Plasm id DNA rekombinan hasil

kloning diseleksi, lalu diisolasi dengan reknik

m iniprep. U kuran insert dalam plasm id hasil

isolasi dikonfirmasi kembali m enggunakan PCR .

Selanjutnya dua buah plasm id hasil iso la si y an g

m cnunjukkan ukuran insert y an g tep at d ian alisis

dengan teknik sekuensing agar diketahui urutan

nukleotidanya. Secara keseluruhan metode

penelitian disajikan pada G am bar 5.

Studi Bioinformatika

Studi bioinform atika yang dilakukan pada

awa! penelitian bertujuan untuk rnernperoleh

sekuens DNA yang mengkode IFNo:2< Studi ini

dilakukan melalui penelusuran di internet pada

situs Gene Bank National Center for

Biotechnology Information (NCB I) dengan

alarnat www ncbi.nlm .nih.gov. Hasil studi ini

8

digunakan untuk sintesis sepasang prim er untuk

amplifikasi sekuens gcn IFNo:z dengan teknik

PCR.

Iso la si D NA

Seleksi

Isolasi p la sm id r ek omb in an

Gambar 5. Diagram alir metode penelitian

IFNa.z·

Isolasi DNA Genom

DNA genom diisolasi dari darah vena. Darah

vena sebanyak 5 lU I dim asukkan ke dalam tabung

.,falcon 50 m l yang berisi IS m l la ru ta n p elisis sel

darah m erah I x, kem udian diinkubasi selam a 10

menit pada suhu kamar sambil diaduk beberapa

kali. Tabung berisi sampel selanjutnya

disentrifugasi pad a 1.500 rpm selama 1 0 m en it.

Langkah !Ill diulang 2-3 kali sampai

supernatannya jernih. Supernatannya dibuang

da n peletnya diberi 1.250 I.d larutan pelisis sel

darah putih lx, lalu dikocok dengan pipet transfer

sampai larutannya homogen. Sebanyak 5 III

RNAse (5 mg/m l) ditambahkan ke dalam tabung,

lalu diaduk beberapa kali, Inkubasi pada suhu



3i'c dilakukan selama 15 m enit pada penangas

air. U ntuk m engendapkan protein dilakukan

penambahan 833 Jll amonium asetat 5 M ke

dalam tabung, kem udian tabung di-vortcx sarnpai

larutan yang terbentuk terlihat seperti susu.

Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 3.000

rpm , 4°C selama 15 menit, Supcrnatannya

dituang ke tabung baru yang berisi 3850 111

isopropanol dan dikocok sampai DNA-nya

terlihat. Tabung disentrifugasi lagi pada

kecepatan 3000 rpm , 4°C selama 5 menit.

Supernatannya dibuang dan DN A dibilas dengan

4,165 I II e tanol 70 %, I alu d ike ringkan pad a suhu

kamar sclama [ jam . Setelah kering, DNA

d ilaru tk an d alam bufer TE dan diinkubasi pada

suhu 37 °C selama dua jam . DNA hasil isolasi ini

disimpan pada suhu -20 °C .

Pcngukuran Kadar dan Kemurnian DNA

DNA yang diperoleh diukur kadar da n

kernurniannya bcrdasarkan m ctodc Sam brook et

al. (1989). K adar larutan DNA diukur dengan

spektrofotomcter pada panjang gelombang 26 0

nm . Kemurnian larutan DNA dihitung dengan

mernbandingkan absorbanss pada panjang

gelombang 260 nm dengan absorbanss pada

panjang gelornbang 280 nm .

Polymera se Chain R ea cti on (peR)

Gen 1FNu2 dikeluarkan dari DNA genom

rnanusia dengan teknik Polymerase Chain

Reaction (PCR). Perbanyakan fragrnen DNA

yang mengkode gen 1FNu2 secara in vitro

dilakukan dengan m enggunakan pasangan prim er

oligonukleotida sintetik yang m em batasi daerah

di luar gen tersebut, M etode yang digunakan

untuk teknik PCR ini adalah metode Saiki et al.

(1988). Pasangan prim er yang digunakan adalah

IF-2 dan IR-2 (Lampi ran 1). Komposisi bahan

yang diperlukan untuk 50 )11 volum e reaksi dalam

tabung PCR adalah 2 )11 sam pel D NA ,S III buffer

PC R lax, 1 ,5 ) 11M gCl2 50 mM , 1 )11 dNTP lOmM , 0,5 JlI prim er IF-l 40 pmol, 0 ,5 )11 primer

IR-l 40 pmol, dan 0 ,5 III Taq DNA p olim erase

dalam akuabides steri!. Pembuatan campuran

reaksi ini semuanya dilakukan dalam keadaan

dingin,

Satu siklus PCR terdiri dari tiga tahapan,

y ai tu d en at ur as i, annealing, dan ekstensi. Tahap

denaturasi dilakukan selama 1 menit pada suhu

94°C , tahap annealing dilakukan selama I menit

9

pada suhu 54-56°C , dan lahar ekstensi dilakukan

selama I menit pada 72°C . Pradenaturasi

dilakukan selama 5 menit, sedangkan pada siklus

te ra kh ir d ilak uk an pemanjangan waktu ekstensi

selama [0 rnenit (G ambar 6). Jum lah siklus yang

digunakan untuk mengarnplifikasi ge n 1FNa2

adalah 30 siklus, Dalam hal ini dilakukan

o ptirn asi su hu annealing agar dihasilkan produk

y an g o ptim um.

I

I

94°C I 94°C

5:00: 1:00II

I

I

I

I

I

54-56°C

I ; O ( }

Garnbar 6. Program PCR untuk amplifikasi gen

1FNa2.

Deteksi Produk PCR dengan Elektroforesis

Gel Agarosa

Prod uk PCR diperiksa dengan tcknik

clektroforesis gel agarosa. Gel agarosa dibuat

dengan cara melarutkan 0 ,25 g agarosa dalam 25

1111bufer TBE rnc la lu i p emanasan dengan oven

microwave, lalu sebanyak 2,5 Jll etidium bromida

ditarnbahkan ke dalam larutan ge l agarosa

tersebut. Selanjutnya Iarutan gel dituang ke

dalam wadah cetakan gel horizontal dengan

sejumlah sumur tcmpat aplikasi sampel,kemudian gel dibiarkan membeku selama

setengah jam atau lebih. Setelah beku, ge l

dimasukkan ke dalam perangkat elektroforesis

yang berisi larutan bufer TBE I x . Sebanyak [0

)11 sampel DNA dicampur dengan 2 )11 loading

bufer, kemudian dimasukkan ke dalam sumur-

surnur tem pat aplikasi sam pel. E lektroforesis

dijalankan pada tegangan 80 V selama 48 rnenit.

Untuk rnembandingkan hasil yang diperoleh

digunakan standar DNA ~X174 DNA/Hac III.

V isualisasi pita DNA dilakukan dengan lampu

UV pada panjang gelombang 300 nm . Hasil

visualisasi kemudian direkam denganm enggunakan kam era UV .

Pemurnian Produk peR

Pemurnian produk PCR dilakukan untuk

m enghilangkan sisa-sisa prim er dan pereaksi lain

pada proses PCR. Pemurnian dilakukan dengan

menggunakan perangkat QlAquick PCR

purification. Prod uk PC R dilarutkan dalam bufer



PB sebanyak 5x voJumenya dan dikocok, lalu

dimasukkan ke dalam kolom spin QIAquick da n

disentrifugasi selam a satu m en it p ad a k ec ep ata n

J 2.000 rpm , sehingga supernatannya terpisah ke

bawah dan dibuang. SeJanjutnya ke dalam kolom

ditambahkan 0,75 ml bufer PE , lalu kolomdisentrifugasi kembali pada kecepatan 12.000

rpm selarna satu menit. Supernatannya dibuang

dan kolorn disentrifugasi kem bali pada kecepatan

14.000 rpm selama satu menit.· Kolom

dipindahkan ke dalam tabung eppendorf

m ikrofuge 1,5 m l, lalu ke dalam kolom

ditarnbahkan 20 III bufer EB . Senlrifugasi

dilakukan selarna I m enit pada kccepatan 14.000

rpm , sehingga produk PCR yang telah

d irn urn ikan d ip ero leh pada tabung eppendorf

mikrofuge.

Ligasi Produk peR dengan Vcktor pGEM®-T

Ligasi produk PCR dilakukan menurut

m etode Sam brook et al. (1989) dengan cara

mencampurkan 7 III produk PCR dengan I III

bu fer ligase lOx, I III vektor pGEM®-T, I III

DNA ligase T4, dan 1 III akuabides steriI daJam

tabung eppendorf, Campuran reaksi tersebut

kemudian diinkubasi sernalam pada suhu 4°C

(rnesin PC R). Sebagai pem banding, digunakan

kontrol negatif yang diperlakukan sama seperti

sampel, kecuali tanpa penambahan prod uk PCR

(insert).

Transformasi Se l E. Coli

Pernasukan plasm id rekombinan ke dalam sel

kompeten dilakukan menurut metode Sam brook

et al. (1989). Sebanyak 5 III prod uk ligasi

dicampur dengan 50 III sci E. coli kompeten

(DH5a), dibiarkan dalam es selama 30 men it,

la lu d ik eju tp an as ka n (heat shocked) dalam

penangas air 42°C selama 45 detik . Setelah itu

disimpan dalam es selama 5 menit, dicampur

dengan 800 III media LB cair, lalu diinkubasi

selama I jam 45 menit dalam incubator shaker

pada suhu 37 °C pada keeepatan 200 rpm .

Suspensi sel dipekatkan dengan sentrifugasi pada

kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit dan ± 750

III supernatannya dibuang. Peletnya kcmudian

d isu sp en sikan d en ga n sisa su pe rn atan nya ,

Suspensi ini disebarkan ke media padat LB

yang mengandung arnpisilin , IPTG, dan X -gal

dalam cawan petri sampai rneresap, lalu

diinkubasi semalam pada suhu 37 °C untuk

10

menumbuhkan koloni sel-sel transform an.

Pemekatan dan penanaman suspensi sel pada

media ini dilakukan pada ko ndisi ste ril, yaitu

debt api. S etelah in ku basi, caw an petri ditutup

dengan parafilm dan disimpan dalam peudingin

(4 0Q. Langkah yang sama juga dilakukan un(ukkontrol negatif,

Seleksi dan Isolasi Plasmid Rekornbinan

P eng ujian y an g dilakukan untuk memperoleh

klon positif (yang rnengandung plasmid

rekombinan) diawali dengan mengambil 10

koloni yang dipilih secara acak, kemudian

m asing-m asing koloni ditum buhkan dalarn m edia

LB cair. SeIanjutnya D NA plasm id rekombinan

dari kultur diisolasi dengan prosedur lisis basa

yang tcrmodifikasi ( Sam b ro ok et al., 1983).

Sebanyak 1,5 IIII kultur bakteri yang Lelahdiinkubasi selama sernalam dalam media LB cair

disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama

3 menit . Supcrnatannya kcmudian dibuang dan

peletnya disuspcnsikan kernbali dalarn 10 0 III

Larutan I d an d iin ku ba si dalam es sclama 5

rncnit, Sel dipccahkan dengan mcnambahkan 200

!!l Larutan II, lulu diinkubasi lagi dalam es

selama 5 menit. Selanjulnya 150 III Larutan III

dirambahkan ke dalam carnpuran dan eam puran

diinkubasi lagi dalam cs selama 5 m enit. Setelah

disentrifugasi pada kccepatan 14.000 rpm pada

suhu 4°C selama 15 rnenit, supematan diekstraksi

dengan larutan fenol-kloroform (I: 1), lalu

disentrifugasi kembali pada kecepatan 14.000

rpm pada suhu 4°C selama 5 menit, Lapisan alas

dipindahkan ke dalarn tabung eppendorf baru.

Plasm id DNA diendapkan dengan penambahan 2

x volum e etanol absolut, dikocok dan didiam kan

pada suhu kamar selama 5 men i t, lalu

disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm , suhu

4°C selarna 10 m enit, Pelet yang diperoleh dicuci

dengan etanol 70 0 / 0 , k em ud ian dik ering kan

dengan speed vac dan disuspensikan kernbali

dalam 50 III buffer TE yang mengandung Rnase.

Larutan plasm id rekombinan selanjutnya

disim pan pada suhu "20°C .Plasm id hasil isolasi kernudian diperiksa

ukuran insert-eye dengan teknik PC R. K ornposisi

bahan dalam satu tabung PCR terdiri dari 21 III

dd H 20, 5 III bufer PCR lOx, 1,5 !!I M gCI2 50

mM , I ",-IdNTP 10 mM , 0,5 III prim er M I3-!, 40

pmol, 0 ,5 III prim er M 13-r 40 prnol, 20 III

plasm id hasil isolasi, dan 0 ,5 III enzirn Taq DNA

polim erase. Program peR yang digunakan untuk



konfirm asi ukuran insert p la sm id rek orn bin an

disajikan oleh G am bar 7 . Selanjutnya dipilih du a

klan plasm id rekombinan untuk digunakan pada

an al is is s eku en s in g .

Gambar 7 . Program PCR untuk konfirrnasi

ukuran insert p la sm i d r ek omb in an ,

Sekucnsing Hasil Kloning

Sekuensing dilakukan dalam em pat tahap,

yaitu purifikasi plasm id rekombinan, PCR

sckuensing, etanol presipitasi, dan pernisahan

fragm en-fragm en DN A dengan elektroforesis gel

poliakrilam ida (Sanger, 197 7). Purifikasi plasm id

rekombinan dilakukan dengan perangkat

QIAquick PCi: purification. P ro se du r p em u rn ia n

plasm id rekombinan sama seperti prosedur

pemurnian prod uk PCR, hanya saja pada tahap

awal, selain ditambahkan bufer PB , juga

ditambahkan larutan NaCI 5 M sebanyak 0 ,2 x

v olu me sa mpe l.

PCR sekuensing dilakukan dengan empat

macam reaksi. K eernpat reaksi tersebut

dibedakan dari jenis prim er yang digunakan.

Reaksi pertama m enggunakan prim er SP6, reaksi

yang kedua menggunakan primer T7 , reaksi

ketiga menggunakan primer IF-2, dan reaksi

keempat menggunakan primer IR-2. Campuran

reaksi untuk PCR sekuensing adalah I III larutan

plasm id rekombinan hasil purifikasi (dari klan

positif), I III prim er (SP6 untuk reaksi pertama

T7 untuk reaksi kedua, IF-2 untuk reaksi ketiga,

dan IR -2 untuk reaksi keempat) dengan

konsentrasi 2 pmol/ul, 3 III ready mix

(m en gan du ng Am pliT ag ™ dan dNTP yang telah

dilabel fluaresens), dan 5 J.11 akuabides.

Campuran tersebut diamplifikasi dengan 25siklus PCR. Denaturasi dilakukan pada suhu

96°C selama 10 detik , annealing dilakukan pada

suhu 50°C selam a 5 detik, dan ekstensi dilakukan

pada suhu 60°C selama 4 menit, Pada tahap awal

dilakukan pradenaturasi selam a 3 m enit. P rogram

PCR yang digunakan untuk sekuensing disajikan

pada Gambar 8.

H asil PC R dipresipitasi dengan etanol absolut

dan I J.11 natrium asetat 3 M pH 4,6 dengan

[ [

perbandingan 10:25: I, kem udian dihornogenkan

dengan vortex. Car npur an itu d id iamkan dalam es

selam a 5 m cnit, kem udian disentrifugasi dengan

kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4°C selama 20

menit. Supernatan dibuang dan peletnya dicuci

dengan 250 III etanol 70 % , kemudian

disentrifugasi pad a kecepatan 12.000 rpm pada

suhu 4()C selama [0 menit, Pelet dikeringkan

dengan speed vac selama 7 menit, DNA yang

diperoleh disirnpan pada suhu _20D e.I

I

I

I

I

60 DC I

4:001

3:00 l 0: 101

1

11

1

1

50 DC

0;05

00

G am bar 8. P rogram PC R untuk sekuensing.

Pernisahan fragm en-fragm en D NA dilakukan

dengan elektroforesis poliakrilam ida (PAGE)

(Sanger, 1978). Konsentrasi gel akrilam ida yang

digunakan adalah 4% . G el tersebut dibuat dengan

mencampurkan 18 g urea, 5 m l stok akrilarnida

40% , 0 ,5 g campuran resin , 25 rnl akuabides

steril. Campuran tersebut dilarutkan selama 10

menit dan disaring menggunakan filter 0 ,25

m ikron dan pornpa vakum selama 10 menit,

Selanjutnya ke dalam campuran tersebut

ditambahkan TBE dan akuabides sampai

volumenya 50 m!. Sebanyak 250 J.l1 APS [0%

dan 35 J.11 TEMED ditambahkan ke dalam

cam puran, lalu dengan segera cam puran tersebut

diinjeksikan ke dalarn pelat elektroforesis dengan

menggunakan syringe 50 ml dan dibiarkan

sampai membeku, Buffer yang digunakan

sebagai jernbatan kanduksi adalah TBE. Untuk

pem isahan dengan .elektroforesis akrilam ida,

DNA hasil presipitasi dilarutkan dalam 3 J!l

loading buffer, lalu dipanaskan pada suhu 90 C

selama 2 menit dan segera didinginkan dengan

es. Selanjutnya larutan tersebut dimasukkan ke

dalam sumur-sumur gel dan e1ektroforesis

dijalankan pada tegangan 1 kV , daya 50 W , suhu

51°C , dan daya laser 40 MW selama 7 jam .



HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA Genom: Kadar dan Kemurnian

DNA

Sebagai tahap awal isolasi DNA genom

manusia, dilakukan pem isahan an t ara sel-sel

darah putih dengan sel-sel darah merah karen a

DNA genom manusia hanya terdapat di dalam

nukleus sel darah putih, Pem isahan itu dilakukan

dengan penambahan Iaru ta n p elisis se l darah

merah yang diikuti dengan sentrifugasi. Sifat

larutan pelisis sel darah m erah adalah hipotonis.,

sehingga larutan tersebut akan m asuk ke dalarn

sel darah mcrah dan mengakibatkan scl terscbut

pecah, Sclanjutnya D NA genom d ik elu ark an d ari

sel darah putih dengan penambahan larutan

pelisis sci darah putih . Larutan pelisis sel darah

putih m cngandung dua kom poncn utarna perusak

struktur membran, yaitu EDTA dan SOS. EDTA

bcrfungsi untuk rnengkelat lcgam Mg yang

rnerupakan salah satu komponen p en tin g p en ja ga

stabilitas m em bran sel, scdangkan ekor nonpolar

SD S berfungsi untuk menarik fosfolipid yang

merupakan penyusun utama mernbran sel

(B row n, 1995).

DNA genom yang d ik elu ark an d ari dalarn se l

darah putih seIanjutnya dipisahkan dari pengotor.

Dua buah pengo tor utama DNA genom adalah

RNA dan protein . Dcgradasi R NA dilakukan

dcngan penambahan RNase, sedangkan protein

dipisahkan dengan pengendapan olch amonium

asetat. DNA kemudian diendapkan dengan

isopropanol. Pad a tahap akhir, untuk

m em isahkan D NA dari p en go to r-p en gotor m in or,

seperti gararn-garam dan m olekul-m olekul

organik keeil, maka D NA dicuci dengan ctanol

70% (M oore, (998).

DNA hasil isolasi diukur kadar dan

kemurniannya dengan spektrofotorneter pada

panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (Tabel

3). A bsorbans sam pel pa(ja panjang gelom bang

260 nm adalah 0,084. N ilai in i menunjukkan

jum lah DNA yang terdapat dalam larutan sampel,

sedangkan absorbans sampel pada panjang

gelombang 280 nm sebesar 0 ,048 menunjukkan

jum lah protein pengotor yang terdapat dalam

larutan tersebut. H asil pengukuran m enunjukkan

bahwa DNA hasil isolasi m em iliki kadar yang

eukup tinggi (>500 ng/pJ), yaitu 840 ng/)ll.

Sambrook et al. (1989) mengemukakan bahwa I

nilai absorbans sebanding dengan 50 ng/)ll DNA

utas ganda, 40 ng/)ll DNA utas tunggal, atau 20

12

ng/)ll oligonukleotida utas tunggal. Sam peJ yang

digunakan mcngandung DNA utas ganda,

sehingga kadar DNA sampel diperoleh dari hasil

perkalian antara absorbans pada panjang

gel o m bang 260 nm dengan faktor pengenceran

dan 50 ng/1l1 (L arn pira n 2 ). Kadar DNA dalamsampel diperlukan u ntu k rn em perk ira ka n jumla h

DNA yang digunakan sebagai DNA cetakan

dalam tahap peR . Apabila kadar DNA sampel

cukup tinggi, maka jum lah DNA cetakan yang

digunakan pada tahap pe R tidak perlu banyak,

Nilai kemurnian DNA hasil isolasi adalah

1,75. Nilai in i d ip ero lc h d ari p erb an din ga n antara

absorbans pada panjang gelombang 260 nm

dengan absorbans pada panjang gelombang 28 0

nm . DNA dikatakan murni apabila nilai

kernurniannya bcrkisar antara 1.8-2.0 dcngan

toleransi sebesar 0,05 (Sambrook et (II., 1 98 9).

Karena nilai kcmurnian DNA hasil isolasimendekati nilai idealnya, DNA ini dapat

langsung digunakan pada tahap pe R karena tidak

terlalu rnem pcngaruhi cfisiensi proses peR . N ilai

kernurnian yang rendah menunjukkan bahwa

DNA hasil isolasi lerselubungi oleh protein .

Akibatnya akan tcrjadi penurunan efisiensi

amplifikasi DNA pada tahap peR secara drastis.

Amplifikasi Gen Interferon Alfa 2 Manusia

Teknik peR diawali dengan penentuan

primer yang akan digunakan untuk

mengampliflkasi gcn diinginkan. G en 1FNa2

manusia merupakan salah satu subtipe dari gen

IFNa manusia, Seperti yang telah dikemukakan

sebelumnya, homologi gen Hu-IFNa sangat

tinggi, y aitu 8 5-9 5% (Larnpiran 3). Oleh karena

itu untuk mengamplifikasi gen tersebut

diperlukan sepasang prim er yang sangat spesifik

supaya gen yang teram plifikasi adalah gen 1FNa2

dan bukan subtipe IFNa yang lain . Prim er yang

digunakan untuk tahap amplifikasi ini adalah

prim er IF-2 dan IR-2. Penempelan sepasang

primer tersebut pada gen 1FNa2 manusia

ditunjukkan oleh Gambar 9.

1 . 0 .

Peptida

sinyal

Gen Hu-IFNO :2

G am bar 9. S trategi am plifikasi gen 1FN a2.



M N S M

13

N S M N S

a . b.

x

1 .3 53 p b1 .0 78 p b

872pb

603 p b

x

797 pb

c.

1 .3 53 p b

1.078 pb

S72pb603 p b

x

Gambar 10. Hasil amplifikasi DNA sarnpel dengan prim er IF-2 dan IR -2 pada 3 macam suhu

annealing. Garnbar a, b , dan c berturu t-turut mcnunjukkan hasil amplifikasi pada suhu

annealing 54°C , 55°C , dan 56°C (x mcnunjukkan produk non spesifik yang terbentuk , M

m cnunjukkan m arker atau penanda, N m enunjukkan kontrol ncgatif, dan S m enunjukkan

sampeI).

Hasil amplifikasi DNA genom hasil isolasi

dengan primer IF-2 dan IR -2 ditunjukkan oleh

Gambar 10. G ambar lOa, lOb, dan 10c berturu t-

turut rnenunjukkan basil amplifikasi DNA

dengan teknik PCR pada suhu 54°C , 55°C, dan

56DC. Ketiga gambar tersebut menjelaskan

len lang proses optim asi suhu annealing yang

digunakan pada tahap PCR . Hasil op tim asi

m enunjukkan bahwa suhu annealing y an g p alin g

optimum untuk amplifikasi gen 1FNu2 adalah56°C . Pada suhu ini, intensitas pita prod uk

spesifik yang terbentuk paling rendah bila

dibandingkan dengan kedua suhu lainnya, tetapi

tidak terbentuk produk non spesifik (Gambar

10c). A rnplifikasi gen 1FNu2 dengan primer IF-2

dan IR -2 akan menghasilkan sebuah produk yang

berukuran 7 97 pb. Penempelan prim er IF-2 dan

IR -2 pada subtipe IFNa yang lain juga akan

menghasilkan produk yang juga berukuran

sekitar 7 97 pb. Akibatnya produk non spesifik

yang dihasilkan dari hasil amplifikasi su lit

dibedakan dari produk spesifiknya apabila

sekuens gen yang teramplifikasi adalah sesamasekuens gen subtipe IFN a.

D ari Gambar 10, dapat diamati bahwa

penaikan suhu annealing akan mengurangi

jum lah produk non spesifik yang terbentuk. Hasil

amplifikasi sampel pada suhu annealing 54 D C

menghasilkan pita prod uk spesifik yang

intensitasnya cukup tinggi. Hal in i ditun jukkan

oleh pita yang cukup tebal an tara 603 pb dan 872

pb. Pada suhu tersebut juga terbentuk dua buah

produk non spesifik yang yang berukuran sekitar

250 pb dan 900 pb (Gambar lOa). Selain itu ,

produk non spesifik yang berukuran 900 pb sulit

d ip isahkan dari produk spesifiknya, sehingga

suhu in i tidak optimum. Untuk suhu 55°C ,

intensitas pita produk spesifik maupun non

spesifik yang terbentuk adalah maksimum

(Gambar lOb). Jum lah produk non spesifik yang

terbentuk berkurang (250 pb), tetap i in tensitas

p ita prod uk non spesifik tersebut bertambah.SeJain itu, pita produk spesifik yang terbentuk

terlalu Iebar, rnencakup daerah yang terlalu luas,

sehingga tidak dapat dipastikan apakah pita itu

tersusun dari hasil amplifikasi satu macam gen

IFNa at au be b e rap a gen IFNa. Hasil amplifikasi

gen-gen yang ukurannya berdekatan dapat

berkumpul di satu tempat yang sarna. O leh

karena itu , suhu ini juga dianggap belum

optimum . Pada suhu 56DC in te nsita s p ita p ro du k

spesifik yang terbentuk lebih rendah

dibandingkan dengan dua suhu yang lain karena

penempelan prim er pada DNA cetakan semakin

su lit (Gambar IOc). Suhu ini d ianggap optimumkarena pada suhu in i hanya terbentuk produk

spesifik dan tidak terbentuk produk non spesifik.

Pada tcknik PCR , suhu denaturasi dan suhu

ekstensi pada umumnya tetap, seh ingga suhu

annealing merupakan penentu utama

keberhasilan amplifikasi. Penentuan suhu

annealing didasarkan atas nilai Tm (melting

temperature) prim er yang digunakan untuk

amplifikasi. Perhitungan Tm untuk prim er yang



tersusun oleh ::; 2 0 basa m engacu kepada m etode

yang dikemukakan oleh W allace et al., yaitu

2 (A+T) + 4(G+C), sedangkan perhitungan Tm

untuk primer yang tersusun oleh ~ 20 basa

didasarkan pada metode Breslauer yang dikenal

dengan nama nearest neighbor method. Kedua

primer yang digunakan pada penelitian ini

tersusun alas ~ 20 basa, sehingga nilai Tm

d ih it un g b erd as ark an nearest neighbor method.

Dar i p e rh it ung an tersebut diperoleh nilai Tm IF-2

adalah 5rC, sedangkan nilai Tm IR -2 adalah

49°C . Secara teoritis suhu annealing adalah 5-

IDoC di bawah Tm kedua primer, tetapi pad a

p ra ktek ny a, suh u annealing harus dioptim asi agar

prod uk yang terbentuk hanyalah produk yang

diinginkan. Semakin rendah suhu annealing,

sernakin tinggi efisiensi penernpelan prim er pada

DNA cetakan termasuk penempelan pada

sekuens gen yang tidak spesifik, S eb alik ny a su hu

annealing yang tinggi akan rnengakibatkan

penurunan efisiensi penempelan prim er pacta

DNA cetakan, sehingga prim er hanya akan

menernpel pada sekuens gen yang s pe sif ik , Akan

tetapi suhu annealing yang terlalu tinggi

m enyebabkan prim er sarna sekali tidak dapat

menempel pada utas DNA , bahkan pada utas

D NA yang spesifik sekalipun.

Bahan yang digunakan pada tahap PCR

jumlahnya tertentu agar menghasilkan produk

spesifik yang optim um . M enurut Innis & Gelfand

(1990), jurnlah DNA yang umum digunakan

sebagai DNA cetakan pada tahap PCR adalah

ki I 5 6se uar O ' - \0 molekul. Jum lah molekul DNA

yang terkandung dalam I ug s il '; f/ e copy DNA

genom manusia adalah 3 x 10 '. Kadar DNA

dalam larutan sam pel adalah 840 ng/u], sehingga

volume DNA yang dibutuhkan sebagai cetakan

pada tahap PCR adalah 2 ~ l. V olume ini

sebanding dengan 1,68 ug DNA atau 5,04 x 105

molekul DNA Sementara itu jum lah enzim Taq

DNA polimerase yang direkomendasikan untuk

PCR oleh Law yer et.a l, (1989) berkisar antara 1-

2,5 Unit/IOO ul larutan. Apabila enzim yang

digunakan terlalu berlebih, m aka gen-gen nonspesifik akan teram plifikasi, sedangkan apabila

enzirn yang digunakan terlalu sedikit, m aka

jum lah produk yang dihasilkan kurang m em adai.

Komponen lain yang menentukan proses

amplifikasi sekuens DNA adalah dNTP dan

MgCh. Keempat macam dNTP yang digunakan

pada tahap PCR harus mempunyai jum lah yang

sebanding supaya tidak terjadi kesalahan

penernpelan dNTP pada DNA cetakan.

14

Magnesium (~g) merupakan komponen yang

berperan pentm g pada keseluruhan tahap PCR.

Oleh karena itu jum lah Mg yang tidak tepat akan

mengakibatkan timbulnya produk-produk non

s~ esifik . B agaim anapun juga, jumlah bahan yang

digunakan pada tahap PC R tidak mutlak, letapi

bergan~ung ~epad.a sifat dan kondisi gen yang

akan diam plifikasi. O leh karena itu , keseluruhan

kondisi PCR yang digunakan untuk

m cngam plifikasi suatu gcn harus dioptim asi.

Kloning

Gen hasil amplifikasi dengan PCR harus

dipurifikasi terlebih dahulu sebelum diklon. Hal

ini dilakukan untuk menghilangkan sisa-sisa

primer, prim er dim er, garam, enzim, da n

pengotor-pengotor lain yang dapat m engganggu

proses kloning. Purifikasi dilakukan densan'"m enggunakan kolom silika, Silika dim anfaatkan

karena dapat mcngadsorbsi DNA pada

konscntrasi garam yang tinggi, tidak

mengadsorbsi protein, RNA, dan oligonukleotida

y~ ng panjangnya < 50 pb, sehingga dapat

diperoleh D NA yang m urni.

K loning diawali dengan memasukkan gen

hasil amplifikasi ke dalam vektor pGEM®-T

(Iigasi), Ligasi dapat dilakukan secara langsung,

yaitu tidak perlu melalui pernotongan dengan

e nz im r es tr ik si tertentu karena setiap ujung 3'

gen hasil arnplifikasi dengan PCR rnemiliki

tambahan bas a adenin (A). Penambahan ini

dilakukan oleh enzim Taq D NA polim erase

secara autornatis. Sem entara itu vektor pG EM® -T

mem iliki keistimewaan yang penting, yaitu

mempunyai basa tim in (T) yang menggantung

(overhang), sehingga keduanya dapat sating

berkomplemen dan dilekatkan dengan enzim

ligase. Selanjutnya plasm id rekom binan tersebut

ditransformasikan ke dalam suatu sel E. coli

kom peten, C ara transform asi yang ditem puh pada

penelitian ini adalah m etode kejut panas. M etode

ini dipilih karen a mernbran sel Ecoli mudah

dibuka hanya dengan kejutan panas, Selain itu

metode ini juga sederhana, D engan metode kejut

panas ini, pori-pori sel E. coli akan m em buka

dalam waktu singkat dan siap untuk menerim a

plasm id rekornbinan yang akan masuk.

Keberhasilan tahap transformasi diperiksa

dengan cawan petri berisi m edium LB yang

mengandung ampisilin , IPTG, dan X -gal.

Ampisilin digunakan untuk menapis sel yang

m engandung plasm id dengan sel yang tidak



a.

15

b.

Gambar II. Cawan petri berisi medium LB yang mengandung ampisilin, IPTG, dan X-gal. Gambar a

menunjukkan kontrol negatif, sedangkan Gambar b menunjukkan sampei.

mengandung plasmid, sedangkan !PTG dan X-

gal digunakan untuk membedakan sel yang

mengandung plasmid rekornbinan dengan sel

yang mengandung plasmid kosong. Gambar 11

menunjukkan cawan petri kontrol negatif dan

cawan petri sampel. Masing-masing cawan petri

tersebut berisi medium LB yang mengandung

ampisilin, IPTG, dan X-gal. Semua koloni yang

tumbuh pada cawan petri, baik cawan petri

kontrol negatif, maupun cawan petri sampel

merupakan koloni yang mengandung plasmid

karena sel-sel yang tidak mengandung plasmid

tidak dapat menghasilkan suatu protein yangdapat merubah arnpisilin menjadi suatu senyawa

yang tidak berbahaya bagi E. coli. Gen penyandi

protein yang resisten terhadap ampisilin terdapat

di dalam plasmid. Secara sepintas dapat pula

diamati bahwa jumlah koloni pada cawan petri

kontrol negatif jauh lebih sedikit dibandingkan

dengan jumlah koloni pada cawan petri sampel.

lumlah koloni pada cawan petri kontrol negatif

adalah 9 buah, sedangkan jumlah koloni pada

cawan petri sampel adalah sekitar 150 buah.

Gambar lla menunjukkan cawan petri kontrol

negatif. Kontrol negatif memperoleh perlakuan

yang sarna dengan sampel hanya tidak diberi

insert. Pada cawan petri tersebut dapat diamati

bahwa selain jumlah koloninya sedikit, koloni

yang ada seluruhnya berwarna biru. Hal ini

menunjukkan bahwa tidak terjadi kontaminasi

pada kontrol negatif karena semua koloni sel

yang terbentuk hanya mangandung plasmid

kosong, Gambar lIb menunjukkan bahwa koloni

yang tumbuh pada cawan petri sampel berwarna

putih dan biru. lumlah koloni yang berwama biru

lebih sedikit daripada koloni yang berwarna putih

(30 : 70). Kenyataan ini menunjukkan bahwa

koloni sel yang berisi plasmid kosong jumlahnya

lebih sedikit daripada koloni sel yang berisi

plasmid rekombinan. Adapun sel pada umumnya

akan menerima plasmid yang berbentuk sirkular.

Plasmid yang tidak berligasi dengan insert, untuk

masuk ke dalam sel hams berswaligasi (self-

ligated vector). Swaligasi vektor pGEM®-T agak

sulit terjadi karena seperti yang sudah disebutkan

di atas, setiap ujung 3' vektor pGE~ -T terdapat

basa timin (T) yang menggantung. Untuk

berswaligasi, maka kedua basa T harus saling

berkomplemen. Komplemen ini tidak stabil,

tetapi mungkin terjadi, oleh karenanya koloni sel

yang mengandung plasmid kosong cenderung

lebih sedikit jumlahnya dibandingkan dengan

koloni sel yang mengandung plasmid

rekombinan.

Dari ratusan koloni yang berwarna putih,

dipilih sepuluh buah koloni untuk diperiksa

ukuran insert-nya dengan teknik peR. Gambar

12 menunjukkan bahwa sembilan koloni

memiliki ukuran insert yang sesuai (1.047 pb),

sedangkan satu koloni memiliki ukuran yang

salah (sekitar 500 bp). Produk peR yang

diperoleh tidak berukuran 797 pb karena peR

dilakukan dengan menggunakan sepasang primer

(MI3) yang terletak pada vektor pGEM®-T.

Kedua primer ini berjarak sekitar 125 pb dari

daerah insert, sehingga ukuran produk peR yang

diperoleh merupakan penjumlahan ukuran insert

dengan jumlah nukleotida dari kedua daerah



prim er ke daerah insert. Adanya sebuah koloni

yang berukuran salah menunjukkan bahwa

ternyata pada suhu annealing 56°e masih

terbentuk produk non spesifik y an g b eru ku ra n

M 2 3

16

sekitar 250 pb. Produk non spesifik tersebut tidak

terekam dengan kamera UV karena

k on se ntra sin ya sa ng at ren dah « 50 ng).

4 5 107 8 9

1 .3 53 p b

1 .0 78 p b

872 pb

603 p h

1 .0 47 p b

5 00 p b

Sekuensing

Garnbar 12 . Hasil peR sepuluh kalani (Memarker, 1 -1 0 = nomo r k olo ni).

Dari sernbilan buah koloni yang menunjukkan

ukuran insert yang tepat, dipilih dua buah koloni

untuk disekuensing. Koloni yang dipilih adalah

koloni 5 dan koloni 8. P lasm id dari m asing-m asing

koloni diisolasi dengan prosedur lisis basa

termodifikasi. Selanjutnya dipurifikasi untuk

menghilangkan sisa-sisa bahan yang digunakan

dalam isolasi plasm id karen a bahan-bahan tersebut

akan rnenimbulkan gangguan pada tahap

pernisahan fragm en-fragm en D NA .

peR sekuensing dilakukan dengan beberapa

prim er, yaitu SP6, T7 , IF-2, dan IR-2. SP6 dan T7

tersusun dari o ligonukleotida yang terletak pada

vektor pGEM®-T (terletak di luar insert).

Pemakaian kedua primer ini bertujuan untuk

m elih at ap ak ah insert b en ar-b en ar te rlig asi d en ga n

vektor pGEM ®-T, yaitu dengan membaca sekuens

sambungan antara vektor dengan ujung-ujung

insert. Gambar 13 menunjukkan sebagian

elek troferogram hasil sekuensing dengan prim er

T7 . Pada gam bar tersebut ditunjukkan bahwa insert

teriigasi dengan vektor pG EM ®-T. U jung T (tim in)

dari vektor langsung disambung oleh insert. T7

dim anfaatkan untuk m erunut sekuens insert dari

depan, sedangkan SP6 dimanfaatkan untuk

m erunut sekuens insert dari belakang. Keadaan

sebaliknya dapat terjadi apabila insert terligasi

dengan vektor dalam posisi terbalik. Perunutan

sekuens insert perlu dilakukan dengan

rnenggunakan kedua prim er ini karena kem am puan

mesin Automatic DNA Sequencer Abi Prism 377

untuk rnerunut sekuens suatu gen untuk satu reaksi

(sebuah primer) terbatas. M esin tersebut hanya

dapat merunut sekuens suatu gen sampai sekitar

400-500 pb. Seharusnya penggunaan SP6 dan T7

dapat d igunakan untuk membaca keseluruhan

sekuens insert, tetapi ternyata ban yak basa di

b ag ia n te ng ah insert yan g tid ak dapat terbaca, Oleh

karen a itu d imanfaaikanlah prim er IF-2 dan IR-2.

Prim er IF-2 dan IR-2 merupakan prim er yang

digunakan untuk m engam plifikasi insert, oleh

karenanya kedua prim er terscbut terletak di ujung-

ujung insert. Perunutan sekuens insert

menggunakan kedua primer ini sangat baik.

(Lampiran 4). Bagian yang tidak dapat terbaca

h an ya b ag ian u ju ng -u ju ng insert. Den ga n d er nik ia n

k es elu ru han se ku en s insert dapat dibaca karena

p eru nu ta n s ek uen s insert dengan prim er SP6, TI,

IF -2, dan IR -2 saling m eJengk api.

Gambar 13. Daerah pertemuan antara vektor

pGEM-T dengan salah satu ujung

insert (ditunjukkan oleh landa'" ).



Sekuens kedua koloni tersebut ternyata sarna

persis dengan standar gen IFNO:2 yang terdapat

dalam Genliank dengan kode akses Yl1834

(Lampi ran 5). Hal ini menunjukkan bahwa benar

gen yang diisolasi merupakan gen 1FNu2 manusia.Sekuens keseluruhan gen has il is ol as i dan urutan

asarn amino yang disandi oleh gen 1FNu2 disajikan

pada Lampiran 6 dan 7. Lebih spesifik lagi,

ternyata gen yang dipero1eh merupakan sub varian

b dari IFNo:2. Ini dibuktikan oleh ciri khas gen

IFNO:2 b yang muncul pada gen sam pel, yaitu

adanya basa guanin (G) pada posisi ke-137 dan

basa adenin (A) pada posisi ke-170 (Kaluz et al.,

1994). Kenyataan ini tidak mengherankan karena

IFNO:2 b merupakan subvarian yang paling

dorninan (Lee et aI., 1995). Perbandingan sekuens

sampel dengan IFNuz a, IFNO:2 b, dan IFNO:2 c

disajikan pada Gambar 14. Sekuens gen 1FNu2 a,IFNo:z b, dan IFNo:z c diperoleh dari Genllank

masing-masing dengan kode akses S64979,

S64994, dan S64991.

137 171

'f 'fSampel gagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatg

IFNA 2b gagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatg

IFNA 2a gaaaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatg

IFNA 2c gagaatctctcmtctcctgcttgaaggacagacgtg

Gambar 14. Perbandingan sekuens sampel dengan

sekuens standar IFNo:z a, IFNO:2 b, danIFNo:2c.

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

Gen yang diisolasi dari DNA genom rnanusia

dengan teknik PCR menggunakan primer IF-2 dan

IR-2 merupakan gen 1FNu2. Konfirmasi diperoleh

dari \1asil sekuensing menggunakan empat buah

primer, yaitu primer SP6, T7, IF-2, dan IR-2. Hasil

sekuensing dikonfirmasi (alignment) denganstandar gen IFNo:z yang terdapat dalam Genllank:

dengan kode akses Y1834. Selanjutnya untuk

mengetahui subvarian IFNuz dari gen tersebut,

maka dilakukan alignment dengan ketiga macam

standar sekuens subvarian IFNO:2 yang ada dalam

GenBank dengan kode akses S64979, S64994, dan

S64991. Hasilnya menunjukkan bahwa gen hasil

isolasi merupakan subvarian b dari IFNo:z. Gen

17

1FNa2 tersebut telah berhasil diklon ke dalam

vektor pGEM®-T.

Teknik PCR yang digunakan pada peneiitian ini

merupakan teknik yang efektif karena dapat

digunakan pada berbagai tahap penelitian, yaitupada tahap amplifikasi sampel, isolasi gen dari

DNA genom, konfirmasi ukuran insert, dan pada

tahap sekuensing, 01eh sebab itu pernanfaatan

teknik PCR pada penelitian irn sangat

menguntungkan.

Saran

Penelitian pendahuluan ini sebaiknya dilanjutkan

dengan ekspresi gen Hu-IFNu2 supaya dapat

dihasilkan protein IFNO:2 yang berrnanfaat sebagai

obat antitumor dan antivirus.

DAFTAR PUSTAKA

Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K.

Roberts & J. D. Watson. 1994. Molecular

Biology of the Cell. Ed. kc-3. Garland

Publishing, New York.

Agarwala, S. S. & J. M. Kirkwood. 1995.

Potential uses of interferon alpha 2 as adjuvan

therapy in cancer. Ann. Surg. Oneal. 2:365-371.

Borden, E. C. 1998. Gene regulation and clinical

roles for interferons in neoplastic disease. TheOncologist 3: 198-203.

Boynton, J. E., N. W. Gillham, E. H. Harris, J.

P. Hosler, A. M. Johnson, A. R. Jones, B. L.

Randolph-Anderson, D. Robertson, T. M.

Klein & K. B. Shark. 1988. Chloroplast

transformation in Chlamydomonas with high

velocity microprojectiles. Science 240: 1534-

1538.

Brown, T. A. 1995. Gene Cloning An

lntroduction. Ed. ke-3. Chapman & Hall,

Madras.

Calvin, N. M. & P.e. Hanawalt. 1988. High

efficiency transformation of bacterial cell by

electroporation. J. Bacteriol. 170:2796-280 l.

Cotler, S. J., D. R. Ganger, S. Kaur, H.

Rosenblate, S. Jakate, D. G. Sulivan, K. W.

Ng, D. R. Gretch & D. M. Jensen. 2001. Daily

interferon therapy for hepatitis C virus infection



in liver transplant recipients. Transplantation

71:261-266.

Daniell, H., J. Vivekananda, B. L. Nielsen, G. N.

Ye, K. K. Tewari & J. C. Sanford. 1990.

Transient foreign gene expression inchloroplast of culture tobacco cells after

biolistic delivery of chloroplast vector. Proc.

Nat!. Acad. Sci. USA 87:88-92.

Dijkmans, R. & A. Billian. 1985. An introduction

to the genes of the interferon system, him. 1-

18. Di dalam 1. Taylor-Papadimitriou

(Penyunting). Interferons Their impact in

Biology and Medicine: an introduction to the

genes of the interferon system. Oxford

University Press, Oxford.

Gray, P. W. D. W. Leung, T. J. Dull, M. Gross,R. M. Lawn, R. McCandliss, P. H. Seeburg,

A. Ullrich, E. Yelverton & P. W. Gray.

1981. Expession of human immune interferon

cDNA in E. coli and monkey cells. Nature

295:503-507.

Gewert, D. R., N. A. Sharp, K. A. Barber, H.

Cooper, D. Tucker, A. P. Lewis, M. Thurs

& J. S. Crowe. 1995. Detection of rare alelic

variants of the interferon-alpha 2 gene in

human genomic DNA. J. interferon Cytokine

Res. 15:403-406.

Gutterman, J. U. 1994. Cytokine therapeutics:

lesson from interferon a. Proc. Natl. A cad.

Sci. USA 91:1198-1205.

Hammer, R. E., V. G. Pursel, C. E. Rexroad, R.

J. Wall, D. J. Bolt, K. M. Elbert, R. D.

Palmiter & R. L. Brinster, 1985. Production

of transgenic rabbits, sheep, and pigs by

microinjection. Nature 315:680-683.

Innis, M. A. & D. H. Gelfand, 1990. Optimization

of PCR, him. 3-12. Di dalam M. A. Innis, D. H.

Gelfand, I. I. Sninsky, & T. I. White(Penyunting). PCR Protocols A Guide to

Methods and Applications. Academic Press,

San Diego.

Kaluz, S., P. Kabat, A. Gibadulinova, J.Vojtassak, N. Fuchsberger & P. Kontsek.

1994. Interferon alpha 2b is the predominant

18

subvariant detected in human genomic DNAs.

Acta Virol. 38:\01-104.

Kirkwood, J. M., M. H. Strawderman &M. S.

Ernstoff. 1996. Interferon alpha-2b adjuvant

therapy of high-risk resected cutaneousmelanoma. 1. Clin. OIlCOI. 14:7-17.

Lawyer, F. C., S. Stoffel, R. K. Saiki, K.

Myambo, K. Drummond & D. H. Gelfand.

1989. Isolation, Characterization and

Expression in Echericia coli of the DNA

polymerase gene from Thermus aquaticus. 1.

BioI. Chem. 264:6427-6437.

Lee, N., D. Ni, R. Brissette, M. Chou, M.

Hussain, D. S. Gill, M. J. Liao & D. Testa.

1995. Interferon-alpha 2 variants in human

genome. J. Interferon Cytokine Res. 15:341-349.

Lawn, R. M.; M. Gross, C. M. Houck, A. E.Franke, P. V. Gray & D. V. Goeddcl. 1981.

DNA sequence of a major human leukocyte

interferon gene. Proc. Nat!. A cad. Sci. USA

78:5435-5439.

MandeUi, F., G. Avvisati & S. Amadori. 1990.

Maintenance treatment with recombinant

interferon alpha 2b in patients with myeloma

responding to conventional induction

chemotherapy. N . Engl. 1. Med. 322: 1430-1434.

Maxam, A. M. & W. Gilbert. 1977. A new

method for sequencing DNA. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 74:560-564.

Millar, B. C., J. B. Bell & R. L. Powles. 1996.

Lymphocyte recovery and clinical response in

multiple myeloma patients receiving interferon

alpha 2 beta after injtensive therapy. Br. J.

Cancer 73:236-240.

Moore, D. 1998. Current Protocol in MolecularBiology: manipulation of DNA. John Wiley &

Sons. Canada.

Sattayasai, N. 1990. Immunological studies of

human interferons a: antibodies with

predetermined specificity. Tesis. Department

of Biochemistry, Monash University,

Australia.



19

Saiki, R. K. 1989. PCR Technology Principles &

Appplications for DNA Amplification: the

design and optimization of the PCR. Stockton

Press, London.

Saiki, R. K, D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J.Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis

& H. A. Erlich. 1988. Primer directed

enzymatic amplification of DNA with a

thermostable DNA polymerase. Science

239:487-494.

Sarnbrook, J., E. F. Fritsch & T. Maniatis. [989.

Molecular Cloning A Laboratory Manual. Ed.

Kc-2 . Cold Spring Harbor Laboratory Press,

USA.

Sanger, F., S. Nicklen & A. R. Coulson. 1977.DNA sequencing with chain-terminating

inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-

5467.

Sanger, F & A. R. Coulson. 1978. The use of thin

acrylamide gels for DNA sequencing. FEBS

Lett. 87: 107-110.

Solal-Celigny, P. E. Lepage & N. Brousse. 1993.

Recombinant interferon alpha-2b combined

with a regimen containing doxorubicin in

patient with advanced follicular lymphoma. N.

Engl. J. Med. 329:1608-[614.

Stites, D. P., A. I. Terr & T. G. Parslow. 1994.

Basic and Clinical Immunology. Ed. ke-8.

Appleton & Lange, Norwalk.

Talpaz, M., H. Kantarijan, R. Kurzrock, J. M.

Trujillo & J. U. Gutterman. 1991.

Interferon-alpha produces sustained

cytogenetic responses in chronic mylogenous

leukimia. Ann. Intern. Med. 144:532-538.

Voet, D. & J. G. Voet, 1994. Biochemistry. Ed.

ke-Z, John Wiley & Sons. New York.

Watson, J. D., M. Gilman, J. Wilkowski & M.

Zoller. 1992. Recombinant DNA. Ed. ke-2.

Scientific American Books, New York.



LAMPlRAN



I:: ero ro

!oo !oj}e e

e e :. E .s' 0 : ; . v : ; E EI:: C

]0

o.l o.l ~] ;:l 10. . ! < : . . . . . . . .

10 o.l "0 "0

'" '" · S · S: : ; A ::U U

til

'":1 .s., p., 0.. 0.e :::;

1 : : : 1 : : ::1 ro"0 "0 'U

' "B e ~ ~

. : : : J , : : : J

~ a : :e e0 :1 ro

. . . . . . !oj} tlJ} . . . . . . . . . .

0,,5 .5 ] ]:l

: : r : : : r : til

'" ;:l ;:l: : : ; e

: : : ; c c <!) <!) '0:; . v : ;

<!) o.l ::l ;:l 0 :1 rottl bll btl . . ! < : . . ! < : E Etl 10 10C , - 'V: ; til

'" " " '. . . .

: ; : : l '" <P <Pttl d p : : ; p : : ;!oJ }

"0 "0c c

~

U U 0 0

$

~p., p.,

~ ~

::00'-"

. . . . .<!)

8';::0

Cd, . . . .: ; : : l

. . ! < : N N ("<') ("<') '1" N

: : : > N N N N N N

M MMU M

M M < r ; u < r ;

u u 0 - c 0u

b0 u

~u <

b 0 - c 0< r ; 0 < U

f- <

U < 0 0 f- < E :5u E - < < r ;

8 ~u< u

~ 0< - c u < r ;u 0 t 3 u

S0 u u u

0 < <

E<

~u u < r;

f- < < < r;

U f- < U 0 0. . . . . u 0 < C b

0 0<!) U f- < 0 0 <

< C U u 0 0 u';:: U E - < < C < < < C0

E - < U E - <

~

U U'"c U U ~ u < Cv 0 b

<I' 0 U;:l

0 r - : ; U E -<. ! < :!l,l

i'rl i'rl i'rl i'rl i'rl InJ')

. . . .

.§. . . .0

d. . . . . . . . . . .

E N N 1.0J - . M

~. . . . . . . . . . . . . .

d

~ ~p., : : g : : gz . . . . . [J')

0z , . . . . ; N ('f) . . , ; v -i 0



21

Lampiran 2. Perhitungan kadar dan kemurnian DNA

A2so

"", Faktor Kadar DNA

pengenceran (ng/p.l)

Kemurnian DNA

(A26onn,! A2BOn",)

Sampel 0,084 0,048 200 840 1,75

I. Perhitungan kadar DNA sampel (ng/ill)

KadarDNA = A260nm X faktor pengenceran x 50 ng/ill

= 0,084 x 200 x 50 ng/il!

= 840 ng/u!

2. Kemurnian DNA sampel

Kemurnian = A260 nm /A2 s o nm

= 0,084/ 0,048



)

),.-.

~ . . . . .

Q)

- E)-, . . . .~q.. >.(c)<{

o 0

c < ) c < )

co c000

-[ij r- -0 0

< D a s (j)><{>

"<too

Ql

g JC D



24

Lampiran 5. Hasil konfirmasi sekuens sampel dengan standar Y11834 (Sequence

reference)

CLUSTAL W (1.8) multiple sequence alignment

SAMPEL

STANDAR

------------------CTTTNAATTCCCTTTG-AACATCNACATNGGCCTTGACCTT-

GGCTCACCCATTTCAACCAGTCTAGCAGCATCTGCAACATCTACAATGGCCTTGACCTTT

* * * * ** ****** *** ************

SAMPEL

STANDAR

GCTTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTGAT

GCTTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTGAT

************************************************************

SAMPEL

STANDAR

CTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGG

CTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGG

************************************************************

SAMPEL

STANDAR

AGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAG

AGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAG

************************************************************

SAMPEL

STANDAR

TTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAG

TTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAG

************************************************************

SAMPEL

STANDAR

ATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGAC

ATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGAC

************************************************************

SAMPEL

STANDAR

AAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGG

AAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGG

************************************************************

SAMPELSTANDAR

GTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTTCATTCTGGCTGTGAAGGAAATAGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGA-GGAAATA

************************************* ************** *******

SAMPEL

STANDAR

CTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGT

CTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGT

************************************************************

SAMPEL

STANDAR

TGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAG

TGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAG

************************************************************

SAMPEL

STANDAR

AAGTAAGGAATGAAAACTGGTTCAACATGGAAATGATTTTCATTGATTCGTATGCCAGCT

AAGTAAGGAATGAAAACTGGTTCAACATGGAAATGATTTTCATTGATTCGTATGCCAGCT

************************************************************

SAMPEL

STANDAR

CACCTTTTTATAATCTGCCATTTCAAAGACTCATGGTTCTGCTATGACCATGACACGATT

CACCTTTTTATGATCTGCCATTTCAAAGACTCATGTTTCTGCTATGACCATGACACGATT

*********** *********************** ************************

SAMPEL

STANDAR

TAAATCTTTTCAAATGGTTTTANGAGTATTAATCAACCATTGGATTCAGCTCTTAAGGCA

TAAATCTTTTCAAATGTTTTTAGGAGTATTAATCAAC-ATTGTATTCAGCTCTTAAGGCA

**************** ***** ************** **** *****************

SAMPEL

STANDAR

CTAGTCCC-----------

CTAGTCCCTTACAGAGGAC

********



L am piran 6. Sekuens keseluruhan IFN CX :1hasil isolasi

10 2030 40I I I.II I III I I IIIII II I I I I I II II " I I I I I. II I I

ggctcaccca tttcaaccag tctagcagca tctgcaacat 40

ctacaatggc cttgaccttt gctttactgg tggccctcct 80

ggtgctcagc tgcaagtcaa gctgctctgt gggctgtgat 120

ctgcctcaaa cccacagcct gggtagcagg aggaccttga 160

tgctcctggc acagatgagg ag aatc tctc tttt ctcct g 200

210 220 230 240

I I I" I I IaI I I I.II I I I I I I I I II II II 1111111111

c ttgaa ggac agac atgac t ttg gatt tcc ccagg aggag 240

tttggcaacc agttccaaaa ggctgaaacc atccctgtcc 280t ccatg agat gatc cagca g atct tcaat c tc ttca gcac 320

aaaggactca tctgctgctt gggatgagac cctcctagac 360

aaattctaca ctgaactcta ccagcagctg aatgacctgg 400

410 420 Lt30 Lt40

I I I.II I II I I I I.II I I.I I I I I III II I I I I I I II II I

aag cctgt gt gat acagg gg gtgggggtga cagagactcc 440

cctgatgaag gaggactcca ttctggctgt gaggaaatac 480

ttccaaagaa tcactctcta tctgaaagag aagaaataca 520

gcccttgtgc ctgggaggtt gtcagagcag aaatcatgag 560

atctttttct ttgtcaacaa acttgcaaga aagtttaaga 600

610 620 630 640

I I I I I I•I II I I IIII I I aI II II II I I II I I I I II I I I I

agta agga at g aaaac tggt tcaacatgga aatgattttc 640

attg attc gt a tgcca gctc acctttttat gatctgccat 680

t tcaa agact c atgtt tctg ctatgaccat gacacgattt 720

aaatcttttc aaatgttttt aggagtatta atcaacattg 760

t qttc agctc tt aagg cact agtcccttac agaggac, 797

25



26

Lampiran 7. Urutan nukleotida gen Hu-IFNCt.2dan asam amino yang disandinya

MALTFALLVALLVLSCK SSC

1 atg gee ttg aee ttt get tta etg gtg gee ete etg gtg etc age tge aag tea age tge

SVGCDLPQ THSLGSRRTLML

61 tet gtg ggc tgt gat ctg ect caa aec cae age etg ggt age agg agg ace ttg atg etc

LAQMRRJSLFSCLKDR HDFG

121 etg gea eag atg agg aga ate tct ett tte tee tge ttg aag gac aga cat gae ttt gga

FPQE EFGNOFQ KAET P V L H

181 ttt eee eag gag gag ttt gge aae eag tte eaa aag get gaa ace ate eet gte ete eat

EM I Q Q IF N L F S TKO S S AA W 0

241 gag atg ate eag cag ate tte aat etc tte age aca aag gae tea tet get get tgg gat

ETLL 0 KFYTELYOOLNDLEA

301 gag aee ete eta gae aaa tte tac aet gaa cte tac eag eag ctg aat gae etg gaa gee

CV IOGVGVT ETPLMKE DSIL

361 tgt gtg ata eag ggg gtg ggg gtg aea gag aet eee etg atg aag gag gac tee att etg

AVRKYFORI TLYLKE KK YSP

421 get gtg agg aaa tae ttc caa aga ate act etc tat etg aaa gag aag aaa tac age cet

CAW EVV RAE 1M RSFSLST NL

481 tgt gee tgg gag gtt gte aga gea gaa ate atg aga tet ttt tet ttg tea aea aac ttg

Q ESLRSKE

541 eaa gaa agt tta aga agt aag gaa tga

Ekspresi Gen

Documents

Transcript of Ekspresi Gen