Wielofunkcyjność białka MDM2 oraz jego rola w niestabilności ...

42 www.postepybiochemii.pl

Wielofunkcyjność białka MDM2 oraz jego rolaw niestabilności genomowej komórek nowotworowych

Marta Małuszek1,2,

1Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, War-szawa 2Międzynarodowy Instytut Biologii Mole-kularnej i Komórkowej, Warszawa

Zakład Biologii Molekularnej, Między-narodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie, ul. Księcia Troj-dena 4, 02-109 Warszawa; tel.: (22) 597 07 00 wew. 741, e-mail: [email protected]

Artykuł otrzymano 1 października 2014 r.Artykuł zaakceptowano 27 listopada 2014 r.

Słowa kluczowe: supresor nowotworów, transformacja nowotworowa, onkogen, MDM2, naprawa dwuniciowych pęknięć DNA

Wykaz skrótów: DSB (ang. DNA double strand break) – pęknięcia dwuniciowe DNA; dsDNA (ang. double-strand DNA) – dwu-niciowy DNA; HR (ang. homologous recom-bination) – rekombinajca homologiczna; MDM2 – (ang. mouse double minute 2); MEF (ang. mouse embryonic fibroblasts) – mysie fi-broblasty zarodkowe; MRN – (ang. MRE11--RAD50-NBN); NBN – nibryna; NBN/NBS1 (ang. Nijmegen breakage syndrome protein 1, NBS1); NHEJ (ang. non-homologous end jo-ining) – niehomologiczne łączenie końców; p53 – (ang. cellular tumor antigen p53); SSA (ang. single strand annealing) – dopasowa-nie pojedynczych nici; ssDNA (ang. single--strand DNA) – jednoniciowy DNA

Podziękowania: Autorka składa podzięko-wania Prof. dr hab. Alicji Żylicz oraz Prof. dr hab. Maciejowi Żylicz za wsparcie mery-toryczne i edytorskie w przygotowaniu ni-niejszej pracy. Badania prowadzone przez autorkę poniższej pracy przeglądowej były finansowane ze środków na naukę przy-znanych przez Narodowe Centrum Nauki na realizację projektu NCN 2012/06/A/NZ1/00089.

STRESZCZENIE

Badania nad powstawaniem i biologią nowotworów ujawniły zwiększony poziom biał-ka MDM2 w różnych jego typach. Jednocześnie dowiedziono, że MDM2 w pewnych

warunkach może działać hamująco na proces transformacji nowotworowej. To sprawia, że mówi się o podwójnej roli MDM2, białka manifestującego właściwości onkogenne jak i su-presorowe. Złożona budowa, szereg makrocząsteczek oddziałujących z MDM2, a także wiele modyfikacji potranslacyjnych wpływają na różnorodność funkcji MDM2 w komórce. Zabu-rzenie równowagi w działaniu MDM2 wpływa na proces transformacji i rozwoju nowotwo-rów. Charakterystyczna dla komórek nowotworowych jest niestabilność genomowa, która bardzo często jest wynikiem zaburzeń naprawy DNA. W przypadku komórek prawidłowych MDM2 działa jako białko onkogenne, hamując naprawę uszkodzeń DNA. W przypadku ko-mórek nowotworowych MDM2 stymuluje naprawę uszkodzeń DNA wywołanych chemio- i radioterapią, stymulując w ten sposób zarówno chemio- jak i radiooporność.

WPROWADZENIE

Białko MDM2 z biochemicznego punktu jest E3 ligazą ubikwityny, która ubi-kwityluje i prowadzi do degradacji supresor nowotworów, białko p53. Obecny stan wiedzy pozwala jednak postrzegać MDM2 jako wielofunkcyjne białko za-angażowane w bardzo różnorodne procesy komórkowe. Jest dobrze udokumen-towane, że MDM2 ulega deregulacji w wielu przypadkach nowotworów i działa onkogennie zarówno za sprawą hamowania p53 jak i innych, niezależnych od p53 aktywności. MDM2 odgrywa znaczącą rolę w regulacji naprawy DNA pra-widłowych komórek, a wszelkie aberracje zaburzające ten proces są potencjalnie kancerogenne. W obliczu obecnie prowadzonych badań mających przybliżyć molekularny mechanizm powstawania i funkcjonowania komórek nowotworo-wych, zagadnienie MDM2 zajmuje znaczące miejsce. Obserwacje prowadzone nad onkogennym charakterem MDM2 często wydają się być rozbieżne lub na-wet wykluczające się. Celem niniejszej pracy przeglądowej jest przedstawienie udziału białka MDM2 w generowaniu niestabilności genomowej komórek no-wotworowych oraz w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA w świetle najnow-szych doniesień literaturowych.

PROTOONKOGEN MDM2

Protoonkogen Mdm2 (ang. Mouse double minute 2)1 został odkryty jako jeden z trzech genów (Mdm1, Mdm2 i Mdm3) ulegających ponad 50-krotnej amplifika-cji w pozachromosomalnym regionie nazywanym „double minute”, w mysich komórkach 3T3-DM, które uległy spontanicznej transformacji. Analiza tych se-kwencji wykazała, że w mysim genomie, w chromosomie 10 zlokalizowane są geny Mdm1 i Mdm2 [1]. Dziś wiadomo, że Mdm2 jest szeroko reprezentowany w świecie organizmów począwszy od bezkręgowców tak prostych jak płaskowce, jeżowce czy ukwiały, poprzez pajęczaki, mięczaki, niższe i wyższe kręgowce, aż do człowieka [2,3]. Już jedne z pierwszych badań ujawniły, że brak genu Mdm2 u myszy okazał się letalny, natomiast równoczesny brak genu Trp53, który koduje supresor nowotworów białko p53, powodował zniesienie letalności [4]. Przepro-wadzono także doświadczenia, w których wykorzystano myszy o zmniejszonej o ok. 30% ekspresji Mdm2. Zwierzęta takie miały obniżoną masę ciała, wyka-zywały wady w hematopoezie i charakteryzowały się wyższą wrażliwością na promieniowanie jonizujące [5]. Ludzki gen MDM2 (Ryc. 1) jest złożony z 12 eks-onów, które mogą generować więcej niż jeden produkt [6]. Są znane dwa pro-motory w obrębie sekwencji MDM2, P1 i P2 (Ryc. 1). P2 jest regulowany trans-krypcyjnie przez p53, a jego aktywacja prowadzi do powstania białka MDM2 o pełnej długości i masie 55 kDa. Promotor P1 jest aktywowany konstytutywnie, a 1 Zgodnie z obowiązującą nomenklaturą nazwa genu i białka ludzkiego zostały napisane wielkimi literami, natomiast w nazwie genu i białka mysiego pierwsza litera jest wielka, pozostałe są małe. Nazwy genów dodatkowo zostały napisane kursywą.

Postępy Biochemii 61 (1) 2015 43

jego produktem jest forma MDM2 o masie 50 kDa, która nie posiada domeny wiążącej p53 [7]. W P2 zostało zidentyfiko-wane miejsce polimorfizmu pojedynczego nukleotydu, SNP (ang. Single nucleotide polymorphism) skojarzone z podwyż-szeniem transkrypcji MDM2 i zwiększeniem ryzyka wystę-powania raka. Zamiana T na G w pozycji 309 (SNP309G) powoduje silniejsze wiązanie czynnika transkrypcyjnego Sp1 (ang. Transcription factor Sp1) w tym miejscu promotora i zwiększoną produkcję transkryptu MDM2 [8]. Natomiast polimorfizm występujący w pozycji 285 (SNP285C) zmniej-sza wiązanie Sp1 do promotora i powoduje obniżenie ry-zyka wystąpienia trzech głównych rodzajów nowotworów u kobiet - raka piersi, raka jajnika i raka endometrium [9].

FUNKCJE I LOKALIZACJA MDM2

MDM2 jest białkiem, które w komórce odgrywa szereg, często zupełnie odmiennych ról: I) Jest E3 ligazą ubikwity-ny, która odpowiada za ubikwitylację i doprowadzenie do degradacji w proteasomie supresora nowotworów, białka p53 [10]. II) Poprzez wiązanie się z N-końcową domeną p53 wpływa na transrepresję genów regulowanych przez to białko [11]. III) W wyniku stresu genotoksycznego MDM2 zostaje ufosforylowany (S395) i zaczyna oddziaływać z mRNA TP53 aktywując jego translację [12]. IV) Charaktery-zuje się aktywnością podobną do białka opiekuńczego (ang. chaperone like) względem p53 [13] (Ryc. 2). MDM2 występuje w komórce w cytoplazmie, jądrze i jąderku [14]. Lokalizacja komórkowa MDM2 jest regulowana odpowiednio przez se-kwencje lokalizacji jądrowej, NLS (ang. nuclear localization signal), eksportu jądrowego, NES (ang. nuclear export signal) i lokalizacji jąderkowej, NoLS (ang. nucleolar localization si-gnal) (Ryc. 3). Fosforylacja reszt serynowych 166 i 186 kie-ruje MDM2 z cytoplazmy do jądra komórkowego [15,16]. Transport z jądra do cytoplazmy i wzmożenie autoubikwi-tylacji jest powodowane przez związanie C-końcowej do-meny RING MDM2 z białkiem adaptorowym 14-3-3σ (ang. epithelial cell marker protein 1) [17]. Domena RING białka MDM2 posiada także w swojej sekwencji motyw Walkera A i motyw pętli P [18], które są charakterystyczne dla białek wiążących ATP/GTP. MDM2 wiąże nukleotyd wykazując największe powinowactwo do ATP, jednak nie katalizuje jego hydrolizy. Mutacja w obrębie pętli P powoduje nie-zdolność MDM2 do wiązania nukleotydu (MDM2 K454A). Pokazano, że funkcja wiązania ATP ogrywa istotną rolę w lokalizacji jąderkowej MDM2 po potraktowaniu komórek aktynomycyną D [19], jak również, że wiązanie nukleotydu

Rycina 1. Regulacja transkrypcji MDM2. Pierwszym kodującym eksonem genu MDM2 jest ekson 2. Promotor P2 (znajdujący się w eksonie 2) jest indukowany przez p53, podczas gdy transkrypcja z promotora P1 (ekson 1) jest konstytutyw-na. Transkrypcja z promotora P1 jest indukowana sygnałami pochodzącymi od mitogenów, hormonów, układu odpornościowego, a także bodźców stresowych. W przypadku komórek, które uległy transformacji nowotworowej może być pod-wyższona przez czynniki transkrypcyjne takie jak: p53, IRF8 (ang. interferon re-gulatory factor 8), Sp1 czy ETS (ang. E26 transformation-specific). Szereg mikro RNA (miR) może blokować translację mRNA MDM2 oddziałując z regionem 3’UTR [90]. Na rysunku kolejne eksony zaznaczono prostokątami. Zmodyfikowano wg [48].

Rycina 2. Funkcje MDM2 związane z aktywnością p53. Poznane funkcje MDM2 są związane z jego oddziaływaniem z białkiem MDMX. Homodimer MDM2 lub heterodimer MDM2-MDMX ubikwityluje i prowadzi do degradacji w proteaso-mie białko p53. MDM2 posiada aktywność autoubikwitylacji jak również odpo-wiada za przyłączenie ubikwityny do MDMX. MDM2 wpływa na transrepresję genów regulowanych przez p53, nie tylko ubiwitylując ten supresor nowotwo-rów, ale też poprzez bezpośrednie wiązanie się z p53 oraz indukcję ubikwityla-cji histonów otaczających region, w którym znajdują się sekwencje elementów odpowiedzi dla p53. MDM2 jest czynnikiem determinującym opiekuńczą rolę względem p53 i przyczynia się do translacji mRNA TP53.

Rycina 3. Struktura domenowa i modyfikacje potranslacyjne MDM2. Łańcuch polipeptydowy MDM2 zawiera 491 reszt aminokwasowych ułożonych w ewolu-cyjnie zachowane domeny. Szereg modyfikacji potranslacyjnych, w tym mające swój znaczny udział fosforylacje, wpływają na aktywność omawianego białka. Począwszy od końca aminowego znajdują się: miejsce fosforylacji reszty sery-nowej (S17) dla kinazy DNA-PKCS (ang. DNA-dependent protein kinase); kieszeń hydrofobowa (25-100aa) odpowiadająca za wiązanie p53; sygnał lokalizacji jądro-wej (179-185aa) oraz sygnał eksportu jądrowego (190-202aa), w obrębie których znajdują się reszty aminokwasowe fosforylowane przez kinazę AKT (alt. nazwa PKB, ang. protein kinase B-alpha); miejsce fosforylacji dla kinazy CDK2 (ang. cyc-lin-dependent kinase inhibitor 2A) [91]; domena kwaśna (243-301aa), a w niej miej-sca fosforylacji dla kinazy GSK3 (ang. glycogen synthase kinase-3 alpha) obniżające zdolność wiązania p53 [92]; kinazy CK1 (ang. casein kinase 1), wpływające na ubi-kwitylację MDM2 przez SCF(beta-TRCP) (ang. F-box/WD repeat-containing protein 1A) [93]; kinazy CK2 (ang. casein kinase 2) obniżające zdolność wiązania MDM2--p53 [94,95]; motyw palca cynkowego (290-335aa); miejsca fosforylacji dla kinazy c-ABL (ang. tyrosine-protein kinase ABL1) [96]; miejsca fosforylacji dla ATM (ang. ataxia telangiectasia mutated); domena RING zlokalizowana na końcu karboksylo-wym, w obrębie której znajduje się miejsce wiązania dla ATP oraz sygnał loka-lizacji jąderkowej. Miejsca fosforylacji oznaczone kolorem zielonym prezentują wzrost zahamowania aktywności białka p53 zależny od MDM2. Miejsca fosfory-lacji oznaczone kolorem żółtym prezentują obniżenie zahamowania aktywności białka p53 zależne od MDM2. Hamowanie oddziaływania MDM2 z p53 ozna-czone jest jako OBB (oddziaływanie białko-białko); modulacja stabilności MDM2 oznaczona jest jako S; zamiana statusu oligomeryzacji MDM2 oznaczona jest jako O; modulacja oligomeryzacji i stabilności oznaczona jest jako O/S. Zmodyfiko-wano wg [48].


jest czynnikiem determinującym opiekuńczą rolę MDM2 względem p53.

SIEĆ ODDZIAŁYWAŃ MDM2

Spośród wszystkich białek oddziałujących z MDM2 tym najlepiej opisanym jest białko p53. Regulacja oddziaływania pomiędzy MDM2 i p53 opiera się na pętli sprzężenia zwrot-nego. p53 jest czynnikiem transkrypcyjnym indukującym promotor P2 MDM2. Ponieważ MDM2 hamuje aktywność p53 powstaje ujemne sprzężenie zwrotne, które w warun-kach bezstresowych ściśle reguluje poziom białka p53 [20]. Z drugiej strony niskie stężenie p53 warunkuje utrzyma-nie podstawowego, niskiego poziomu MDM2. Dodatko-wo MDM2 ubikwityluje i prowadzi do degradacji również sam siebie [21]. W warunkach stresowych, np. w obecności czynników uszkadzających DNA, następuje stabilizacja i akumulacja p53 [22]. W wyniku indukcji uszkodzeń DNA kinaza ATM fosforyluje MDM2 i p53, zapobiegając tworze-niu się kompleksu MDM2-p53, co powoduje zahamowanie ubikwitylacji p53. Ufosforylowany MDM2 (S395) wiąże się także do mRNA TP53 i wzmacnia jego translację. Paralo-giem MDM2 jest białko MDMX (zwane także MDM4). Po-dobnie jak MDM2 pełni rolę regulatorową wobec p53, a zaburzenia w jego funkcjonowaniu są skorelowane z pro-cesem transformacji nowotworowej [23]. MDM2 tworzy za-równo homodimery jak i heterodimery z MDMX [24]. Oba białka dzielą 50% homologii sekwencji aminokwasowej, przy czym homologia końca aminowego wiążącego p53 wynosi 70% [25]. MDMX posiada domenę RING jednak nie ubikwityluje i nie prowadzi do degradacji p53, natomiast samo jest substratem MDM2 lub, określając to bardziej pre-cyzyjnie, kompleksu MDM2-MDMX, jest ubikwitylowane i kierowane do proteolizy [26,27] (Ryc. 2). Sugeruje się, że forma oligomeryzacji MDM2 reguluje stabilność zarówno MDM2 jak i MDMX, jednak to zagadnienie nie jest jeszcze w pełni zbadane [28,29]. Dotychczas pokazano, że tworze-nie heterodimeru MDM2-MDMX wzmaga aktywność E3 ligazową MDM2 i tym samym przyczynia się do degrada-cji zarówno p53 jak i MDM2 [30,31]. Wiadomo również, że fosforylacja katalizowana przez ATM wpływa na deoligo-meryzację, destabilizując MDM2 po uszkodzeniu DNA [32]. Dotychczas scharakteryzowano wiele białek wiążących się do MDM2, jak również opisano funkcje, które są niezależne od najwnikliwiej zbadanej interakcji: MDM2-p53. Złożona budowa domenowa pozwala MDM2 oddziaływać nie tylko z ponad 100 białkami lecz także z nukleotydami. Co ważne, nie wszystkie białka, które oddziałują z MDM2, są przez nie ubikwitylowane. Ta właściwość MDM2 plasuje je w gronie białek węzłowych (ang. hub proteins), czyli posiadających wiele współoddziałujących partnerów w postaci białek czy kwasów nukleinowych z różnych obszarów komórki [33]. Aby pośredniczyć i brać udział w wielu zróżnicowa-nych oddziaływaniach, białka węzłowe muszą być ściśle selektywne i precyzyjnie regulowane. Istnieje hipoteza, że MDM2 można rozpatrywać również w kategorii białka rusztowania (ang. scaffold protein), czyli takiego, które sta-nowi punkt wiązania dla białek danej ścieżki sygnałowej. Interakcje MDM2 z innymi cząsteczkami są determinowane przez jego lokalizację w komórce, izoformy, w jakich wystę-puje, a także modyfikacje potranslacyjne, które wpływają na jego konformację (Ryc. 3).

AKTYWACJA MDM2 W NOWOTWORACH

Badania nad powstawaniem nowotworów ujawniły, że zwiększony poziom MDM2 odnajdywany jest w kostnia-komięsakach [34], mięsakach oraz rakach płaskonabłonko-wych głowy i szyi [35,36]. Wykazano ponadto, że nadpro-dukcją MDM2 charakteryzują się raczej guzy metastatyczne i nawracające niż pierwotne [37]. Badania na niedrobnoko-mórkowym raku płuca, NSCLC (ang. non-small-cell lung car-cinoma) ujawniły, że amplifikacja MDM2 jest złym progno-stykiem dla chorych [38]. Spośród przeanalizowanych 28 typów nowotworów amplifikacją MDM2 charakteryzowało się średnio 7% z nich, z czego największy udział, 20%, przy-padał na nowotwory tkanek miękkich. W tej samej analizie wykazano, że w 29 na 33 przypadki badanych nowotworów charakteryzujących się amplifikacją MDM2, występowała niezmieniona forma genu TP53 [39]. Podwyższenie stężenia MDM2 w komórkach nowotworowych w wielu przypad-kach wywołane może być przez czynniki niezależne od p53. Już pierwsze badania pokazały, że niezależnie od statusu p53, podwyższony poziom MDM2 w gruczole piersiowym prowadził do niestabilności genetycznej i rozwoju nowo-tworu [40]. Wykazano, że doksorubicyna, antybiotyk sto-sowany przy leczeniu niektórych rodzajów nowotworów, obniża poziom zarówno mRNA MDM2 jak i białka MDM2 niezależnie od tego, w jakiej formie występuje p53, zmie-nionej lub niezmienionej [41]. W badaniach nad rolą estro-genów w kontroli białek, niezależnej od p53, związanych z regulacją cyklu komórkowego komórek raka piersi wyka-zano, że w promotorze P2 MDM2 znajduje się sekwencja elementu odpowiedzi na receptor ERα (ang. estrogen recep-tor α). Autorzy badania postulują, że najprawdopodobniej niezależna od p53 transkrypcja MDM2, w komórkach raka piersi zależnych od estrogenu, promuje wykluczenie działa-nia niezmienionej formy p53 w jądrze i może prowadzić do obejścia punktów kontrolnych cyklu komórkowego G1/S oraz G2/M [42]. Z kolei doświadczenia na transgenicz-nych myszach nie posiadających p53, badające tzw. jałowy naciek, połączyły aktywność Mdm2 i gojenie się nabłonka występujące w poudarowym, ostrym niedokrwieniu nerek. Pokazano, że jałowy naciek został znacznie wytłumiony po zablokowaniu Mdm2 jego inhibitorem nutliną-3A. Bloka-da Mdm2 osłabiła poniedokrwienną indukcję czynników prozapalnych takich jak cytokiny i chemokiny, jak również następujące po tym rekrutowanie leukocytów do miejsca uszkodzenia tkanki. Pokazano, że Mdm2 działa jako kofak-tor białka NFκB (ang. nuclear factor NF-kappa-B); wiążąc się do sekwencji miejsc odpowiedzi dla tego czynnika trans-krypcyjnego promuje powstawanie mRNA elementów pro-zapalnych zależnych od NFκB [43,44]. Warto także nadmie-nić, że w ostatnich badaniach nad mysim modelem gruczo-lakoraka trzustki otrzymano pozytywne wyniki działania inhibitorów Mdm2 skojarzonych z inhibitorami topoizome-razy II na niektóre grupy komórek rakowych, niezależnie od statusu p53 [45]. Wielokierunkowe działanie MDM2, złożoność budowy i mnogość białek z jakimi wchodzi ono w interakcje daje szerokie pole do analizy funkcjonowania tego białka i jego zaangażowania w mechanizm transfor-macji nowotworowej. Tło genetyczne, na jakim manifestuje się ekspresja MDM2 jest niezwykle istotnym czynnikiem w analizie problemu. Transgeniczne myszy nie posiadają-ce p53 rozwijają spektrum nowotworów inne niż zwierzę-


ta, które dodatkowo wykazują zwiększony poziom Mdm2 [46]. Istotny wkład w problematykę zagadnienia mają bada-nia, które wyraźnie pokazują, że efekt działania MDM2 ma-nifestuje się różnie w zależności od tkanki i typu komórek [47]. Guzy, w których odnaleziono podwyższony poziom MDM2 i/lub MDMX charakteryzują się niższą aktywnością p53, lecz niektóre z nich mają jednocześnie podwyższony poziom MDM2 i/lub MDMX i nieaktywny gen TP53 [48].

MDM2 JAKO BIAŁKO O WŁAŚCIWOŚCIACH ONKOGENNYCH I SUPRESORA TRANSFORMACJI NOWOTWOROWEJ

Identyfikacja mechanizmów molekularnych przyczynia-jących się do powstawania nowotworów jest drogą wyjścia do projektowania nowych leków, terapii, ale też profilakty-ki przeciwnowotworowej. Cały czas żywa jest dyskusja za-gadnienia podwójnej roli MDM2: jako białka onkogennego lub supresora nowotworów [49]. MDM2 z jednej strony za-chowuje się jak białko onkogenne stymulujące transforma-cję nowotworową, moduluje aktywność supresora nowo-tworów p53 (inaktywuje i degraduje p53). Co istotne, działa jako białko onkogenne także w reakcjach niezależnych od p53: wzmaga translację czynnika antyapoptotycznego XIAP (ang. X-linked inhibitor of apoptosis protein), stymulując w ten sposób przeżywalność komórek nowotworowych; promuje translację onkogenu MYCN (ang. N-myc proto-oncogene pro-tein) [50]; ubikwityluje i prowadzi do degradacji, między innymi, czynnik FOXO3A (ang. Forkhead box protein O3), co prowadzi do pozytywnej kontroli cyklu komórkowego [51]; hamuje aktywność supresora nowotworów pRB (ang. retinoblastoma-associated protein) [52], uniemożliwiając w ten sposób zajście apoptozy; stymuluje angiogenezę, aktywuje NFκB i hamuje naprawę DNA, zwiększając niestabilność ge-netyczną komórki. Z drugiej strony MDM2 działa także jako supresor nowotworów - utrata aktywności MDM2 powo-duje podwyższenie ekspresji zmutowanych TP53, których produkty białkowe, jeśli nie są degradowane z udziałem MDM2, nabywają aktywności onkogennych; wspomagając export z jądra umożliwia apoptozę prowadzącą przez szlak mitochondrialny zależny od p53; po uszkodzeniu DNA sty-muluje translację mRNA TP53 oraz fałdowanie powstające-go łańcucha polipeptydowego p53 do jego natywnej formy. Reasumując, MDM2 modulując aktywność supresorów no-wotworowych oraz onkogenów wpływa na transformację nowotworową, a część z tych reakcji jest niezależna od kla-sycznego oddziaływania MDM2 z p53 (Ryc. 4).

UDZIAŁ MDM2 W PROCESACH ZWIĄZANYCH Z NAPRAWĄ DNA

Nienaprawiony materiał genetyczny komórki może pro-wadzić do nagromadzenia mutacji, a w konsekwencji do chorób genetycznych (jeśli mutacje są pierwotne) lub nowo-tworów. Uszkodzony w czasie chemioterapii DNA może również stać się przyczyną śmierci komórki nowotworowej. Rozmaite czynniki pochodzące z wnętrza komórki, które można uznać za fizjologiczne lub przypadkowe, wynika-jące ze środowiska zewnętrznego mogą przyczynić się do zmian naruszających integralność DNA. Wiadomo, że na skutek indukcji pęknięć DNA, powstałych w wyniku che-mioterapii czy napromienienia, domena kwaśna MDM2 zo-

staje zdefosforylowana [53], a koniec karboksylowy ulega fosforylacji przez kinazy c-Abl oraz ATM, co wpływa na deoligomeryzację i destabilizację MDM2 [54,55]. W komór-kach prawidłowych szereg modyfikacji potranslacyjnych zarówno MDM2 jak i p53, które pojawiają się po uszkodze-niu DNA ma na celu zdestabilizowanie wiązania MDM2--p53 poprzez zmianę konformacji obu białek. Fosforylacja p53 zapobiega jego degradacji oraz uruchamia jego aktyw-ność transkrypcyjną. Komórki nowotworowe charaktery-zują się dużą niestabilnością genomową/chromosomową. Rozwój nowotworu, porównywany jest do ewolucyjnego mechanizmu doboru naturalnego. Komórki, które ulegają transformacji, dzięki niestabilności informacji genetycznej, mają szanse na dostosowanie się do zmieniających się wa-runków otoczenia, na przykład niedoboru tlenu czy gluko-zy. Ta selekcja komórek, które są w stanie dostosować się do nowych warunków otoczenia zależna jest nie tylko od częstości mutacji, ale także od systemu naprawy DNA. W skrajnych przypadkach zbyt duża częstość mutacji i niewy-dajna ich naprawa może spowodować apoptozę lub nekro-zę komórek nowotworowych. Udział MDM2 w procesie transformacji zazwyczaj kojarzony jest z jego aktywnością jako E3 ligazy w stosunku do p53. Pokazano jednak rów-nież w licznych pracach [56-58], że MDM2 niezależnie od p53 i od swojej aktywności E3 ligazy może prowadzić do rozwoju nowotworu. Doświadczenia przeprowadzone na mysich fibroblastach zarodkowych, MEF (ang. mouse embry-onic fibroblasts), które nie posiadają p53, pokazały, że nad-produkcja białka MDM2 powoduje spontaniczne złamania chromatyd i chromosomów, jak również opóźnia naprawę DNA [59]. Taka właściwość MDM2 objawiająca się w ko-mórkach może być bezpośrednią przyczyną transformacji nowotworowej. Obserwowana zwłoka w naprawie DNA komórek prawidłowych nadprodukujących MDM2 może mieć źródło w opóźnieniu fosforylacji cząsteczek zaangażo-wanych we wczesną odpowiedź na uszkodzenia materiału genetycznego [60]. Podobne wyniki, jakie opisano powyżej uzyskano także z doświadczeń wykonanych z wykorzy-staniem tych samych komórek (MEF) nadprodukujących MDMX. Autorzy obu badań wnioskują, że regulacja na-

Rycina 4. MDM2 moduluje procesy związane z transformacją nowotworową. DNA Polε (ang. DNA polymerase epsilon) – polimeraza DNA ε; NBN – nibryna; NBN/NBS1 (NBS1, ang. Nijmegen breakage syndrome protein 1); E2F1 (alternatyw-na nazwa RBAP-1, ang. retinoblastoma-associated protein 1) – czynnik transkryp-cyjny; p21 (alt. nazwa WAF1, ang. wild type p53-activated fragment 1) – inhibitor kinaz zależnych od cyklin; pRB – supresor nowotworów; FOXO3A – czynnik transkrypcyjny; ECDH (ang. epithelial cadherin, e-cadherin) – E-kadheryna, białko adhezyjne; VEGF (ang. vascular endothelial growth factor) – czynnik wzrostu; XIAP – inhibitor kaspaz; NFκB – czynnik transkrypcyjny. Zmodyfikowano wg [97].


prawy DNA jest zachowaną ewolucyjnie funkcją członków rodziny białek MDM [61]. Doświadczenia przeprowadzone w naszym laboratorium potwierdzają te obserwacje, że w komórkach MEF podwyższona produkcja białka MDM2 przyczynia się do powstawania większej liczby pęknięć i złamań chromatyd. Co ciekawe, w przypadku zastoso-wania produktu białkowego zmutowanej formy MDM2, nie wiążącego ATP (MDM2 K454A), spontaniczne uszko-dzenia chromosomów występują z niższą częstotliwością, zbliżoną do wartości kontrolnej. Sytuacja zupełnie inaczej wygląda w ludzkich, nowotworowych komórkach niedrob-nokomórkowego raka płuca (linia komórkowa H1299). O ile samych uszkodzeń jest relatywnie więcej, to ani MDM2 ani jego zmieniona forma nie wiążąca ATP (MDM2 K454A) nie powodują zwiększenia liczby obserwowanych złamań i pęknięć chromatyd i chromosomów. Nadprodukcja MDM2 (lub MDM2 K454A) w linii H1299 ukazała nam interesujący fenotyp - niezdolność wiązania ATP przez MDM2 obniża wydajność, spowalnia w czasie naprawę DNA i negatyw-nie wpływa na przeżywalność komórek nowotworowych. Zgłębiając to zagadnienie zauważyliśmy również, że wiąza-nie ATP przez MDM2 wpływa na obniżenie jego stabilności po zaindukowaniu pęknięć obu nici DNA. Z naszych badań wynika, że w komórkach nowotworowych przyłączanie nukleotydu do MDM2 odgrywa niebagatelną rolę w proce-sie naprawy DNA zachodzącej dzięki/z udziałem homolo-gicznej rekombinacji. Wyniki te po raz kolejny sugerują, że nadprodukcja MDM2 w komórkach może mieć różne obli-cza i działać jak miecz obosieczny, w przypadku komórek prawidłowych MDM2, hamując naprawę DNA, stymuluje niestabilność genetyczną niezbędną do transformacji nowo-tworowej. W przypadku komórek, które już uległy transfor-macji nadprodukcja MDM2 promuje naprawę zaindukowa-nych uszkodzeń DNA, przyczyniając się do przeżywalności komórek nowotworowych i nabywania przez nie oporności na działanie chemioterapeutyków uszkadzających DNA.

NAPRAWA DWUNICIOWYCH PĘKNIĘĆ DNA

Dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB, ang. DNA double--strand breaks) są szczególnie niebezpieczne dla komórki. Brak jest nici, która mogłaby służyć jako matryca do synte-zy DNA. DSB prowadzą do zahamowania replikacji i mogą przyczynić się do utraty dłuższych fragmentów nici DNA. Dwuniciowe pęknięcia mogą być reperowane za pomocą rekombinacji homologicznej (HR, ang. homologous recom-bination) zwanej też naprawą rekombinacyjną, niehomolo-gicznego łączenia końców (NHEJ, ang. non-homologous end joining) oraz dopasowania pojedynczych nici (SSA, ang. sin-gle strand annealing). SSA zachodzi w miejscach sekwencji powtarzalnych (repetytywnych) i wymaga udziału białka RAD52 (ang. DNA repair protein RAD52 homolog) oraz kom-pleksu nukleolitycznego XPF/ERCC1 (ang. Xeroderma pig-mentosum group F-complementing protein i ang. excision repair cross-complementation group 1) [62]. W odpowiedzi na usz-kodzenie DSB aktywacji ulegają białka z grupy kinaz sko-relowanych z kinazami fosfatydyloinozytolu-3 (PIKK, ang. phosphatidylinositol-3 kinase-like family) - ATM, ATR i DNA--PKCS oraz białka z rodziny polimeraz poli(ADP-ryboza), PARP (ang. poly(ADP-ribose) polymerase). ATM i ATR biorą udział między innymi w naprawie HR i NHEJ, stabilizują również widełki replikacyjne w trakcie replikacji [63]. p53

warunkuje zatrzymanie cyklu komórkowego, apoptozę lub starzenie się komórki [64]. Głównym czynnikiem wpływa-jącym na wybór ścieżki naprawy jest zasięg, w jakim końce DNA w miejscu uszkodzenia ulegną wstępnemu wycięciu (resekcji). Klasyczny NHEJ może przebiegać bez wycięcia nukleotydów w miejscu pęknięcia, natomiast HR i szereg modyfikacji tych napraw wymagają resekcji [65]. Cztery, częściowo niezależne kompleksy sensorowe biorą udział w wymienionych wyżej naprawach: MRN (MRE11-RAD50--NBS1; ang. meiotic recombination 11 – ang. DNA repair protein RAD50 – ang. Nijmegen breakage syndrome protein 1), hetero-dimer złożony z białka Ku70 (alt. nazwa XRCC6, ang. X-ray repair cross-complementing protein 6) oraz białka Ku80 (alt. nazwa XRCC5, ang. X-ray repair cross-complementing protein 5), PARP (ang. poly(ADP-ribose) polymerase) i RPA (ang. repli-cation protein A 32 kDa subunit). Składowe kompleksu MRN są fosforylowane przez kinazę ATM, co prowadzi do akty-wacji odpowiedzi na uszkodzenia DNA i tworzy dodatnią pętlę sprzężenia zwrotnego, która podtrzymuje aktywność samego ATM [66,67]. Udział MDM2 w zaobserwowanej in-dukcji niestabilności genomowej jest ściśle sprzężony z wią-zaniem i osłabianiem aktywności białka NBN (NBS1, ang. Nijmegen breakage syndrome protein 1) z kompleksu MRN przez MDM2 [68]. Pokazano, że podwyższony poziom MDM2 w komórkach MEF, który hamuje NBN prowadzi do większej liczby złamań chromosomów i opóźnienia na-prawy DNA [59]. Porządek w wyborze sposobu naprawy pęknięć dwuniciowych DNA jest możliwy dzięki negatyw-nej kontroli jednego szlaku naprawy przez drugi. Istotnym aspektem w regulacji tych procesów jest acetylacja białka CTIP (ang. CtBP-interacting protein), aktywatora resekcji i białka współoddziałującego z BRCA1 (ang. breast cancer type 1) oraz kompleksu MRN, który to tworzy się na DSB niezależnie od sposobu naprawy DSB. W trakcie trwania fazy G1 cyklu komórkowego, acetylacja CTIP ma charakter konstytutywny i utrzymuje to białko w stanie nieaktyw-nym (Ryc. 5). Dodatkowo 53BP1 (ang. p53-binding Protein 1) i oddziałujące z nim białko biorące udział w kontroli cyklu komórkowego RIF1 (ang. telomere-associated protein RIF1) zapobiegają wiązaniu CTIP i BRCA1, promując naprawę NHEJ [69]. W momencie wejścia komórki w fazę S deacety-laza SIRT6 (ang. NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-6) usuwa grupę acetylową z CTIP aktywując tę endonukleazę

Rycina 5. Regulacja wyboru drogi naprawy. Kompleks MRN (składający się z białek MRE11, RAD50 oraz NBN) tworzy się w miejscach DSB niezależnie od tego czy dojdzie do naprawy HR czy NHEJ. W fazie G1 białko CTIP pozosta-je w formie zacetylowanej, co hamuje jego aktywność endonukleolityczną. Do-datkowo oddziałujące ze sobą 53BP1 oraz białko RIF1 zapobiegają przyłączeniu BRCA1 do CTIP i hamują możliwość rozpoczęcia naprawy drogą rekombinacji homologicznej, promując niehomologiczne łączenie zakończeń. W fazie S/G2 deacetylaza SIRT6 katalizuje odłączenie grupy acetylowej od CTIP, możliwe jest wtedy związanie BRCA1, zainicjowanie resekcji oraz przeprowadzenie naprawy HR. Hamujący wpływ MDM2 na NBN z kompleksu MRN może przyczyniać się do zaburzenia regulacji wyboru drogi naprawy. Zmodyfikowano wg [98].


i przyczynia się do promocji resekcji, a co za tym idzie na-prawy HR (Ryc. 5) [70].

REKOMBINACJA HOMOLOGICZNA

Naprawa poprzez rekombinację homo-logiczną zachodzi po replikacji, w trakcie późnej fazy S. Po uformowaniu się chro-matyny, siostrzana chromatyda z drugie-go chromosomu może służyć jako matryca do przeprowadzenia dokładnej naprawy [71]. MDM2 wiążąc się do NBN może mo-dulować szybkość z jaką zachodzi napra-wa DNA, przy czym nie jest to związane z aktywnością MDM2 jako E3 ligazy [59]. Dobrze poznane etapy naprawy poprzez HR obejmują (Ryc. 6): I) Utworzenie frag-mentów jednoniciowych po stronie 3’ w miejscu podwójnego pęknięcia; jest to wa-runek konieczny, aby mogła zajść inwazja nici homologicznej i utworzenie hetero-dupleksu DNA. Wolne końce 3’ są gene-rowane na każdej z obu nici DNA. Proces przebiega dwuetapowo [72]. Pierwszy etap - inicjacji angażuje endonukleazę CTIP oddziałującą z BRCA1 oraz białko MRE11, charakteryzujące się aktywnością endo- i egzonukleazową, znajdujące się w kompleksie MRN. Wycięcie nukleotydów w obszarze pęknięcia ma miejsce w późnej fazie S, kiedy są już uformowane siostrza-ne chromatydy i zachodzi możliwość re-kombinacji. Drugi etap - elongacji zacho-dzi przy udziale kompleksu BLM złożo-nego z helikazy BLM (ang. Bloom syndrome protein), topoizomerazy Top3α (ang. DNA topoisomerase 3-alpha), białek RMI1 (ang. RecQ-mediated genome instability protein 1) i RMI2 (ang. RecQ-mediated genome insta-bility protein 2) oraz egzonukleazy EXO1 (ang. exonuclease 1), które kontynuują re-sekcję [73] (Ryc. 6). II) Opłaszczenie jed-noniciowych końców 3’ przez białko RPA. Przeprowadzenie wymiany pojedynczych nici DNA wymaga złożenia, rearanżacji, a następnie rozłożenia filamentów białka RAD51 (ang. DNA repair protein RAD51 homolog 1). Najprawdopodobniej RAD51 nie jest w stanie wejść w oddziaływanie z pojedynczą nicią DNA, dlatego jedno-niciowe końce DNA zostają opłaszczone przez białko RPA [74] (Ryc. 6). Dotychczas proces ten zbadano i przedstawiono na odpowiednikach bakteryjnych, ale można przypuszczać, że u organizmów wyższych dzieje się podobnie [75]. III) Zastąpienie RPA przez RAD51 w celu utworzenia fi-lamentu nukleoproteinowego. RAD51 przy udziale białka BRCA2 (ang. breast cancer type 2) oddziałuje z jednoniciowym DNA. W procesie zależnym od hydrolizy ATP zostają utworzone nukleofilamenty

złożone z jednoniciowego DNA (ang. single-strand DNA, ssDNA) i RAD51 [76]. IV) Utworzenie heterodupleksu DNA i struktury Hollidaya (ang. Holliday Junction, HJ). Re-aranżacja przestrzenna RAD51 związanego z DNA i BRCA2 umożliwia wymianę nici między siostrzanymi chromatyda-

Rycina 6. Naprawa dwuniciowych pęknięć DNA. W zależności od początkowego zaawansowania wycięcia nukleotydów (lub jego braku) DSB mogą zostać naprawione na jeden z trzech sposobów. 1. NHEJ: Związanie Ku70/80 promuje naprawę NHEJ przyłączając kinazę DNA-PKCS. MDM2 może ubikwitylować i obniżać po-ziom podjednostki Ku70. DNA-PKCS fosforyluje MDM2 i umożliwia zahamowanie cyklu komórkowego w celu naprawy DNA. Fosforylacje przeprowadzane przez DNA-PKCS aktywują kompleks endo/egzonukleolityczny ARTEMIS. Autofosforylacja DNA-PKCS zapobiega nadmiernej obróbce końców DNA przez ARTEMIS. Końco-wym etapem jest ligacja końców DNA. 2. HR: W początkowych etapach naprawy DSB białko PARP konkuruje z Ku70/80 o dostęp do zakończeń DNA. MDM2 oddziałuje z NBN z kompleksu MRN hamując jego aktywność w procesie naprawy. Wstępna resekcja przebiega przy udziale białka CTIP oraz BRCA1. Dalsze wycinanie nukleotydów i opłaszczenie wolnych końców 3’ DNA przez białko RPA jest promowane przez EXO1 i BLM. Kinaza ATM pełni kluczową rolę w fosforylacji elementów składowych kaskady naprawy HR. Wymiana RPA na RAD51 przy udziale BRCA2 powoduje utworzenie nukleofilamentów i inwazję nici na sekwencję homo-logiczną. Może dojść do cięcia przy pomocy kompleksu MUS81/EME1 lub utworzenia HJ. HJ może zostać przecięte w sposób umożliwiający powstanie rekombinantu lub heterodupleksu, dzieje się to przy udziale kompleksu białek MUS81/EME1, które łączą się z SLX1/SLX4 i nukleazą GEN1. HJ może także ulec rozple-ceniu przy pomocy kompleksu BLM/TOPOIIIa. 3. SSA: jednoniciowe fragmenty 3’ są tworzone bezpośrednio w sąsiedztwie pęknięcia nici DNA. RAD52 katalizuje reakcję łączenia końców 3’ DNA, kompleks XPF/ERCC1 usuwa wolne końce DNA. Zmodyfikowano wg [99].


mi i utworzenie heterodupleksu DNA [77] (Ryc. 6). Uważa się, że BRCA2 oddziałuje z RAD51 promując powstawanie filamentów RAD51 raczej z ssDNA niż z dwuniciowym DNA (ang. double-strand DNA, dsDNA) [78]. V) Migracja rozgałęzienia wzdłuż nici DNA. W procesie migracji rozga-łęzienia DNA biorą udział helikazy z rodziny RecQ: BLM, RECQ1 (ang. ATP-dependent DNA helicase Q1), RECQ5 (ang. ATP-dependent DNA helicase Q5) i RAD54 (ang. DNA repair and recombination protein RAD54-like) [79]. VI) Uwolnienie naprawionego DNA. Naprawiony DNA może zostać uwol-niony ze struktury Hollidaya na trzy sposoby. Pierwszy z nich zakłada rozplecenie nici naprawionego DNA i po-wstanie heterodupleksu, co oznacza, że DNA siostrzanych chromatyd nie zostało wymienione, a jedynie użyte jako matryca do naprawy. Dzieje się to przy udziale topoizome-razy IIIa, RMI1 i RMI2. Druga i trzecia możliwość obejmują przecięcie nici DNA i powstanie rekombinantu lub hete-rodupleksu, zależnie od orientacji cięcia nukleolitycznego. Endonukleaza GEN1 (ang. flap endonuclease GEN homolog 1) przeprowadza symetryczne cięcie w obu niciach u podsta-wy HJ. Takie cięcie może być przeprowadzone również przez endonukleolityczny heterodimer MUS81-EME1 (ang. crossover junction endonuclease MUS81 i ang. crossover junc-tion endonuclease EME1). Białko SLX4 (ang. structure-specific endonuclease subunit SLX4) sprawuje funkcję rusztowania dla aktywnych endonukleaz [80] (Ryc. 6). Pokazano, że in-hibitory MDM2 mogą wpływać na spowolnienie naprawy HR działając stymulująco na p53 [81].

NIEHOMOLOGICZNE ŁĄCZENIE KOŃCÓW DNA

Niehomologiczne łączenie końców jest naprawą, któ-ra zachodzi w komórce w czasie trwania całego cyklu ko-mórkowego, przy czym szczególne znaczenie ma w fazie G1. Jest to główny rodzaj naprawy pęknięć dwuniciowych DNA [82]. Kluczowymi elementami biorącymi udział w na-prawie NHEJ są: heterodimer Ku70/80, podjednostka ka-talityczna kinazy białkowej zależnej od DNA - DNA-PKCS, egzo- i endonukleazowy kompleks ARTEMIS/DCLRE1C (ang. DNA cross-link repair 1C protein), białko XRCC4 (ang. X-ray repair cross-complementing protein 4), ligaza DNA IV oraz czynnik XLF (ang. XRCC4-like factor; alt. nazwa: Cern-nunos). Proces naprawy zachodzi w trzech etapach (Ryc. 6): I) Rozpoznanie dwuniciowego pęknięcia DNA. Ku70/80, toroidalny heterodimer o aktywności helikazy rozpozna-je miejsce DSB, częściowo zabezpiecza wolne końce DNA oraz rekrutuje do miejsca uszkodzenia kinazę serynowo--treoninową DNA-PKCS. DNA-PKCS wpływa na wewnętrz-ną translokację Ku70/80 i swoje umiejscowienie na końcach przeciętych nici [83]. Pokazano, że DNA-PKcs fosforylując MDM2 (S17) osłabia wiązanie MDM2-p53 i umożliwia za-hamowanie cyklu komórkowego [84]. II) Obróbka niesparo-wanych końców DNA. W miejscu uszkodzenia formuje się holoenzym DNA-PKCS. Oddziaływanie pomiędzy dwoma cząsteczkami DNA-PKCS znajdującymi się na sąsiadujących ze sobą niciach stymuluje ich aktywność kinazową, tworzy się kompleks synaptyczny, który na zasadzie pomostu tym-czasowo łączy obie nici [85]. Dochodzi do autofosforylacji, a następie do dysocjacji DNA-PKCS. DNA-PKCS fosforyluje Ku70/80 pobudzając jej aktywność helikazową. Ku70/80 rozplata końce DNA w miejscu uszkodzenia. Do miejsca naprawy rekrutowana jest endonukleaza ARTEMIS, kon-

trolowana przez kinazę ATM. Grupa ARTEMIS/DNA-PKCS ma możliwość nukleolitycznego cięcia i usuwania różnego typu wolnych końców DNA powstałych w miejscu DSB [86]. Kinaza/fosfataza polinukleotydowa PNKP (ang. po-lynucleotide kinase/phospatase), która oddziałuje z białkiem XRCC4 usuwa grupę fosforanową z końca 3’ jak również dodaje ją do końca 5’, aby umożliwić ligację [87]. III) Ligacja. Łączenie wolnych końców DNA przeprowadza ligaza DNA IV w kompleksie z XRCC4. Czynnik XLF stymuluje zarów-no kompleks XRCC4/ligaza DNA IV jak i samo XRCC4 w wydajnym łączeniu końców DNA [88] (Ryc. 6). Elastycz-ność z jaką mogą działać nukleaza, polimerazy i ligaza na-prawy NHEJ sprawia, że ostateczny wynik naprawy DNA może być zróżnicowany mimo, że początkowy uszkodzo-ny materiał był taki sam. Ku70 wiąże i hamuje aktywność białka BAX (ang. Bcl-2-asocciated X protein). Dowiedziono, że MDM2 ubikwityluje Ku70 obniżając jego poziom. Auto-rzy badania sugerują, że ubikwitylacja Ku70 przez MDM2 może spełniać funkcję przełącznika i być elementem regula-cji w procesie prowadzącym do apoptozy po uszkodzeniu DNA [89].

PODSUMOWANIE

MDM2 jest wielofunkcyjnym białkiem węzłowym zaan-gażowanym w szereg procesów zachodzących w komórce w tym także naprawę DNA. Pokazano, że MDM2 ulega de-regulacji w wielu przypadkach nowotworów i działa jako białko onkogenne zarówno hamując p53 jak i funkcjonując niezależnie od niego. Kluczowe dla zrozumienia procesu transformacji i rozwoju nowotworu jest poznanie mechani-zmów modulujących naprawę DNA. Jednym z czynników, który może wpływać na te procesy jest MDM2, białko które-go poziom jest wyraźnie podwyższony w przypadku wielu nowotworów. Choć pokazano związek MDM2 z uszkodze-niami i naprawą DSB, jego udział w tych procesach nie jest jeszcze do końca poznany i stanowi interesujące zagadnie-nie do przyszłych badań np. nad rolą MDM2 w szlaku SSA.

PIŚMIENNICTWO1. Cahilly-Snyder L, Yang-Feng T, Francke U, George DL (1987) Mole-

cular analysis and chromosomal mapping of amplified genes isolated from a transformed mouse 3T3 cell line. Somat Cell Mol Genet 13: 235-244

2. Lane DP, Cheok CF, Brown C, Madhumalar A, Ghadessy FJ, Verma C (2010) Mdm2 and p53 are highly conserved from placozoans to man. Cell Cycle 9: 540-547

3. Momand J, Villegas A, Belyi VA (2011) The evolution of MDM2 family genes. Gene 486: 23-30

4. Montes de Oca Luna R, Wagner DS, Lozano G (1995) Rescue of early embryonic lethality in mdm2-deficient mice by deletion of p53. Nature 378: 203-206

5. Mendrysa SM, McElwee MK, Michalowski J, O’Leary KA, Young KM, Perry ME (2003) mdm2 Is critical for inhibition of p53 during lympho-poiesis and the response to ionizing irradiation. Mol Cell Biol 23: 462-472

6. Liang H, Atkins H, Abdel-Fattah R, Jones SN, Lunec J (2004) Genomic organisation of the human MDM2 oncogene and relationship to its al-ternatively spliced mRNAs. Gene 338: 217-223

7. Zauberman A, Flusberg D, Haupt Y, Barak Y, Oren M (1995) A functio-nal p53-responsive intronic promoter is contained within the human mdm2 gene. Nucleic Acids Res 23: 2584-2592


8. Bond GL, Menin C, Bertorelle R, Alhopuro P, Aaltonen LA, Levine AJ (2006) MDM2 SNP309 accelerates colorectal tumour formation in women. J Med Genet 43: 950-952

9. Knappskog S, Lonning PE (2012) Effects of the MDM2 promoter SNP285 and SNP309 on Sp1 transcription factor binding and cancer risk. Transcription 2: 207-210

10. Kubbutat MH, Jones SN, Vousden KH (1997) Regulation of p53 stabi-lity by Mdm2. Nature 387: 299-303

11. Thut CJ, Goodrich JA, Tjian R (1997) Repression of p53-mediated transcription by MDM2: a dual mechanism. Genes Dev 11: 1974-1986

12. Gajjar M, Candeias MM, Malbert-Colas L, Mazars A, Fujita J, Oliva-res-Illana V, Fahraeus R (2012) The p53 mRNA-Mdm2 interaction controls Mdm2 nuclear trafficking and is required for p53 activation following DNA damage. Cancer Cell 21: 25-35

13. Wawrzynow B, Zylicz A, Wallace M, Hupp T, Zylicz M (2007) MDM2 chaperones the p53 tumor suppressor. J Biol Chem 282: 32603-32612

14. Tang J, Qu LK, Zhang J, Wang W, Michaelson JS, Degenhardt YY, El--Deiry WS, Yang X (2006) Critical role for Daxx in regulating Mdm2. Nat Cell Biol 8: 855-862

15. Milne D, Kampanis P, Nicol S, Dias S, Campbell DG, Fuller-Pace F, Meek D (2004) A novel site of AKT-mediated phosphorylation in the human MDM2 onco-protein. FEBS Lett 577: 270-276

16. Zhou BP, Liao Y, Xia W, Zou Y, Spohn B, Hung MC (2001) HER-2/neu induces p53 ubiquitination via Akt-mediated MDM2 phosphory-lation. Nat Cell Biol 3: 973-982

17. Yang HY, Wen YY, Lin YI, Pham L, Su CH, Yang H, Chen J, Lee MH (2007) Roles for negative cell regulator 14-3-3sigma in control of MDM2 activities. Oncogene 26: 7355-7362

18. Walker JE, Saraste M, Runswick MJ, Gay NJ (1982) Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold. EMBO J 1: 945-951

19. Poyurovsky MV, Jacq X, Ma C, Karni-Schmidt O, Parker PJ, Chalfie M, Manley JL, Prives C (2003) Nucleotide binding by the Mdm2 RING domain facilitates Arf-independent Mdm2 nucleolar localization. Mol Cell 12: 875-887

20. Barak Y, Gottlieb E, Juven-Gershon T, Oren M (1994) Regulation of mdm2 expression by p53: alternative promoters produce transcripts with nonidentical translation potential. Genes Dev 8: 1739-1749

21. Fang S, Jensen JP, Ludwig RL, Vousden KH, Weissman AM (2000) Mdm2 is a RING finger-dependent ubiquitin protein ligase for itself and p53. J Biol Chem 275: 8945-8951

22. Meek DW (2004) The p53 response to DNA damage. DNA Repair (Amst) 3: 1049-1056

23. Eischen CM, Lozano G (2014) The Mdm Network and Its Regulation of p53 Activities: A Rheostat of Cancer Risk. Hum Mutat 35: 728-737

24. Linke K, Mace PD, Smith CA, Vaux DL, Silke J, Day CL (2008) Struc-ture of the MDM2/MDMX RING domain heterodimer reveals dime-rization is required for their ubiquitylation in trans. Cell Death Differ 15: 841-848

25. Giglio S, Mancini F, Gentiletti F, Sparaco G, Felicioni L, Barassi F, Martella C, Prodosmo A, Iacovelli S, Buttitta F, Farsetti A, Soddu S, Marchetti A, Sacchi A, Pontecorvi A, Moretti F (2005) Identification of an aberrantly spliced form of HDMX in human tumors: a new mecha-nism for HDM2 stabilization. Cancer Res 65: 9687-9694

26. Kawai H, Wiederschain D, Kitao H, Stuart J, Tsai KK, Yuan ZM (2003) DNA damage-induced MDMX degradation is mediated by MDM2. J Biol Chem 278: 45946-45953

27. Pan Y, Chen J (2003) MDM2 promotes ubiquitination and degradation of MDMX. Mol Cell Biol 23: 5113-5121

28. Marine JC (2011) MDM2 and MDMX in cancer and development. Curr Top Dev Biol 94: 45-75

29. Wade M, Wang YV, Wahl GM (2010) The p53 orchestra: Mdm2 and Mdmx set the tone. Trends Cell Biol 20: 299-309

30. Badciong JC, Haas AL (2002) MdmX is a RING finger ubiquitin liga-se capable of synergistically enhancing Mdm2 ubiquitination. J Biol Chem 277: 49668-49675

31. Linares LK, Hengstermann A, Ciechanover A, Muller S, Scheffner M (2003) HdmX stimulates Hdm2-mediated ubiquitination and degrada-tion of p53. Proc Natl Acad Sci USA 100: 12009-12014

32. Cheng Q, Chen L, Li Z, Lane WS, Chen J (2009) ATM activates p53 by regulating MDM2 oligomerization and E3 processivity. EMBO J 28: 3857-3867

33. Fahraeus R, Olivares-Illana V (2013) MDM2’s social network. Oncoge-ne 33: 4365-4376

34. Oliner JD, Kinzler KW, Meltzer PS, George DL, Vogelstein B (1992) Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in human sarcomas. Nature 358: 80-83

35. Denaro N, Lo Nigro C, Natoli G, Russi EG, Adamo V, Merlano MC (2011) The Role of p53 and MDM2 in Head and Neck Cancer. ISRN Otolaryngol 2011: 931813

36. Girod SC, Cesarz D, Fischer U, Krueger GR (1995) Detection of p53 and MDM2 protein expression in head and neck carcinogenesis. Anti-cancer Res 15: 1453-1457

37. Liu J, Zheng Y, Lei D, Liu D, Xu F, Jin T, Cao X, Zhao X, Yu X, Pan X (2012) MDM2 309T>G polymorphism and risk of squamous cell car-cinomas of head and neck: a meta-analysis. Asian Pac J Cancer Prev 12: 1899-1903

38. Dworakowska D, Jassem E, Jassem J, Peters B, Dziadziuszko R, Zy-licz M, Jakobkiewicz-Banecka J, Kobierska-Gulida G, Szymanowska A, Skokowski J, Roessner A, Schneider-Stock R (2004) MDM2 gene amplification: a new independent factor of adverse prognosis in non--small cell lung cancer (NSCLC). Lung Cancer 43: 285-295

39. Momand J, Jung D, Wilczynski S, Niland J (1998) The MDM2 gene amplification database. Nucleic Acids Res 26: 3453-3459

40. Lundgren K, Montes de Oca Luna R, McNeill YB, Emerick EP, Spencer B, Barfield CR, Lozano G, Rosenberg MP, Finlay CA (1997) Targeted expression of MDM2 uncouples S phase from mitosis and inhibits mammary gland development independent of p53. Genes Dev 11: 714-725

41. Ma Y, Yuan R, Meng Q, Goldberg ID, Rosen EM, Fan S (2000) P53-in-dependent down-regulation of Mdm2 in human cancer cells treated with adriamycin. Mol Cell Biol Res Commun 3: 122-128

42. Brekman A, Singh KE, Polotskaia A, Kundu N, Bargonetti J (2011) A p53-independent role of Mdm2 in estrogen-mediated activation of breast cancer cell proliferation. Breast Cancer Res 13: R3

43. Mulay SR, Thomasova D, Ryu M, Anders HJ (2012) MDM2 (murine double minute-2) links inflammation and tubular cell healing during acute kidney injury in mice. Kidney Int 81: 1199-1211

44. Thomasova D, Mulay SR, Bruns H, Anders HJ (2013) p53-independent roles of MDM2 in NF-kappaB signaling: implications for cancer the-rapy, wound healing, and autoimmune diseases. Neoplasia 14: 1097-1101

45. Conradt L, Henrich A, Wirth M, Reichert M, Lesina M, Algul H, Schmid RM, Kramer OH, Saur D, Schneider G (2012) Mdm2 inhibitors synergize with topoisomerase II inhibitors to induce p53-independent pancreatic cancer cell death. Int J Cancer 132: 2248-2257

46. Jones SN, Hancock AR, Vogel H, Donehower LA, Bradley A (1998) Overexpression of Mdm2 in mice reveals a p53-independent role for Mdm2 in tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci USA 95: 15608-15612

47. Maetens M, Doumont G, Clercq SD, Francoz S, Froment P, Bellefroid E, Klingmuller U, Lozano G, Marine JC (2007) Distinct roles of Mdm2 and Mdm4 in red cell production. Blood 109: 2630-2633

48. Wade M, Li YC, Wahl GM (2013) MDM2, MDMX and p53 in oncoge-nesis and cancer therapy. Nat Rev Cancer 13: 83-96

49. Manfredi JJ (2010) The Mdm2-p53 relationship evolves: Mdm2 swings both ways as an oncogene and a tumor suppressor. Genes Dev 24: 1580-1589

50. Gu L, Zhang H, He J, Li J, Huang M, Zhou M (2012) MDM2 regulates MYCN mRNA stabilization and translation in human neuroblastoma cells. Oncogene 31: 1342-1353

51. Fu W, Ma Q, Chen L, Li P, Zhang M, Ramamoorthy S, Nawaz Z, Shi-mojima T, Wang H, Yang Y, Shen Z, Zhang Y, Zhang X, Nicosia SV, Pledger JW, Chen J, Bai W (2009) MDM2 acts downstream of p53 as


an E3 ligase to promote FOXO ubiquitination and degradation. J Biol Chem 284: 13987-14000

52. Miwa S, Uchida C, Kitagawa K, Hattori T, Oda T, Sugimura H, Yasuda H, Nakamura H, Chida K, Kitagawa M (2006) Mdm2-mediated pRB downregulation is involved in carcinogenesis in a p53-independent manner. Biochem Biophys Res Commun 340: 54-61

53. Kulikov R, Winter M, Blattner C (2006) Binding of p53 to the central domain of Mdm2 is regulated by phosphorylation. J Biol Chem 281: 28575-28583

54. Dias SS, Milne DM, Meek DW (2006) c-Abl phosphorylates Hdm2 at tyrosine 276 in response to DNA damage and regulates interaction with ARF. Oncogene 25: 6666-6671

55. Sionov RV, Coen S, Goldberg Z, Berger M, Bercovich B, Ben-Neriah Y, Ciechanover A, Haupt Y (2001) c-Abl regulates p53 levels under normal and stress conditions by preventing its nuclear export and ubi-quitination. Mol Cell Biol 21: 5869-5878

56. Dimitriadi M, Poulogiannis G, Liu L, Backlund LM, Pearson DM, Ichi-mura K, Collins VP (2008) p53-independent mechanisms regulate the P2-MDM2 promoter in adult astrocytic tumours. Br J Cancer 99: 1144-1152

57. Steinman HA, Burstein E, Lengner C, Gosselin J, Pihan G, Duckett CS, Jones SN (2004) An alternative splice form of Mdm2 induces p53-in-dependent cell growth and tumorigenesis. J Biol Chem 279: 4877-4886

58. Zhang Z, Zhang R (2005) p53-independent activities of MDM2 and their relevance to cancer therapy. Curr Cancer Drug Targets 5: 9-20

59. Bouska A, Lushnikova T, Plaza S, Eischen CM (2008) Mdm2 promotes genetic instability and transformation independent of p53. Mol Cell Biol 28: 4862-4874

60. Melo AN, Eischen CM (2012) Protecting the genome from mdm2 and mdmx. Genes Cancer 3: 283-290

61. Carrillo AM, Bouska A, Arrate MP, Eischen CM (2014) Mdmx promo-tes genomic instability independent of p53 and Mdm2. Oncogene doi: 10.1038/onc.2014.27

62. McNeil EM, Melton DW (2012) DNA repair endonuclease ERCC1-XPF as a novel therapeutic target to overcome chemoresistance in cancer therapy. Nucleic Acids Res 40: 9990-10004

63. Shiloh Y (2001) ATM and ATR: networking cellular responses to DNA damage. Curr Opin Genet Dev 11: 71-77

64. Korwek Z, Alster O (2014) Rola szlaku indukowanego uszkodzenia-mi DNA w apoptozie i starzeniu komórkowym. Postepy Biochem 60: 248 - 262

65. Hartlerode AJ, Scully R (2009) Mechanisms of double-strand break re-pair in somatic mammalian cells. Biochem J 423: 157-168

66. Czornak K, Chughtai S, Chrzanowska KH (2008) Mystery of DNA re-pair: the role of the MRN complex and ATM kinase in DNA damage repair. J Appl Genet 49: 383-396

67. Lee JH, Paull TT (2007) Activation and regulation of ATM kinase ac-tivity in response to DNA double-strand breaks. Oncogene 26: 7741-7748

68. Alt JR, Bouska A, Fernandez MR, Cerny RL, Xiao H, Eischen CM (2005) Mdm2 binds to Nbs1 at sites of DNA damage and regulates double strand break repair. J Biol Chem 280: 18771-18781

69. Escribano-Diaz C, Orthwein A, Fradet-Turcotte A, Xing M, Young JT, Tkac J, Cook MA, Rosebrock AP, Munro M, Canny MD, Xu D, Du-rocher D (2013) A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell 49: 872-883

70. Kaidi A, Weinert BT, Choudhary C, Jackson SP (2010) Human SIRT6 promotes DNA end resection through CtIP deacetylation. Science 329: 1348-1353

71. Johnson RD, Jasin M (2000) Sister chromatid gene conversion is a prominent double-strand break repair pathway in mammalian cells. EMBO J 19: 3398-3407

72. Garcia V, Phelps SE, Gray S, Neale MJ (2011) Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature 479: 241-244

73. Symington LS, Gautier J (2011) Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annu Rev Genet 45: 247-271

74. Liu J, Doty T, Gibson B, Heyer WD (2010) Human BRCA2 protein promotes RAD51 filament formation on RPA-covered single-stranded DNA. Nat Struct Mol Biol 17: 1260-1262

75. Bell JC, Plank JL, Dombrowski CC, Kowalczykowski SC (2012) Direct imaging of RecA nucleation and growth on single molecules of SSB--coated ssDNA. Nature 491: 274-278

76. Yang H, Li Q, Fan J, Holloman WK, Pavletich NP (2005) The BRCA2 homologue Brh2 nucleates RAD51 filament formation at a dsDNA--ssDNA junction. Nature 433: 653-657

77. Jensen RB, Carreira A, Kowalczykowski SC (2010) Purified human BRCA2 stimulates RAD51-mediated recombination. Nature 467: 678-683

78. Holthausen JT, van Loenhout MT, Sanchez H, Ristic D, van Rossum--Fikkert SE, Modesti M, Dekker C, Kanaar R, Wyman C (2011) Effect of the BRCA2 CTRD domain on RAD51 filaments analyzed by an en-semble of single molecule techniques. Nucleic Acids Res 39: 6558-6567

79. Larsen NB, Hickson ID (2013) RecQ Helicases: Conserved Guardians of Genomic Integrity. Adv Exp Med Biol 767: 161-184

80. Svendsen JM, Harper JW (2010) GEN1/Yen1 and the SLX4 complex: Solutions to the problem of Holliday junction resolution. Genes Dev 24: 521-536

81. Rigatti MJ, Verma R, Belinsky GS, Rosenberg DW, Giardina C (2011) Pharmacological inhibition of Mdm2 triggers growth arrest and pro-motes DNA breakage in mouse colon tumors and human colon cancer cells. Mol Carcinog 51: 363-378

82. Goodarzi AA, Jeggo PA (2013) The repair and signaling responses to DNA double-strand breaks. Adv Genet 82: 1-45

83. Calsou P, Frit P, Humbert O, Muller C, Chen DJ, Salles B (1999) The DNA-dependent protein kinase catalytic activity regulates DNA end processing by means of Ku entry into DNA. J Biol Chem 274: 7848-7856

84. Mayo LD, Turchi JJ, Berberich SJ (1997) Mdm-2 phosphorylation by DNA-dependent protein kinase prevents interaction with p53. Cancer Res 57: 5013-5016

85. DeFazio LG, Stansel RM, Griffith JD, Chu G (2002) Synapsis of DNA ends by DNA-dependent protein kinase. EMBO J 21: 3192-3200

86. Goodarzi AA, Yu Y, Riballo E, Douglas P, Walker SA, Ye R, Harer C, Marchetti C, Morrice N, Jeggo PA, Lees-Miller SP (2006) DNA-PK autophosphorylation facilitates Artemis endonuclease activity. EMBO J 25: 3880-3889

87. Williams GJ, Hammel M, Radhakrishnan SK, Ramsden D, Lees-Miller SP, Tainer JA (2014) Structural insights into NHEJ: Building up an inte-grated picture of the dynamic DSB repair super complex, one compo-nent and interaction at a time. DNA Repair (Amst) 17: 110-120

88. Dobbs TA, Tainer JA, Lees-Miller SP (2010) A structural model for re-gulation of NHEJ by DNA-PKcs autophosphorylation. DNA Repair (Amst) 9: 1307-1314

89. Gama V, Gomez JA, Mayo LD, Jackson MW, Danielpour D, Song K, Haas AL, Laughlin MJ, Matsuyama S (2009) Hdm2 is a ubiquitin liga-se of Ku70-Akt promotes cell survival by inhibiting Hdm2-dependent Ku70 destabilization. Cell Death Differ 16: 758-769

90. Pichiorri F, Suh SS, Rocci A, De Luca L, Taccioli C, Santhanam R, Zhou W, Benson DM, Jr., Hofmainster C, Alder H, Garofalo M, Di Leva G, Volinia S, Lin HJ, Perrotti D, Kuehl M, Aqeilan RI, Palumbo A, Croce CM (2010) Downregulation of p53-inducible microRNAs 192, 194, and 215 impairs the p53/MDM2 autoregulatory loop in multiple myeloma development. Cancer Cell 18: 367-381

91. Zhang T, Prives C (2001) Cyclin a-CDK phosphorylation regulates MDM2 protein interactions. J Biol Chem 276: 29702-29710

92. Kulikov R, Boehme KA, Blattner C (2005) Glycogen synthase kinase 3-dependent phosphorylation of Mdm2 regulates p53 abundance. Mol Cell Biol 25: 7170-7180

93. Inuzuka H, Tseng A, Gao D, Zhai B, Zhang Q, Shaik S, Wan L, Ang XL, Mock C, Yin H, Stommel JM, Gygi S, Lahav G, Asara J, Xiao ZX, Kaelin WG, Jr., Harper JW, Wei W (2010) Phosphorylation by casein kinase


I promotes the turnover of the Mdm2 oncoprotein via the SCF(beta--TRCP) ubiquitin ligase. Cancer Cell 18: 147-159

94. Gotz C, Kartarius S, Scholtes P, Nastainczyk W, Montenarh M (1999) Identification of a CK2 phosphorylation site in mdm2. Eur J Biochem 266: 493-501

95. Allende-Vega N, Dias S, Milne D, Meek D (2005) Phosphorylation of the acidic domain of Mdm2 by protein kinase CK2. Mol Cell Biochem 274: 85-90

96. Sionov RV, Moallem E, Berger M, Kazaz A, Gerlitz O, Ben-Neriah Y, Oren M, Haupt Y (1999) c-Abl neutralizes the inhibitory effect of Mdm2 on p53. J Biol Chem 274: 8371-8374

97. Nag S, Qin J, Srivenugopal KS, Wang M, Zhang R (2013) The MDM2--p53 pathway revisited. J Biomed Res 27: 254-271

98. Panier S, Durocher D (2013) Push back to respond better: regulatory inhibition of the DNA double-strand break response. Nat Rev Mol Cell Biol 14: 661-672

99. Ciccia A, Elledge SJ (2010) The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell 40: 179-204

Multifunctionality of MDM2 protein and its role in genomic instability of cancer cellsMarta Małuszek1,2,

1Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 5a Pawinskiego St., 02-106 Warsaw, Poland;2International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw, 4 Ksiecia Trojdena St., 02-109 Warsaw, Polande-mail: [email protected]

Key words: scaffold protein, hub protein, DNA double-strand breaks repair, oncogene, transformation process, tumor suppressor

ABSTRACTNumerous studies have revealed that MDM2 oncoprotein is upregulated in different types of cancer. Additionally, it was demonstrated that in some cases, MDM2 may inhibit the neoplastic transformation process. In other words, MDM2 protein can be considered as an oncogene or as a tumor suppressor depending on the appropriate cellular context. MDM2 functions on different levels in the cell, which is a consequence of its complex structure, a plethora of interacting partners and regulation through numerous postranslational modifications. Thus, an altera-tion of the delicate balance in MDM2 activity can influence transformation and cancer development. Genomic instability is a hallmark of cancer, which inversely correlates to the activity of DNA damage response. In the case of not transformed cells MDM2 inhibits double strand brakes (DSBs) repair, hence stimulating carcinogenesis. In cancer cells MDM2 stimulates cytostatic-induced DSBs repair, thus leading to chemoresistance.

Wielofunkcyjność białka MDM2 oraz jego rola w niestabilności ...

Documents

Transcript of Wielofunkcyjność białka MDM2 oraz jego rola w niestabilności ...