RZECZPOSPOLITA TŁUMACZENIE PATENTU …public.sds.tiktalik.com/patenty/pdf/250685.pdf ·...

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1957539 RZECZPOSPOLITA POLSKA

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej

Polskiej

(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 08.12.2006 06848508.5 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 17.04.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/16 EP 1957539 B1

(13) (51)

T3 Int.Cl. C07K 16/30 (2006.01) C07K 16/40 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01)

(54) Tytuł wynalazku:

Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko białku kinazy tyrozynowej 7 (PTK7) i ich zastosowanie

(30) Pierwszeństwo:

08.12.2005 US 748373 P

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

20.08.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/34

(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:

30.08.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08

(73) Uprawniony z patentu:

Medarex, Inc., Princeton, US

(72) Twórca(y) wynalazku:

LI-SHENG LU, Mountain View, US JONATHAN ALEXANDER TERRETT, Los Altos, US CHIN PAN, Los Altos, US

(74) Pełnomocnik:

PL/E

P 19

5753

9 T3

rzecz. pat. Anna Grzelak WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla 12 53-114 Wrocław

Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

1

Opis

Stan techniki

[0001] Receptory związane z aktywnością kinazy tyrozynowej (RTK, ang. receptor tyrosine kinase) to

transbłonowe białka sygnałowe, które przekazują sygnały biologiczne ze środowiska

zewnątrzkomórkowego do wnętrza komórki. Regulacja sygnałów RTK jest ważna w regulacji wzrostu

komórek, różnicowania, wzrostu aksonów, wzrostu nabłonka, rozwoju, adhezji, migracji oraz apoptozy

(Prenzel et al. (2001) Endocr. Relat. Cancer 8:11-31; Hubbard i Till (2000) Annu. Rev. Biochem. 69:373-

98). Wiadomo, że RTK biorą udział w rozwoju i progresji kilku form nowotworów. W większości

nowotworów powiązanych z RTK występowała raczej amplifikacja białka receptora niż mutacja genu

(Kobus i Fleming (2005) Biochemistry 44:1464-70).

[0002] Białko kinazy tyrozynowej 7 (PTK7, ang. protein tyrosine kinase 7), członek rodziny receptorów

związanych z aktywnością kinazy tyrozynowej, zostało wyizolowane po raz pierwszy z prawidłowych

ludzkich melanocytów i sklonowane przy pomocy RT-PCR (Lee et al., (1993) Oncogene 8:3403-10; Park

et al., (1996) J.Biochem 119:235-9). Niezależnie, gen sklonowano z linii komórkowej pochodzącej od

ludzkiego raka okrężnicy i nazwano kinazą raka okrężnicy 4 (CCK4, ang. colon carcinoma kinase 4)

(Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84). PTK7 należy do podzbioru RTK nie posiadających

wykrywalnej aktywności katalitycznej kinazy tyrozynowej, ale zachowujących aktywność przekazywania

sygnału i uważa się, że mogą one funkcjonować jako cząsteczki adhezji komórkowej.

[0003] Stwierdzono, że mRNA dla PTK7 podlega zmiennej ekspresji w liniach komórkowych

pochodzących od raka okrężnicy lecz nie podlega ekspresji w dojrzałych ludzkich tkankach okrężnicy

(Mossie et al., supra). Ekspresję PTK7 obserwowano także w niektórych liniach komórkowych czerniaka

oraz w biopsjach czerniaka (Easty, et al. (1997) Int. J. Cancer 71:1061-5). Stwierdzono ekspresję

alternatywnej formy splicingowej (składania) w komórkach raka wątroby i jelita grubego (Jung et al.

(2002) Biochim Biophys Acta 1579: 153-63). Ponadto, stwierdzono wysoką nadekspresję PTK7 w

próbkach ostrej białaczki szpikowej (Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:1241-9).

Immunohistochemicznie, obserwowano specyficzne dla nowotworu barwienia PTK7 w rakach piersi, jelita

grubego, płuc, trzustki, nerki i pęcherza moczowego, jak opisano w publikacji PCT WO 04/17992. WO

2004/017992 opisuje PTK7, środki, które oddziałują z lub modulują ekspresję lub aktywność PTK7, oraz

ich zastosowanie w leczeniu raka. Kyriakos et al. (Cancer Research 52, luty 1992, nr. 4, strony 835-842)

opisują losy przeciwciał związanych do powierzchni komórek nowotworowych in vitro.

[0004] Zgodnie z tym, pożądane są środki rozpoznające PTK7 oraz sposoby stosowania takich środków.

Streszczenie wynalazku

[0005] Niniejszy wynalazek dostarcza izolowanych przeciwciał monoklonalnych, w szczególności

ludzkich przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się z PTK7 i które wykazują wiele pożądanych

właściwości. Właściwości te obejmują wiązanie z wysokim powinowactwem z ludzką PTK7 oraz wiązanie

do komórek guza Wilmsa. Dostarczone są również przeciwciała i kompozycje według wynalazku do

zastosowania w sposobach leczenia różnorodnych chorób powiązanych z PTK7.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

2

[0006] Wynalazek dotyczy izolowanego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego, lub jego części wiążącej

antygen, przy czym przeciwciało:

(a) swoiście wiąże się z ludzką PTK7; oraz

(b) wiąże się do linii komórkowej guza Wilmsa o numerze dostępu ATCC CRL-1441 z EC50

wynoszącym 4,0 nM lub mniejszym, w badaniu, które obejmuje inkubowanie 1 x 105 komórek z

przeciwciałem przy początkowym stężeniu 30 µg/ml i seryjne rozcieńczanie przeciwciała w

rozcieńczeniach 1:10; oraz

(c) wiąże się z tym samym epitopem na ludzkiej PTK7 co przeciwciało odniesienia obejmujące:

(i) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:

2 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR

ID: 7; lub

(ii) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:


ID: 8; lub

(iii) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:


ID: 10.

[0007] Korzystne przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, obejmuje:

(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 12;

(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 16;

(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 20;

(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 25;

(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 31; oraz

(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 37;

lub






(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 40.

lub







[0008] Inne korzystne przeciwciała według wynalazku, lub ich części wiążące antygen, obejmują:

(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:2; oraz

(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 7;

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

3

lub


(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 10;

lub


(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 8.

[0009] Przeciwciała według wynalazku mogą być, na przykład, przeciwciałami pełnej długości, na

przykład z izotypu IgG1 lub IgG4. Alternatywnie, przeciwciała mogą być fragmentami przeciwciał, takimi

jak fragmenty Fab lub Fab’2, lub przeciwciała jednołańcuchowe.

[0010] Wynalazek dostarcza także immunokoniugatu obejmującego przeciwciało według wynalazku, lub

jego część wiążącą antygen, połączone z środkiem terapeutycznym, takim jak cytotoksyna lub izotop

radioaktywny.

[0011] Dostarczone są kompozycje obejmujące przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, lub

immunokoniugat według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

[0012] Cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące przeciwciała, lub ich części wiążące antygen, według

wynalazku, również są objęte zakresem wynalazku, jak również wektory ekspresyjne obejmujące takie

kwasy nukleinowe oraz komórki gospodarza obejmujące takie wektory ekspresyjne.

[0013] Dostarczony jest także sposób in vitro dla przygotowania przeciwciała według wynalazku, który

obejmuje wyrażanie przeciwciała w komórce gospodarzu według wynalazku i izolację przeciwciała z

komórki gospodarza.

[0014] Ponadto, ujawniono mysz transgeniczną obejmującą transgeny ludzkich ciężkich i lekkich

łańcuchów immunoglobulin, przy czym mysz wyraża przeciwciało według wynalazku, jak również

hybrydomy przygotowane z takiej myszy, przy czym hybrydoma wytwarza przeciwciało według

wynalazku.

[0015] W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen,

według wynalazku do zastosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania nowotworowi,

charakteryzującemu się wzrostem komórek guza wyrażających PTK7. Nowotwór może być rakiem

okrężnicy (obejmującym raka jelita cienkiego), rakiem płuc, rakiem piersi, rakiem trzustki, czerniakiem

(np. przerzutowym czerniakiem złośliwym), ostrą białaczką szpikową, rakiem nerki, rakiem pęcherza,

rakiem jajnika lub rakiem prostaty. Przykłady innych nowotworów obejmują raka nerek (np. raka

nerkowokomórkowego), glejaka, guzy mózgu, przewlekłe lub ostre białaczki w tym ostrą białaczkę

limfocytową (ALL, ang. acute lymphocytic leukemia), białaczkę T-komórkową dorosłych (T-ALL),

przewlekłą białaczkę szpikową, ostrą białaczkę limfoblastyczną, przewlekłą białaczkę limfocytową,

chłoniaki (np. chłoniak Hodgkina (ziarniczy) i nieziarniczy, chłoniak limfocytarny, pierwotny chłoniak

centralnego układu nerwowego, chłoniak z komórek-T, chłoniak Burkitta, chłoniaki anaplastyczne z

dużych komórek (ALCL, ang. anaplastic large-cell lymphoma), skórne chłoniaki T-komórkowe, chłoniaki z

małych komórek z wpuklonym jądrem komórkowym, chłoniaki z obwodowych komórek T, chłoniaki

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

4

Lennerta (limfoepitelialne), chłoniaki immunoblastyczne, chłoniaki/białaczki T-komórkowe (ATLL),

chłoniaki grudkowe centroblastyczne-centrocytarne (cb/cc), chłoniaki rozlane z dużych komórek B, typ

angioimmunoblastycznych chłoniaków T-komórkowych (typu AILD, ang. angioimmunoblastic

lymphadenopathy) oraz chłoniaki rozwijające się w jamach ciała związane z HIV), raki zarodkowe,

niezróżnicowane raki nosa i gardła (np. guz Schminckego), chorobę Castlemana, mięsaka Kaposiego,

szpiczaka mnogiego, makroglobulinemię Waldenströma i inne chłoniaki B-komórkowe, raki jamy nosowo-

gardłowej, raka kości, raka skóry, raka głowy i szyi, złośliwego czerniaka skórnego lub śródocznego, raka

macicy, raka odbytnicy, raka odbytu, raka żołądka, raka jąder, raka macicy, raka jajowodów, raka

endometrium, raka szyjki macicy, raka pochwy, raka sromu, raka przełyku, raka jelita cienkiego, raka

układu hormonalnego, raka tarczycy, raka przytarczyc, raka nadnercza, mięsaka tkanek miękkich, raka

cewki moczowej, raka prącia, guzy lite wieku dziecięcego, raka pęcherza moczowego, raka nerki lub

moczowodu, raka miedniczki nerwowej, nowotwory ośrodkowego układu nerwowego (OUN, ang. CNS),

angiogenezę nowotworową, guzy rdzenia kręgowego, glejaka pnia mózgu, gruczolaka przysadki, raka

naskórkowego, raka płaskonabłonkowego, nowotwory indukowane środowiskowo włączając indukowane

przez azbest, np. międzybłoniaka oraz kombinacje wymienionych nowotworów.

Krótki opis figur rysunku

[0016]

Figura 1A przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 41) i sekwencję aminokwasową (SEKW

NR ID: 1) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkich monoklonalnych przeciwciał 3G8 i 3G8a.

Regiony CDR1 (SEKW NR ID: 11), CDR2 (SEKW NR ID: 15) i CDR3 (SEKW NR ID: 19) oznaczono

kreskami oraz wskazano pochodzenie germinalne V, D i J (wyprowadzenia linii germinalnej) .

Figura 1B przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 45) i sekwencję aminokwasową (SEKW

NR ID: 5) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 3G8. Regiony

CDR1 (SEKW NR ID: 23), CDR2 (SEKW NR ID: 29) i CDR3 (SEKW NR ID: 35) oznaczono kreskami

oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J .

Figura 1C przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 46) i sekwencję aminokwasową (SEKW

NR ID: 6) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 3G8a. Regiony


oraz wskazano pochodzenie germinalne V i J.


NR ID: 2) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 4D5. Regiony


oraz wskazano pochodzenie germinalne V, D i J.


NR ID: 7) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 4D5. Regiony



PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

5


NR ID: 3) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkich monoklonalnych przeciwciał 12C6. Regiony




NR ID: 8) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 12C6. Regiony



Figura 3C przedstawia sekwencję nukleotydową (SEKW NR ID: 49) i sekwencję aminokwasową (SEKW

NR ID: 9) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 12C6a. Regiony




NR ID: 4) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 7C8. Regiony




NR ID: 10) regionu zmiennego łańcucha lekkiego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała 7C8. Regiony



Figura 5 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennych regionów łańcucha ciężkiego

3G8 (SEKW NR ID: 1) i 3G8a (SEKW ID NR: 1) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego VH

3-30.3 (SEKW NR ID: 51) (germinalny JH4b ujawniony jako SEKW NR ID: 59).

Figura 6 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha ciężkiego

4D5 (SEKW NR ID: 2) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego VH 3-30.3 (SEKW NR ID:

51) (germinalny JH4b ujawniony jako SEKW NR ID: 60).

Figura 7 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennych regionów łańcucha ciężkiego

12C6 (SEKW NR ID: 3) i 12C6a (SEKW NR ID: 2) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego

VH DP44 (SEKW NR ID: 52) (germinalne 3-7, 3-23 oraz JH4b ujawnione odpowiednio jako SEKW NR ID:

61-63).

Figura 8 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha ciężkiego

7C8 (SEKW NR ID: 4) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego VH 3-33 (SEKW NR ID: 53)

(germinalny 3H6b ujawniony jako SEKW NR ID: 64).

Figura 9 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennych regionów łańcucha lekkiego

3G8 (SEKW NR ID: 5) i 3G8a (SEKW ID NR: 6) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego Vk

L15 (SEKW NR ID: 54) (germinalny JK1 ujawniony jako SEKW NR ID: 65).

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

6

Figura 10 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych zmiennego regionu łańcucha lekkiego

4D5 (SEKW NR ID: 7) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego Vk A10 (SEKW NR ID: 55)

(germinalny JK5 ujawniony jako SEKW NR ID: 66).


12C6 (SEKW NR ID: 8) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego Vk A27 (SEKW NR ID: 56)



12C6a (SEKW NR ID: 9) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego Vk L15 (SEKW NR ID:

54) (germinalny JK2 ujawniony jako SEKW NR ID: 68).


7C8 (SEKW NR ID: 10) do sekwencji aminokwasowej ludzkiego germinalnego Vk L6 (SEKW NR ID: 57)


Figura 14 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że ludzkie przeciwciało

monoklonalne 7C8, skierowane przeciwko ludzkiej PTK7, wiąże się do powierzchni komórek HEK3

transfekowanych ludzką PTK7 pełnej długości.

Figura 15 przedstawia wyniki doświadczeń ELISA wykazujące, że ludzkie przeciwciała monoklonalne

przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą swoiście PTK7.

Figura 16 przedstawia wyniki doświadczeń cytometrii przepływowej wykazujące, że przeciwciała

skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do powierzchni komórek guza Wilmsa.


skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do powierzchni komórek różnych nowotworowych linii

komórkowych.


skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do powierzchni komórek dendrytycznych.


skierowane przeciwko ludzkiej PTK7 wiążą się do limfocytów T CD4+ i CD8+, ale nie do limfocytów B.

Figura 20 przedstawia wyniki doświadczeń internalizacji Hum-Zap wykazujące, że ludzkie przeciwciała

monoklonalne przeciwko PTK7 mogą ulegać internalizacji do komórek PTK7+. (A) Internalizacja ludzkich

przeciwciał 3G8, 4D5 i 7C8 do komórek guza Wilmsa. (B) Internalizacja ludzkiego przeciwciała 12C6 do

komórek guza Wilmsa. (C) Internalizacja ludzkich przeciwciał 7C8 i 12C6 do komórek guza A-431. (D)

Internalizacja ludzkich przeciwciał 7C8 i 12C6 do komórek guza PC3.

Figura 21 przedstawia wyniki testu proliferacji komórek wykazujące, że ludzkie monoklonalne

przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną zabijają komórki z linii ludzkiego raka nerki.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

7

Figura 22 przedstawia wyniki testu proliferacji komórek wykazujące, że ludzkie monoklonalne

przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną zabijają komórki linii wyrażających PTK7 o poziomach

ekspresji od niskiego do wysokiego.

Figura 23 przedstawia wyniki testu inwazji wykazujące, że przeciwciała anty-PTK7 hamują ruchliwość

inwazyjną komórek wyrażających PTK7 na powierzchni.

Figura 24 przedstawia wyniki badania ksenoprzeszczepu guza in vivo wykazujące, że przeciwciała anty-

PTK7 sprzężone z toksyną spowolniły progresję wzrostu guza w raku trzustki.

Figura 25 przedstawia wyniki badania ksenoprzeszczepu guza in vivo wykazujące, że przeciwciała anty-

PTK7 sprzężone z toksyną spowolniły progresję wzrostu guza w raku piersi.

Szczegółowy opis wynalazku

[0017] W jednym aspekcie, niniejszy wynalazek odnosi się do izolowanych przeciwciał monoklonalnych,

w szczególności ludzkich przeciwciał monoklonalnych, wiążących swoiście PTK7. W niektórych

wykonaniach, przeciwciała według wynalazku wykazują jedną lub więcej pożądanych właściwości

funkcjonalnych, takich jak wiązanie z wysokim powinowactwem z PTK7 i/lub zdolność do hamowania

wzrostu komórek guza in vitro i in vivo. W niektórych wykonaniach, przeciwciała według wynalazku

pochodzą od szczególnych sekwencji germinalnych łańcucha ciężkiego i lekkiego i/lub obejmują

szczególne cechy strukturalne, takie jak regiony CDR obejmujące szczególne sekwencje aminokwasowe.

Wynalazek dostarcza izolowanych przeciwciał, sposobów wytwarzania takich przeciwciał,

immunokoniugatów i cząsteczek dwuspecyficznych obejmujących takie przeciwciała oraz kompozycji

farmaceutycznych zawierających przeciwciała, immunokoniugaty lub cząsteczki dwuspecyficzne według

wynalazku. Wynalazek odnosi się także do sposobów stosowania przeciwciał, takich jak dla leczenia

chorób takich jak nowotwór.

[0018] Aby niniejszy wynalazek mógł być lepiej zrozumiany, zdefiniowano najpierw pewne terminy.

Dodatkowe definicje są umieszczone w szczegółowym opisie.

[0019] Terminy „PTK7” i „CCK4” stosowane są zamiennie i obejmują warianty, izoformy i homologi

gatunkowe ludzkiej PTK7. Zgodnie z tym, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą, w niektórych

przypadkach, reagować krzyżowo z PTK7 z gatunków innych niż człowiek. W niektórych wykonaniach,

przeciwciała mogą być zupełnie swoiste dla jednej lub więcej ludzkich PTK7 i mogą nie wykazywać

reaktywności krzyżowej dla innych gatunków niż człowiek lub innej. Kompletna sekwencja

aminokwasowa przykładowej ludzkiej PTK7 ma numer dostępu Genbank NM_002821 (SEKW NR ID:

58).

[0020] Termin „odpowiedź immunologiczna” odnosi się do działania, na przykład, limfocytów, komórek

prezentujących antygen, komórek fagocytujących, granulocytów, oraz rozpuszczalnych makromolekuł

wytwarzanych przez powyższe komórki lub wątrobę (włączając przeciwciała, cytokiny i białka

dopełniacza), które skutkuje selektywnymi uszkodzeniami, zniszczeniem lub usunięciem z ciała ludzkiego

infekujących patogenów, komórek lub tkanek zainfekowanych patogenami, komórek nowotworowych lub,

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

8

w przypadkach autoimmunizacji lub patologicznej reakcji zapalnej, normalnych ludzkich komórek lub

tkanek.

[0021] „Szlak transdukcji sygnału” odnosi się do biochemicznej zależności pomiędzy różnymi

cząsteczkami transdukcji sygnału, które odgrywają rolę w przekazywaniu sygnału z jednej części komórki

do innej części komórki. Stosowany tutaj zwrot „receptor na powierzchni komórki” obejmuje, na przykład,

cząsteczki lub kompleksy cząsteczek zdolne do odbierania sygnału i przekazywania takiego sygnału

poprzez błonę komórkową. Przykładem „receptora na powierzchni komórki” według niniejszego

wynalazku jest receptor PTK7.

[0022] Termin „przeciwciało”, w rozumieniu niniejszego opisu, obejmuje całe przeciwciała oraz dowolny

fragment wiążący antygen (tj. „część wiążącą antygen”) lub ich pojedyncze łańcuchy. „Przeciwciało”

odnosi się do glikoproteiny obejmującej co najmniej dwa łańcuchy ciężkie (H, ang. heavy) i dwa łańcuchy

lekkie (L, ang. light) wzajemnie połączone wiązaniami dwusiarczkowymi, lub jej części wiążącej antygen.

Każdy łańcuch ciężki obejmuje region zmienny łańcucha ciężkiego (skracany tutaj do VH, ang. variable

heavy) oraz region stały łańcucha ciężkiego. Rejon stały łańcucha ciężkiego obejmuje trzy domeny, CH1,

CH2 i CH3. Każdy łańcuch lekki obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego (skracany tutaj do VL, ang.

variable light) oraz region stały łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego obejmuje jedną

domenę, CL. Regiony VH i VL można dalej podzielić na regiony hiperzmienne, nazywane regionami

determinującymi dopasowanie (komplementarność) (CDR, ang. complementarity determining regions),

poprzedzielane regionami bardziej konserwowanymi, nazywanymi regionami zrębowymi (szkieletowymi)

(FR, ang. framework regions). Każdy VH i VL składa się trzech CDR i czterech FR, ułożonych od końca

aminowego do końca karboksylowego w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3,

FR4. Regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich zawierają domenę wiążącą, która oddziałuje z

antygenem. Regiony stałe przeciwciał mogą pośredniczyć w wiązaniu immunoglobuliny do tkanek lub

czynników gospodarza, włączając różne komórki układu immunologicznego (np. komórki efektorowe)

oraz pierwszy składnik (CIq) klasycznego układu dopełniacza.

[0023] Stosowany tutaj termin „część wiążąca antygen” przeciwciała (lub po prostu „część przeciwciała”),

odnosi się do jednego lub więcej fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność swoistego wiązania

antygenu (np. PTK7). Wykazano, że funkcja wiązania antygenu przeciwciała może być pełniona przez

fragmenty przeciwciała pełnej długości. Przykłady wiążących fragmentów objętych terminem „część

wiążąca antygen” przeciwciała obejmują (i) fragment Fab, monowalentny fragment składający się z

domen VL, VH, CL, i CH1; (ii) fragment F(ab’)2, biwalentny fragment obejmujący dwa fragmenty Fab

połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fab’, będący w zasadzie

Fab z częścią regionu zawiasowego (patrz, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul wyd. 3 uzupełnione

1993); (iv) fragment Fd składający się z domen VH i CH1; (v) fragment Fv składający się z domen VL i VH

jednego ramienia przeciwciała, (vi) fragment dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), który składa

się z domeny VH; (vii) izolowany region determinujący dopasowanie (CDR); oraz (viii) nanociało, region

zmienny łańcucha ciężkiego zawierający jedną domenę zmienną i dwie domeny stałe. Ponad to, mimo że

dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH kodowane są przez osobne geny, mogą być one połączone, z

zastosowaniem metod rekombinacyjnych, syntetycznym łącznikiem, który umożliwia ich połączenie w

jeden łańcuch białkowy, w którym regiony VL i VH tworzą pary dając cząsteczki monowalentne (znane

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

9

jako jednołańcuchowe Fv (scFv, ang. single chain Fv); patrz np. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i

Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takie jednołańcuchowe przeciwciała

również są w zamierzeniu objęte terminem „część wiążąca antygen” przeciwciała. Te fragmenty

przeciwciała uzyskiwane są konwencjonalnymi technikami znanymi specjalistom w dziedzinie, a

fragmenty są sprawdzane pod kątem użyteczności w ten sam sposób co całe przeciwciała.

[0024] Stosowane tutaj „izolowane przeciwciało”, ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciała, które

jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał mających inne swoistości antygenowe (np. izolowane

przeciwciało, które swoiście wiąże PTK7 jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które swoiście wiążą

antygeny inne niż PTK7). Izolowane przeciwciało, które swoiście wiąże PTK7 może jednak reagować

krzyżowo z innymi antygenami, takimi jak cząsteczki PTK7 z innych gatunków. Ponad to, izolowane

przeciwciało może być zasadniczo wolne od innych składników komórkowych i substancji.

[0025] Stosowane tutaj terminy „przeciwciało monoklonalne” lub „kompozycja przeciwciał

monoklonalnych” odnoszą się do preparatu cząsteczek przeciwciał o pojedynczym składzie

cząsteczkowym. Kompozycja przeciwciał monoklonalnych wykazuje pojedynczą swoistość wiązania i

powinowactwo do konkretnego epitopu.

[0026] Stosowany tutaj termin „ludzkie przeciwciało”, ma w zamierzeniu obejmować przeciwciała o

regionach zmiennych, w których zarówno zrąb jak i regiony CDR pochodzą od ludzkich germinalnych

sekwencji immunoglobulin (ang. human germline immunoglobulin sequences).. Ponad to, jeśli

przeciwciało zawiera region stały, ten region stały również pochodzi od ludzkich germinalnych sekwencji

immunoglobulin. Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą obejmować reszty aminokwasowe nie

kodowane przez sekwencje ludzkich germinalnych immunoglobulin (np. mutacje wprowadzone przez

mutagenezę losową lub ukierunkowaną in vitro lub poprzez mutacje somatyczne in vivo). Jednakże,

stosowany tutaj termin „ludzkie przeciwciało”, nie ma w zamierzeniu obejmować przeciwciał, w których

sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowej ssaka innego gatunku, takiego jak mysz, zostały

wstawione do ludzkich sekwencji zrębowych.

[0027] Termin „ludzkie przeciwciało monoklonalne” odnosi się do przeciwciał wykazujących pojedynczą

swoistość wiązania, które zawierają regiony zmienne, w których zarówno regiony zrębowe jak i CDR

pochodzą od sekwencji immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej. W jednym wykonaniu, ludzkie

przeciwciała monoklonalne wytwarzane są przez hybrydomę, obejmującą komórki B (limfocyty typu B)

pozyskane z transgenicznego zwierzęcia niebędącego człowiekiem, np. transgenicznej myszy, mającej

genom zawierający transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen łańcucha lekkiego, włączone do

unieśmiertelnionej komórki.

[0028] Stosowany tutaj termin „rekombinowane ludzkie przeciwciało" obejmuje wszystkie ludzkie

przeciwciała przygotowywane, wyrażane, tworzone lub izolowane sposobami rekombinacyjnymi, takie jak

(a) przeciwciała wyizolowane ze zwierzęcia (np. myszy), które jest transgeniczne lub

transchromosomalne pod względem genów ludzkich immunoglobulin lub z otrzymanej z nich hybrydomy

(szerzej opisanej poniżej), (b) przeciwciała wyizolowane z komórki gospodarza transformowanej w celu

ekspresji ludzkiego przeciwciała, np. z transfektomy, (c) przeciwciała wyizolowane z rekombinowanych,

kombinatorycznych bibliotek ludzkich przeciwciał i (d) przeciwciała przygotowane, wyrażane, tworzone

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

10

lub izolowane wszelkimi innymi sposobami, obejmującymi splicing (składanie) sekwencji genów ludzkich

immunoglobulin do innych sekwencji DNA. Takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mają regiony

zmienne, w których regiony zrębowe i CDR pochodzą od sekwencji immunoglobulin ludzkiej linii

zarodkowej. Jednakże, w niektórych wykonaniach, takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mogą być

poddane mutagenezie in vitro (lub somatycznej mutagenezie in vivo, gdy stosowane jest zwierzę

transgeniczne pod względem ludzkich sekwencji Ig) i tym sposobem sekwencje aminokwasowe regionów

VH i VL rekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które, pomimo pochodzenia i powiązania z

sekwencjami VH i VL ludzkiej linii zarodkowej, nie muszą naturalnie występować w ludzkim repertuarze

przeciwciał linii zarodkowej (germinalnej) in vivo.

[0029] Stosowany tutaj „izotyp” odnosi się do klasy przeciwciała (np. IgM lub IgG1), kodowanej przez

geny regionu stałego łańcucha ciężkiego.

[0030] Zwroty „przeciwciało rozpoznające antygen” oraz „przeciwciało swoiste wobec antygenu”

stosowane są tutaj zamiennie z terminem „przeciwciało, które wiąże się swoiście z antygenem”.

[0031] Termin „pochodne ludzkiego przeciwciała” odnosi się do jakiejkolwiek zmodyfikowanej formy

ludzkiego przeciwciała, np. koniugatu przeciwciała z innym środkiem lub przeciwciałem.

[0032] Termin „przeciwciało humanizowane” ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciał, w których

sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowych innych gatunków ssaków, takich jak mysz, wstawiono do

ludzkich sekwencji zrębowych. W obrębie ludzkich sekwencji zrębowych mogą być wykonane dodatkowe

modyfikacje regionów zrębowych.

[0033] Termin „przeciwciało chimeryczne” ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciał, w których

sekwencje regionów zmiennych pochodzą z jednego gatunku, a sekwencje regionów stałych pochodzą z

innego gatunku, tak jak przeciwciało, w którym sekwencje regionów zmiennych pochodzą z przeciwciała

mysiego, a sekwencje regionów stałych pochodzą z przeciwciała ludzkiego.

[0034] Stosowane tutaj przeciwciało, które „swoiście wiąże się z ludzką PTK7” ma w zamierzeniu odnosić

się do przeciwciała, które wiąże się z ludzką PTK7 z KD wynoszącą 1x10-7

M lub mniejszą, korzystniej

5x10-8

M lub mniejszą, korzystniej 1x10-8

M lub mniejszą, korzystniej 5x10-9

M lub mniejszą.

[0035] Stosowany tutaj termin „zasadniczo nie wiąże się” z białkiem lub komórkami, oznacza nie wiąże

się lub nie wiąże się z wysokim powinowactwem z białkiem lub komórkami, tj. wiąże się z białkiem lub

komórkami z KD wynoszącą 1x10-6

M lub większą, korzystniej 1x10-5

M lub większą, korzystniej 1x10-4

M

lub większą, korzystniej 1x10-3

M lub większą, jeszcze korzystniej 1x10-2

M lub większą.

[0036] Stosowany tutaj termin "Kassoc" lub "Ka" ma w zamierzeniu odnosić się do szybkości asocjacji

danego oddziaływania przeciwciało-antygen, podczas gdy stosowany tutaj termin "Kdis" lub "Kd," ma w

zamierzeniu odnosić się do szybkości dysocjacji danego oddziaływania przeciwciało-antygen. Stosowany

tutaj termin "KD" ma za zadanie odnosić się do stałej równowagi dysocjacji, którą uzyskuje się ze

stosunku Kd do Ka (tj. Kd/Ka) i wyraża jako stężenie molowe (M). Wartości KD dla przeciwciał można

określić stosując sposoby powszechnie uznane w stanie techniki. Korzystnym sposobem określania KD

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

11

przeciwciała jest stosowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego, korzystniej stosowanie

systemu biosensorowego, takiego jak system Biacore®.

[0037] Stosowany tutaj termin „wysokie powinowactwo” (duże powinowactwo) dla przeciwciała IgG,

odnosi się do przeciwciała mającego KD wynoszącą 10-8

M lub mniejszą, korzystniej 10-9

M lub mniejszą,

a jeszcze korzystniej 10-10

M lub mniejszą wobec docelowego antygenu. Jednakże, „wysokie

powinowactwo” wiązania może różnić się dla innych izotypów przeciwciała. Na przykład, „wysokie

powinowactwo” wiązania dla izotypu IgM odnosi się do przeciwciała mającego KD wynoszącą 10-7

M lub

mniejszą, korzystniej 10-8

M lub mniejszą, jeszcze korzystniej 10-9

M lub mniejszą.

[0038] Stosowany tutaj termin „osobnik” obejmuje dowolne zwierzę będące lub niebędące człowiekiem.

Termin „zwierzę niebędące człowiekiem” obejmuje wszystkie kręgowce, np. ssaki i nie-ssaki, takie jak

naczelne inne niż człowiek, owce, psy, koty, konie, krowy, kury, płazy, gady itd.

[0039] Różne aspekty wynalazku opisane są bardziej szczegółowo w dalszych podrozdziałach.

Przeciwciała anty-PTK7.

[0040] Przeciwciała według wynalazku są scharakteryzowane przez szczególne cechy funkcjonalne lub

właściwości przeciwciał. Na przykład, przeciwciała specyficznie wiążą się z PTK7. Korzystnie,

przeciwciało według wynalazku wiąże się z PTK7 z wysokim powinowactwem, na przykład z KD

wynoszącą 1x10-7

M lub mniejszą. Korzystnie, przeciwciało wiąże się z ludzką PTK7 z KD wynoszącą

5x10-8

M lub mniejszą, wiąże się z ludzką PTK7 z KD wynoszącą 1x10-8

M lub mniejszą, wiąże się z

ludzką PTK7 z KD wynoszącą 5x10-9

M lub mniejszą, lub wiąże się z ludzką PTK7 z KD pomiędzy

1x10-8

M a 1x10-10

M lub mniejszą. Przeciwciało wiąże się z komórkami guza Wilmsa z EC50 wynoszącym

4,0 nM lub mniejszym, lub wiąże się z komórkami guza Wilmsa z EC50 wynoszącym 3,5 nM lub

mniejszym. W stanie techniki znane są badania oceniające zdolność wiązania przeciwciał względem

PTK7, w tym na przykład testy ELISA, Western blot i RIA. Kinetykę wiązania (np. powinowactwo

wiązania) przeciwciał można również ocenić standardowymi, znanymi w stanie techniki badaniami, takimi

jak test ELISA, analizy Scatchard i Biacore. W innym przykładzie, przeciwciała według niniejszego

wynalazku mogą wiązać się do komórek guza linii raka nerki, na przykład do linii komórkowej guza

Wilmsa. Odpowiednie badania oceniające dowolną z opisanych powyżej cech opisano szczegółowo w

Przykładach.

Przeciwciała monoklonalne 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8

[0041] Przeciwciała według wynalazku obejmują ludzkie przeciwciała monoklonalne 4D5, 12C6 oraz 7C8.

Inne ujawnione tutaj przeciwciała obejmują 3G8, 3G8a oraz 12C6. Wszystkie przeciwciała zostały

wyizolowane i scharakteryzowane strukturalnie jak opisano w Przykładach 1 i 2. Specjaliści w dziedzinie

zauważą, że przeciwciała 3G8 i 3G8a, tak jak i przeciwciała 12C6 i 12C6a mają te same sekwencje

łańcuchów ciężkich, różniąc się w sekwencjach łańcuchów lekkich. Sekwencje aminokwasowe VH dla

3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: 1 (3G8 i 3G8a), 2 (4D5), 3 (12C6 i

12C6a) oraz 4 (7C8). Sekwencje aminokwasowe VL dla 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8

przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 5, 6, 7, 8, 9 i 10.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

12

[0042] Z uwagi na to, że każde z tych przeciwciał może wiązać się z PTK7, sekwencje VH i VL mogą być

„mieszane i dopasowywane” w celu stworzenia innych cząsteczek wiążących anty-PTK7. Wiązanie PTK7

przez takie „zmieszane i dopasowane” przeciwciała można być sprawdzane przy zastosowaniu testów

wiązania opisanych powyżej oraz w Przykładach (np. testy ELISA). Korzystnie, kiedy łańcuchy VH i VL są

mieszane i dopasowywane, sekwencja VH z konkretnej pary VH/VL podmieniana jest sekwencją VH

podobną strukturalnie. Podobnie, korzystnie sekwencja VL z konkretnej pary VH/VL podmieniana jest

sekwencją VL podobną strukturalnie.

[0043] Zgodnie z tym, w jednym aspekcie, ujawniono tutaj izolowane przeciwciało monoklonalne, lub jego

część wiążącą antygen, obejmujące:

(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy

składającej się z SEKW NR ID: 1, 2, 3 i 4; oraz

(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z grupy

składającej się z SEKW NR ID: 5, 6, 7, 8, 9 i 10;

przy czym przeciwciało swoiście wiąże PTK7, korzystnie ludzką PTK7.

[0044] Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według wynalazku może obejmować:

(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 2; oraz

(b) region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 7; lub





[0045] Inne ujawnione kombinacje łańcucha ciężkiego i lekkiego obejmują:







[0046] W innym aspekcie, ujawniono tutaj przeciwciała, które obejmują CDR1, CDR2 i CDR3 łańcuchów

ciężkich i lekkich z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 lub ich kombinacje. Sekwencje aminokwasowe

CDR1 z VH z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: 11 (3G8 i 3G8a), 12

(4D5), 13 (12C6 i 12C6a) oraz 14 (7C8). Sekwencje aminokwasowe CDR2 z VH z 3G8, 3G8a, 4D5,

12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: 15 (3G8 i 3G8a), 16 (4D5), 17 (12C6 i 12C6a) oraz

18 (7C8). Sekwencje aminokwasowe CDR3 z VH z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w

SEKW NR ID: 19 (3G8 i 3G8a), 20 (4D5), 21 (12C6 i 12C6a) oraz 22 (7C8). Sekwencje aminokwasowe

CDR1 z Vk z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 23, 24,

25, 26, 27 i 28. Sekwencje aminokwasowe CDR2 z Vk z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8

przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 29, 30, 31, 32, 33 i 34. Sekwencje aminokwasowe CDR3 z

Vk z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 35, 36, 37, 38, 39

i 40. Regiony CDR są wytyczone z zastosowaniem systemu Kabata (Kabat, E. A., et al. (1991)

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

13

Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human

Services, NIH nr publikacji. 91-3242).

[0047] Z uwagi na to, że każde z tych przeciwciał może wiązać się z PTK7 oraz że swoistość wiązania

antygenu zapewniana jest głównie przez regiony CDR1, CDR2 i CDR3, sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3

z VH oraz sekwencje CDR1, CDR2 i CDR3 z Vk mogą być „mieszane i dopasowywane” (tj. CDRy z

różnych przeciwciał mogą być mieszane i dopasowywane, ale każde przeciwciało musi zawierać CDR1,

CDR2 i CDR3 z VH oraz CDR1, CDR2 i CDR3 z Vk) w celu stworzenia innych cząsteczek wiążących anty-

PTK7 według wynalazku. Wiązanie z PTK7 dla takich „zmieszanych i dopasowanych” przeciwciał można

sprawdzić stosując testy wiązania opisane powyżej i w Przykładach (np. ELISA, analiza Biacore).

Korzystnie, kiedy sekwencje CDR z VH są mieszane i dopasowywane, sekwencja CDR1, CDR2 i/lub

CDR3 z konkretnej sekwencji VH podmieniana jest sekwencją (/ami) CDR podobną (/ymi) strukturalnie.

Podobnie, kiedy sekwencje CDR z Vk są mieszane i dopasowywane, sekwencja CDR1, CDR2 i/lub CDR3

z konkretnej sekwencji Vk podmieniana jest korzystnie sekwencją (/ami) CDR podobną (/ymi)

strukturalnie. Dla specjalisty w dziedzinie oczywiste będzie, że nowe sekwencje VH i VL mogą być

tworzone poprzez zastępowanie jednej lub więcej sekwencji regionu CDR z VH i/lub VL sekwencjami

podobnymi strukturalnie, z sekwencji CDR ujawnionych tutaj dla przeciwciał monoklonalnych 3G8, 3G8a,

4D5, 12C6, 12C6a i 7C8.

[0048] Zgodnie z tym, w innym aspekcie, ujawniono tutaj izolowane przeciwciało monoklonalne, lub jego

część wiążąca antygen, obejmujące:

(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z

grupy składającej się z SEKW NR ID: 11, 12, 13 i 14;

(b) CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z


(c) CDR3 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z


(d) CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z

grupy składającej się z SEKW NR ID: 23, 24, 25, 26, 27 i 28;

(e) CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z

grupy składającej się z SEKW NR ID: 29, 30, 31, 32, 33 i 34; oraz

(f) CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z

grupy składającej się z SEKW NR ID: 35, 36, 37, 38, 39 i 40;

przy czym przeciwciało swoiście wiąże PTK7, korzystnie ludzką PTK7.

[0049] Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według wynalazku może obejmować:







PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

14

lub







lub







[0050] Ujawniono tutaj również przeciwciała obejmujące:







lub







lub







[0051] W stanie techniki znany jest fakt, że domena CDR3, niezależnie od domen(-y) CDR1 i/lub CDR2,

sama może determinować swoistość wiązania przeciwciała dla odpowiedniego antygenu oraz, że można

wytworzyć w przewidywalny sposób liczne przeciwciała o tej samej swoistości wiązania w oparciu o

wspólną sekwencję CDR3. Patrz, na przykład, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)

(opisujące wytwarzanie humanizowanego przeciwciała anty-CD30 z zastosowaniem jedynie zmiennej

domeny CDR3 łańcucha ciężkiego z mysiego przeciwciała Ki-4 anty-CD30); Beiboer et al., J. Mol. Biol.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

15

296:833-849 (2000) (opisujące rekombinowane przeciwciała przeciw glikoproteinie nabłonkowej-2 (EGP-

2, ang. epithelial glycoprotein-2), z zastosowaniem jedynie sekwencji CDR3 ciężkiego łańcucha

wyjściowego mysiego przeciwciała MOC-31 anty-EGP-2); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

95:8910-8915 (1998) (opisujący panel humanizowanych przeciwciał anty-integryna αvβ3, z

zastosowaniem zmiennych domen CDR3 łańcucha ciężkiego i lekkiego mysiego przeciwciała LM609

anty-integryna αvβ3, gdzie każde z przeciwciał zawiera odmienną sekwencję poza domeną CDR3 i

zdolne jest do wiązania się z tym samym epitopem, co wyjściowe, mysie przeciwciało, z powinowactwami

tak wysokimi jak lub wyższymi niż wyjściowe, mysie przeciwciało); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc.

116:2161-2162 (1994) (ujawniający, że domena CDR3 zapewnia najistotniejszy wkład w wiązanie

antygenu); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 2529-2533 (1995) (opisujący przeszczepienie

sekwencji CDR3 łańcucha ciężkiego trzech Fab (SI-1, SI-40 i SI-32) przeciw ludzkiemu, łożyskowemu

DNA, na łańcuch ciężki Fab toksoida przeciw-tężcowego, zastępujące w ten sposób istniejący CDR3

łańcucha ciężkiego i wykazujące, że sama domena CDR3 nadaje swoistość wiązania); oraz Ditzel et al.,

J. Immunol. 157: 739-749 (1996) (opisujący badania przeszczepiania, w których przeniesienie jedynie

CDR3 łańcucha ciężkiego wyjściowego wieloswoistego Fab LNA3 na łańcuch ciężki monoswoistego

przeciwciała Fab p313 IgG, wiążącego się z tężcowym toksoidem, było wystarczające do zachowanie

swoistości wiązania wyjściowego Fab).

[0052] Zgodnie z tym, ujawnione zostały przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej domen

CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała pochodzącego od człowieka lub zwierzęcia nie

będącego człowiekiem, przy czym przeciwciało monoklonalne jest zdolne do swoistego wiązania z PTK7.

Ujawniono tutaj także przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha

ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała z gatunku innego niż człowiek, takiego jak przeciwciało mysie lub

szczurze, przy czym przeciwciało monoklonalne jest zdolne do swoistego wiązania z PTK7. Takie

przeciwciała obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała z

gatunku innego niż człowiek (a) są zdolne do współzawodniczenia o wiązanie z; (b) zachowują

charakterystykę funkcjonalną; (c) wiążą się z tym samym epitopem; i/lub (d) mają podobne

powinowactwa wiązania jak odpowiadające wyjściowe przeciwciało z gatunku innego niż człowiek.

[0053] Ujawnione zostały także przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej domen CDR3

łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z przeciwciała ludzkiego, takiego jak, na przykład, ludzkie przeciwciało

otrzymane od zwierzęcia innego niż człowiek, przy czym ludzkie przeciwciało jest zdolne do swoistego

wiązania z PTK7. Ujawniono tutaj również przeciwciała monoklonalne obejmujące jedną lub więcej

domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z pierwszego ludzkiego przeciwciała, takiego jak, na

przykład, ludzkie przeciwciało otrzymane od zwierzęcia innego niż człowiek, przy czym pierwsze

przeciwciało jest zdolne do swoistego wiązania z PTK7 i gdzie domena CDR3 z pierwszego ludzkiego

przeciwciała zastępuje domenę CDR3 w ludzkim przeciwciele któremu brak swoistości wiązania dla

PTK7, w celu stworzenia drugiego ludzkiego przeciwciała, które jest zdolne do swoistego wiązania z

PTK7. Takie przeciwciała obejmujące jedną lub więcej domen CDR3 łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego z

pierwszego ludzkiego przeciwciała (a) są zdolne do współzawodniczenia o wiązanie z; (b) zachowują

charakterystykę funkcjonalną; (c) wiążą się z tym samym epitopem; i/lub (d) mają podobne

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

16

powinowactwa wiązania jak odpowiadające wyjściowe pierwsze ludzkie przeciwciało. Pierwszym ludzk im

przeciwciałem może być 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a oraz 7C8.

Przeciwciała wiążące się z tym samym epitopem co przeciwciała anty-PTK7 według wynalazku

[0054] Wynalazek dostarcza przeciwciał, które wiążą się z tym samym epitopem na ludzkiej PTK7 co

dowolne z przeciwciał monoklonalnych PTK7 według wynalazku.(tj. przeciwciał, które mają zdolność do

krzyżowego współzawodniczenia o wiązania z PTK7 z dowolnym z przeciwciał monoklonalnych według

wynalazku). Przeciwciałem odniesienia dla badań krzyżowego współzawodniczenia może być

przeciwciało monoklonalne 4D5 (mające sekwencje VH i VL jak przedstawiono w SEKW NR ID:

odpowiednio 2 i 7), lub przeciwciało monoklonalne 12C6 (mające sekwencje VH i VL jak przedstawiono w

SEKW NR ID: odpowiednio 3 i 8), lub przeciwciało monoklonalne 7C8 (mające sekwencje VH i VL jak

przedstawiono w SEKW NR ID: odpowiednio 4 i 10). Takie przeciwciała współzawodniczące krzyżowo

mogą być identyfikowane w oparciu o ich zdolność do krzyżowego współzawodniczenia z 4D5, 12C6 lub

7C8 w standardowych testach wiązania z PTK7. Na przykład, do wykazania krzyżowego

współzawodniczenia z przeciwciałami według niniejszego wynalazku, zastosowana może być analiza

BIAcore, testy ELISA lub cytometria przepływowa. Zdolność badanego przeciwciała do hamowania

wiązania, na przykład, 4D5, 12C6 lub 7C8 z ludzką PTK7 wykazuje, że badane przeciwciało może

współzawodniczyć z 4D5, 12C6 lub 7C8 o wiązanie z ludzką PTK7, a więc wiąże się z tym samym

epitopem na ludzkiej PTK7 co 4D5, 12C6 lub 7C8. Przeciwciało, które wiąże się z tym samym epitopem

na ludzkiej PTK7 co 4D5, 12C6 lub 7C8 jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym. Takie ludzkie

przeciwciała monoklonalne mogą być przygotowane i izolowane jak opisano w Przykładach.

Cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące przeciwciała według wynalazku

[0055] Kolejny aspekt wynalazku dotyczy cząsteczek kwasów nukleinowych, które kodują przeciwciała

według wynalazku. Kwasy nukleinowe mogą być obecne w całych komórkach, w lizacie komórkowym, lub

w postaci częściowo oczyszczonej albo zasadniczo oczyszczonej. Kwas nukleinowy jest „wyizolowany”

lub „uznany za zasadniczo oczyszczony” gdy jest oczyszczony z innych składników komórkowych lub

innych zanieczyszczeń, np. innych kwasów nukleinowych lub białek, standardowymi technikami,

włączając metodę alkaliczną/SDS, gradient CsCl, chromatografię kolumnową, elektroforezę w żelu

agarozowym i inne dobrze znane w stanie techniki. Patrz, F. Ausubel, et al., wyd. (1987) Current

Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nowy York. Kwasem

nukleinowym według wynalazku może być, na przykład, DNA lub RNA i może on obejmować sekwencje

intronowe lub nie. W korzystnym wykonaniu, kwas nukleinowy jest cząsteczką cDNA.

[0056] Kwasy nukleinowe mogą być otrzymane z zastosowaniem standardowych technik biologii

molekularnej. Dla przeciwciał wyrażanych w hybrydomach (np. hybrydomach wytworzonych z myszy

transgenicznych niosących ludzkie geny immunoglobulin jak opisano poniżej), cDNA kodujące łańcuchy

lekkie i ciężkie przeciwciała wytwarzanego przez hybrydomę może być otrzymany poprzez standardową

amplifikację PCR lub techniki klonowania cDNA. Dla przeciwciał otrzymywanych z biblioteki genowej

immunoglobulin (np. z zastosowaniem technik ekspozycji fagowej (ang. phage display), kwasy

nukleinowe kodujące przeciwciało mogą być odzyskane z biblioteki.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

17

[0057] Korzystnymi cząsteczkami kwasów nukleinowych są te kodujące sekwencje VH i VL z przeciwciał

monoklonalnych 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a lub 7C8. Sekwencje DNA kodujące sekwencje VH z

3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 przedstawione są w SEKW NR ID: 41 (3G8 i 3G8a), 42 (4D5), 43

(12C6 i 12C6a) oraz 44 (7C8). Sekwencje DNA kodujące sekwencje VL z 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a

i 7C8 przedstawione są odpowiednio w SEKW NR ID: 45, 46, 47, 48, 49 i 50.

[0058] Po otrzymaniu fragmentów DNA kodujących segmenty VH i VL, te fragmenty DNA mogą być

poddane dalszej manipulacji standardowymi technikami rekombinacji DNA, na przykład aby przekształcić

geny regionu zmiennego do genów łańcucha przeciwciała pełnej długości, do genów fragmentu Fab lub

do genu scFv. W tych zabiegach, fragment DNA kodujący VL lub VH jest łączony funkcjonalnie z innym

fragmentem DNA kodującym inne białko, takie jak region stały przeciwciała lub elastyczny łącznik. Zwrot

„łączony funkcjonalnie”, stosowany w tym kontekście, ma oznaczać, że dwa fragmenty DNA połączone

są w ten sposób, że sekwencje aminokwasowe kodowane przez dwa fragmenty DNA pozostają w tej

samej ramce odczytu.

[0059] Wyizolowany DNA kodujący region VH może być przekształcony do genu łańcucha ciężkiego

pełnej długości poprzez funkcjonalne połączenie DNA kodującego VH z inną cząsteczką DNA kodującą

regiony stałe łańcucha ciężkiego (CH1, CH2 i CH3). Sekwencje ludzkich genów regionu stałego łańcucha

ciężkiego są znane w stanie techniki (patrz np. Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of

Immunological Interest, Wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Nr

publikacji. 91-3242) a fragmenty DNA obejmujące te regiony mogą być otrzymane przez standardową

amplifikację PCR. Region stały łańcucha ciężkiego może być regionem stałym z IgG1, IgG2, IgG3, IgG4,

IgA, IgE, IgM lub IgD, ale najkorzystniej jest regionem stałym z IgG1 lub IgG4. Dla genu łańcucha

ciężkiego fragmentu Fab, DNA kodujący VH może być łączony funkcjonalnie z inną cząsteczką DNA

kodującą tylko region stały CH1 łańcucha ciężkiego.

[0060] Wyizolowany DNA kodujący region VL może być przekształcony do genu łańcucha lekkiego pełnej

długości (jak również do genu łańcucha lekkiego z Fab) poprzez funkcjonalne połączenie DNA

kodującego VL z inną cząsteczką DNA kodującą region stały łańcucha lekkiego, CL. Sekwencje ludzkich

genów regionu stałego łańcucha lekkiego są znane w stanie techniki (patrz np. Kabat, E. A., el al. (1991)

Sequences of Proteins of Immunological Interest, Wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human

Services, NIH Nr publikacji. 91-3242) a fragmenty DNA obejmujące te regiony mogą być otrzymane przez

standardową amplifikację PCR. Region stały łańcucha lekkiego może być regionem stałym kappa lub

lambda, ale najkorzystniej jest regionem stałym kappa.

[0061] Aby wytworzyć gen scFv, fragmenty DNA kodujące VH i VL są łączone funkcjonalnie z innym

fragmentem kodującym elastyczny łącznik, np. kodującym sekwencję aminokwasową (Gly4 – Ser)3, tak

że sekwencje VH i VL mogą być wyrażane jako ciągły pojedynczy łańcuch białkowy, z regionami VL i VH

połączonymi elastycznym łącznikiem (patrz np. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al.

(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych według wynalazku

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

18

[0062] Przeciwciała monoklonalne (mAbs – ang. monoclonal antibodies) mogą być wytwarzane

różnorodnymi technikami, włączając konwencjonalną metodologię przeciwciał monoklonalnych np.

standardowa technika hybrydyzacji somatycznej – Kohler i Milstein (1975) Nature 256: 495. Chociaż

procedury hybrydyzacji somatycznej są korzystne, to zasadniczo można zastosować inne techniki

wytwarzania przeciwciała monoklonalnego np. transformacja wirusowa lub onkogenna limfocytów B.

[0063] Korzystnym systemem zwierzęcym do przygotowywania hybrydom jest system mysi. Wytwarzanie

hybrydomy w myszy jest bardzo dobrze udokumentowaną procedurą. Znane są w stanie techniki

procedury immunizacji i techniki izolacji immunizowanych splenocytów do fuzji. Znani są także partnerzy

fuzyjni (np. komórki mysiego szpiczaka) i procedury fuzji.

[0064] Przeciwciała chimeryczne lub ludzkie mogą być przygotowane w oparciu o sekwencję mysiego

przeciwciała monoklonalnego przygotowanego jak opisano powyżej. DNA kodujący łańcuch ciężki i lekki

immunoglobulin może być otrzymany z odpowiedniej mysiej hybrydomy i zaprojektowany tak aby

zawierał nie-mysie (np. ludzkie) sekwencje immunoglobulin z zastosowaniem standardowych technik

biologii molekularnej. Na przykład, aby stworzyć przeciwciało chimeryczne, mysie regiony zmienne mogą

być połączone z ludzkimi regionami stałymi sposobami znanymi w stanie techniki (patrz np. patent USA

nr 4,816,567 dla Cabilly et al.). W celu stworzenia przeciwciała humanizowanego, mysie regiony CDR

mogą być wstawione do ludzkiej sekwencji zrębowej z zastosowaniem sposobów znanych w stanie

techniki (patrz np. patent USA nr 5,225,539 dla Winter, oraz patenty USA nr 5,530,101; 5,585,089;

5,693,762 i 6,180,370 dla Queen et al.).

[0065] Przeciwciała według wynalazku to ludzkie przeciwciała monoklonalne. Takie ludzkie przeciwciała

monoklonalne skierowane przeciw PTK7 mogą być wytworzone z zastosowaniem myszy transgenicznych

lub transchromosomalnych, niosących części ludzkiego systemu immunologicznego zamiast systemu

mysiego. Te myszy transgeniczne i transchromosomalne obejmują myszy określane tutaj odpowiednio

jako myszy HuMAb i myszy KM miceTM

, i są wspólnie określane tutaj jako „myszy z ludzkimi Ig”.

[0066] Mysz HuMAb® (Medarex Inc.) zawiera miniloci ludzkich genów immunoglobulin, które kodują

niezrearanżowane ludzkie sekwencje łańcucha ciężkiego (µ i γ) i lekkiego κ immunoglobulin, razem z

ukierunkowanymi mutacjami, które inaktywują endogenne loci łańcucha µ i κ (patrz np. Lonberg, et al.

(1994) Nature 368 (6474): 856-859). Tak więc, myszy wykazują obniżoną ekspresję mysich IgM lub κ i w

odpowiedzi na immunizację wprowadzone transgeny ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego przechodzą

zmianę klasy i mutacje somatyczne dając ludzkie monoklonalne IgGκ o wysokim powinowactwie

(Lonberg, N. et al. (1994), supra; opisane w Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology

113:49-101; Lonberg, N. i Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, oraz Harding, F. i Lonberg,

N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). Przygotowanie i zastosowanie myszy HuMab oraz

modyfikacje genomowe tych myszy opisane są dalej w Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research

20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993)

EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994)

International Immunology 6: 579-591; oraz Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851.

Patrz dalej patenty USA nr 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397;

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

19

5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; wszystkie dla Lonberg i Kay; patent USA nr 5,545,807 dla

Surani et al.; publikacje PCT nr WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO

98/24884 i WO 99/45962, wszystkie dla Lonberg i Kay; oraz publikacja PCT nr WO 01/14424 dla

Korman et al.

[0067] W innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą być uzyskane z

zastosowaniem myszy niosącej ludzkie sekwencje immunoglobulin w transgenach lub na

transchromosomach, takich jak mysz niosąca transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego oraz

transchromosom ludzkiego łańcucha lekkiego. Takie myszy, określane tutaj jako „KM miceTM

”, opisane są

szczegółowo w publikacji PCT nr WO 02/43478 dla Ishida et al.

[0068] Dalsze, alternatywne zwierzęce systemy transgeniczne wyrażające ludzkie geny immunoglobulin

są dostępne w stanie techniki i mogą być stosowane do otrzymania przeciwciał anty-PTK7 według

wynalazku. Na przykład, zastosowany może być alternatywny system transgeniczny określany jako

Xenomouse (Abgenix, Inc.); takie myszy opisane są, na przykład, w patentach USA nr 5,939,598;

6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 i 6,162,963 dla Kucherlapati et al.

[0069] Ponad to, w stanie techniki dostępne są alternatywne zwierzęce systemy transchromosomalne

wyrażające ludzkie geny immunoglobulin i mogą być one stosowane w celu otrzymania przeciwciał anty-

PTK7 według wynalazku. Na przykład, mogą być stosowane myszy niosące zarówno transchromosom

ludzkiego łańcucha ciężkiego jak i transchromosom ludzkiego łańcucha lekkiego, określane tutaj jako „TC

mice”; takie myszy opisane są w Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Co

więcej, w stanie techniki opisano krowy niosące transchromosomy ludzkiego łańcucha ciężkiego i

lekkiego (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) i mogą być one stosowane w celu

otrzymania przeciwciał anty-PTK7 według wynalazku.

[0070] Ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą być także przygotowane z

zastosowaniem metod ekspozycji fagowej (technik prezentacji na fagu) (ang. phage display) do

przeszukiwania bibliotek ludzkich genów immunoglobulin. Takie metody ekspozycji fagowej dla

izolowania ludzkich przeciwciał są ustalone w stanie techniki. Patrz na przykład: patenty USA nr

5,223,409; 5,403,484; i 5,571,698 dla Ladner et al.; patenty USA nr 5,427,908 i 5,580,717 dla Dower et

al.; patenty USA nr 5,969,108 i 6,172,197 dla McCafferty et al.; oraz patenty USA nt 5,885,793;

6,521,404; 6,544,731;.6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081 dla Griffiths et al.

[0071] Ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą być także przygotowane z

zastosowaniem myszy SCID, w których rekonstytuowano ludzkie komórki odpornościowe, tak że można

otrzymać odpowiedź ludzkich przeciwciał po immunizacji. Takie myszy opisano na przykład w patentach

USA nr 5,476,996 i 5,698,767 dla Wilson et al.

Immunizacja myszy z ludzkimi Ig

[0072] Kiedy do otrzymania ludzkich przeciwciał według wynalazku stosowane są myszy z ludzkimi Ig,

myszy te mogą być immunizowane oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem antygenu PTK7 i/lub

rekombinowaną PTK7, lub białkiem fuzyjnym z PTK7, jak opisano w Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

20

(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; oraz publikacjach PCT nr

WO 98/24884 i WO 01/14424. Korzystnie, myszy będą w wieku 6-16 tygodni przy pierwszej infuzji. Na

przykład, oczyszczony lub rekombinowany preparat (5-50 µg) antygenu PTK7 może być zastosowany do

immunizacji myszy z ludzkimi Ig dootrzewnowo.

[0073] Szczegółowe procedury wytworzenia całkowicie ludzkich przeciwciał monoklonalnych dla PTK7 są

opisane w Przykładzie 1 poniżej. Zbiór doświadczeń z różnymi antygenami wykazał, że myszy

transgeniczne odpowiadają gdy początkowo immunizowane są dootrzewnowo (IP, ang. intraperitoneally)

z antygenem w kompletnym adiuwancie Freunda, z kolejnymi immunizacjami IP co drugi tydzień (do

łącznie 6) antygenem w niekompletnym adiuwancie Freunda. Jednakże, adiuwanty inne niż Freunda

również okazują się skuteczne. Dodatkowo, stwierdzono, że całe komórki przy braku adiuwanta są

wysoce immunogenne. Odpowiedź immunologiczna może być monitorowana w tracie trwania protokołu

immunizacji przy pomocy próbek osocza otrzymywanych ze skrwawiania pozagałkowego. Osocze może

być badane testem ELSIA (jak opisano poniżej), a myszy z wystarczającymi mianami ludzkiej

immunoglobuliny anty-PTK7 mogą być wykorzystane do fuzji. Myszy mogą być stymulowane antygenem

dożylnie 3 dni przed uśmierceniem i usunięciem śledziony. Spodziewane jest, że dla każdej immunizacji

będą musiały być wykonane 2-3 fuzje. Myszy zazwyczaj immunizowane są pomiędzy 6 a 24 dla każdego

antygenu. Zazwyczaj stosowane są szczepy zarówno HCo7 jak i HCo12. Dodatkowo, zarówno transgen

HCo7 jak i HCo12 mogą być wkrzyżowane do jednej myszy mającej dwa różne transgeny ludzkiego

łańcucha ciężkiego (HCo7/HCo12). Alternatywnie lub dodatkowo, może być stosowany szczep myszy KM

mouseTM

, jak opisano w przykładzie 1.

Tworzenie hybrydom wytwarzających ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku

[0074] W celu wytworzenia hybrydomy wytwarzającej ludzkie przeciwciała monoklonalne według

wynalazku, splenocyty i/lub komórki węzłów chłonnych z immunizowanych myszy mogą być wyizolowane

i poddane fuzji z odpowiednią unieśmiertelnioną linią komórkową, taką jak linia komórkowa mysiego

szpiczaka. Powstające hybrydomy mogą być przeszukane pod kątem wytwarzania przeciwciał swoistych

dla antygenu. Na przykład, zawiesiny pojedynczych komórek limfocytów śledziony z immunizowanych

myszy mogą być poddane fuzji z jedną szóstą liczby komórek niewydzielniczego szpiczaka myszy

P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) z 50% PEG. Komórki są wysiewane w ilości około 2 x 105 na

płaskodenną płytkę mikrotitracyjną, a następnie przez dwa tygodnie inkubowane w pożywce selekcyjnej

zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej, 18% pożywki kondycjonowanej „653”, 5% origen (IGEN), 4

mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 5mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanolu, 50 jednostek/ml

penicyliny, 50 mg/ml streptomycyny, 50 mg/ml gentamycyny oraz 1X HAT (Sigma; HAT dodawane jest 24

godziny po fuzji). Po około dwóch tygodniach, komórki mogą być hodowane w pożywce, w której HAT

zastąpione jest HT. Poszczególne studzienki mogą być wówczas sprawdzone testem ELISA pod kątem

ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgM i IgG. Kiedy wystąpi znaczny wzrost hybrydomy, można

monitorować pożywkę zazwyczaj po 10-14 dniach. Hybrydomy wydzielające przeciwciało mogą być

przesiewane, ponownie sprawdzane, i jeżeli nadal dają wynik pozytywny dla ludzkich monoklonalnych

przeciwciał IgG, mogą być subklonowane co najmniej dwa razy przez ograniczające rozcieńczenia.

Stabilne subklony mogą być wówczas hodowane in vitro do wytworzenia małych ilości przeciwciał w

pożywce hodowli tkankowej w celu charakteryzacji.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

21

[0075] W celu oczyszczenia ludzkich przeciwciał monoklonalnych, wybrane hybrydomy mogą być

hodowane w dwu-litrowych kolbach z mieszadłem obrotowym dla oczyszczania przeciwciał

monoklonalnych. Supernatanty mogą być filtrowane i zatężane przed chromatografią powinowactwa ze

złożem protein A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluowane IgG może być sprawdzone

poprzez elektroforezę w żelu i wysokosprawną chromatografię cieczową w celu zapewnienia czystości.

Roztwór buforowany może zostać zastąpiony PBS, a stężenie można ustalić przez OD280 stosując

współczynnik ekstynkcji 1,43. Przeciwciała monoklonalne można porcjować i przechowywać w -80° C.

Tworzenie transfektom wytwarzających przeciwciała monoklonalne według wynalazku

[0076] Przeciwciała według wynalazku mogą być także wytwarzane w transfektomie komórki gospodarza

z zastosowaniem, na przykład, kombinacji technik rekombinacji DNA i metod transfekcji genów, znanych

w stanie techniki (np. Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

[0077] Na przykład, w celu wyrażania przeciwciał, lub fragmentów tych przeciwciał, DNA kodujący lekkie i

ciężkie łańcuchy częściowe lub pełnej długości, można otrzymać standardowymi technikami biologii

molekularnej (np. amplifikacja PCR lub klonowanie cDNA z zastosowaniem hybrydomy wyrażającej

odpowiednie przeciwciało) i można wstawić DNA do wektorów ekspresyjnych takich, że geny są

połączone funkcjonalnie (operatywnie) do sekwencji kontrolnych transkrypcji i translacji. W tym

kontekście, zwrot „połączone funkcjonalnie” ma oznaczać, że gen przeciwciała jest zligowany z wektorem

tak, że sekwencje kontrolne transkrypcji i translacji w wektorze wypełniają swoją zamierzoną funkcję

regulacji transkrypcji i translacji genu przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje kontrolne ekspresji

wybrane są tak aby były kompatybilne ze stosowaną do ekspresji komórką gospodarzem. Gen łańcucha

lekkiego przeciwciała i gen łańcucha ciężkiego przeciwciała mogą być wstawione do osobnych wektorów

lub, bardziej typowo, oba geny wstawione są do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny przeciwciał

wstawiane są do wektora ekspresyjnego standardowymi sposobami (np. ligacja komplementarnych

miejsc restrykcyjnych fragmentu genu przeciwciała i wektora, lub ligacja tępych końców jeżeli brak miejsc

restrykcyjnych). Opisane tutaj regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciał mogą być

stosowane do stworzenia genów przeciwciał pełnej długości dowolnego izotypu przeciwciała poprzez

wstawienie ich do wektorów ekspresyjnych już kodujących regiony stałe łańcucha ciężkiego i regiony

stałe łańcucha lekkiego żądanego izotypu, tak jak gdy segment VH jest połączony funkcjonalnie z

segmentem (-ami) CH w wektorze, a segment Vκ jest połączony funkcjonalnie z segmentem CL w

wektorze. Dodatkowo lub alternatywnie, rekombinowany wektor ekspresyjny może kodować peptyd

sygnałowy, który ułatwia wydzielanie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen łańcucha

przeciwciała może być wklonowany w wektor, tak że peptyd sygnałowy jest połączony z końcem

aminowym genu łańcucha przeciwciała, z zachowaniem ramki odczytu. Peptyd sygnałowy może być

peptydem sygnałowym immunoglobulin lub heterologicznym peptydem sygnałowym (tj. peptydem

sygnałowym z białka nie będącego immunoglobuliną).

[0078] Dodatkowo do genów łańcuchów przeciwciał, rekombinowane wektory ekspresyjne według

wynalazku niosą sekwencje regulatorowe, które kontrolują ekspresję genów łańcuchów przeciwciał w

komórce gospodarzu. Zwrot „sekwencja regulatorowa” ma w zamierzeniu obejmować promotory,

sekwencje wzmacniające i inne elementy kontroli ekspresji (np. sygnały poliadenylacji), które kontrolują

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

22

transkrypcję lub translację genów łańcuchów przeciwciał. Takie sekwencje regulatorowe są opisane, na

przykład, w Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San

Diego, CA (1990)). Specjaliści w dziedzinie zauważą, że konstrukcja wektora ekspresyjnego, łącznie z

wyborem sekwencji regulatorowych, może zależeć od czynników takich jak wybór komórki gospodarza do

transformacji, pożądany poziom ekspresji białka, itd. Korzystne sekwencje regulatorowe dla ekspresji w

ssaczej komórce gospodarzu obejmują elementy wirusowe, które kierują wysokim poziomem ekspresji

białka w komórkach ssaków, takie jak promotory i/lub sekwencje wzmacniające pochodzące z wirusa

cytomegalii (CMV), małpiego wirusa 40 (SV40), adenowirusa, (np. główny późny promotor adenowirusa

(AdMLP) i poliomy. Alternatywnie, można zastosować niewirusowe sekwencje regulatorowe, takie jak

promotor ubikwityny lub promotor β-globiny. Jeszcze dalej, elementy regulatorowe złożone z sekwencji z

różnych źródeł, takie jak system promotorowy SRα, który zawiera sekwencje z wczesnego promotora

SV40 i długie końcowe powtórzenia z wirusa ludzkiej białaczki komórek-T typu 1 (Takebe, Y. et al. (1988)

Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

[0079] W dodatku do genów łańcuchów przeciwciał i sekwencji regulatorowych, rekombinowane wektory

ekspresyjne według wynalazku mogą nieść dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje regulujące

replikację wektora w komórkach gospodarzach (np. miejsca inicjacji replikacji) i selekcyjne geny

markerowe. Selekcyjny gen markerowy ułatwia selekcję komórek gospodarzy, do których wprowadzono

wektor (patrz, np. patenty USA nr 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, wszystkie przez Axel et al.). Na

przykład, typowo selekcyjny gen markerowy nadaje oporność na leki, takie jak G418, hygromycyna czy

metotreksat, dla komórki gospodarza, do której wprowadzono wektor. Korzystne selekcyjne geny

markerowe obejmują gen reduktazy dihydrofolianu (DHFR) (do stosowania w komórkach gospodarzach

dhfr- z selekcją/amplifikacją metotreksatem) i gen neo (dla selekcji G418).

[0080] W celu ekspresji łańcuchów lekkich i ciężkich, wektor(-y) ekspresyjny kodujący łańcuchy ciężkie i

lekkie transfekowany jest do komórki gospodarza standardowymi technikami. Różne formy terminu

„transfekcja” mają w zamierzeniu obejmować całą różnorodność technik powszechnie stosowanych do

wprowadzania egzogennego DNA do prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza, np.

elektroporacja, strącanie fosforanem wapnia, transfekcja z DEAE-dekstranem i tym podobne. Chociaż

teoretycznie możliwa jest ekspresja przeciwciał według wynalazku zarówno w prokariotycznych jak i

eukariotycznych komórkach gospodarzach, najkorzystniejsza jest ekspresja przeciwciał w komórkach

eukariotycznych, a najkorzystniej w ssaczych komórkach gospodarzach, ponieważ takie komórki

eukariotyczne, a w szczególności komórki ssaków; z większym prawdopodobieństwem niż komórki

prokariotyczne złożą i wydzielą prawidłowo zwinięte i aktywne immunologicznie przeciwciało.

Stwierdzono, że prokariotyczna ekspresja genów przeciwciał jest nieskuteczna do wytwarzania

aktywnego przeciwciała z wysoką wydajnością (Boss, M. A. i Wood, C. R. (1985) Immunology Today

6:12-13).

[0081] Korzystne ssacze komórki gospodarze do ekspresji rekombinowanych przeciwciał według

wynalazku obejmują komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) (włączając komórki CHO dhfr-, opisane w

Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, stosowane z markerem selekcyjnym

DHFR, np. jak opisano w R. J. Kaufman i P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), komórki szpiczaka

NSO, komórki COS i komórki SP2. W szczególności, do zastosowania z komórkami szpiczaka NSO,

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

23

innym korzystnym systemem ekspresji jest system ekspresji genu GS ujawniony w WO 87/04462, WO

89/01036 i EP 338,841. Kiedy rekombinowane wektory ekspresyjne kodujące geny przeciwciał

wprowadzane są do ssaczych komórek gospodarzy, przeciwciała wytwarzane są poprzez hodowlę

komórek gospodarzy przez okres czasu wystarczający aby umożliwić ekspresję przeciwciała w

komórkach gospodarzach lub, korzystniej, wydzielenie przeciwciała do pożywki hodowlanej, w której

rosną komórki gospodarze. Przeciwciała można odzyskać z pożywki hodowlanej stosując standardowe

sposoby oczyszczania białka.

Charakteryzacja wiązania się przeciwciała z antygenem

[0082] Przeciwciała według wynalazku mogą być testowane pod kątem wiązania z PTK7 przez, na

przykład, standardowy test ELISA. W skrócie, płytki mikrotitracyjne pokrywane są oczyszczoną PTK7

0,25 µg/ml w PBS, a następnie blokowane 5% albuminą surowicy bydlęcej w PBS. Rozcieńczenia

przeciwciała (np. rozcieńczenia osocza od myszy immunizowanych PTK7) dodawane są do każdej

studzienki i inkubowane przez 1-2 godziny w 37°C. Płytki są płukane PBS/Tween, a następnie

inkubowane z odczynnikiem drugorzędowym (np. dla przeciwciał ludzkich, anty-ludzki swoisty względem

IgG-Fc poliklonalny reagent z kozy) sprzężonym z fosfatazą alkaliczną przez 1 godzinę w 37°C. Po

płukaniu, płytki są wywoływane substratem pNPP (1 mg/ml) i analizowane przy OD 405-650. Korzystnie,

do fuzji wykorzystywane będą myszy osiągające najwyższe miana.

[0083] Test ELISA taki jak opisany powyżej może także być stosowany dla hybrydom, które wykazują

pozytywną reaktywność z immunogenem PTK7. Hybrydomy, które wiążą się z wysokim powinowactwem

z PTK7 są subklonowane i dalej charakteryzowane. Jeden klon z każdej hybrydomy, który zachowuje

reaktywność komórek wyjściowych (w teście ELISA), może być wybrany do przygotowania banku

komórek z 5-10 fiolek, przechowywanego w -140°C, oraz do oczyszczenia przeciwciała.

[0084] W celu oczyszczenia przeciwciał anty-PTK7, wybrane hybrydomy można hodować w dwu-

litrowych kolbach z mieszadłem obrotowym do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych. Supernatanty

mogą być filtrowane i zatężane przed chromatografią powinowactwa ze złożem proteinA-sepharose

(Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluowane IgG może być sprawdzone poprzez elektroforezę w żelu i

wysokosprawną chromatografię cieczową w celu zapewnienia czystości. Roztwór buforowy może zostać

zastąpiony PBS, a stężenie może być ustalone przy OD280 z zastosowaniem współczynnika ekstynkcji

1,43. Przeciwciała monoklonalne mogą być porcjowane i przechowywane w -80°C.

[0085] W celu ustalenia czy wybrane przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 wiążą się z unikalnymi

epitopami, każde przeciwciało może być biotynylowane z zastosowaniem odczynników dostępnych

komercyjnie (Pierce, Rockford, IL). Badania kompetencyjne z zastosowaniem niewyznakowanych

przeciwciał monoklonalnych i biotynylowanych przeciwciał monoklonalnych mogą być przeprowadzone z

zastosowaniem płytek ELISA opłaszczonych PTK7, jak opisano powyżej. Wiązanie biotynylowanych mAb

może być wykrywane przy pomocy sondy steptawidyna-fosfataza alkaliczna.

[0086] W celu ustalenia izotypu oczyszczonych przeciwciał, można przeprowadzić izotypowe testy

ELISA, z zastosowaniem odczynników swoistych dla konkretnego izotypu. Na przykład, do ustalenia

izotypu ludzkiego przeciwciała monoklonalnego, studzienki płytek mikrotitracyjnych można opłaszczyć 1

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

24

µg/ml anty-ludzkiej immunoglobuliny przez noc w 4°C. Po zablokowaniu 1% BSA, płytki są traktowane 1

µg/ml lub mniej testowych przeciwciał monoklonalnych lub oczyszczonych kontroli izotypowych, w

temperaturze otoczenia przez jedną do dwóch godzin. Studzienki mogą być potem traktowane

sprzężonymi z fosfatazą alkaliczną sondami swoistymi dla ludzkiego IgG1 lub ludzkiego IgM. Płytki

wywołuje się i analizuje jak opisano powyżej.

[0087] Ludzkie IgG anty-PTK7 mogą być dalej sprawdzone pod kątem reaktywności z antygenem PTK7 z

pomocą Western blot. W skrócie, PTK7 może być przygotowane i poddane elektroforezie w żelu

poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu. Po elektroforezie, rozdzielone antygeny są

transferowane na membrany nitrocelulozowe, blokowane 10% płodową surowicą bydlęcą i sondowane

przy użyciu testowanych przeciwciał monoklonalnych. Wiązanie ludzkiego IgG może być wykryte przy

zastosowaniu fosfataz alkalicznych anty-ludzkie IgG i wywołane tabletkami substratu BCIP/NBT (Sigma

Chem. Co., St. Louis, Mo.).

Immunokoniugaty

[0088] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciało anty-PTK7, lub jego fragment,

sprzężone z środkiem terapeutycznym, takim jak cytotoksyna, lekiem (np. immunosupresantem) lub

radiotoksyną. Takie koniugaty określane są tutaj jako „immunokoniugaty”. Immunokoniugaty, które

obejmują jedną lub więcej cytotoksyn określane są jako „immunotoksyny”. Cytotoksyna lub środek

cytotoksyczny obejmują dowolne środki, które są szkodliwe (np. zabójcze) dla komórek. Przykłady

obejmują taksol, cytochalazynę B, gramicydynę D, bromek etydyny, emetynę, mitomycynę, etopozyd,

tenopozyd, winkrystynę, winblastynę, kolchicynę, doksorubicynę, daunorubicynę, dion

dihydroksyantracyny, mitoksantron, mitramycynę, aktynomycynę D, 1-dehydrotestosteron,

glukokortykoidy, prokainę, tetrakainę, lidokainę, propranolol i puromycynę i ich analogi lub homologi.

Środkii terapeutyczne obejmują także, na przykład, antymetabolity (np. metotreksat, 6-merkaptopurynę,

6-tioguaninę, cytrabinę, 5-fluorouracyl dekarbazynę), środki alkilujące (np. mechloretaminę, tiotepa

chlorambucyl, melfalan, karmustynę (BSNU) i lomustynę (CCNU), cyklofosfamid, busulfan,

dibromomannitol, streptozotocynę, mitomycynę C i cis-dichlorodiaminoplatynę (II) (DDP) cisplatynę),

antracykliny, (np. daunorubicynę (niegdyś daunomycynę) i doksorubicynę), antybiotyki (np. dakty-

nomycynę (niedgyś aktynomycynę), bleomycynę, mitramycynę i antramycynę (AMC)) i środki anty-

mitotyczne (np. winkrystynę i winblastynę).

[0089] Inne korzystne przykłady terapeutycznych cytotoksyn, które można sprzęgać z przeciwciałami

według wynalazku obejmują duokarmycyny, kalicheamycyny, maitanzyny i aurystatyny i ich pochodne.

Przykład koniugatu przeciwciała i kalichaemycyny jest komercyjnie dostępny (MylotargTM

; Wyeth-Ayerst).

Przykłady terapeutycznych cytotoksyn można znaleźć, przykładowo, w patentach USA nr 6548530 i

6281354 i w zgłoszeniach patentowych nr US 2003/0064984, US 2003/0073852 i US 2003/0050331.

[0090] Cytotoksyny można sprzęgać z przeciwciałami według wynalazku, stosując technologię łącznika,

dostępną w stanie techniki. Przykłady typów łączników, stosowanych do sprzęgania cytotoksyn z

przeciwciałami obejmują, ale nie ograniczają się do, hydrazonów, tioestrów, estrów, dwusiarczków i

łączników zawierających peptydy. Można wybrać łącznik, przykładowo, podatny na rozszczepianie niskim

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

25

pH w obrębie kompartmentu lizosomalnego lub podatny na rozszczepianie proteazami, takimi jak

proteazy preferencyjnie wyrażane w tkance nowotworowej, takie jak katepsyny (np. katepsyny B, C, D).

[0091] Dla dalszych rozważań nad typami cytotoksyn, łączników i sposobów sprzęgania środków

terapeutycznych z przeciwciałami, patrz także Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215;

Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer. Cell 3:207-

212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. i Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin.

Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. i Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

[0092] Przeciwciała według niniejszego wynalazku można sprzęgać również z izotopem radioaktywnym,

aby wytworzyć cytotoksyczne radiofarmaceutyki, określane również jako radioimmunokoniugaty.

Przykłady izotopów radioaktywnych, które można sprzęgać z przeciwciałami, w celu użycia

diagnostycznego lub terapeutycznego, obejmują, ale nie ograniczają się do jodu131

, indu111

, itru90

i

lutetu177

. Sposoby wytwarzania radioimmunokoniugatów są ustalone w stanie techniki. Przykłady

radioimmunokoniugatów są komercyjnie dostępne, włączając ZevalinTM

(IDEC Pharmaceuticals) i

BexxarTM

(Corixa Pharmaceuticals), a podobne sposoby można stosować do wytwarzania

radioimmunokoniugatów z zastosowaniem przeciwciał według wynalazku.

[0093] Koniugaty przeciwciał według wynalazku można stosować do modyfikacji danej odpowiedzi

biologicznej, a cząstki leku nie należy rozumieć jako ograniczonej do klasycznych, chemicznych środków

terapeutycznych. Przykładowo, cząstką leku może być białko lub polipeptyd, mający pożądaną

aktywność biologiczną. Takie białka mogą obejmować, na przykład, enzymatycznie aktywną toksynę lub

jej aktywny fragment, takie jak abrynę, rycynę A, egzotoksynę pseudomonas lub toksynę błonicy; białko,

takie jak czynnik martwicy guza lub interferon-γ; lub modyfikatory odpowiedzi biologicznej, takie jak, na

przykład, limfokiny, interleukinę-1 ("IL-1"), interleukinę-2 ("IL-2"), interleukinę-6 ("IL-6"), czynnik

stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów ("GM-CSF"), czynnik stymulujący tworzenie

kolonii granulocytów ("G-CSF") lub inne czynniki wzrostu.

[0094] Techniki sprzęgania takich cząstek terapeutycznych z przeciwciałami są dobrze znane, patrz, np.

Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", w Monoclonal

Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (wyd.), s. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et

al., "Antibodies For Drug Delivery", w Controlled Drug Delivery (Wyd. 2.), Robinson et al. (wyd.), s. 623-

53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A

Review", w Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (wyd.), s. 475-

506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled

Antibody In Cancer Therapy", w Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.

(wyd.), s. 303-16 (Academic Press 1985) i Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of

Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Kompozycje farmaceutyczne

[0095] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza kompozycję np. kompozycję farmaceutycznązawierającą

jedno lub kombinację przeciwciał monoklonalnych, lub ich części wiążącej (wiążących) antygen, według

niniejszego wynalazku, formułowanej razem z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem. Takie

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

26

kompozycje mogą obejmować jedno lub kombinację (np. dwóch lub więcej różnych) przeciwciał lub

immunokoniugatów według wynalazku. Na przykład, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku

może obejmować kombinację przeciwciał (lub immunokoniugatów), wiążących się z różnymi epitopami

antygenu docelowego lub mających aktywności komplementarne.

[0096] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać w terapii skojarzonej, tj.

połączonej z innymi środkami. Przykładowo, terapia skojarzona może obejmować przeciwciało anty-PTK7

według wynalazku, połączone z przynajmniej jednym innym środkiem przeciwzapalnym lub

immunosupresyjnym. Przykłady środków terapeutycznych, które można stosować w terapii skojarzonej,

opisano bardziej szczegółowo poniżej, w sekcji poświęconej stosowaniu przeciwciał według wynalazku.

[0097] Stosowany tu "nośnik dopuszczalny farmaceutycznie" obejmuje wszelkie rozpuszczalniki, środki

dyspersyjne, pokrycia, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające

wchłanianie i tym podobne, które są fizjologicznie kompatybilne. Korzystnie, nośnik jest odpowiedni do

podawania dożylnego, domięśniowego, podskórnego, pozajelitowego, dordzeniowego lub naskórkowego

(np. przez iniekcje lub infuzje). W zależności od drogi podawania, składnik aktywny, tj. przeciwciało,

immunokoniugat lub cząsteczka dwu-specyficzna może być pokryty materiałem chroniącym składnik

przed działaniem kwasów lub innych warunków naturalnych, mogących dezaktywować składnik.

[0098] Składniki farmaceutyczne według wynalazku mogą obejmować jedną lub więcej soli

dopuszczalnych farmaceutycznie. "Sól dopuszczalna farmaceutycznie" odnosi się do soli, zachowującej

pożądaną aktywność biologiczną składnika macierzystego i nie wywołującej żadnych skutków

niepożądanych (patrz, np. Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Przykłady takich soli

obejmują kwaśne sole addycyjne i zasadowe sole addycyjne. Kwaśne sole addycyjne obejmują te

pochodzące od nietoksycznych kwasów nieorganicznych, takich jak solny, azotowy, fosforowy, siarkowy,

bromowodorowy, jodowodorowy, fosforawy i tym podobne, jak również od nietoksycznych kwasów

organicznych, takich jak alifatyczne kwasy mono- i dikarboksylowe, kwasy alkanowe podstawione

fenylem, hydroksykwasy alkanokarboskylowe, kwasy aromatyczne, alifatyczne i aromatyczne kwasy

sulfonowe i tym podobne. Zasadowe sole addycyjne obejmują te pochodzące od metali ziem

alkalicznych, takich jak sód, potas, magnez, wapń i tym podobne, jak również od nietoksycznych amin

organicznych, takich jak N,N’-dibenzyloetylenodiamina, N-metyloglukamina, chloroprokaina, cholina,

dietanoloamina, etylenodiamina, prokaina i tym podobne.

[0099] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może także obejmować farmaceutycznie

dopuszczalny przeciwutleniacz. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych przeciwutleniaczy obejmują:

(1) przeciwutleniacze rozpuszczalne w wodzie, takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny,

wodorosiarczan sodu, pirosiarczyn sodu, siarczyn sodu i tym podobne; (2) przeciwutleniacze

rozpuszczalne w tłuszczach, takie palmitynian askorbylu, butylowany hydroksyanizol (BHA), butylowany

hydroksytoluen (BHT), lecytyna, galusan propylu, alfa-tokoferol i tym podobne; i (3) środki chelatujące

metale, takie jak kwas cytrynowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), sorbitol, kwas winowy, kwas

fosforowy i tym podobne.

[0100] Przykłady odpowiednich nośników wodnych i nie-wodnych, które można stosować w

kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak glicerol,

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

27

glikol propylenowy, glikol polietylenowy i tym podobne),oraz ich odpowiednie mieszaniny, oleje roślinne,

takie jak oliwa z oliwek i estry organiczne, odpowiednie do wstrzykiwania, takie jak oleinian etylu.

Odpowiednią płynność można utrzymać, na przykład, stosując materiały powlekające, takie jak lecytynę,

utrzymując wymagany rozmiar cząstek w przypadku dyspersji oraz stosując środki powierzchniowo

czynne.

[0101] Kompozycje te mogą również zawierać adiuwanty, takie jak konserwanty, środki zwilżające, środki

emulgujące i środki dyspergujące. Zapobieganie obecności mikroorganizmów można zapewnić zarówno

przez procedury sterylizacji, supra, i przez dodatek różnych środków przeciwbakteryjnych i

przeciwgrzybiczych, na przykład, parabenu, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbowego i tym podobnych.

Pożądane może być również włączenie do kompozycji środków izotonicznych, takich jak cukry, chlorek

sodu i tym podobne. Dodatkowo, przedłużone wchłanianie wstrzykniętej postaci farmaceutycznej można

osiągnąć, przez włączenie środków opóźniających wchłanianie, takich jak monostearynian glinu i

żelatyna.

[0102] Nośniki dopuszczalne farmaceutycznie obejmują sterylne roztwory wodne lub dyspersje i sterylne

proszki do późniejszego przygotowywania sterylnych wstrzykiwanych roztworów i dyspersji. W stanie

techniki znane jest stosowanie takich podłoży i środków dla substancji aktywnych farmaceutycznie. Z

wyjątkiem sytuacji, w której jakieś podłoże lub środek jest niekompatybilny ze składnikiem aktywnym,

rozważane jest jego użycie w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku. Do kompozycji można

włączyć również uzupełniające składniki aktywne.

[0103] Kompozycje terapeutyczne zazwyczaj muszą być sterylne i stabilne w warunkach wytwarzania i

przechowywania. Kompozycję można formułować jako roztwór, mikroemulsję, liposom lub inną

zorganizowaną strukturę, odpowiednią do uzyskania wysokiego stężenia leku. Nośnik może być

rozpuszczalnikiem lub ośrodkiem dyspersyjnym, zawierającym, na przykład, wodę, etanol, poliol (na

przykład, glicerol, glikol propylenowy i ciekły glikol polietylenowy i tym podobne) oraz ich odpowiednie

mieszaniny. Odpowiednią płynność można utrzymać, przykładowo, stosując powleczenia, takie jak

lecytynę, utrzymując wymagany rozmiar cząstek w przypadku dyspersji oraz stosując środki

powierzchniowo czynne. W wielu przypadkach, korzystne będzie włączenie do kompozycji środków

izotonicznych, na przykład, cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol lub chlorku sodu. Wydłużone

wchłanianie wstrzykiwanej kompozycji można osiągnąć dzięki włączeniu do kompozycji środka

opóźniającego wchłanianie, przykładowo, soli monostearynianu i żelatyny.

[0104] Sterylne roztwory do wstrzykiwania można przygotować poprzez wprowadzenie składnika

aktywnego w wymaganej ilości do odpowiedniego rozpuszczalnika, razem z jednym lub kombinacją

wyliczonych powyżej składników, zależnie od potrzeb, a następnie sterylizację przez mikrofiltrację.

Zasadniczo, dyspersje wytwarza się poprzez wprowadzenie składnika aktywnego do sterylnego nośnika,

zawierającego podstawowy ośrodek dyspersyjny i inne wymagane składniki, spośród wyliczonych

powyżej. W przypadku sterylnych proszków, służących do wytwarzania sterylnych roztworów do

wstrzykiwania, korzystnymi sposobami przygotowywania są suszenie próżniowe i suszenie sublimacyjne

(liofilizacja), skutkujące otrzymaniem proszku ze składnika aktywnego i każdego dodatkowego,

pożądanego składnika z ich wcześniej sterylnie odfiltrowanego roztworu.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

28

[0105] Ilość aktywnego składnika, która może być połączona z materiałem nośnikowym, w celu

wytworzenia pojedynczej postaci dawkowania będzie różnić się, w zależności od leczonego osobnika i

szczególnego sposobu podania. Ilość aktywnego składnika, która może być połączona z materiałem

nośnikowym, w celu wytworzenia pojedynczej postaci dawkowania będzie generalnie tą ilością

kompozycji, która daje efekt terapeutyczny. Ogólnie, ze stu procent, ilość ta będzie się zawierać w

przedziale od około 0.01 procenta do około dziewięćdziesięciu dziewięciu procent składnika aktywnego,

korzystnie od około 0.1 procenta do około 70 procent, najkorzystniej od około 1 procenta do około 30

procent składnika aktywnego w kombinacji z nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie.

[0106] Schematy dawkowania dostosowywane są, by zapewniać optymalną pożądaną odpowiedź (np.

odpowiedź terapeutyczną). Na przykład, można podać pojedynczy bolus, można podać kilka

podzielonych dawek w przeciągu czasu lub można proporcjonalnie zredukować lub zwiększyć dawkę,

zgodnie ze wskazaniami wymogów sytuacji terapeutycznej. Szczególnie korzystne jest formułowanie

kompozycji pozajelitowych w postaci jednostkowych dawek dla łatwości podawania i jednorodności

dawek. Stosowana tu postać jednostkowej dawki odnosi się do fizycznie odrębnych jednostek,

odpowiednich jako jednostkowe dawki dla leczonych osobników; każda jednostka zawiera z góry

określoną ilość składnika aktywnego, wyliczoną w celu uzyskania pożądanego efektu terapeutycznego, w

połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Wymagania techniczne dla postaci

jednostkowych dawek według wynalazku podyktowane są przez i bezpośrednio zależą od (a) unikalnych

cech charakterystycznych składnika aktywnego i konkretnego efektu terapeutycznego, który ma być

osiągnięty, oraz (b) ograniczeń właściwych dziedzinie wytwarzania takiego aktywnego składnika do

leczenia wrażliwości osobniczej.

[0107] Przy podawaniu przeciwciała, dawka pochodzi z zakresu od około 0,0001 do 100 mg/kg, a

częściej 0,01 do 5 mg/kg masy ciała gospodarza. Przykładowo, dawkować można 0,3 mg/kg masy ciała,

1 mg/kg masy ciała, 3 mg/kg masy ciała, 5 mg/kg masy ciała lub 10 mg/kg masy ciała lub w zakresie 1-10

mg/kg. Przykładowy schemat dawkowania wymaga podawania raz w tygodniu, raz na dwa tygodnie, raz

na trzy tygodnie, raz na cztery tygodnie, raz na miesiąc, raz na 3 miesiące lub raz na trzy do 6 miesięcy.

Korzystne sposoby dawkowania dla przeciwciała anty-PTK7 według wynalazku obejmują 1 mg/kg masy

ciała lub 3 mg/kg masy ciała przed podanie dożylne, z podawaniem przeciwciała z zastosowaniem

jednego z następujących schematów dawkowania: (i) co każde cztery tygodnie przez sześć dawek,

następnie co trzy miesiące; (ii) co trzy tygodnie; (iii) 3 mg/kg masy ciała jednorazowo, a następnie 1

mg/kg masy ciała, co trzy tygodnie.

[0108] W niektórych sposobach, jedno lub dwa przeciwciała monoklonalne o różnych swoistościach

(specyficznościach) wiązania podawane są równocześnie, i wówczas dawkowanie każdego z przeciwciał

znajduje się we wskazanym zakresie. Przeciwciało podawane jest zazwyczaj wielokrotnie. Odstępy

między poszczególnymi dawkowaniami mogą być, przykładowo, tygodniowe, miesięczne, trzymiesięczne

lub roczne. Odstępy mogą również być nieregularne, zgodnie ze wskazaniami pomiarów poziomów

przeciwciała wobec docelowego antygenu, we krwi pacjenta. W niektórych sposobach, dawkowanie jest

dopasowywane, aby uzyskać stężenie przeciwciała w surowicy na poziomie około 1-1000 μg /ml, a w

niektórych sposobach 25-300 μg /ml.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

29

[0109] Alternatywnie, przeciwciało można podawać w postaci formulacji o długotrwałym uwalnianiu, w

przypadku której wymagane jest rzadsze dawkowanie. Dawkowanie i częstotliwość różnią się, w

zależności od czasu półtrwania przeciwciała w pacjencie. Ogólnie, ludzkie przeciwciała wykazują

najdłuższy czas półtrwania, następne są przeciwciała humanizowane, przeciwciała chimeryczne i

przeciwciała nie-ludzkie. Dawkowanie i częstość podawania mogą różnić się w zależności od tego, czy

leczenie jest profilaktyczne czy terapeutyczne. W aplikacjach profilaktycznych podawane są stosunkowo

niskie dawkowania w stosunkowo nieregularnych odstępach przez długi okres czasu. Niektórzy pacjenci

kontynuują przyjmowanie leczenia przez resztę życia. W aplikacjach terapeutycznych wymagane są

czasami stosunkowo wysokie dawkowania w stosunkowo krótkich odstępach, dopóki postęp choroby nie

zostanie zredukowany lub zakończony, a korzystnie dopóki pacjent wykazuje częściową lub całkowitą

poprawę objawów choroby. Od tego czasu pacjent może przejść na profilaktyczny sposób dawkowania.

[0110] Rzeczywiste poziomy dawkowania składników aktywnych kompozycji farmaceutycznych według

niniejszego wynalazku mogą być zróżnicowane, tak aby uzyskać ilość składnika aktywnego,

wystarczającą do osiągnięcia pożądanej odpowiedzi terapeutycznej dla konkretnego pacjenta,

kompozycji i sposobu podawania, nietoksyczną dla pacjenta. Wybrany poziom dawkowania zależeć

będzie od różnorodnych czynników farmakokinetycznych, włączając aktywność konkretnych,

zastosowanych kompozycji według wynalazku lub ich estrów, soli lub amidów, drogi podawania, czasu

podawania, stopnia wydalania konkretnego, zastosowanego składnika, czasu trwania leczenia, innych

leków, składników i/lub materiałów, zastosowanych w kombinacji z konkretnymi, zastosowanymi

kompozycjami, wieku, płci, wagi, kondycji, ogólnego zdrowia i wcześniejszej historii medycznej leczonego

pacjenta oraz podobnych czynników, dobrze znanych w stanie technik medycznych.

[0111] "Dawkowanie skuteczne terapeutycznie" (terapeutycznie skuteczna dawka) przeciwciała anty-

PTK7 według wynalazku, korzystnie skutkuje obniżeniem ostrości objawów choroby, wzrostem częstości i

długości okresów bezobjawowych choroby lub zapobieganiem osłabieniu lub niepełnej sprawności,

powodowanej dolegliwościami chorobowymi. Przykładowo, w leczeniu guzów, "dawkowanie skuteczne

terapeutycznie" korzystnie hamuje wzrost komórek lub wzrost guza o przynajmniej około 20%, korzystniej

o przynajmniej około 40%, jeszcze korzystniej o przynajmniej około 60%, a jeszcze korzystniej o

przynajmniej około 80%, w porównaniu do osobników nieleczonych. Zdolność składnika do hamowania

wzrostu guza można ocenić na podstawie zwierzęcego układu modelowego, prognostycznego względem

skuteczności w ludzkich guzach. Alternatywnie, tą właściwość kompozycji można ocenić, badając

zdolność składnika do hamowania, takim hamowaniem in vitro testami znanymi specjaliście.

Terapeutycznie skuteczna ilość składnika terapeutycznego może spowodować zmniejszenie rozmiaru

guza lub też inaczej złagodzić objawy u osobnika. Przeciętny specjalista będzie zdolny do wyznaczenia

takich ilości, w oparciu o czynniki takie jak wielkość osobnika, ostrość objawów u osobnika oraz

konkretna kompozycja lub droga podawania.

[0112] Kompozycję według niniejszego wynalazku można podawać jedną lub większą ilością dróg po-

dawania, stosując jeden lub więcej różnorodnych sposobów, znanych w stanie techniki. Znawca

zauważy, że drogi i/lub sposoby podawania będą zróżnicowane, w zależności od pożądanych rezultatów.

Korzystne drogi podawania przeciwciał według wynalazku obejmują dożylne, domięśniowe, śródskórne,

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

30

dootrzewnowe, podskórne, dordzeniowe lub inne, pozajelitowe drogi podawania, przykładowo, iniekcje

lub infuzje. Stosowany tu zwrot "podawanie pozajelitowe" oznacza sposoby podawania inne niż

podawanie dojelitowe lub miejscowe, zazwyczaj w formie iniekcji, i obejmuje, bez ograniczania, dożylne,

domięśniowe, dotętnicze, dooponowe, dotorebkowe, dooczodołowe, dosercowe, śródskórne,

dootrzewnowe, przeztchawicze, podskórne, podnaskórkowe, dostawowe, podtorebkowe,

podpajęczynówkowe, do kregosłupa, nadtwardówkowe i domostkowe iniekcje i infuzje.

[0113] Alternatywnie, przeciwciało według wynalazku można podawać drogą nie-pozajelitową, taką jak

droga podawania miejscowa, naskórkowa lub przez błony śluzowe, przykładowo, donosowo, doustnie,

dopochwowo, doodbytniczo, podjęzykowo lub miejscowo.

[0114] Związki aktywne można przygotowywać z nośnikami, które będą chroniły związek przed szybkim

uwalnianiem, takimi jak formulacje do kontrolowanego uwalniania, włącznie z implantami, plastrami

przezskórnymi i mikrokapsułkowanymi systemami podawania. Można stosować biodegradowalne,

biokompatybilne polimery, takie jak etylenu z octanem winylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy,

kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Wiele sposobów wytwarzania takich formulacji zostało

opatentowanych lub są one ogólnie znane specjalistom. Patrz, np. Sustained and Controlled Release

Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, wyd., Marcel Dekker, Inc., Nowy York, 1978.

[0115] Kompozycje terapeutyczne można podawać za pomocą urządzeń medycznych, znanych w stanie

techniki. Na przykład, w korzystnym przykładzie wykonania, kompozycja terapeutyczna według

wynalazku może być podawana za pomocą bezigłowego urządzenia do iniekcji podskórnych, takiego jak

urządzenia ujawnione w patentach USA nr 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880;

4,790,824; lub 4,596,556. Przykłady dobrze znanych implantów i modułów, użytecznych według

niniejszego wynalazku, obejmują: patent US nr 4,487,603, ujawniający wszczepialną pompę do mikro-

infuzji, do podawania leku w kontrolowanym tempie; patent US nr 4,486,194, ujawniający urządzenie

terapeutyczne do podawania substancji medycznych przez skórę; patent USA nr 4,447,233, ujawniający

pompę do infuzji leków, do dostarczania leków w precyzyjnych dawkach infuzji; patent USA nr 4,447,224,

ujawniający wszczepialny aparat o zmiennym przepływie do infuzji do ciągłego dostarczania leku; patent

USA nr 4,439,196, ujawniający system osmotyczny do dostarczania leków, mający wielkokomorowe

przedziały; i patent USA nr 4,475,196, ujawniający osmotyczny system dostarczania leku. Znawcom

znane są różne inne podobne implanty, systemy dostarczania i moduły.

[0116] W niektórych przykładach wykonania, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku

można formułować tak, aby zapewnić ich prawidłową dystrybucję in vivo. Przykładowo, bariera krew-

mózg (BBB, ang. blood-brain barrier) wyklucza wiele wysoce hydrofilowych składników. Aby zapewnić

pokonanie BBB (jeśli wymagane) przez składniki terapeutyczne według wynalazku, można je formułować,

na przykład, w liposomach. Dla sposobów wytwarzania liposomów, patrz, np. patenty USA nr 4,522,811;

5,374,548; i 5,399,331. Liposomy mogą obejmować jedną lub więcej cząstek, selektywnie

transportowanych do specyficznych komórek lub organów, zwiększając tym samym ukierunkowane

dostarczanie leku (patrz, np. V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Przykładowe cząstki

kierujące obejmują kwas foliowy lub biotynę (patrz, np. patent nr US 5,416,016, dla Low et al.);

mannozydy (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); przeciwciała (P.G.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

31

Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother.

39:180); receptor białka surfaktantowego A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120

(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); patrz także K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS

Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Zastosowania i sposoby według wynalazku

[0117] Przeciwciała, kompozycje przeciwciał i sposoby według wynalazku mają liczne diagnostyczne i

terapeutyczne zastosowania in vitro i in vivo, włączając diagnostykę i leczenie zaburzeń zależnych od

PTK7. Na przykład, cząsteczki te można podawać do komórek w hodowlach, in vitro lub ex vivo, lub

osobnikom ludzkim, np. in vivo, aby leczyć, zapobiegać i diagnozować różnorodne zaburzenia.

Stosowany tu termin "osobnik" ma w zamierzeniu obejmować ludzi i zwierzęta inne niż ludzie. Zwierzęta

inne niż ludzie obejmują wszystkie kręgowce, np. ssaki i nie-ssaki, takie jak naczelne inne niż ludzie,

owce, psy, koty, krowy, konie, kurczaki, płazy i gady. Korzystne osobniki obejmują ludzkich pacjentów,

mających zaburzenia zależne od aktywności PTK7. Sposoby są szczególnie odpowiednie do leczenia

ludzkich pacjentów, z zaburzeniem związanym z anormalną ekspresją PTK7. Gdy przeciwciała przeciw

PTK7 podawane są razem z innym środkiem, oba z nich można podawać w dowolnej kolejności lub

równocześnie.

[0118] Wziąwszy pod uwagę swoiste wiązanie się przeciwciał według wynalazku z PTK7, przeciwciała

według wynalazku można stosować do specyficznego wykrywania ekspresji PTK7 na powierzchni

komórek i, co więcej, stosować do oczyszczania PTK7 przez oczyszczanie z wykorzystaniem

immunopowinowactwa.

[0119] Wynalazek ponadto dostarcza sposoby wykrywania obecności antygenu ludzkiej PTK7 w próbce

lub pomiary ilości antygenu ludzkiej PTK7, obejmujące kontaktowanie próbki i próbki kontrolnej z ludzkim

przeciwciałem monoklonalnym lub jego częścią wiążącą antygen, które specyficznie wiąże się z ludzką

PTK7, w warunkach pozwalających na formowanie kompleksu między przeciwciałem lub jego częścią, a

ludzką PTK7. Następnie wykrywane jest formowanie kompleksu, przy czym różnica w formowaniu

kompleksu między próbką w porównaniu do próbki kontrolnej jest wyznacznikiem obecności antygenu

ludzkiej PTK7 w próbce.

[0120] PTK7 wyrażana jest w liniach komórkowych pochodzących od raka okrężnicy, ale nie stwierdzono

jej ekspresji w dojrzałych, ludzkich tkankach jelita grubego (Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84).

Ekspresję PTK7 obserwowano także w niektórych liniach komórkowych czerniaka i biopsjach czerniaka

(Easty, et al. (1997) Int. J. Cancer 71:1061-5). Ponadto, stwierdzono wysoką nadekspresję PTK7 w

próbkach ostrej białaczki szpikowej (Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:1241-9).

Przeciwciało anty-PTK7 można stosować pojedynczo, w celu hamowania wzrostu guzów rakowych.

Alternatywnie, przeciwciało anty-PTK7 można stosować w połączeniu z innymi środkami

immunogennymi, standardowymi sposobami leczenia nowotworu lub innymi przeciwciałami, jak opisano

poniżej.

[0121] Korzystne nowotwory, których wzrost może być hamowany z zastosowaniem przeciwciał według

wynalazku obejmują nowotwory zasadniczo wrażliwe na immunoterapię. Nieograniczające przykłady

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

32

korzystnych nowotworów do leczenia obejmują raka okrężnicy (włączając raka jelita cienkiego), raka

płuca, raka piersi, raka trzustki, czerniaka (np. czerniaka złośliwego z przerzutami), ostrą białaczkę

szpikową, raka nerki, raka pęcherza moczowego, raka jajnika i raka prostaty. Przykłady innych raków,

które mogą być leczone z zastosowaniem sposobów według wynalazku obejmują raka nerek (np. raka

nerkowokomórkowego), glejaka, guzy mózgu, przewlekłe lub ostre białaczki w tym ostrą białaczkę

limfocytową (ALL, ang. acute lymphocytic leukemia), białaczkę T-komórkową dorosłych (T-ALL),

przewlekłą białaczkę szpikową, ostrą białaczkę limfoblastyczną, przewlekłą białaczkę limfocytową,

chłoniaki (np. chłoniak Hodgkina (ziarniczy) i nieziarniczy, chłoniak limfocytarny, pierwotny chłoniak

centralnego układu nerwowego, chłoniak z komórek-T, chłoniak Burkitta, chłoniaki anaplastyczne z

dużych komórek (ALCL, ang. anaplastic large-cell lymphoma), skórne chłoniaki T-komórkowe, chłoniaki z

małych komórek z wpuklonym jądrem komórkowym, chłoniaki z obwodowych komórek T, chłoniaki

Lennerta (limfoepitelialne), chłoniaki immunoblastyczne, chłoniaki/białaczki T-komórkowe (ATLL),

chłoniaki grudkowe centroblastyczne-centrocytarne (cb/cc), chłoniaki rozlane z dużych komórek B, typ

angioimmunoblastycznych chłoniaków T-komórkowych (typu AILD, ang. angioimmunoblastic

lymphadenopathy) oraz chłoniaki rozwijające się w jamach ciała związane z HIV), raki zarodkowe,

niezróżnicowane raki nosa i gardła (np. guz Schminckego), chorobę Castlemana, mięsaka Kaposiego,

szpiczaka mnogiego, makroglobulinemię Waldenströma i inne chłoniaki B-komórkowe, raki jamy nosowo-

gardłowej, raka kości, raka skóry, raka głowy i szyi, złośliwego czerniaka skórnego lub śródocznego, raka

macicy, raka odbytnicy, raka odbytu, raka żołądka, raka jąder, raka macicy, raka jajowodów, raka

endometrium, raka szyjki macicy, raka pochwy, raka sromu, raka przełyku, raka jelita cienkiego, raka

układu hormonalnego, raka tarczycy, raka przytarczyc, raka nadnercza, mięsaka tkanek miękkich, raka

cewki moczowej, raka prącia, guzy lite wieku dziecięcego, raka pęcherza moczowego, raka nerki lub

moczowodu, raka miedniczki nerwowej, nowotwory ośrodkowego układu nerwowego (OUN),

angiogenezę nowotworową, guzy rdzenia kręgowego, glejaka pnia mózgu, gruczolaka przysadki, raka

naskórkowego, raka płaskonabłonkowego, nowotwory indukowane środowiskowo włączając indukowane

przez azbest, np. międzybłoniaka oraz kombinacje wymienionych nowotworów.

[0122] Ponadto, biorąc pod uwagę ekspresję PTK7 na różnych komórkach guza, przeciwciała ludzkie,

kompozycje przeciwciał i sposoby według niniejszego wynalazku można stosować do leczenia osobnika z

chorobą rakotwórczą, np. chorobą, charakteryzującą się obecnością komórek guza, wyrażających PTK7,

włączając, na przykład, raka okrężnicy (włączając raka jelita cienkiego), czerniaka (np. czerniaka

złośliwego z przerzutami), ostrą białaczkę szpikową, raka płuca, raka piersi, raka pęcherza moczowego,

raka trzustki, raka jajnika i raka prostaty. Przykłady innych osobników z chorobą rakotwórczą obejmują

osobniki mające raka nerek (np. raka nerkowokomórkowego), glejaka, guzy mózgu, przewlekłe lub ostre

białaczki w tym ostrą białaczkę limfocytową (ALL, ang. acute lymphocytic leukemia), białaczkę T-

komórkową dorosłych (T-ALL), przewlekłą białaczkę szpikową, ostrą białaczkę limfoblastyczną,

przewlekłą białaczkę limfocytową, chłoniaki (np. chłoniak Hodgkina (ziarniczy) i nieziarniczy, chłoniak

limfocytarny, pierwotny chłoniak centralnego układu nerwowego, chłoniak z komórek-T, chłoniak Burkitta,

chłoniaki anaplastyczne z dużych komórek (ALCL, ang. anaplastic large-cell lymphoma), skórne chłoniaki

T-komórkowe, chłoniaki z małych komórek z wpuklonym jądrem komórkowym, chłoniaki z obwodowych

komórek T, chłoniaki Lennerta (limfoepitelialne), chłoniaki immunoblastyczne, chłoniaki/białaczki T-

komórkowe (ATLL), chłoniaki grudkowe centroblastyczne-centrocytarne (cb/cc), chłoniaki rozlane z

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

33

dużych komórek B, typ angioimmunoblastycznych chłoniaków T-komórkowych (typu AILD, ang.

angioimmunoblastic lymphadenopathy) oraz chłoniaki rozwijające się w jamach ciała związane z HIV),

raki zarodkowe, niezróżnicowane raki nosa i gardła (np. guz Schminckego), chorobę Castlemana,

mięsaka Kaposiego, szpiczaka mnogiego, makroglobulinemię Waldenströma i inne chłoniaki B-

komórkowe, raki jamy nosowo-gardłowej, raka kości, raka skóry, raka głowy i szyi, złośliwego czerniaka

skórnego lub śródocznego, raka macicy, raka odbytnicy, raka odbytu, raka żołądka, raka jąder, raka

macicy, raka jajowodów, raka endometrium, raka szyjki macicy, raka pochwy, raka sromu, raka przełyku,

raka jelita cienkiego, raka układu hormonalnego, raka tarczycy, raka przytarczyc, raka nadnercza,

mięsaka tkanek miękkich, raka cewki moczowej, raka prącia, guzy lite wieku dziecięcego, raka pęcherza

moczowego, raka nerki lub moczowodu, raka miedniczki nerwowej, nowotwory ośrodkowego układu

nerwowego (OUN), angiogenezę nowotworową, guzy rdzenia kręgowego, glejaka pnia mózgu,

gruczolaka przysadki, raka naskórkowego, raka płaskonabłonkowego, nowotwory indukowane

środowiskowo włączając indukowane przez azbest, np. międzybłoniaka oraz kombinacje wymienionych

nowotworów.

[0123] Odpowiednio, w jednym z przykładów wykonania, wynalazek dostarcza przeciwciała lub części

wiążącej antygen według wynalazku do zastosowania w sposobie hamowania wzrostu komórek guza u

osobnika, a wspomniany sposób obejmuje podawanie osobnikowi terapeutycznie skutecznej ilości

wspomnianego przeciwciała lub części wiążącej antygen.

[0124] Przeciwciała (np. ludzkie przeciwciała monoklonalne i kompozycje) według wynalazku można

stosować do wykrywania poziomów PTK7 lub poziomów komórek, zawierających PTK7 na powierzchni

błony, które to poziomy można następnie powiązać z pewnymi objawami choroby. Alternatywnie, można

stosować przeciwciała do hamowania lub blokowania funkcji PTK7, które z kolei można powiązać z

zapobieganiem lub łagodzeniem pewnych objawów choroby, wskazując w ten sposób, że PTK7

pośredniczy w chorobie. Można to osiągnąć, kontaktując próbkę eksperymentalną i próbkę kontrolną z

przeciwciałem anty-PTK7 w warunkach pozwalających na formowanie kompleksu między przeciwciałem,

a PTK7. Dowolne kompleksy, uformowane między przeciwciałem, a PTK7 są wykrywane i porównywane

w próbce eksperymentalnej i kontroli.

[0125] Przeciwciała (np. ludzkie przeciwciała i kompozycje) według wynalazku można początkowo

testować pod kątem aktywności wiązania, powiązanej z terapeutycznym lub diagnostycznym

stosowaniem in vitro. Na przykład, kompozycje według wynalazku można testować, stosując badania

cytometrii przepływowej, opisane w Przykładach poniżej.

[0126] Przeciwciała (np. ludzkie przeciwciała, immunokoniugaty i kompozycje) według wynalazku, mogą

mieć dodatkowe zastosowanie w terapii i diagnostyce chorób powiązanych z PTK7. Na przykład, ludzkie

przeciwciała monoklonalne, i immunokoniugaty można stosować, aby wywołać in vivo lub in vitro jedną

lub więcej z następujących, biologicznych aktywności: hamowanie wzrostu i/lub zabijanie komórki

wyrażającej PTK7; pośredniczenie w fagocytozie lub ADCC (cytotoksyczności komórkowej zależnej od

przeciwciał, ang. Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity) komórki wyrażającej PTK7 w obecności ludzkich

komórek efektorowych; lub blokowanie wiązania liganda PTK7 do PTK7.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

34

[0127] Przeciwciała (np. ludzkie przeciwciała i kompozycje) mogą być stosowane in vivo do leczenia,

zapobiegania lub diagnozowania różnorodnych chorób powiązanych z PTK7. Przykłady chorób

powiązanych z PTK7 obejmują, między innymi, raka okrężnicy (włączając raka jelita cienkiego), czerniaka

(np. czerniaka złośliwego z przerzutami), ostrą białaczkę szpikową, raka płuca, raka piersi, raka pęcherza

moczowego, raka trzustki, raka jajnika i raka prostaty.

[0128] Odpowiednie drogi podawania in vivo i in vitro kompozycji przeciwciał (np. ludzkich przeciwciał

monoklonalnych i immunokoniugatów) według wynalazku są dobrze znane w stanie techniki i mogą

zostać wybrane przez specjalistów. Przykładowo, kompozycje przeciwciał mogą być podawane przez

iniekcję (np. dożylną lub podskórną). Odpowiednie dawkowania stosowanych cząsteczek będą zależały

od wieku i masy osobnika oraz stężenia i/lub formulacji kompozycji przeciwciał.

[0129] Jak opisano wcześniej, ludzkie przeciwciała anty-PTK7 według wynalazku można podawać razem

z jednym lub więcej środków terapeutycznych, np. środkiem cytotoksycznym, środkiem radiotoksycznym

lub środkiem immunosupresyjnym. Przeciwciało można połączyć z środkiem (w immunokompleks) lub

można podawać oddzielnie od środka. W tym ostatnim przypadku (osobne podawanie) przeciwciało

może być podawane przed, po lub równocześnie z środkiem lub może być podawane razem z innymi,

znanymi terapiami, np. terapią anty-nowotworową, np. promieniowaniem. Takie środki terapeutyczne

obejmują, między innymi, środki przeciwnowotworowe, takie jak doksorubicyna (adriamycyna), cispla-

tyna, siarczan bleomycyny, karmustyna, chlorambucyl i hydroksymocznik cyklofosfamidu, które same z

siebie są efektywne tylko na poziomach toksycznych lub podtoksycznych dla pacjenta. Cisplatynę podaje

się dożylnie 100 mg/ dawkadawkach, raz na cztery tygodnie, a adriamycynę podaje się dożylnie w

dawkach 60-75 mg/ml, raz na 21 dni. Łączne podawanie ludzkich przeciwciał anty-PTK7, lub ich

fragmentów wiążących antygen, według niniejszego wynalazku, z środkami chemioterapeutycznymi,

zapewnia dwa środki antynowotworowe, działające według różnych mechanizmów, dla ludzkich komórek

guza skutkujące efektem cytotoksycznym Takie podawanie łączne może rozwiązać problemy,

spowodowane rozwijaniem oporności na leki lub zmianą antygenności komórek guza, co czyniłoby je

niereagującymi z przeciwciałem.

[0130] W jednym z przykładów wykonania, immunokoniugaty według wynalazku można stosować do

kierowania składników (np. środków terapeutycznych, znaczników, cytotoksyn, radiotoksyn

immunosupresantów itd.) do komórek, mających receptory powierzchniowe dla PTK7, poprzez

przyłączanie takich składników do przeciwciała. Przykładowo, przeciwciało anty-PTK7 można przyłączyć

do dowolnego ze składników toksycznych, opisanych w patentach USA nr 6,281,354 i 6,548,530,

publikacjach patentowych nr US 20030050331, 20030064984, 20030073852 i 20040087497 lub

opublikowanych w WO 03/022806. A zatem, wynalazek zapewnia także sposoby lokalizowania ex vivo

lub in vivo komórek, wyrażających PTK7 (np. z wykrywalnym znacznikiem, takim jak radioizotop, składnik

fluorescencyjny, enzym lub kofaktor enzymu). Alternatywnie, immunokoniugaty można stosować do

zabijania komórek, mających receptory powierzchniowe dla PTK7, poprzez kierowanie cytotoksyn lub

radiotoksyn do PTK7.

[0131] Komórki efektorowe, swoiste względem celu; np. komórki efektorowe, połączone z kompozycjami

(np. ludzkimi przeciwciałami, wielospecyficznymi i dwuspecyficznymi cząsteczkami) według wynalazku,

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

35

również można stosować jako środki terapeutyczne. Komórkami efektorowymi do nakierowywania mogą

być ludzkie leukocyty, takie jak makrofagi, neutrofile lub monocyty. Inne komórki obejmują eozynofile,

komórki NK i inne komórki, mające receptory dla IgG lub IgA. W razie potrzeby, komórki efektorowe

można uzyskać od leczonego osobnika. Komórki efektorowe, swoiste względem celu, można podawać

jako zawiesinę komórek w roztworze dopuszczalnym fizjologicznie. Ilość podawanych komórek może być

rzędu 108-10

9, ale będzie różnić się w zależności od celu terapeutycznego. Zasadniczo, ilość będzie

wystarczająca do umiejscowienia na docelowej komórce, np. na komórce guza, wyrażającej PTK7 i do

uskutecznienia zabijania komórki przez, np. fagozytozę. Drogi podawania mogą również być różne.

[0132] Terapię z komórkami efektorowymi, swoistymi wobec celu, można przeprowadzać w połączeniu z

innymi technikami usuwania docelowych komórek. Na przykład, terapia anty-nowotworowa, stosująca

kompozycje (np. ludzkich przeciwciał) według wynalazku i/lub komórki efektorowe, wyposażone w te

kompozycje, może być stosowana w połączeniu z chemioterapią. Dodatkowo, można stosować

kombinowaną immunoterapię, aby skierować dwie odrębne populacje cytotoksycznych efektorów w celu

eliminacji komórki guza. Przykładowo, przeciwciała anty-PTK7, połączone z anty-Fc-gamma RI lub anty-

CD3 można stosować w połączeniu z środkiem swoiście wiążącym receptor IgG lub IgA.

[0133] Kompozycje (np. ludzkich przeciwciał i immunokoniugatów) według wynalazku, mające miejsca

wiązania dopełniacza, takie jak części z IgG1, -2 lub -3 lub IgM, wiążące dopełniacz, mogą być również

stosowane w obecności dopełniacza. W jednym z przykładów wykonania, leczenie ex vivo populacji

komórek, zawierających komórki docelowe, środkiem wiążącym według wynalazku i odpowiednimi

komórkami efektorowymi, może być uzupełniane dodatkiem dopełniacza lub surowicy, zawierającej

dopełniacz. Fagocytoza komórek docelowych, pokrytych środkiem wiążącym według wynalazku, może

być usprawniona przez wiązanie białek dopełniacza. W innym przykładzie wykonania, komórki docelowe,

pokryte kompozycjami (np. ludzkimi przeciwciałami) według wynalazku mogą być również lizowane przez

dopełniacz. W jeszcze innym przykładzie wykonania, kompozycje według wynalazku nie aktywują

dopełniacza.

[0134] Kompozycje (np. ludzkich przeciwciał i immunokoniugatów) według wynalazku, można również

podawać razem z dopełniaczem. Odpowiednio, w zakresie wynalazku są kompozycje, obejmujące

ludzkie przeciwciała i surowicę lub dopełniacz. Kompozycje te są korzystne w związku z tym, że

dopełniacz zlokalizowany jest w bliskim sąsiedztwie ludzkich przeciwciał. Alternatywnie, ludzkie

przeciwciała według wynalazku i dopełniacz lub surowicę można podawać oddzielnie.

[0135] Odpowiednio, pacjentom, leczonym kompozycjami przeciwciał według wynalazku, można

dodatkowo podawać (wcześniej, równocześnie lub po podaniu ludzkiego przeciwciała według wynalazku)

inny środek terapeutyczny, taki jak środek cytotoksyczny lub radiotoksyczny, wzmacniający lub

zwiększający terapeutyczny efekt ludzkich przeciwciał.

[0136] W innych przykładach wykonania, osobnik może być dodatkowo leczony środkiem modulującym,

np. wzmacniającym lub hamującym ekspresję lub aktywność Fcγ lub receptorów Fcγ przez, na przykład,

leczenie osobnika cytokiną. Korzystne cytokiny do podawania podczas leczenia wielospecyficzną

cząsteczką obejmują czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

36

tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), interferon-γ (IFN-y) i czynnik martwicy guza

(TNF).

[0137] Kompozycje (np. ludzkie przeciwciała) według wynalazku można również stosować do celowania

w komórki wyrażające FcγR lub PTK7, przykładowo, do znakowania takich komórek. Do takiego

zastosowania, środek wiążący można połączyć z wykrywalną cząsteczką. A zatem, ujawnienie zapewnia

sposoby lokalizowania ex vivo lub in vitro komórek, wyrażających receptory Fc, takie jak FcγR lub PTK7.

Wykrywalnym znacznikiem może być, np. radioizotop, składnik fluorescencyjny, enzym lub kofaktor

enzymu.

[0138] W zakresie niniejszego wynalazku znajdują się również zestawy, obejmujące kompozycje

przeciwciał według wynalazku (np. ludzkie przeciwciała lub immunokoniugaty) oraz instrukcje do

stosowania. Zestaw może dodatkowo zawierać jeden lub więcej dodatkowych reagentów, takich jak

reagent immunosupresyjny, środek cytotoksyczny lub środek radiotoksyczny lub jedno lub więcej

dodatkowych ludzkich przeciwciał według wynalazku (np. ludzkie przeciwciało mające aktywność

komplementarną, wiążące się z epitopem na antygenie PTK7, odmiennym od pierwszego ludzkiego

przeciwciała). Zestawy zawierają zazwyczaj etykietę, wskazującą na zamierzone zastosowanie

zawartości zestawu. Termin etykieta obejmuje jakikolwiek pisany lub nagrany materiał, dostarczany na

lub z zestawem lub w inny sposób towarzyszący zestawowi.

[0139] Niniejszy wynalazek jest dalej zilustrowany następującymi przykładami, które nie powinny być

interpretowane jako dalej ograniczające.

Przykłady

Przykład 1: Wytworzenie ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko PTK7

Antygen

[0140] Protokoły immunizacji jako antygen stosowały zarówno (i) rekombinowane białko fuzyjne

obejmujące zewnątrzkomórkową część PTK7 z tagiem zarówno myc jak i his oraz (ii) powiązaną z błoną

PTK7 pełnej długości. Oba antygeny wytworzono metodami transfekcji rekombinantów w linii komórkowej

CHO.

Transgeniczne myszy HuMab i KM miceTM

[0141] W pełni ludzkie przeciwciała przeciw PTK7 przygotowano, stosując szczepy HCo7 i HCo12,

transgenicznych myszy HuMab i szczep KM myszy transgenicznych transchromosomalnych, z których

każdy wyraża geny ludzkiego przeciwciała. W każdym z tych mysich szczepów endogenny gen łańcucha

lekkiego kappa został homozygotycznie przerwany, jak opisano w Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-

820, a endogenny mysi gen łańcucha ciężkiego został homozygotycznie przerwany, jak opisano w Przy-

kładzie 1 publikacji PCT WO 01/09187. Każdy z tych mysich szczepów zawiera ludzki transgen łańcucha

lekkiego kappa, KCo5, jak opisano w Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Szczep

HCo7 zawiera transgen HCo7 ludzkiego łańcucha ciężkiego, jak opisano w patentach USA nr 5,770,429;

5,545,806; 5,625,825; i 5,545,807. Szczep HCo12 zawiera transgen HCo12 ludzkiego łańcucha

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

37

ciężkiego, jak opisano w Przykładzie 2 WO 01/09187 lub przykładzie 2 WO 01/14424. Szczepy

HCo7+HCo12 zawierają oba transgeny łańcucha ciężkiego, HCo7 i HCo12. Szczep KM zawiera

transchromosom SC20, jak opisano w publikacji PCT WO 02/43478.

Immunizacje HuMab i KM:

[0142] Aby wytworzyć w pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw PTK7, myszy HuMab i KM

miceTM

immunizowano oczyszczonym rekombinowanym białkiem fuzyjnym PTK7 oraz komórkami CHO

transfekowanymi PTK7 jako antygenem. Ogólne schematy immunizacji dla myszy HuMab opisano w

Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:

845-851 i publikacji PCT WO 98/24884. Myszy były w wieku 6-16 tygodni przy pierwszym podaniu

antygenu. Antygen oczyszczonego rekombinowanego preparatu (5-50 µg) białka fuzyjnego PTK7 i 5 –

106 komórek zastosowano do immunizacji myszy HuMab i KM mice

TM dootrzewnowo, podskórnie (Sc,

ang. subcutaneously) lub przez wstrzykiwanie do opuszki łapy.

[0143] Transgeniczne myszy dwukrotnie immunizowano IP (dootrzewnowo) antygenem w kompletnym

adiuwancie Freunda lub adiuwancie Ribi. a następnie 3-21 dni IP (dootrzewnowo) (do łącznie 11

immunizacji) antygenem w niekompletnym adiuwancie Freunda lub adiuwancie Ribi. Odpowiedź

immunologiczną monitorowano skrwawieniami pozagałkowymi. Osocze sprawdzano testem ELISA (jak

opisano poniżej), a do fuzji zastosowano myszy z wystarczającymi mianami ludzkiej immunoglobuliny

anty-PTK7. Myszy stymulowano dożylnie antygenem 3 dni przed uśmierceniem i usunięciem śledziony.

Zazwyczaj wykonywano 10-35 fuzji dla każdego antygenu. Dla każdego antygenu immunizowano kilka

tuzinów myszy.

Selekcja myszy HuMab lub KM MiceTM

wytwarzających przeciwciała anty-PTK7:

[0144] W celu wyselekcjonowania myszy HuMab lub KM miceTM

wytwarzających przeciwciała wiążące

się z PTK7, surowice od immunizowanych myszy sprawdzano testem ELISA jak opisano w Fishwild, D. et

al. (1996). W skrócie, płytki mikrotitracyjne opłaszczono oczyszczonym rekombinowanym białkiem

fuzyjnym PTK7 z transfekowanych komórek CHO przy 1-2 µg/ml w PBS, 100 µl/studzienkę, inkubowano

w 4 °C przez noc, następnie blokowano 200 µl/studzienkę 5% płodowej surowicy bydlęcej w PBS/Tween

(0,05%). Do każdej studzienki dodawano rozcieńczenia surowicy z myszy immunizowanych PTK7, a

następnie inkubowano przez 1-2 godzin w temperaturze otoczenia. Płytki płukano PBS/Tween, a potem

inkubowano z kozim przeciwciałem poliklonalnym anty-ludzkie IgG sprzężonym z peroksydazą

chrzanową (HRP, ang. horseradish peroxidase) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po płukaniu,

płytki wywoływano substratem ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) i analizowano spektrofotometrem przy

OD 415-495. Do infuzji stosowano myszy, które osiągnęły najwyższe miana przeciwciał anty-PTK7.

Infuzje wykonywano tak jak opisano poniżej, a supernatanty hybrydom sprawdzano pod kątem

aktywności anty-PTK7 testem ELISA.

Wytworzenie hybrydom wytwarzających ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw PTK7:

[0145] Mysie splenocyty, wyizolowane z myszy HuMab, poddawano fuzji z użyciem PEG z linią

komórkową mysiego szpiczaka, w oparciu o standardowe procedury. Powstające hybrydomy

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

38

przeszukiwano następnie pod kątem wytwarzania przeciwciał swoistych dla antygenu. Zawiesiny

pojedynczych komórek splenocytów z immunizowanych myszy poddawano fuzji z jedną czwartą liczby

komórek niewydzielniczego szpiczaka SP2/0 (ATCC, CRL 1581) z 50% PEG (Sigma). Komórki

wysiewano przy około 1x105/studzienkę na płaskodenną płytkę mikrotitracyjną, a następnie inkubowano

przez około dwa tygodnie w pożywce selekcyjnej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 10%

pożywki kondycjonowanej P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), 3-5% origen (IGEN) w DMEM (Mediatech, CRL

10013, z wysoką zawartością glukozy, L-glutaminą i pirogronianem sodu) z dodatkiem 5 MM HEPES,

0,055 mM 2-merkaptoetanolu, 50 mg/ml gentamycyny i 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Po 1-2 tygodniach,

komórki hodowano w pożywce, w której HAT zastąpiono HT. Poszczególne studzienki sprawdzono

następnie testem ELISA (opisanym powyżej) pod kątem ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgG anty-

PTK7. Kiedy wystąpił znaczny wzrost hybrydomy, pożywkę monitorowano, zazwyczaj po 10-14 dniach.

Hybrydomy wydzielające przeciwciało były przesiewane, ponownie sprawdzane, i jeżeli nadal dawały

wynik pozytywny dla ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgG anty-PTK7, były subklonowane co

najmniej dwa razy przez ograniczające rozcieńczenia. Stabilne subklony były wówczas hodowane in vitro

do wytworzenia małych ilości przeciwciał w pożywce hodowli tkankowej w celu dalszej charakteryzacji.

[0146] Do dalszej analizy wyselekcjonowano klony hybrydom 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8.

Przykład 2: Charakterystyka strukturalna ludzkich przeciwciła monoklonalnych 3G8, 3G8a, 4D5,

12C6, 12C6a i 7C8

[0147] Sekwencje cDNA kodujące regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich z przeciwciał

monoklonalnych 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 uzyskano z hybrydom, odpowiednio, 3G8, 3G8a,

4D5, 12C6, 12C6a i 7C8, z zastosowaniem standardowych technik PCR i sekwencjonowano z

zastosowaniem standardowych technik sekwencjonowania DNA.

[0148] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 3G8 są

przedstawione na Figurze 1A i odpowiednio w SEKW NR ID: 41 i 1.

[0149] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 3G8 są

przedstawione na Figurze 1B i odpowiednio w SEKW NR ID: 45 i 5.

[0150] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 3G8 ze znanymi ludzkimi

germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 3G8 zawiera

segment VH z ludzkiego germinalnego VH 3-30.3, nieustalony segment D i segment JH z ludzkiego

germinalnego JH 4b. Dopasowanie sekwencji VH 3G8 do sekwencji germinalnego VH 3-30.3

przedstawiono na Figurze 5. Dalsza analiza sekwencji VH 3G8 z zastosowaniem systemu Kabata do

określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha

ciężkiego, jak przedstawiono na Figurach 1A i 5 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 11, 15 i 19.

[0151] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 3G8 ze znanymi ludzkimi germinalnymi

sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 3G8 zawiera segment VL z

ludzkiego germinalnego VK L15 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 1. Dopasowanie sekwencji

VL 3G8 do sekwencji germinalnego VK L15 przedstawiono na Figurze 9. Dalsza analiza sekwencji VL

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

39

3G8 z zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia

regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na Figurach 1B i 9 oraz

odpowiednio w SEKW NR ID: 23, 29 i 35.

[0152] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 3G8a są


[0153] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 3G8a są

przedstawione na Figurze 1C i odpowiednio w SEKW NR ID: 46 i 6.

[0154] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 3G8a ze znanym i ludzkimi

germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 3G8a

zawiera segment VH z ludzkiego germinalnego VH 3-30.3, nieustalony segment D i segment JH z

ludzkiego germinalnego JH 4b. Dopasowanie sekwencji VH 3G8a do sekwencji germinalnego VH 3-30.3

przedstawiono na Figurze 5. Dalsza analiza sekwencji VH 3G8a z zastosowaniem systemu Kabata do



[0155] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 3G8a ze znanymi ludzkimi

germinalnymi sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 3G8a zawiera

segment VL z ludzkiego germinalnego VK L15 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 3.

Dopasowanie sekwencji VL 3G8a do sekwencji germinalnego VK L15 przedstawiono na Figurze 9.

Dalsza analiza sekwencji VL 3G8a z zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR

doprowadziła do wytyczenia regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na

Figurach 1C i 9 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 24, 30 i 36.

[0156] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 4D5 są


[0157] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 4D5 są


[0158] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 4D5 ze znanymi ludzkimi

germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 4D5 zawiera

segment VH z ludzkiego germinalnego VH 3-30.3, nieustalony segment D i segment JH z ludzkiego

germinalnego JH 4b. Dopasowanie sekwencji VH 4D5 do sekwencji germinalnego VH 3-30.3

przedstawiono na Figurze 6. Dalsza analiza sekwencji VH 4D5 z zastosowaniem systemu Kabata do



[0159] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 4D5 ze znanymi ludzkimi germinalnymi

sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 4D5 zawiera segment VL z

ludzkiego germinalnego VK A10 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 5. Dopasowanie sekwencji

VL 4D5 do sekwencji germinalnego VK A10 przedstawiono na Figurze 10. Dalsza analiza sekwencji VL

4D5 z zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

40

regionów CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na Figurach 2B i 10 oraz

odpowiednio w SEKW NR ID: 25, 31 i 37.

[0160] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 12C6 są


[0161] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 12C6 są


[0162] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 12C6 ze znanymi ludzkimi

germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 12C6

zawiera segment VH z ludzkiego germinalnego VH DP44, nieustalony segment D i segment JH z

ludzkiego germinalnego JH 4b. Dopasowanie sekwencji VH 12C6 do sekwencji germinalnego VH DP44

przedstawiono na Figurze 7. Dalsza analiza sekwencji VH 12C6 z zastosowaniem systemu Kabata do



[0163] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 12C6 ze znanymi ludzkimi

germinalnymi sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 12C6 zawiera

segment VL z ludzkiego germinalnego VK A27 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 2.

Dopasowanie sekwencji VL 12C6 do sekwencji germinalnego VK A27 przedstawiono na Figurze 11.

Dalsza analiza sekwencji VL 12C6 z zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR


Figurach 3B i 11 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 26, 32 i 38.

[0164] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 12C6a są


[0165] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 12C6a są

przedstawione na Figurze 3C i odpowiednio w SEKW NR ID: 49 i 9.

[0166] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 12C6a ze znanymi ludzkimi

germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 12C6a

zawiera segment VH z ludzkiego germinalnego VH DP44, nieustalony segment D i segment JH z

ludzkiego germinalnego JH 4b. Dopasowanie sekwencji VH 12C6a do sekwencji germinalnego VH DP44

przedstawiono na Figurze 7. Dalsza analiza sekwencji VH 12C6a z zastosowaniem systemu Kabata do



[0167] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 12C6a ze znanymi ludzkimi

germinalnymi sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 12C6a zawiera

segment VL z ludzkiego germinalnego VK L15 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 2.

Dopasowanie sekwencji VL 12C6a do sekwencji germinalnego VK L15 przedstawiono na Figurze 12.

Dalsza analiza sekwencji VL 12C6a z zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

41


Figurach 3C i 12 oraz odpowiednio w SEKW NR ID: 27, 33 i 39.

[0168] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z 7C8 są


[0169] Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego z 7C8 są


[0170] Porównanie sekwencji łańcucha ciężkiego immunoglobuliny 7C8 ze znanymi ludzkimi

germinalnymi sekwencjami łańcuchów ciężkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch ciężki 7C8 zawiera

segment VH z ludzkiego germinalnego VH 3-33, segment D z ludzkiego zarodkowego 3-10 i segment JH

z ludzkiego germinalnego JH 6b. Dopasowanie sekwencji VH 7C8 do sekwencji germinalnego VH 3-33

przedstawiono na Figurze 8. Dalsza analiza sekwencji VH 7C8 z zastosowaniem systemu Kabata do



[0171] Porównanie sekwencji łańcucha lekkiego immunoglobuliny 7C8 ze znanymi ludzkimi germinalnym i

sekwencjami łańcuchów lekkich immunoglobulin wykazało, że łańcuch lekki 7C8 zawiera segment VL z

ludzkiego germinalnego VK L6 i segment JK z ludzkiego germinalnego JK 3. Dopasowanie sekwencji VL

7C8 do sekwencji germinalnego VK L6 przedstawiono na Figurze 13. Dalsza analiza sekwencji VL 7C8 z

zastosowaniem systemu Kabata do określania regionów CDR doprowadziła do wytyczenia regionów

CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na Figurach 4B i 13 oraz odpowiednio w

SEKW NR ID: 28, 34 i 40.

Przykład 3: Mutacja mAb 12C6 i zastosowanie alternatywnej linii zarodkowej (germinalnej)

[0172] Jak opisano w Przykładzie 2 powyżej, przeciwciała monoklonalne 12C6 i 12C6a zawierają region

zmienny łańcucha ciężkiego pochodzący od ludzkiej sekwencji germinalnej DP-44 obecnej w transgenie

HCo7 szczepu myszy HuMab Mouse®. Ponieważ DP-44 nie jest sekwencją germinalną stosowaną w

repertuarze natywnych ludzkich immunoglobulin, korzystne może być zmutowanie sekwencji VH z 12C6 i

12C6a w celu obniżenia potencjalnej immunogenności. Korzystnie, jedna lub więcej reszt zrębowych z

sekwencji VH 12C6 i 12C6a jest mutowanych do reszt obecnych w sekwencji zrębowej germinalnej

sekwencji VH powiązanej strukturalnie, stosowanej w repertuarze natywnych ludzkich immunoglobulin.

Na przykład, Figura 7 przedstawia dopasowanie sekwencji VH z 12C6 i 12C6a do sekwencji germinalnej

DP44, jak również do dwóch ludzkich sekwencji germinalnych powiązanych strukturalnie, VH 3-23 i VH 3-

7. Z uwagi na powiązanie tych sekwencji, można przewidzieć, że można wyselekcjonować ludzkie

przeciwciało, które swoiście wiąże się z ludzką PTK7 i które zawiera region VH pochodzący od sekwencji

germinalnych VH 3-23 lub VH 3-7. Ponad to, można zmutować jedną lub więcej reszt w obrębie

sekwencji VH z 12C6 lub 12C6a, które różnią się od reszt w porównywalnych pozycjach w sekwencji VH

3-23 lub VH 3-7, na resztę (/y) obecne w VH 3-23 lub VH 3-7 lub na konserwatywne podstawienia tych

aminokwasów.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

42

Przykład 4: Charakterystyka swoistości wiązania i kinetyki wiązania ludzkich przeciwciał

monoklonalnych anty-PTK7

[0173] W tym przykładzie, zbadano powinowactwo wiązania i kinetykę wiązania przeciwciał anty-PTK7

analizą Biacore. Swoistość wiązania i współzawodnictwo krzyżowe badano cytometrią przepływową.

Swoistość wiązania w cytometrii przepływowej

[0174] Skonstruowano linie komórkowe HEK3 wyrażające rekombinowaną ludzką PTK7 na powierzchni

komórek i zastosowano je do ustalenia swoistości ludzkich przeciwciał monoklonalnych PTK7 z pomocą

cytometrii przypływowej. Komórki HEK3 transfekowano plazmidami ekspresyjnymi zawierającymi cDNA

pełnej długości kodujący transbłonowe postaci PTK7. Wiązanie ludzkiego przeciwciała monoklonalnego

anty-PTK7 7C8 oceniano inkubując transfekowane komórki z ludzkim przeciwciałem monoklonalnym

anty-PTK7 przy stężeniu 10 µg/ml. Komórki płukano i wykrywano wiązanie z pomocą Ab (przeciwciała)

anty-ludzkie IgG znakowanego FITC. Analizy cytometrii przepływowej wykonano z zastosowaniem

cytometru przepływowego FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Wyniki są przedstawione na

Figurze 14. Ludzkie przeciwciało monoklonalne anty-PTK7 7C8 wiązało się z komórkami HEK3

transfekowanymi PTK7 ale nie z komórkami HEK3 nie transfekowanymi ludzką PTK7. Dane te wykazują

swoistość ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 dla PTK7.

Swoistość wiązania w teście ELISA

[0175] Wiązanie przeciwciał anty-PTK7 oceniano także standardowym testem ELISA w celu zbadania

swoistości wiązania dla PTK7.

[0176] Sprawdzono wiązanie rekombinowanej domeny pozakomórkowej z PTK7 z ludzkimi

przeciwciałami monoklonalnymi anty-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 i 12C6a w różnych stężeniach. Wykonano

standardowe procedury ELISA. Ludzkie przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 dodano w początkowym

stężeniu 10 µg/ml i seryjnie rozcieńczano rozcieńczeniem 1:2. Jako przeciwciało drugorzędowe

zastosowano kozie przeciwciało poliklonalne anty-ludzkie IgG (swoiste dla łańcucha kappa), sprzężone z

peroksydazą chrzanową (HRP). Wyniki przedstawione są na Figurze 15. Każde z ludzkich przeciwciał

monoklonalnych anty-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 i 12C6a wiązało się z PTK7. Dane te wykazują swoistość

ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 dla PTK7.

Mapowanie epitopów przeciwciał anty-PTK7

[0177] W celu ustalenia grupowania epitopów dla HuMAb anty-PTK7 zastosowano cytometrię

przepływową. Komórki guza Wilmsa G-401 (ATCC nr dostępu CRL-1441) transfekowano plazmidami

ekspresyjnymi zawierającymi cDNA pełnej długości kodujący transbłonowe postaci PTK7. Wiązanie z

epitopem dla każdego z ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 oceniano inkubując 1x105

transfekowanych komórek z 10 µg/ml zimnego ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-PTK7,

płukano, a następnie dodawano 10 µg/ml ludzkiego przeciwciała monoklonalnego anty-PTK7

znakowanego fluorescencyjnie. Wiązanie wykrywano Ab anty-ludzkie IgG znakowanym FITC. Analizy

cytometrii przepływowej wykonano z zastosowaniem cytometru przepływowego FACScan (Becton

Dickinson, San Jose, CA). Przy analizie danych, przeciwciała anty-PTK7 podzielono na 3 grupy

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

43

epitopowe – grupa A, obejmująca 7D11, grupa B, obejmująca 3G8 i 3G8a oraz grupa C, obejmująca 7C8,

12C6 i 12C6a.

Przykład 5: Charakterystyka wiązania przeciwciała anty-PTK7 z PTK7 wyrażaną na powierzchni

komórek ludzkiego nowotworu

[0178] Linię komórkową nerczaka płodowego guza Wilmsa G-401 (ATCC nr dost. CRL-1441)

sprawdzono pod kątem wiązania HuMAb ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 12C6 i 7C8 w

różnych stężeniach. Wiązanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 oceniano inkubując 1x105

komórek z przeciwciałem przy początkowym stężeniu 30 µg/ml i seryjnych rozcieńczeniach przeciwciała

rozcieńczeniem 1:10. Komórki płukano i wykrywano wiązanie za pomocą Ab anty-ludzkie IgG

znakowanego PE. Analizy cytometrii przepływowej wykonano z zastosowaniem cytometru

przepływowego FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Wyniki przedstawiono na Figurze 16.

Przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 12C6 i 7C8 wiązały się z linią komórkową nerczaka płodowego

guza Wilmsa w sposób zależny od stężenia, na co wskazuje średnia fluorescencja (MFI, ang. mean

fluorescence intensity) barwienia. Wartości EC50 dla przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 12C6 i 7C8

wynosiły odpowiednio 4,035 nM i 3,428 nM.

[0179] Dane te wykazują, że HuMab anty-PTK7 wiążą się z liniami komórkowymi raka nerki.

Przykład 6: Wiązanie ludzkiego przeciwciała anty-PTK7 do nowotworowych linii komórkowych

[0180] Przeciwciała anty-PTK7 sprawdzono pod kątem wiązania do różnorodnych nowotworowych linii

komórkowych z pomocą cytometrii przepływowej.

[0181] Wiązanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-PTK7 3G8, 12C6a, 4D5 i 12C6 do panelu

nowotworowych linii komórkowych oceniano inkubując nowotworowe linie komórkowe z ludzkimi

przeciwciałami monoklonalnymi anty-PTK7 w stężeniu 10 µg/ml. Testowane nowotworowe linie

komórkowe to A-431 (ATCC nr dost. CRL-1555), komórki guza Wilmsa G-401 (ATCC nr dost. CRL-

1441), Saos-2 (ATCC nr dost. HTB-85), SKOV-3 (ATCC nr dost. HTB-77), PC3 (ATCC nr dost. CRL-

1435), DMS 114 (ATCC nr dost. CRL-2066), ACHN (ATCC nr dost. CRL-1611), LNCaP (ATCC nr dost.

CRL-1740), DU 145 (ATCC nr dost. HTB-81), LoVo (ATCC nr dost. CCL-229) i MIA PaCa-2 (ATCC nr

dost. CRL-1420). Jako kontrolę negatywną zastosowano izotypowe przeciwciało kontrolne. Komórki

płukano i wykrywano wiązanie z pomocą Ab anty-ludzkie IgG znakowanego FITC. Analizy cytometrii

przepływowej wykonano z zastosowaniem cytometru przepływowego FACScan (Becton Dickinson, San

Jose, CA). Wyniki przedstawiono na Figurze 17. Przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 3G8, 12C6a, 4D5

i 12C6 wiązały się do nowotworowych linii komórkowych A-431, komórki guza Wilmsa G-401, Saos-2,

SKOV-3, PC3, DMS 114, ACHN, LNCaP, DU 145, LoVo i MIA Paca-2, na co wskazuje średnia

fluorescencja (MFI, ang. mean fluorescence intensity) barwienia. Dane te wykazują że HuMab anty-PTK7

wiążą się z zakresem komórek nowotworowych wyrażających PTK7 na powierzchni komórek.

Przykład 7: Wiązanie anty-PTK7 do ludzkich komórek T, B i dendrytycznych

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

44

[0182] Przeciwciała anty-PTK7 sprawdzono pod kątem wiązania do komórek-T CD4+, CD8+, komórek-B

CD19+ i ludzkich dendrytycznych komórek szpikowych krwi, wyrażających PTK7 na powierzchni

komórek, z pomocą cytometrii przepływowej.

[0183] Ludzkie komórki T aktywowano przeciwciałem anty-CD3 w celu zaindukowania ekspresji PTK7 na

komórkach T przed wiązaniem z ludzkim przeciwciałem monoklonalnym anty-PTK7. Wiązanie ludzkiego

przeciwciała monoklonalnego anty-PTK7 7c8 oceniano inkubując komórki z ludzkimi przeciwciałami

monoklonalnymi anty-PTK7 w stężeniu 10 µg/ml. W niektórych doświadczeniach zastosowano znane

przeciwciało wiążące się ze swoistym markerem komórek T i B, jako kontrolę pozytywną. Komórki

płukano i wykrywano wiązanie z pomocą Ab anty-ludzkie IgG znakowanego FITC. Analizy cytometrii

przepływowej wykonano z zastosowaniem cytometru przepływowego FACScan (Becton Dickinson, San

Jose, CA). Wyniki przedstawiono na Figurach 18 (aktywowane komórki T i komórki B) i 19 (komórki

dendrytyczne). Przeciwciało monoklonalne anty-PTK7 7C8 wiązało się z aktywowanymi ludzkimi

komórkami-T CD4+ i CD8+ oraz komórkami dendrytycznymi, ale nie z komórkami-B, na co wskazuje

średnia fluorescencja (MFI, ang. mean fluorescence intensity) barwienia. Dane te wykazują że HuMab

anty-PTK7 wiążą się z ludzkimi komórkami T i komórkami dendrytycznymi.

Przykład 8: Internalizacja przeciwciała monoklonalnego anty-PTK7

[0184] HuMAb anty-PTK7 testowano pod kątem zdolności do internalizacji do linii komórkowych

wyrażających PTK7 z zastosowaniem testu internalizacji Hum-Zap. Test Hum-Zap bada internalizację

przeciwciała pierwszorzędowego przez wiązanie przeciwciała drugorzędowego z powinowactwem do

ludzkiego IgG sprzężonego z toksyczną saporyną.

[0185] Nowotworowe linie komórkowe wyrażające PTK7 guz Wilmsa G-401 (ATCC nr dost. CRL-1441),

A-431 (ATCC nr dost. CRL-1555) i PC3 (ATCC nr dost. CRL-1435) wysiewano przy 1x104

komórek/studzienkę bezpośrednio do 100 µl studzienek. Przeciwciała HuMAb anty-PTK7 3G8, 4D5,

12C6 lub 7C8 dodawano do studzienek w początkowym stężeniu 30 nM, dalej zmniejszanym seryjnymi

rozcieńczeniami 1:3. Jako kontrolę negatywną zastosowano izotypowe przeciwciało kontrolne, nieswoiste

dla PTK7. Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-22-25) dodawano w stężeniu 11

nM i płytki inkubowano przez 72 godziny. Płytki następnie traktowano 1,0 µCi 3H-tymidyny przez 24

godziny, zbierano i sczytywano w liczniku Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments, Meriden,

CT). Wyniki przedstawiono na Figurze 20A-D. Dla przeciwciał anty-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 i 7C8

wykazano spadek włączania 3H-tymidyny w linii komórkowej guza Wilmsa wyrażającej PTK7 zależny od

stężenia przeciwciała. Dla przeciwciał anty-PTK7 12C6 i 7C8 wykazano spadek włączania 3H-tymidyny w

wyrażających PTK7 nowotworowych liniach komórkowych A-431 i PC3, zależny od stężenia przeciwciała.

Wartości EC50 dla przeciwciał anty-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 i 7C8 w komórkach guza Wilmsa wynosiły

odpowiednio 0,6437 nM, 0,2516 nM, 0,2053 nM i 0,1788 nM. Wartości EC50 dla przeciwciał anty-PTK7

12C6 i 7C8 w komórkach A-431 wynosiły odpowiednio 0,1657 nM i 0,1826 nM. Wartości EC50 dla

przeciwciał anty-PTK7 12C6 i 7C8 w komórkach guza PC3 wynosiły odpowiednio 0,3175 nM i 0,2648 nM.

Dane te wykazują, że przeciwciała anty-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 i 7C8 internalizują do komórek

nowotworowych.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

45

Przykład 9: Ocena zabijania komórek dla przeciwciała anty-PTK7 sprzężonego z toksyną na

ludzkich nowotworowych liniach komórkowych

[0186] W tym przykładzie przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 sprzężone z toksyną sprawdzono pod

kątem zdolności do zabijania ludzkich nowotworowych linii komórkowych PTK7+ w teście proliferacji

komórek.

[0187] Przeciwciało HuMAb anty-PTK7 12C6a sprzężono z toksyną poprzez łącznik, taki jak łącznik

peptydylowy, hydrazonowy lub dwusiarczkowy. Przykłady związków toksyn, które można sprzęgać z

przeciwciałami według niniejszego wynalazku opisano w WO 2007/038658. Ludzką linię komórkową raka

nerki guza Wilmsa G-401 (ATCC nr dost. CRL-1441) wyrażającą PTK-7 wysiewano przy 104

komórek/studzienkę w 100 µl studzienkach na 3 godziny. Do studzienek dodawano koniugat przeciwciało

anty-PTK7-toksyna w początkowym stężeniu 100 nM, dalej zmniejszanym seryjnymi rozcieńczeniami 1:3.

Płytki pozostawiono do inkubacji na 48 godzin. Płytki następnie traktowano 1 µCi 3H-tymidyny przez 24

godziny przed zakończeniem hodowli, zbierano i sczytywano w liczniku Top Count Scintillation Counter

(Packard Instruments). Figura 21 przedstawia wpływ koniugatu 12C6a na komórki guza Wilmsa. Dla

przeciwciała anty-PTK7 12C6 wykazano spadek włączania 3H-tymidyny w ludzkiej linii komórkowej raka

nerki guza Wilmsa wyrażającej PTK7 zależny od stężenia przeciwciała-toksyny.

[0188] Dane te wykazują, że przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną wykazują swoistą

cytotoksyczność dla ludzkich komórek raka nerki.

Przykład 10: Ocena zabijania komórek dla przeciwciała anty-PTK7 sprzężonego z toksyną na

ludzkich liniach komórkowych guza

[0189] W tym przykładzie przeciwciała monoklonalne anty-PTK7 sprzężone z toksyną sprawdzono w

teście proliferacji komórek pod kątem zdolności do zabijania ludzkich linii komórkowych guza PTK7+,

mających niską, średnią lub wysoką ekspresję PTK7 na powierzchni komórek.

[0190] Przeciwciało HuMAb anty-PTK7 12C6a sprzężono z toksyną łącznikiem, takim jak łącznik

peptydylowy, hydrazonowy lub dwusiarczkowy. Przykłady związków toksyn, które można sprzęgać z

przeciwciałami według niniejszego wynalazku opisano w WO 2007/038658. Ludzkie nowotworowe linie

komórkowe guza, wyrażające PTK-7, A-431, SKOV3 i LoVo wysiewano przy 104 komórek/studzienkę w

100 µl studzienkach. Linie komórkowe sprawdzono wcześniej pod kątem wyrażania PTK7 na powierzchni

komórek standardowym testem FACS. Linia komórkowa A-431 miała najwyższy poziom ekspresji PTK7

na powierzchni komórek, a linia komórkowa LoVo miała najniższy poziom ekspresji PTK7 na powierzchni

komórek. Do studzienek dodano koniugat przeciwciało anty-PTK7-toksyna w początkowym stężeniu 20

nM dalej zmniejszanym seryjnymi rozcieńczeniami 1:2. Jako kontrolę negatywną zastosowano izotypowe

przeciwciało kontrolne. Płytki pozostawiono do inkubacji na 3 godziny i odpłukano niezwiązane (wolne)

koniugaty przeciwciało-toksyna. Płytki inkubowano dalej przez 96 godz. i mierzono śmiertelność

(jednostki fluorescencji, FU, ang. fluorescence units) luminescencyjnym testem przeżywalności komórek

CellTiter-Glo® zgodnie z protokołem (Promega, WI, USA, Biuletyn techniczny nr 288) stosując czytnik

BIO-TEK (Bio-Tek Instruments, Inc, VT, USA). Wyniki przedstawiono na Figurze 22. Dla koniugatu

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

46

przeciwciało anty-PTK7-toksyna wykazano spadek w teście proliferacji zależny od stężenia przeciwciała-

toksyny w wyrażających PTK7 A431wysoka

, SKOV3średnia

, LoVoniska

.

[0191] Dane te wykazują, że przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną wykazują swoistą

cytotoksyczność dla różnych ludzkich komórek nowotworowych.

Przykład 11: Immunohistochemia z 3G8, 12C6a, 2E11

[0192] Zdolność HuMab anty-PTK7 3G8, 12C6a i 2E11 do rozpoznawania PTK7 immunohistochemicznie

zbadano z zastosowaniem biopsji klinicznych z raka płuc, raka piersi, raka pęcherza moczowego, raka

trzustki, raka okrężnicy, raka jajnika, raka jelita cienkiego i raka prostaty.

[0193] Do immunohistochemii, zastosowano 5 µm mrożone skrawki (Ardais Inc. USA). Po suszeniu przez

30 minut, skrawki utrwalono w acetonie (w temperaturze pokojowej przez 10 minut) i suszono na

powietrzu przez 5 minut. Skrawki płukano PBS, a następnie pre-inkubowano z 10% prawidłową surowicą

kozią w PBS, przez 20 min, i dalej inkubowano z 10µg/ml FITC-przeciwciała w PBS, z 10% prawidłową

surowicą kozią, przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Dalej skrawki płukano trzy razy w PBS, i

inkubowano przez 30 minut z mysim anty-FITC (10µg/ml DAKO) w temperaturze pokojowej. Skrawki

ponownie płukano w PBS i inkubowano z kozim anty-mysz sprzężonym z HRP (DAKO) przez 30 minut w

temperaturze pokojowej. Skrawki ponownie płukano 3x PBS. Jako substrat stosowano

diaminobenzydynę (Sigma), dającą brązowe zabarwienie. Po płukaniu wodą destylowaną, skrawki

barwiono kontrastowo hematoksyliną przez 1 min. Następnie skrawki płukano przez 10 sek. pod bieżącą

wodą destylowaną i osadzano w glicerożelu (Glycergel, DAKO). Barwienie immunohistochemiczne biopsji

klinicznych pokazało pozytywne barwienie w skrawkach raka płuc, raka piersi, raka pęcherza

moczowego, raka trzustki, raka okrężnicy, raka jajnika, raka jelita cienkiego i raka prostaty. Tkanka

prawidłowa zawsze dawała wynik negatywny w barwieniu PTK7, podczas gdy dla tkanki złośliwej,

zarówno fibroblastów aktywowanych nowotworowo jak i zrakowaciałych komórek nabłonkowych,

obserwowano wynik pozytywny w barwieniu PTK7. Potwierdzono identyfikację fibroblastów

aktywowanych nowotworowo w skrawkach raka pęcherza moczowego i raka piersi barwieniem z użyciem

przeciwciała przeciw białku aktywującemu fibroblasty (FAP, ang. Fibroblast Activation Protein, Alexis

Biochemicals, San Diego, USA). FAP jest znanym markerem fibroblastów aktywowanych nowotworowo

(Hofheinz et al. (2003) Oncologie 26:44-48).

Przykład 12: Badanie inwazji

[0194] W tym przykładzie, przeciwciała skierowane przeciwko PTK7 sprawdzono pod kątem zdolności do

wywierania wpływu na inwazję linii komórkowej CHO transfekowanej PTK7.

Badanie wykonano z zastosowaniem płytki wielodołkowej HTS 96-Multiwell Insert System (nr kat.

351162, BD Biosciences, CA) zgodnie z protokołem. Wyjściową linię komórkową CHO lub komórki CHO

transfekowane PTK7 pełnej długości lub kontrolną linię komórkową HEK293 wymieszano z pulą HuMab

anty-PTK7 lub izotypowym przeciwciałem kontrolnym przed dodaniem komórek na płytki. Mieszankę

(komórki + pula Ab) dodawano do studzienki na płytce inwazyjnej. Po inkubacji w 37 °C, w 5% CO2 przez

24 godziny, komórki wyznakowano barwnikiem fluorescencyjnym i oznaczono ilościowo komórki, które

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

47

spenetrowały na dno membrany, z zastosowaniem fluorescencyjnego czytnika płytek. Wyniki

przedstawiono na Figurze 23. Dane te wykazują, że przeciwciała anty-PTK7 hamują inwazyjną

ruchliwość komórek wyrażających PTK7 na powierzchni komórek.

Przykład 13: Leczenie modelu ksenoprzeszczepu komórek raka trzustki in vivo z zastosowaniem

przeciwciał anty-PTK7, nagich i sprzężonych z cytotoksyną

[0195] Ten Przykład ujawnia leczenie in vivo myszy z wszczepionym guzem raka trzustki przeciwciałami

anty-PTK7 sprzężonymi z toksyną, w celu zbadania wpływu przeciwciał na wzrost guza in vivo.

[0196] HPAC (ludzki gruczolakorak trzustki, ang. human pancreatic adenocarcinoma, ATCC numer

dostępu CRL-2119) lub inne odpowiednie komórki raka trzustki namnażano in vitro stosując standardowe

procedury laboratoryjne. Samcom Ncr bezgrasiczych nagich myszy (Taconic, Hudson, NY) w wieku

między 6-8 tygodni wszczepiono podskórnie w prawy bok 2,5x106 komórek HPAC w 0,2 ml PBS/Matrigel

(1:1) na mysz. Myszy ważono i mierzono w trzech wymiarach szukając guzów, z użyciem elektronicznej

suwmiarki dwa razy w tygodniu po implantacji. Objętości guzów obliczano jako wysokość x szerokość x

długość/2. Myszy z guzami HPAC średnio 90 mm3 randomizowano do grup leczenia. Myszom podawano

jedną dawkę dożylną nagiego przeciwciała anty-PTK7 lub HuMAb anty-PTK7 sprzężonego z toksyną, w

nośniku PBS, w Dniu 0 we wskazanej dawce (µmol/kg). Przykłady związków toksycznych, którą mogą

być sprzęgane z przeciwciałami według niniejszego wynalazku opisano w oczekującym amerykańskim

zgłoszeniu patentowym, numer publikacji 2006/0024317 A1. Myszy monitorowano pod kątem wzrostu

guza przez 61 dni po podaniu dawki. Myszy poddawano eutanazji gdy guzy osiągały punkt końcowy guza

(2000 mm3) lub ulegały owrzodzeniu. Przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną spowalniały progresję

wzrostu guza. Wyniki przedstawiono na Figurze 24. Wpływ koniugatu anty-PTK7 toksyna

przeciwdziałający guzowi zależał od dawki, z najsilniejszym efektem obserwowanym przy dawce 0,3

µmol/kg. Leczenie koniugatem anty-PTK7 toksyna było dobrze tolerowane, a osobniki nigdy nie

doświadczały średniej utraty masy ciała większej niż 5% (dane nie przedstawione). Tak więc, leczenie

koniugatem przeciwciało anty-PTK7-toksyna ma bezpośredni wpływ hamujący in vivo na wzrost guza

raka trzustki.

Przykład 14: Leczenie modelu ksenoprzeszczepu komórek raka piersi in vivo z zastosowaniem

przeciwciał anty-PTK7, nagich i sprzężonych z cytotoksyną

[0197] Ten Przykład ujawnia leczenie in vivo myszy z wszczepionym guzem raka piersi opornym na

adriamycynę, przy pomocy przeciwciał anty-PTK7 sprzężonych z toksyną w celu zbadania wpływu

przeciwciał na wzrost guza in vivo.

[0198] MCF7-adr (linię komórkową ludzkiego raka piersi oporną na adriamycynę) namnażano in vitro z

zastosowaniem standardowych procedur laboratoryjnych. Samicom myszy CB17.SCID (Taconic,

Hudson, NY) w wieku między 6-8 tygodni wszczepiono podskórnie 1,7 mg granulek uwalniających

estrogen przez 90 dni, wielkości 3,0 mm (Innovative Research of America, Sarasota, FL) w rejonie

szyjnym, na dzień przed wszczepieniem podskórnym w prawy bok 10 x106 komórek MCF7-Adr w 0,2 ml

PBS/Matrigel (1:1) na mysz. Myszy ważono i mierzono w trzech wymiarach szukając guzów, z użyciem

elektronicznej suwmiarki dwa razy w tygodniu po implantacji. Objętości guzów obliczano jako wysokość x

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

48

szerokość x długość/2. Myszy z guzami MCF7-Adr około 160 mm3 randomizowano do grup leczenia.

Myszom podawano jedną dawkę dożylną 0,1 µmol/kg nagiego przeciwciała anty-PTK7 lub HuMAb anty-

PTK7 sprzężonego z toksyną, w nośniku PBS, w Dniu 0. Przykłady związków toksycznych, którą mogą

być sprzęgane z przeciwciałami według niniejszego wynalazku opisano w oczekującym amerykańskim

zgłoszeniu patentowym, numer publikacji 2006/0024317 A1. Myszy monitorowano pod kątem wzrostu

guza przez 63 dni po podaniu dawki. Myszy poddawano eutanazji gdy guzy ulegały owrzodzeniu. Wyniki

przedstawiono na Figurze 25. Przeciwciała anty-PTK7 sprzężone z toksyną spowalniały progresję

wzrostu guza. Tak więc, leczenie koniugatem przeciwciało anty-PTK7-toksyna ma bezpośredni wpływ

hamujący in vivo na wzrost guza raka piersi.

SEKW NR ID: SEKWENCJA SEKW NR ID: SEKWENCJA

1 VH a.a. 3G8, 3G8a 23 VK CDR1 a.a. 3G8

2 VH a.a. 4D5 24 VK CDR1 a.a. 3G8a

3 VH a.a. 12C6, 12C6a 25 VK CDR1 a.a. 4D5

4 VH a.a. 7C8 26 VK CDR1 a.a. 12C6

27 VK CDR1 a.a. 12C6a

5 VK a.a. 3G8 28 VK CDR1 a.a. 7C8

6 VK a.a. 3G8a

7 VK a.a. 4D5 29 VK CDR2 a.a. 3G8

8 VK a.a. 12C6 30 VK CDR2 a.a. 3G8a

9 VK a.a. 12C6a 31 VK CDR2 a.a. 4D5

10 VK a.a. 7C8 32 VK CDR2 a.a. 12C6

33 VK CDR2 a.a. 12C6a

11 VH CDR1 a.a. 3G8 34 VK CDR2 a.a. 7C8

12 VH CDR1 a.a. 4D5

13 VH CDR1 a.a. 12C6 35 VK CDR3 a.a. 3G8

14 VH CDR1 a.a. 7C8 36 VK CDR3 a.a. 3G8a

37 VK CDR3 a.a. 4D5

15 VH CDR2 a.a. 3G8 38 VK CDR3 a.a. 12C6

16 VH CDR2 a.a. 4D5 39 VK CDR3 a.a. 12C6a

17 VH CDR2 a.a. 12C6 40 VK CDR3 a.a. 7C8

18 VH CDR2 a.a. 7C8

41 VH n.t. 3G8, 3G8a

19 VH CDR3 a.a. 3G8 42 VH n.t. 4D5

20 VH CDR3 a.a. 4D5 43 VH n.t. 12C6, 12C6a

21 VH CDR3 a.a. 12C6 44 VH n.t. 7C8

22 VH CDR3 a.a. 7C8

I

45 VK n.t. 3G8 51 VH 3-30.3 germinalna a.a.

46 VK n.t. 3G8a 52 VH DP44 germinalna a.a.

47 VK n.t. 4D5 53 VH 3-33 germinalna a.a.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

49

SEKW NR ID: SEKWENCJA SEKW NR ID: SEKWENCJA

48 VK n.t. 12C6

49 VK n.t. 12C6a 54 VK L15 germinalna a.a.

50 VK n.t. 7C8 55 VK A10 germinalna a.a.

56 VK A27 germinalna a.a.

57 VK L6 germinalna a. a.

I

58 PTK7 a.a.

59 JH4b germinalna a.a

60 JH4b germinalna a.a.

61 3-7 germinalna a.a.

62 3-23 germinalna a.a.

63 JH4b germinalna a.a

64 JH6b germinalna a.a.

65 JK1 germinalna a.a.





LISTA SEKWENCJI

[0199]

<110> MEDAREX, INC.

<120> LUDZKIE PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE PRZECIW BIAŁKU KINAZY TYROZYNOWEJ 7

(PTK7) I SPOSOBY STOSOWANIA PRZECIWCIAŁ ANTY-PTK7

<130> MXI-345PC

<140>

<141>

<150> 60/748,373

<151> 2005-12-08

<160> 69

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

50

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

51

<210> 4

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

52

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

53

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

54

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

55

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

56

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

57

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

58

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

59

<210> 41

<211> 348

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(348)

<400> 41

<210> 42

<211> 345

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(345)

<400> 42

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

60

<210> 43

<211> 336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<400> 43

<210> 44

<211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(378)

<400> 44

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

61

<210> 45

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 45

<210> 46

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

62

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 46

<210> 47

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 47

<210> 48

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

63

<211> 327

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(327)

<400> 48

<210> 49

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321).

<400> 49

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

64

<210> 50

<211> 324

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(324)

<400> 50

<210> 51

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

65

<210> 52

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

<210> 53

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

66

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 96

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

67

<210> 57

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 1070

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

68

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

69

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

70

<210> 59

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

71

<210> 61

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

72

<400> 64

<210> 65

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

<210> 67

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

<210> 68

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

<210> 69

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

73

Zastrzeżenia

1. Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, lub jego część wiążąca antygen, przy czym

przeciwciało:

(a) swoiście wiąże się z ludzką PTK7; oraz

(b) wiąże się do linii komórkowej guza Wilmsa o nr dost. ATCC CRL-1441, z EC50 4,0 nM lub

mniejszym, w badaniu, które obejmuje inkubowanie 1 x 105 komórek z przeciwciałem przy

początkowym stężeniu 30 µg/ml i seryjne rozcieńczanie przeciwciała w rozcieńczeniach 1:10; oraz

(c) wiąże się z tym samym epitopem na ludzkiej PTK7 co przeciwciało odniesienia obejmujące:

(i) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR

ID: 2 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW

NR ID: 7; lub

(ii) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR


NR ID: 8; lub

(iii) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR


NR ID: 10.

2. Przeciwciało według zastrz. 1, które jest:

(a) przeciwciałem pełnej długości izotypu IgG1 lub IgG4; lub

(b) fragmentem przeciwciała lub przeciwciałem jednołańcuchowym.

3. Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według zastrz. 1 albo 2, przy czym przeciwciało wiąże

się do komórek guza Wilmsa z EC50 3,5 nM lub mniejszym.

4. Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według dowolnego z zastrz. 1 do 3, które obejmuje:

(a) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 12,

CDR2 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 16,


CDR1 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 25,

CDR2 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 31 oraz

CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 37; lub

(b) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 14,

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

74





CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 40; lub

(c) CDR1 regionu zmiennego łańcucha ciężkiego obejmujący SEKW NR ID: 13,





CDR3 regionu zmiennego łańcucha lekkiego obejmujący SEKW NR ID: 38

5. Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według dowolnego z zastrz. 1 do 4, które obejmuje:

(a) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:2 oraz

region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 7; lub

(b) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:4 oraz

region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 10; lub

(c) region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID:3 oraz

region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową SEKW NR ID: 8.

6. Immunokoniugat obejmujący przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, jak określone w dowolnym

z zastrz. 1 do 5, połączone z środkiem terapeutycznym, takim jak cytotoksyna lub izotop radioaktywny.

7. Kompozycja obejmująca przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, jak określone w dowolnym z

zastrz. 1 do 5 lub immunokoniugat określony w zastrz. 6 oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

8. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, jak

określone w dowolnym z zastrz. 1 do 5.

9. Wektor ekspresyjny obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 8.

10. Komórka gospodarz obejmująca wektor ekspresyjny określony w zastrz. 9.

11. Sposób in vitro dla przygotowania przeciwciała anty-PTK7, który obejmuje wyrażanie przeciwciała w

komórce gospodarzu jak określonej w zastrz. 10 i izolację przeciwciała z komórki gospodarza.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

75

12. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen, jak określone w dowolnym z zastrz. 1 do 5 do

zastosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania nowotworowi znamiennemu wzrostem komórek

guza wyrażających PTK7.

13. Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, według zastrz. 12, przy czym nowotwór jest wybrany z

raka okrężnicy, raka płuc, raka piersi, raka trzustki, czerniaka, ostrej białaczki szpikowej, raka nerek, raka

pęcherza moczowego, raka jajnika i raka prostaty.

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

76

An

ty-P

TK7

3G

8 V

H

Segm

ent

V:

3-3

0.3

Se

gmen

t D

: n

ieu

stal

on

y Se

gmen

t J:

JH

4b

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

77

An

ty-P

TK7

3G

8 V

K

Segm

ent

V:

L15

Se

gmen

t J:

JK

1

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

78

An

ty-P

TK7

3G

8a

VK

Se

gmen

t V

: L1

5

Segm

ent

J:

JK3

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

79

An

ty-P

TK7

4D

5 V

H

Segm

ent

V:

3-3

0.3

Se

gmen

t D

: n

ieu

stal

on

y

Segm

ent

J:

JH4

b

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

80

An

ty-P

TK7

4D

5 V

K

Segm

ent

V:

A1

0

Segm

ent

J:

JK5

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

81

An

ty-P

TK7

12

C6

VH

Se

gmen

t V

: D

P-4

4 Se

gmen

t D

: n

ieu

stal

on

y

Segm

ent

J:

JH4

b

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

82

An

ty-P

TK7

12

C6

VK

Se

gmen

t V

: A

27

Se

gmen

t J:

JK

2

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

83

An

ty-P

TK7

12

C6

a V

K

Segm

ent

V:

L15

Se

gmen

t J:

JK

2

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

84

An

ty-P

TK7

7C

8 V

H

Segm

ent

V:

3-3

3 Se

gmen

t D

: 3

-10

Segm

ent

J:

JH6

b

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

85

An

ty-P

TK7

7C

8 V

K

Segm

ent

V:

L6

Segm

ent

J:

JK3

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

86

An

ty-P

TK7

, reg

ion

VH

3G

8 i

3G

8a

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

87

An

ty-P

TK7

, reg

ion

VH

4D

5

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

88

An

ty-P

TK7

, reg

ion

VH

12

C6

i 1

2C

6a

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

89

An

ty-P

TK7

, reg

ion

VH

7C

8

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

90

An

ty-P

TK7

, reg

ion

VK

3G

8 i

3G

8a

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

91

An

ty-P

TK7

, reg

ion

VK

4D

5

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

92

An

ty-P

TK7

, reg

ion

VK

12

C6

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

93

An

ty-P

TK7

, reg

ion

VK

12

C6

a

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

94

An

ty-P

TK7

, reg

ion

VK

7C

8

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

germ

inal

ny

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

95

Wią

zan

ie H

uM

ab a

nty

-PTK

7 d

o k

om

óre

k tr

ansf

eko

wan

ych

PTK

7

HEK

29

3 t

ran

sfek

ow

ane

PTK

7

wyj

ścio

we

HEK

29

3

kon

tro

la iz

oty

po

wa

Względna # komórek


Inte

nsy

wn

ośd

flu

ore

sce

ncj

i In

ten

syw

no

śd f

luo

resc

en

cji

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

96

Wią

zan

ie p

rzec

iwci

ał P

TK7

z b

iałk

iem

PTK

7 t

este

m E

LISA

kon

tro

la n

egat

ywn

a

Stęż

enie

(u

g/m

l)

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

97

Mia

recz

kow

anie

FA

CS

na

kom

órk

ach

gu

za W

ilmsa

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

98

Intensywnośd fluorescencji (MFI)

kon

tro

la iz

oty

po

wa

Eksp

resj

a P

TK7

w e

nd

oge

nn

ych

lin

iach

ko

mó

rko

wyc

h g

uza

, z

zast

oso

wan

iem

FA

CS

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

99


kon

tro

la p

ozy

tyw

na

kon

tro

la

Inte

nsy

wn

ośd

flu

ore

sce

ncj

i (P

TK7

)

kom

órk

i ko

mó

rki

kom

órk

i

An

aliz

a FA

CS

akty

wo

wan

ych

lud

zkic

h li

mfo

cytó

w p

od

kat

em P

TK7

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

100

kon

tro

la iz

oty

po

wa


An

aliz

a FA

CS

Hu

MA

b a

nty

-PTK

7 n

a ko

mó

rkac

h d

end

ryty

czn

ych

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

101

kontrola izotypowa

Stężenie przeciwciał (nM)


Włą

czan

ie 3 H

-tym

idyn

y (

CP

M)

Włą

czan

ie 3 H

-tym

idyn

y (

CP

M)

HumZaP – guz Wilmsa

HumZaP – guz Wilmsa

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

102

kontrola izotypowa

kontrola izotypowa



Włą

czan

ie 3 H

-tym

idyn

y (

CP

M)

Włą

czan

ie 3 H

-tym

idyn

y (

CP

M)

test HumZaP – PC3

test HumZaP – A-431

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

103

kontrola

Stężenie UPT (nM)

Włą

czan

ie 3 H

-tym

idyn

y (

CP

M)

Proliferacja Wilmsa 72 godz. – bez

płukania

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

104

A4

31

(P

TK7

wys

) SK

OV

3 (

PTK

7śr)

LoV

o (

PTK

7n

is)

kon

tro

la iz

oty

po

wa-

tox

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

105

Inwazja (24 godz.)

Ab stosowane w 50 ug/ml

Pożywka Ab kontr izo

anty-PTK7

Linie komórkowe (1,5x10e5/studzienkę)

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

106

sam

a to

ksyn

a

sam

a to

ksyn

a

no

śnik

Ab

ko

ntr

ola

izo

typ

ow

a

Dn

i po

po

dan

iu

Śre

dn

ia o

bję

tośd

guza

n=8

Objętośd guza (długośd x szerokośd x wysokośd/2)

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

107

Objętośd guza (długośd x szerokośd x wysokośd/2)

Dn

i po

po

dan

iu

No

śnik

Ko

ntr

ola

izo

typ

ow

a 0

,1

Ko

ntr

ola

izo

typ

ow

a-to

x 0

,1

13

72-

00

9

MC

F7/A

dr

Śre

dn

ia o

bję

tośd

guza

n=9

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

108

Odnośniki cytowane w opisie

Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego

i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności

przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej

odpowiedzialności w tym względzie.

Dokumenty patentowe cytowane w opisie

• WO 0417992 A [0003] • WO 2004017992 A [0003] • US 4816567 A, Cabilly [0064] • US 5225539 A, Winter [0064] • US 5530101 A [0064] • US 5585089 A [0064] • US 5693762 A [0064] • US 6180370 A, Queen [0064] • US 5545806 A [0066] [0141] • US 5569825 A [0066] • US 5625126 A [0066] • US 5633425 A [0066] • US 5789650 A [0066] • US 5877397 A [0066] • US 5661016 A [0066] • US 5814318 A [0066] • US 5874299 A [0066] • US 5770429 A, Lonberg i Kay [0066] [0141] • US 5545807 A, Surani [0066] [0141] • WO 9203918 A [0066] • WO 9312227 A [0066] • WO 9425585 A [0066] • WO 9713852 A [0066] • WO 9824884 A [0066] [0072] [0142] • WO 9945962 A, Lonberg and Kay [0066] • WO 0114424 A, Korman [0066] [0072] [0141] • WO 0243478 A, Ishida [0067] [0141] • US 5939598 A [0068] • US 6075181 A [0068] • US 6114598 A [0068] • US 6150584 A [0068] • US 6162963 A, Kucherlapati [0068] • US 5223409 A [0070] • US 5403484 A [0070] • US 5571698 A, Ladner [0070] • US 5427908 A [0070] • US 5580717 A, Dower [0070] • US 5969108 A [0070] • US 6172197 A, McCafferty [0070] • US 5885793 A [0070] • US 6521404 A [0070] • US 6544731 A [0070] • US 6555313 A [0070] • US 6582915 A [0070] • US 6593081 A, Griffiths [0070] • US 5476996 A [0071] • US 5698767 A, Wilson [0071] • US 4399216 A [0079] • US 4634665 A [0079] • US 5179017 A, Axel [0079] • WO 8704462 A [0081]

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

109

• WO 8901036 A [0081] • EP 338841 A [0081] • US 6548530 B [0089] [0130] • US 6281354 B [0089] [0130] • US 20030064984 A [0089] [0130] • US 20030073852 A [0089] [0130] • US 20030050331 A [0089] [0130] • US 5399163 A [0115] • US 5383851 A [0115] • US 5312335 A [0115] • US 5064413 A [0115] • US 4941880 A [0115] • US 4790824 A [0115] • US 4596556 A [0115] • US 4487603 A [0115] • US 4486194 A [0115] • US 4447233 A [0115] • US 4447224 A [0115] • US 4439196 A [0115] • US 4475196 A [0115] • US 4522811 A [0116] • US 5374548 A [0116] • US 5399331 A [0116] • US 5416016 A, Low [0116] • US 20040087497 A [0130] • WO 03022806 A [0130] • WO 0109187 A [0141] • US 5625825 A [0141] • WO 2007038658 A [0187] [0190] • US 20060024317 A1 [0196] [0198] • US 60748373 B [0199] Literatura nie patentowa, cytowana w opisie • PRENZEL et al. Endocr. Relat. Cancer, 2001, tom 8, 11-31 [0001] • HUBBARD ; TILL. Annu. Rev. Biochem., 2000, tom 69, 373-98 [0001] • KOBUS ; FLEMING. Biochemistry, 2005, tom 44, 1464-70 [0001] • LEE et al. Oncogene, 1993, tom 8, 3403-10 [0002] • PARK et al. J. Biochem, 1996, tom 119, 235-9 [0002] • MOSSIE et al. Oncogene, 1995, tom 11, 2179-84 [0002] [0120] • EASTY et al. Int. J. Cancer, 1997, tom 71, 1061-5 [0003] [0120] • JUNG et al. Biochim Biophys Acta, 2002, tom 1579, 153-63 [0003] • MULLER-TIDOW et al. Clin. Cancer Res., 2004, tom 10, 1241-9 [0003] [0120] • KYRIAKOS et al. Cancer Research, February 1992, tom 52 (4), 835-842 [0003] • WARD et al. Nature, 1989, tom 341, 544-546 [0023] • BIRD et al. Science, 1988, tom 242, 423-426 [0023] [0061] • HUSTON et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, tom 85, 5879-5883 [0023] [0061] • KABAT, E. A. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. U.S. Department of Health and Human Services, 1991 [0046] [0060] • KLIMKA et al. British J. of Cancer, 2000, tom 83 (2), 252-260 [0051] • BEIBOER et al. J. Mol. Biol., 2000, tom 296, 833-849 [0051] • RADER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, tom 95, 8910-8915 [0051] • BARBAS et al. J. Am. Chem. Soc., 1994, tom 116, 2161-2162 [0051] • BARBAS et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995, tom 92, 2529-2533 [0051] • DITZEL et al. J. Immunol., 1996, tom 157, 739-749 [0051] • Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing and Wiley Interscience, 1987 [0055] • KABAT, E. A. Sequences of Proteins of Immunological Interest. U.S. Department of Health and Human Services, 1991 [0059] • MCCAFFERTY et al. Nature, 1990, tom 348, 552-554 [0061] • KOHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, tom 256, 495 [0062] • LONBERG et al. Nature, 1994, tom 368 (6474), 856-859 [0066]

PZ/1922/AGR EP 1 957 539 B1

110

• LONBERG, N. Handbook of Experimental Pharmacology. 1994, tom 113, 49-101 [0066] • LONBERG, N. ; HUSZAR, D. Intern. Rev. Immunol., 1995, tom 13, 65-93 [0066] • HARDING, F. ; LONBERG, N. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1995, tom 764, 536-546 [0066] • TAYLOR, L. et al. Nucleic Acids Research, 1992, tom 20, 6287-6295 [0066] • CHEN, J. et al. International Immunology, 1993, tom 5, 647-656 [0066] • TUAILLON et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, tom 90, 3720-3724 [0066] • CHOI et al. Nature Genetics, 1993, tom 4, 117-123 [0066] • CHEN, J. et al. EMBO J., 1993, tom 12, 821-830 [0066] • TUAILLON et al. J. Immunol., 1994, tom 152, 2912-2920 [0066] • TAYLOR, L. et al. International Immunology, 1994, tom 6, 579-591 [0066] • FISHWILD, D. et al. Nature Biotechnology, 1996, tom 14, 845-851 [0066] [0072] [0142] • TOMIZUKA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, tom 97, 722-727 [0069] • KUROIWA et al. Nature Biotechnology, 2002, tom 20, 889-894 [0069] • LONBERG, N. et al. Nature, 1994, tom 368 (6474), 856-859 [0072] [0142] • MORRISON, S. Science, 1985, tom 229, 1202 [0076] • GOEDDEL. Gene Expression Technology. Methods in Enzymology. Academic Press, 1990, tom 185 [0078] • TAKEBE, Y. et al. Mol. Cell. Biol., 1988, tom 8, 466-472 [0078] • BOSS, M. A. ; WOOD, C. R. Immunology Today, 1985, tom 6, 12-13 [0080] • URLAUB ; CHASIN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, tom 77, 4216-4220 [0081] • R. J. KAUFMAN ; P. A. SHARP. Mol. Biol., 1982, tom 159, 601-621 [0081] • SAITO, G. Adv. Drug Deliv. Rev., 2003, tom 55, 99-215 [0091] • TRAIL, P.A. et al. Cancer Immunol. Immunother, 2003, tom 52, 328-337 [0091] • PAYNE; G. Cancer. Cell, 2003, tom 3, 207-212 [0091] • ALLEN, T.M. Nat Rev Cancer, 2002, tom 2, 750-763[0091] • PASTAN, I. ; KREITMAN, R. J. Curr. Opin. Investig. Drugs, 2002, tom 3, 1089-1091 [0091] • SENTER, P.D. ; SPRINGER, C.J. Adv. Drug Deliv. Rev., 2001, tom 53, 247-264 [0091] • Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy. ARNON et al. Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy. Alan R. Liss, Inc, 1985, 243-56 [0094] • Antibodies For Drug Delivery. HELLSTROM et al. Controlled Drug Delivery. Marcel Dekker, Inc, 1987, 623-53 [0094] • Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review. THORPE et al. Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications. 1985, 475-506 [0094] • Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy. Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy. Academic Press, 1985, 303-16 [0094] • THORPE et al. The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates. Immunol. Rev., 1982, tom 62, 119-58 [0094] • BERGE, S.M. et al. J. Pharm. Sci., 1977, tom 66, 1-19 [0098] • Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems. Marcel Dekker, Inc, 1978 [0114] • V.V. RANADE. J. Clin. Pharmacol., 1989, tom 29, 685 [0116] • UMEZAWA et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1988, tom 153, 1038 [0116] • P.G. BLOEMAN et al. FEBS Lett., 1995, tom 357, 140 [0116] • M. OWAIS et al. Antimicrob. Agents Chemother, 1995, tom 39, 180 [0116] • BRISCOE et al. Am. J. Physiol., 1995, tom 1233, 134 [0116] • SCHREIER et al. J. Biol. Chem., 1994, tom 269, 9090 [0116] • K. KEINANEN ; M.L. LAUKKANEN. FEBS Lett., 1994, tom 346, 123 [0116] • J.J. KILLION ; I.J. FIDLER. Immunomethods, 1994, tom 4, 273 [0116] • CHEN et al. EMBO J., 1993, tom 12, 811-820 [0141] • FISHWILD et al. Nature Biotechnology, 1996, tom 14, 845-851 [0141] • HOFHEINZ et al. Oncologie, 2003, tom 26, 44-48 [0193]

RZECZPOSPOLITA TŁUMACZENIE PATENTU …public.sds.tiktalik.com/patenty/pdf/250685.pdf ·...

Documents

Transcript of RZECZPOSPOLITA TŁUMACZENIE PATENTU …public.sds.tiktalik.com/patenty/pdf/250685.pdf ·...