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13º Congresso Interinstitucional de Iniciação Científica – CIIC 2019

30 e 31 de julho de 2019 – Campinas, São Paulo

ISBN: 978-85-7029-149-3

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Influência da data de colheita na ocorrência de Aspergillus section Flavi e aflatoxinas

em dois cultivares de amendoim alto oleico

Tamara Santos de Oliveira¹; Ligia Manoel Martins²; William Pio Martins3; Beatriz T.

Iamanaka4; Marta H.Taniwaki5

Nº 19235

RESUMO – A cultura do amendoim está susceptível a contaminação por fungos, naturalmente

presentes no solo, e com potencial para produção de aflatoxinas. Uma das medidas propostas para

reduzir a produção no campo é a alteração da data de plantio ou de colheita, evitando maior

exposição do amendoim ao fungo quando em condições ideais para produção de aflatoxinas. O

objetivo do trabalho foi avaliar a influência da data de colheita na contaminação por Aspergillus

section Flavi e produção de aflatoxinas nos cultivares IAC OL3 e IAC 503, que apresentam alto teor

de ácido oleico. Um total de 40 amostras de amendoim (20 IAC OL3 e 20 IAC 503) foram

plaqueadas em meio Dicloran Glicerol 18% agar (DG18) e incubadas a 25ºC por 5 dias. O potencial

para produção de aflatoxinas foi avaliado pela técnica do agar plug. A análise de aflatoxinas foi

realizada utilizando cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE). A porcentagem de infecção por

A. section Flavi vairou de 0 a 18% no cultivar IAC OL3 e de 0 a10% no cultivar IAC 503. Foram

isoladas 318 cepas de A. section Flavi, sendo que no total, 86 não apresentaram potencial de

produção, 137 eram produtoras de aflatoxina B e 95 produtoras de aflatoxina B e G. Apenas 1

amostra de amendoim apresentou contaminação por aflatoxinas (0,06 µg/kg), mas o valor estava

abaixo do limite máximo estabelecido na legislação. A data de colheita apresentou maior influência

na contaminação por A. section Flavi para o cultivar IAC OL3.

Palavras-chaves: Amendoim alto oleico, aflatoxinas, Aspergillus section Flavi, fungos

aflatoxigênicos.

1 Bolsista CNPq (PIBIC): Graduação em Engenharia de Alimentos, UNIFAJ - Jaguariúna-SP; [email protected] 2 Colaborador, Doutorado em Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP, Campinas-SP; [email protected] 3 Colaborador, Médico da Secretaria de Saúde da Prefeitura de Araraquara, Araraquara-SP 4 Colaborador, Pesquisador do Instituto de Tecnologia de Alimentos, Campinas-SP; [email protected] 5 Orientador: Pesquisador do Instituto de Tecnologia de Alimentos, Campinas-SP.; [email protected]



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ABSTRACT - The peanut crop is susceptible to contamination by fungi, naturally present in

the soil, with aflatoxin production potential. One of the measures proposed to reduce production in

the field is to change the date of planting or harvesting, avoiding greater exposure of the peanut to

the fungus when in ideal conditions for the production of aflatoxins. The objective of this work was to

evaluate the influence of the date of harvest on the contamination by Aspergillus section Flavi and

aflatoxin production in cultivars IAC OL3 and IAC 503, which present high content of oleic acid. A

total of 40 peanut samples (20 IAC OL3 and 20 IAC 503) were plated on Dicloran Glycerol 18%

agar medium (DG18) and incubated at 25° C for 5 days. The potential for aflatoxin production was

evaluated by agar plug technique. Aflatoxin analysis was performed using high-performance liquid

chromatography (HPLC). The percentage of infection by A. section Flavi ranged from 0 to 18% in

the cultivar IAC OL3 and 0 to 10% in the cultivar IAC 503. A total of 318 strains of A. section Flavi

was isolated, of which 86 had no production potential, 137 were aflatoxin B and 95 aflatoxin B and

G producers. Only 1 sample of peanuts showed aflatoxin contamination (0.06 μg/kg), but the value

was below the maximum limit established by the legislation. The harvesting date had a more

significant influence on A. section Flavi contamination for the cultivar IAC OL3.

Key-words: High oleic peanut, aflatoxins, Aspergillus section Flavi, aflatoxigenic fungi

1. INTRODUÇÃO

A produção de amendoim no Brasil tem apresentado um aumento considerável de

produtividade nos últimos anos, devido ao avanço das tecnologias e desenvolvimento de novas

sementes (Conab, 2015). Este aumento na produção aliado ao aumento do incentivo ao consumo

de amendoim tem levado ao maior cuidado com a qualidade do produto. Medidas de controle de

qualidade estão sendo tomadas, como por exemplo, a resolução RDC 172 de 2003 da Agência

Nacional de Vigilância Sanitária (Brasil, ANVISA, 2003), que dispõe sobre boas práticas de

fabricação, e o programa “pró-amendoim”, criado pela Associação Brasileira de Chocolate, Cacau,

Amendoim, Bala e Derivados (ABICAB, www.abicab.org.br). Este programa visa o controle e

monitoramento das aflatoxinas, que são metabólitos tóxicos produzidos principalmente por

Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nomius, e o controle de umidade nos grãos de amendoim

para prevenir a multiplicação dos fungos.

Segundo Pitt et al. (2013), dentre os fatores que podem favorecer a produção de aflatoxinas

estão: danos causados por insetos e estresse hídrico na etapa de pré-colheita, secagem lenta na

pós colheita e uma estocagem precária. Os pontos críticos para formação de aflatoxinas nas



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etapas pós colheita podem ser controlados através de uma secagem rápida e estocagem com

controle de temperatura e umidade. Na etapa de pré-colheita, a produção de aflatoxinas pode ser

minimizada garantindo condições ideais no solo. A temperatura e umidade do solo durante as

etapas de maturação do amendoim influenciam na produção de aflatoxinas. Quando a umidade do

solo é controlada, a atividade de água do grão se mantém constante, e a produção de fitoalexinas,

substâncias de defesa da planta, é maior. Em casos de estresse hídrico, a produção de fitoalexinas

é menor. Somado ao aumento da temperatura, essas condições favorecem a infecção do

amendoim e consequente produção da toxina (Doner et al., 1989).

Com o objetivo de prevenir e reduzir a ocorrência de aflatoxinas em amendoim na pré-

colheita, modelos matemáticos estão sendo propostos. Através da previsão do risco de produção

de aflatoxinas, calculado levando em consideração as condições climáticas na qual o amendoim

está se desenvolvendo, medidas de controle podem ser sugeridas e assim, garantir um produto de

melhor qualidade (Chauhan et al., 2010). Dentre as medidas, a alteração da data de plantio

(Craufurd et al,2006) e alteração na data de colheita (Canavar & Kaynak, 2013; Rachaputi &

Krosch, 2002) foram propostos. Devido a rotação de cultura com a cana-de-açúcar, a alteração da

data do plantio poderia prejudicar este esquema de rotação, que não pode exceder 130 dias

(Godoy et al., 2014). Por outro lado, a alteração da data de colheita pode ser uma tomada de

decisão aplicável nas condições da cultura do amendoim no estado de São Paulo. Assim, o

objetivo do trabalho foi avaliar a influência da data de colheita na contaminação por Aspergillus

section Flavi e produção de aflatoxinas nos cultivares IAC OL3 e IAC 503.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Amostras

Foi realizado uma plantação em um campo experimental localizado no município de

Araraquara utilizando dois cultivares de amendoim alto oleico (IAC OL3 e IAC 503), colhidos em

diferentes datas: colheita antecipada (2 semanas antes), colheita antecipada (1 semana antes),

colheita ideal e colheita tardia. As variáveis (cultivares e datas de colheita) foram combinadas e

distribuídas aleatoriamente no campo, com quatro repetições para cada tratamento, com exceção

da data de colheita ideal, a qual foram colhidas 8 amostras de cada cultivar, totalizando 40

amostras.

2.2 Determinação da atividade de água e umidade



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A análise de atividade de água foi determinada no aparelho Aqualab, modelo 3TE

(Decagon, USA). As leituras foram realizadas em triplicatas a 25°C ±1°C. O teor de umidade das

amostras de amendoim foi determinado de acordo com o método oficial AOCS Ab2-49 (Aoac,

2009). O amendoim sem casca foi moído e colocado em placa, previamente taradas, e

permaneceu em estufa de 130°C por 3 horas. As placas foram removidas e resfriadas à

temperatura ambiente em um dessecador e pesadas para o cálculo do teor de umidade

2.3 Análise micológica

As análises micológicas foram realizadas pelo método de plaqueamento direto, segundo Pitt

& Hocking (2009). Primeiramente, o amendoim foi superficialmente desinfectado em solução de

hipoclorito 0,4% por dois minutos e em seguida, 50 grãos foram diretamente plaqueados em 10

placas (5 grãos por placa) contendo ágar Dicloran 18% glicerol (DG18). Paralelamente, foi

realizado um plaqueamento direto sem desinfecção superficial, seguindo os mesmos

procedimentos posteriores. As placas de amendoim foram incubadas a 25ºC por 5 dias. O

resultado foi expresso em porcentagem de amendoim infectado para as amostras plaqueadas com

desinfecção superficial e porcentagem de contaminação para as amostras analisadas sem

desinfecção superficial

2.4 Identificação dos fungos

Os isolados pertencentes ao grupo A. section Flavi foram inoculados em Agar extrato de

levedura Czapeck (CYA) e identificados através das características macroscópicas e microscópicas

pela chave de classificação Pitt & Hocking (2009) e Samson et al. (2010).

2.5 Teste de produção de toxina dos isolados

Os isolados de A. section Flavi foram inoculados em meio de cultura ágar extrato de

levedura sacarose (YESA) e incubados à 25ºC por 7 dias. Em seguida foi aplicada a técnica de

ágar plug associada a cromatografia de camada delgada (CCD), segundo Filtenborg et al. (1983)

para testes de produção de aflatoxinas.

2.6 Determinação de aflatoxinas nas amostras de amendoim

A determinação de aflatoxinas nas amostras de amendoim foi realizada a partir da

metodologia de Stroka et al. (2000) com modificações. Aproximadamente 500g de amendoim foi

triturado e 25 g da amostra foi adicionada de 2,5 g de NaCl e 100 mL de metanol:água (8:2 v/v).



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Esta solução foi homogeneizada em shaker por 30 minutos. Em seguida, foi duplamente filtrada em

papel filtro qualitativo e membrana de vidro, respectivamente, e 10 mL do filtrado final foi diluído em

60 mL de solução tampão fostato (PBS pH 7). O conteúdo total foi passado em coluna de

imunoafinidade, com fluxo de 1 – 2 gotas por segundo, seguido de lavagem da coluna com 30 mL

de água destilada. A aflatoxina contida na coluna foi eluída com 1250 µL de metanol grau HPLC e

1750 µL de água ultrapura. Para detecção da toxina foi utilizado cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE), com detector de fluorescência, comprimento de onda de excitação e emissão de

362 e 455nm, e sistema Kobracell para derivatização pós-coluna das aflatoxias B1 e G1. A fase

móvel foi composta de água:acetonitrila:metanol (6:2:3, v/v/v), adicionada de 119mg de KBr e

350μL de ácido nítrico 4M por litro, em um fluxo de 1mL/min., com volume de injeção de 20μL.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Atividade de água e umidade das amostras de amendoim

A Tabela 1 apresenta os valores de atividade de água e umidade dos amendoins IAC OL3 e

IAC 503. Houve uma variação na atividade de água do amendoim OL3 de 0,452 até 0,722. No

amendoim 503 a variação foi de 0,519 a 0,741. Para os valores de umidade no amendoim IAC OL3

houve uma variação de 4,14% a 6,93% com uma média de 5,53%. No amendoim IAC 503 a

variação foi de 4,46% a 6,68% com uma média de 5,64%.

Tabela 1. Valores de atividade de água (aW) e umidade (%) dos amendoins IAC OL3 e IAC 503.

Amostras Período Tempo aw Umidade

IAC OL3

Colheita antecipada

2 semanas 0,489 - 0,554 4,46 - 5,42

1 semana 0,452 - 0,706 4,71 - 6,68

Colheita ideal - 0,548 - 0,722 5,12 - 6,68

Colheita tardia 1 semana 0,507 - 0,608 5,09 - 6,13

IAC 503

Colheita antecipada

2 semanas 0,519 - 0,741 4,18 - 5,7

1 semana 0,592 - 0,711 4,14 - 5,73

Colheita ideal - 0,53 - 0,692 5,11 - 6,49

Colheita tardia 1 semana 0,608 - 0,69 5,69 - 6,93



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3.2 Fungos isolados do amendoim

Os resultados do plaqueamento direto com e sem desinfecção superficial estão ilustrados

nas figuras 1 e 2, respectivamente. Os resultados do plaqueamento com desinfecção estão

expressos em % de infecção. Pode-se observar que a infecção por A. section Flavi foi baixa,

variando de 0 a 18% no cultivar IAC OL3 e de 0 a10% no cultivar IAC 503. Para o cultivar IAC OL3,

uma colheita tardia resultou na infecção por A. section Flavi em todas as amostras analisadas. O

mesmo não foi observado no cultivar IAC 503.

O resultado do plaqueamento direto sem desinfecção estão expressos em % de

contaminação. Os fungos que cresceram através deste plaqueamento não necessariamente estão

infectando o grão. Os resultados mostram maior ocorrência de A. section Flavi nas amostras, que

variou de 0 a 44% para o cultivar IAC OL3 e de 2 a 94% no cultivar IAC 503.

Figura 1. Porcentagem de infecção por Aspergillus section Flavi nas amostras de amendoim IAC OL3 e IAC

503 em diferentes datas de colheita.

0

50

100

Infe

cção

po

r

A.

sect

ion

Fla

vi (

%)

OL3 503



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7

Figura 2. Porcentagem de contaminação por Aspergillus section Flavi nas amostras de amendoim IAC OL3 e IAC 503 em diferentes datas de colheita.

3.3 Teste de produção de aflatoxinas pelos isolados

Foram isoladas 318 cepas de A. section Flavi, sendo 137 do cultivar IAC OL3 (38 isolados

do plaqueamento com desinfecção e 99 do plaqueamento sem desinfecção) e 181 do cultivar IAC

503 (8 isolados do plaquemanto com desinfecção e 173 do plaqueamento sem desinfecção). As

figuras 3 e 4 ilustram o potencial de produção de aflatoxinas pelos isolados dos cultivares IAC OL3

e IAC 503, respectivamente.

Dos 38 isolados das amostras com desinfecção superficial do cultivar IAC OL3, 14 não eram

produtores de aflatoxinas, 13 eram produtores de aflatoxina B e 11 de aflatoxina B e G. Nos 99

isolados do plaqueamento sem desinfecção, 27 não eram produtores de aflatoxinas, 41 eram

produtores de aflatoxina B e 31 de aflatoxina B e G. Do cultivar IAC 503, no plaqueamento com

desinfecção, 4, 3 e 1 isolados eram não produtores, produtores de aflatoxina B e aflatoxina B e G

respectivamente. Nos isolados sem desinfecção estes números foram 41, 80 e 52,

respectivamente.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Co

nta

min

ação

po

r

A.

sect

ion

Fla

vi (

%)

OL3 503



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8

Figura 3. Potencial de produção de aflatoxinas dos isolados do cultivar IAC OL3.

Figur

a 4.

Poten

cial

de

produção de aflatoxinas dos isolados do cultivar IAC 503

3.4 Presença de aflatoxinas nas amostras de amendoim

Dentre as 40 amostras de amendoim analisadas quanto a presença de aflatoxinas, apenas

uma amostra (2,5%), pertencente ao cultivar IAC 503, apresentou contaminação de 0,06 µg/kg.

Este valor está abaixo do limite máximo estabelecido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA) de 20 µg/kg (Brasil, ANVISA, 2011).

0

10

20

30

Afla - B+ B+G+ Afla - B+ B+G+

Com desinfecção Sem desinfecção Pote

nci

al d

e p

rod

uçã

o

de

afla

toxi

nas

pel

os

iso

lad

os

OL3 OL3 OL3 OL3

0

10

20

30

40

50

Afla - B+ B+G+ Afla - B+ B+G+

Com desinfecção Sem desinfecção

Pote

nci

al d

e p

rod

uçã

o d

e af

lato

xin

as p

elo

s is

ola

do

s

503 503 503 503



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3 CONCLUSÃO

Houve baixa infecção por A. section Flavi nas amostras analisadas. Este resultado indica que

não houve condições ideais para infecção e produção de aflatoxinas no amendoim. Entretanto, o

plaquemanto sem desinfecção revelou a presença de fungos aflatoxigênicos, e se não houver

controle de temperatura e umidade, estes contaminantes podem infectar o amendoim e produzir

toxina. De uma forma geral, o cultivar IAC OL3 apresentou maior contaminação nas amostras

colhidas após o período ideal. Esta relação não foi observada para o cultivar IAC 503.

4 AGRADECIMENTOS

Agradecemos ao CNPq/PIBIC pela bolsa concedida.

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