1

Właściwości ogólne i metody hodowli wirusów, odczyny

serologiczne

Maciej Przybylski

Katedra i zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM

Definicja wirusa

Organizm o budowie niekomórkowej, którego genom zbudowany jest z kwasu nukleinowego

i który bezwzględnie musi namnażać sięwewnątrz żywych komórek, wykorzystując ich metabolizm i aparat syntezy białek do

syntezy komponentów, które składają się w struktur ę zwaną wirionem, chroniącą kwas

nukleinowy i umożliwiaj ącą transport wirusa między komórkami

2

I. Systematyka wirusów

Taksonomia wirusów

�(Rząd) -virales–rodzina -viridae

• podrodzina –virinae–rodzaj –virus

»gatunek

9th Report of International Committee on Taxonomy ofViruses (2011)

3

Przykłady

Wirus opryszczki typu 1

� Rząd: Herpesvirales

� Rodzina: Herpesviridae

� Podrodzina: Alphaherpesvirinae

� Rodzaj: Simplexvirus

� Gatunek: HumanHerpesvirus 1 (HHV-1)

Syncytialny wirus oddechowy

� Rząd: Mononegavirales

� Rodzina: Paramyxoviridae

� Podrodzina: Paramyxovirinae

� Rodzaj: Pneumovirus

� Gatunek: Human Respiratory Syncytial Virus

Klasyfikacja wirusów DNA

4

Klasyfikacja wirusów RNA

Polarność wirusowej nici RNA

5

II. Wła ściwości ogólnewirusów

Wielkość wirusów DNA

6

Wielkość wirusów RNA

Budowa wirusów

�kwas nukleinowy

�kapsyd

�białka matrix i białka związane z kwasem nukleinowym (niektóre rodziny)

�osłonka (niektóre rodziny)

�białka powierzchniowe związane z osłonką(niektóre rodziny)

7

Symetria kapsydów wirusowych

Spiralna(helikalna)

Ikozaedralna(dwudziestościenna)

8

Replikacja wirusów w komórce

� adsorpcja

�wniknięcie

� odpłaszczenie

� synteza białek wczesnych

� powielenie genomu

� synteza białek późnych

� składanie i dojrzewanie wirionów potomnych

� uwolnienie dojrzałych wirionów

Następstwa zakażenia komórki

9

III. Metody hodowliwirusów

Izolacja i namnażanie wirusów kręgowców

2. Sposoby namnażania wirusów:� w zwierzętach laboratoryjnych (próba

biologiczna)

� w zarodkach ptaków

� w hodowlach komórkowych

10

Namnażanie wirusów w hodowlach komórkowych

1. Rodzaje hodowli stosowanych do namnażania wirusów:

� pierwotne

� półciągłe

� ciągłe

2. Źródła komórek używanych do hodowli komórkowych:

� tkanki embrionalne

� tkanki nowotworowe

� tkanki dojrzałe

Namnażanie wirusów w hodowlach komórkowych

Wygląd współczesnych butelek do hodowli komórkowych

11

Namnażanie wirusów:� diagnostyka zakażenia

� badania naukowe

� produkcja antygenów

monolayer - jednowarstwowa hodowla komórkowa

Linia komórkowa Vero

12

Pożywki do hodowlikomórkowych zawierają:

- cukry

- aminokwasy

- witaminy

- sole mineralne

- związek buforujący (do pH 7,2 - 7,4)

- antybiotyki

- surowicę (najcześciej płodową cielęcą)

• w stężeniu 10 - 20% pożywka wzrostowa

• w stężeniu 2 - 5% pożywka utrzymująca

- wskaźnik barwny pH

Warunki hodowli:

• temperatura 37OC• stężenie CO2 5%• odpowiednia wilgotność

13

Efekty cytopatyczne (cytopathogeniceffect – CPE)

�wtręty wewnątrzkomórkowe (wewnątrzjądrowe, cytoplazmatyczne)

�wielojądrzaste komórki olbrzymie

�zmiana kształtu komórki

�zniszczenie komórki (liza)

�transformacja nowotworowa

Przykładowe efekty cytopatyczneAdenowirus

Wirus ECHO

HSV-1 Wirus świnki

14

Zmiany niecytopatyczne

1. hemadsorpcja - np. ortomyksowirusy, paramyksowirusy

2. interferencja - np. wirusróżyczki

Hemadsorpcja w komórkach zakażonych wirusem parainfluenzy

15

IV. Patogeneza zakażeńwirusowych

Patogeneza zakażenia wirusowego

16

Patogeneza zakażenia wirusowego

�wniknięcie wirusa (skóra, błony śluzowe)

� namnożenie wirusa we wrotach zakażenia

� zmiany miejscowe

� replikacja w węzłach chłonnych

i RES

�wiremia

� zakażenie uogólnione

� zakażenie narządów

� śmierć

Odpornośćkomórkowanieswoista i swoista

Wszystkie elementyukładu odpornościowego

Formy zakażeń wirusowych

� ostre� przewlekłe

� objawowe� bezobjawowe� poronne

� pierwotne� powtórne

� miejscowe� narządowe� uogólnione

� latentne� persystentne� wynikaj ące z

reaktywacji w. latentnego

17

Odpowiedź immunologiczna w zakażeniu wirusowym� odpowiedź komórkowa i humoralna

� odpowiedź nieswoista – bariery, makrofagi, komórki NK, apoptoza, interferony, TNF

�wirusy = antygeny endogenne

� odpowiedź swoista – MHC-I, limfocyty Tc, ADCC: niszczenie komórek zakażonych wirusem

� odpowiedź swoista – MHC-II, limfocyty Th, limfocyty B, przeciwciała: IgA na błonach śluzowych, IgM, IgG – neutralizacja wirionów we krwi i płynach ciała

V. Diagnostyka wirusologiczna

18

Metody diagnostyki wirusologicznej

� Wykrywanie wirusa:– zakaźnych cząstek

wirusa– białek wirusowych

(antygenów)– wirusowego kwasu

nukleinowego

� Wykrywanie przeciwciałswoistych wobec wirusa wywołującego zakażenie

Objawy wskazujące na etiologię wirusową

– zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu

– zapalenie wątroby

– zapalenie mięśnia sercowego, osierdzia, wsierdzia

– objawy porażenne

– gorączki krwotoczne

– przedłużające się stany gorączkowe

– biegunki niemowląt i dzieci poniżej 2 roku życia

– zespół nabytego upośledzenia odporności

19

Grupy osób, u których należy wykonywaćdiagnostyczne badania wirusologiczne

– u kobiet w ciąży (ryzyko uszkodzenia płodu)

– u noworodków (ryzyko zakażenia okołoporodowego lub wrodzonego)

– u biorców przeszczepów

– u chorych na AIDS

– u dawców krwi

– u dawców narządów do przeszczepów

– u osób z upośledzeniem odporności

Pobieranie materiału do badańwirusologicznych

� do jałowych pojemników z zachowaniem zasad aseptyki

� wystarczająca do badania ilośćmateriału

� do każdego badania (nie materiału!) musi byćdołączone skierowanie

20

Transport materiału do badańwirusologicznych

�SZYBKO� optymalna temperatura = 4°C�wymazy, popłuczyny - w odpowiednim płynie

transportowym

�między odległymi placówkami - w odpowiednich zestawach transportowych

� do materiału nie wolno dodawać żadnych związków chemicznych

Izolacja wirusów w hodowlach komórkowych� Materiałem pobranym od

chorego zakaża się wrażliwe linie komórkowe

� Jeżeli w materiale klinicznym byłwirus (aktywny!), wywoła on zmiany w komórkach hodowli = efekt cytopatyczny

� Efekt cytopatyczny może służyć do wstępnej identyfikacji wirusa

� Konieczna jest późniejsza dokładna identyfikacja

21

Efekty cytopatyczne (1)

Efekty cytopatyczne (2)

22

Antygeny

�Antygen jest to cząsteczka rozpoznawana jako obcaprzez organizm immunokompetentny (czyli zdolny do prawidłowej odpowiedzi immunologicznej)

�Epitop jest to część antygenu rozpoznawana przez receptory komórek odpornościowych i przeciwciała (odpowiedzialna za jego immunogenność)

białkapowierzchniowe

białkakapsydu

białkategumentu

białka związane z RNA lub DNA

Cechy charakterystyczne antygenów

� Immunogenność - zdolność do wywoływania odpowiedzi immunologicznej

�Swoistość - komórki odpornościowe uczulone (aktywowane) przez jeden typ antygenu reagują

potem tylko na ten typ antygenu

Własności immunogenne mają białka, węglowodany i wiele innych związków chemicznych

23

Wykrywanie antygenów wirusowych

� do wykrywania antygenów używa się swoistych wzorcowych przeciwciał

� najczęściej wykorzystuje sięprzeciwciała znakowane:– fluoresceiną– enzymem– izotopem radioaktywnym

� zastosowanie znacznika umożliwia uwidocznienie wzorcowych przeciwciałzwiązanych z wykrywanym wirusem

Wykrywanie wirusowych kwasów nukleinowych

�opiera się na wykryciu wysoce swoistych sekwencji DNA lub RNA wirusów– bezpośrednie wykrycie genu wirusowego

(metody hybrydyzacji)

– namnożenie wirusowego KN obecnego w materiale klinicznym, następnie wykrycie (PCR)

– kombinacje powyższych metod

24

Przeciwciała

�Przeciwciałami (albo immunoglobulinami) nazywamy cząsteczki białkowe syntetyzowanepo pobudzeniu antygenem, skierowane swoiścieprzeciwko temu antygenowi.

�Przeciwciała są wytwarzane przez komórkiplazmatyczne(aktywowane limfocyty B).

Swoista aktywacja limfocytów B

25

Budowa immunoglobuliny

Klasy immunoglobulin

� organizm człowieka produkuje 5 klas przeciwciał:

– immunoglobuliny G (IgG)– immunoglobuliny M (IgM)

– immunoglobuliny A (IgA)– immunoglobuliny E (IgE)

– immunoglobuliny D (IgD)

�W odpowiedzi przeciwzakaźnej najważniejsząrolę odgrywają przeciwciała klas IgG, IgM i IgA

26

Swoista odpowiedź humoralna

Metody serologiczne w badaniach wirusologicznych

�metody serologiczne (serum = surowica) opierają

się na wykrywaniu przeciwciał swoistych wobec antygenówwirusów, które wywołały zakażenie

�metody te opierają się na swoistości reakcji antygen - przeciwciało

27

Metody serologiczne - wykrywanie przeciwciał

� szczególnie przydatne w diagnostyce chorób wirusowych, w których napotykamy trudności w izolacji lub wykryciu czynnika etiologicznego:– AIDS

– WZW A-E

– różyczka

– odra

– wirusowe zapalenia mózgu

– mononukleoza zakaźna)

� metodami laboratoryjnymi przeciwciała wykrywa się

najczęściej w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym(neuroinfekcje)

Wykrywanie przeciwciał - zastosowanie

� badanie surowic parzystych– określenie wzrostu miana swoistych przeciwciał

� wykrywanie przeciwciał w klasie IgM– w surowicy - wykrywanie bieżącego zakażenia;

– w płynie mózgowo-rdzeniowym - potwierdzenie neuroinfekcji

– u noworodków - potwierdzenie zakażenia wrodzonego

� wykrywanie przeciwciał w klasie IgG– potwierdzenie kontaktu z antygenem (po zakażeniu lub

szczepieniu IgG utrzymują się w surowicy nawet przez wiele lat)

� metody jakościowe lub ilościowe

28

Badanie surowic parzystych

Laboratoryjne metody wykrywania przeciwciał

� odczyny aglutynacji� odczyny precypitacyjne� odczyny hemaglutynacji� test ELISA (enzymatyczny odczyn immunosorbcyjny)� Immunobloting (Western-Blott)� odczyn immunofluorescencji� odczyn wiązania dopełniacza

� odczyn zahamowania hemaglutynacji

29

Western-Blott

30

Aglutynacja

Reakcja zachodząca pomiędzy immunoglobulinami a

antygenem w formie komórkowej (bakterie, drożdże,

erytrocyty, leukocyty itp.). Polega ona na zlepianiu się

komórek pod wpływem swoistych Ig i wypadaniu ich z

roztworu w obecności elektrolitów.

Precypitacja

Reakcja zachodząca pomiędzy immunoglobulinami i

rozpuszczalnym antygenem przejawiająca się

powstawaniem strątów

Zakażenie miejscowe

Przykłady: opryszczka zwykła, zapalenie spojówek

Diagnostyka:� najczęściej na podstawie objawów klinicznych

� laboratoryjne wykrycie wirusów w zmianach miejscowych

31

Ostre Ostre zakażenie uoguogóólnionelnione

Przykłady: odra, różyczka, ospa wietrzna i wiele innych

Diagnostyka:� objawy kliniczne

� wykrycie wirusa w zmianach miejscowych, wydzielinach, wydalinach, krwi

� wykrycie przeciwciał

Zakażenie przewlekłePrzykłady: przewlekłe WZW, zakażenie HIV

Diagnostyka:� objawy kliniczne� wykrycie wirusa we krwi

� monitorowanie poziomu wirusa we krwi (przewlekła wiremia)

� wykrycie wirusa w narządach wewnętrznych

� monitorowanie obecności i poziomu przeciwciał

32

III. Wybrane wirusy

chorobotwórcze dlaczłowieka

Wirusy ważne ze względu na groźne następstwa zakażenia

�wirusy wywołujące choroby zgłaszane i zwalczane z urzędu

�wirusy badane we krwi dawców

�wirusy stanowiące zagrożenie w przypadku zakażenia wrodzonego

33

Choroby wirusowe zgłaszane i zwalczane z urzędu (I)

� obowiązek zgłaszania, rejestracji i hospitalizacji:

– wirusowe zapalenia wątroby wszystkich typów

– biegunki wirusowe wieku dziecięcego

– wirusowe zapalenia mózgu i opon mózgowo-rdzeniowych

– nagminne porażenie dziecięce (poliomyelitis)

– wirusowe gorączki krwotoczne i tropikalne

– zespół nabytego upośledzenia odporności (obowiązek rejestracji i leczenia)

– wścieklizna

Choroby wirusowe podlegające obowiązkowi zgłaszania i rejestracji

�mononukleoza zakaźna

�różyczka

�świnka

�odra (+ szczepienia)

�grypa (obowiązek zgłaszania)

34

Wirusy badane we krwi dawców

�wirus zapalenia wątroby typu B

�wirus zapalenia wątroby typu C

�ludzki wirus upośledzenia odporności

Wirusy groźne w przypadku zakażenia wrodzonego

�HIV�WZW typu C�WZW typu B�wirus różyczki� ludzkie herpeswirusy typu 1 i 2 (wirusy

opryszczki typu 1 i 2)�wirus cytomegalii� także inne wirusy (wirus ospy wietrznej i

półpaśca, wirusy Coxsackie)