Przygotowanie surowców roślinnych do wyznaczania ...
Transcript of Przygotowanie surowców roślinnych do wyznaczania ...
POLITECHNIKA WARSZAWSKA
WYDZIAŁ CHEMICZNY
Kierunek: TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Joanna Wysiadecka
Przygotowanie surowców roślinnych
do wyznaczania aktywności antyoksydacyjnej
Praca dyplomowa
na stopień inżyniera
wykonana w Katedrze Chemii Analitycznej
Kierująca pracą dr inż. Elżbieta Święcicka-Füchsel
Opiekun naukowy dr. inż Stanisław Kuś
WARSZAWA 2012
2
3
Warszawa,.....................................
........................................................
Nazwisko i imię
........................................................
nr albumu
........................................................
PESEL
Tytuł pracy dyplomowej inżynierskiej
.......................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................
.......................................................................................................................................................
Oświadczenie autora pracy
Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że praca dyplomowa o w/w tytule nie
zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami. Oświadczam
również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych
z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni.
Oświadczam, że wyniki zamieszczone w mojej pracy dyplomowej zostały
sfinansowane i wykonane z wykorzystaniem aparatury i urządzeń będących własnością
Wydziału Chemicznego Politechniki Warszawskiej. Niniejsza praca dyplomowa jest utworem
zbiorowym i jest własnością intelektualną Kierującego pracą, opiekuna naukowego
oraz moją.
Zobowiązuję się, że nie wykorzystam ani nie opublikuję wyników pracy bez zgody
Kierującego pracą i Kierownika Jednostki Wydziału Chemicznego Politechniki Warszawskiej
w której wykonano pracę.
.........................................
Podpis Studenta
..................................................... .................................................
Imię i Nazwisko Kierującego pracą Podpis Kierującego pracą
.............................................................. ....................................................
Imię i nazwisko Opiekuna Naukowego Podpis Opiekuna Naukowego
...........................................................................................
Specjalność
4
5
Spis treści
I. Wstęp .................................................................................................................................. 7
II. Część literaturowa ............................................................................................................. 8
1. Aktywność antyoksydacyjna .............................................................................................. 8
2. Metody wyznaczania aktywności antyoksydacyjnej .......................................................... 9
2.1. Mechanizm HAT ........................................................................................................ 10
2.1.1. Metoda ORAC (ang. oxygen radical absorbance capacity) ................................ 10
2.1.2. Metoda TRAP (ang. total radical trapping antioxidant parametr) ...................... 10
2.2. Mechanizm SET ......................................................................................................... 11
2.2.1. Metoda Folina-Ciocaltau (F-C) ........................................................................... 11
2.2.2. Metoda TEAC (ang. trolox equivalent antioxidant capacity) ............................. 12
2.2.3. Metoda FRAP (ang. ferric ion reducing antioxidant parametr) .......................... 12
2.2.4. Metoda ABTS ..................................................................................................... 12
2.2.5. Metoda DPPH ..................................................................................................... 13
3. Inne metody ...................................................................................................................... 13
4. Przechowywanie żywności ............................................................................................... 14
4.1. Metody fizyczne utrwalania żywności ....................................................................... 15
4.1.1. Utrwalanie przy użyciu niskich temperatur ........................................................ 15
4.1.2. Utrwalanie przy użyciu wysokich temperatur ..................................................... 16
4.1.3. Metody osmoaktywne ......................................................................................... 18
4.2. Metody chemiczne ..................................................................................................... 18
4.3. Metody niekonwencjonalne i skojarzone ................................................................... 18
5. Antocyjany ........................................................................................................................ 19
III. Część doświadczalna ..................................................................................................... 23
1. Odczynniki i aparatura ...................................................................................................... 23
2. Metodyka badań i sposób interpretacji otrzymanych wyników ....................................... 23
3. Przygotowanie surowca roślinnego .................................................................................. 25
4. Badania właściwości antocyjanów ................................................................................... 27
4.1. Malwidynyna, - widmo absorpcji i krzywa wzorcowa .............................................. 28
4.2. Wpływ czasu na zawartość antocyjanów w ekstrakcie .............................................. 30
4.3. Wpływ sposobu przechowywania owoców ............................................................... 33
4.4. Wyznaczanie aktywności antyoksydacyjnej metodą Folina–Ciocaletau ................... 34
6
4.5. Zależność pomiędzy aktywnością antyoksydacyjną a zawartością antocyjanów ..... 37
IV. Wnioski .................................................................................................................... 38
V. Streszczenie ............................................................................................................... 41
VI. Bibliografia .............................................................................................................. 43
7
I. Wstęp
Antyoksydanty, czyli przeciwutleniacze są to substancje, które opóźniają zajście
procesu utleniania związków chemicznych. Nawet ich niewielka ilość może całkowicie
zapobiec reakcjom utleniania substratów [1]. Duża ilość związków przeciwutleniających
znajduje się w owocach jagodowych, przede wszystkim w owocach borówki wysokiej,
nazywanej potocznie czarną jagodą [2]. Różne gatunki oraz odmiany roślin charakteryzują się
szczególną dla nich zawartością związków antyoksydacyjnych [3]. Przeciwutleniacze
występujące w surowcach roślinnych to: kwasy fenolowe, flawonoidy, flawony, polifenole
czy kwas askorbinowy.
Materiał roślinny do badań w niniejszej pracy stanowiły jagody oraz wiśnie. Owoce
jagód są bogate w antyoksydanty. Są to jednak owoce sezonowe, których całoroczne
spożywanie wiąże się z dużymi kosztami. Suszone oraz pasteryzowane produkty mogą być
wybierane ze względu na wygodę oraz długi czas przechowywania.
Celem mojej pracy było sprawdzenie jak utrwalanie wybranych owoców wpływa
na ich aktywność antyoksydacyjną. Owoce w różny sposób utrwalano i przechowywano.
Zastosowano następujące metody utrwalania owoców: pasteryzację, liofilizację oraz suszenie.
Dla porównania wpływu przechowywania sporządzono ekstrakty ze świeżych owoców
oraz poddanych różnym sposobom konserwacji [4].
W ekstraktach zbadano zawartość antocyjanów oraz określono ich aktywność
antyoksydacyjną metodą Folina-Ciocaltau.
8
II. Część literaturowa
1. Aktywność antyoksydacyjna
Możemy wyróżnić dwie grupy antyoksydantów: pierwotne (pierwszorzędowe)
oraz wtórne (drugorzędowe) (Rysunek 1). Przeciwutleniacze pierwotne przerywają reakcję
łańcuchową poprzez przyłączenie się atomu wodoru do wolnego rodnika w wyniku czego
powstają bardziej stabilne związki, już niereaktywne [5]. Z kolei przeciwutleniacze wtórne
wyłącznie opóźniają reakcje utleniania, nie przerywając reakcji łańcuchowej. Dzieje się
to m.in. dzięki: wiązaniu jonów metali (chelatowanie) katalizujących autooksydację,
dezaktywacji tlenu singletowego, absorpcji promieniowania UV [6].
Antyoksydanty dostarczane do organizmu człowieka wraz z żywnością pozwalają
na zapobieganie negatywnym skutkom działania wolnych rodników. Dodatek naturalnych
przeciwutleniaczy do żywności nie jest regulowany przez prawo i nie wymaga zgody na ich
zastosowanie [7]. Jedną z przyczyn badań przeciwutleniaczy pochodzenia naturalnego jest
rozbieżność pomiędzy badaniami klinicznymi a epidemiologicznymi. Pierwsze z nich
nie zawsze potwierdzają korzystne efekty spożywania antyoksydantów, drugie zaś wykazują
zmniejszenie się częstotliwości występowania chorób nowotworowych oraz układu
krwionośnego [8]. Dlatego też przeciwutleniacze odgrywają tak ważną rolę w profilaktyce
i leczeniu m.in. cukrzycy, miażdżycy oraz chorób serca [7].
Rysunek 1. Podział antyoksydantów.
9
Cechą charakterystyczną dla antyoksydantów jest ich potencjał lub pojemność
antyoksydacyjna. Pojemność antyoksydacyjna wyrażana jest najczęściej jako aktywność
antyoksydacyjna. Jest to zdolność do reagowania substancji z substancjami oksydacyjnymi
tzn. z utleniaczami cząsteczkowymi i rodnikowymi. Zdolność ta oznacza opóźnienie działania
danego antyoksydanta na związek o właściwościach utleniających. Aktywność biologiczna
antyoksydantów uwarunkowana jest ich przyswajalnością [9].
2. Metody wyznaczania aktywności antyoksydacyjnej
Istnieje wiele metod pozwalających na obliczenie względnego potencjału
antyoksydacyjnego związków i ich mieszanin.
Metody wyznaczania zdolności antyoksydacyjnej związków można podzielić
na addycyjne (pierwotne) i postaddycyjne (wtórne) (Rysunek 2). Metody pierwotne polegają
na opóźnieniu procesu oksydacyjnego zachodzącego w mieszaninie reakcyjnej w obecności
antyoksydantów. Metody wtórne polegają na reakcji badanej substancji z określoną ilością
przeciwutleniacza i oznaczeniu jego zawartości po pewnym czasie. Pozostała ilość
przeciwutleniacza jest odwrotnie proporcjonalna do aktywności przeciwutleniacza [5; 10].
Wyznaczona aktywność antyoksydacyjna wyrażana jest poprzez całkowity potencjał
oksydacyjny (ang. total activity control – TAC).
Rysunek 2. Podział metod wyznaczania aktywności antyoksydacyjnej.
Dezaktywacja przeciwutleniaczy może przebiegać według dwóch mechanizmów:
mechanizmu przeniesienia atomu wodoru – HAT (ang. hydrogen atom transwer) oraz według
mechanizmu przeniesienia pojedynczego elektronu – SET (ang. single electron transfer). Oba
mechanizmy mogą zachodzić jednocześnie, ale jeden z nich ma zawsze charakter dominujący.
Mają na to wpływ czynniki związane z właściwościami danego związku oraz środowisko
reakcji [11]. Efekt końcowy obydwu mechanizmów jest zawsze taki sam [12].
10
2.1. Mechanizm HAT
Mechanizm HAT zachodzi w rozpuszczalniku, niezależnie od jego pH. Trwa on
od kilku sekund do kilku minut, dlatego też aktywność jest liczona w stosunku do kinetyki
reakcji. Obecne w rozpuszczalniku reduktory mogą być przyczyną widocznych zmian
reaktywności. Do metod HAT należą m. in. metoda ORAC (ang. oxygen radical absorbance
capacity) oraz TRAP (ang. total radical trapping antioxidant parametr). Mechanizm HAT
przebiega w następujący sposób [12]:
gdzie: AH - związek będący donorem atomu wodoru, - wolny rodnik.
2.1.1. Metoda ORAC (ang. oxygen radical absorbance capacity)
Metoda ta służy do oznaczania zdolności absorpcji rodników tlenowych. Znalazła ona
zastosowanie do pomiaru aktywności przeciwutleniaczy hydrofilowych.
Rejestrowany w tej metodzie jest spadek fluorescencji, spowodowany uszkodzeniem
chemicznym sondy molekularnej. Traci ona swoje właściwości fluorescencyjne w wyniku
reakcji z termicznie generowanymi rodnikami nadtlenkowymi (pochodzącymi z AAPH [2,2’-
diazobis (2-amidinopropan) dichlorowodorku] – związek azowy). Jako sonda molekularna
jest wykorzystywana m.in. fluoresceina czy dichlorofluoresceina. W tej metodzie aktywność
oksydacyjna jest wyznaczana na podstawie integracji pola powierzchni między krzywymi
fluorescencji dla próbki badanej oraz ślepej próby [13; 14]. Metoda ta pozwala na oznaczanie
aktywności związków o właściwościach przeciwutleniających rozpuszczonych w tłuszczach
czy wodzie [15].
W celu określenia aktywności antyoksydacyjnej wyznacza się krzywą fluorescencji dla próbki
badanej oraz dla ślepej próby, a następnie integruje się pole powierzchni pomiędzy nimi. Pole
powierzchni oznaczane jest jako AUC (ang. area under curve) [13]. Pomiar metodą ORAC
trwa około godziny [5].
2.1.2. Metoda TRAP (ang. total radical trapping antioxidant parametr)
Metoda TRAP pozwala oznaczyć całkowitą zdolność wychwytywania wolnych rodników.
Mierzony jest spadek fluorescencji białka R-fikoerytyny (R-PE). Dzieje się tak w wyniku
działania rodników nadtlenkowych ROO•, które są generowane są w wyniku rozpadu AAPH.
Przeciwutleniacz znajdujący się w mieszaninie reakcyjnej powoduje opóźnienie zaniku
11
fluorescencji roztworu proporcjonalnie do ich potencjału antyoksydacyjnego [13]. Reakcje
zachodzące w tej metodzie są bardzo podobne do zachodzących w mechanizmie ORAC [5].
Sonda R-PE reaguje 100 razy wolniej przerywając łańcuch reakcji wolnorodnikowych,
niż przeciwutleniacze posiadające tę zdolność [13]. Czas, w którym substancja badana
jest indukowana porównuje się z czasem indukcji troloksu [15].
2.2. Mechanizm SET
W mechanizmie SET mieszaninę reakcyjną stanowi antyoksydant i utleniacz. Barwa
związku o właściwościach redukcyjnych ulega zmianie w wyniku zmiany stopnia utlenienia.
Punkt końcowy jest rejestrowany w momencie osiągnięcia stabilnej barwy. Zmiana
absorbancji w funkcji stężenia antyoksydanta w próbce stanowi zależność liniową. Uzyskane
wyniki przelicza się najczęściej na równoważnik troloksu [13].
Mechanizm SET można opisać następującymi reakcjami [12]:
(1)
(2)
(3)
(4) ( ) ( )
gdzie: AH - związek będący donorem atomu wodoru, - wolny rodnik.
Mechanizm SET jest znacznie wolniejszy niż mechanizm HAT. W celu określenia
aktywności antyoksydacyjnej w obliczeniach wykorzystuje się procentowy spadek ilości
produktu. Mechanizm SET jest wykorzystywany w następujących metodach: TEAC, FRAP
(ang. ferric ion reducing antioxidant parametr), Folina-Ciocalteau, z zastosowaniem
odczynnika ABTS (2’-azynobis(3-etylobenzenotiazolino-6-sulfonianu)) oraz DPPH (2,2-
difenylo-1-pikrylohydrazylu) [13].
2.2.1. Metoda Folina-Ciocaltau (F-C)
Odczynnik F-C ulega redukcji w wyniku przeniesienia elektronu. W skład odczynnika
Folina-Ciocaltau wchodzą wolframnian sodu (Na2WO4), molibdenian sodu (Na2MoO4),
siarczan litu (Li2SO4), woda bromowa oraz stężony kwas solny oraz kwas fosforowy. Niestety
struktura otrzymanego związku nie została jeszcze w pełni zidentyfikowana. Podejrzewa się,
że w wyniku reakcji tworzy się heteropolifosfowolframian molibdenu.
12
Odczynnik F-C reaguje z wieloma związkami posiadającymi właściwości
przeciwutleniające.
Podczas oznaczania związków fenolowych tą metodą środowisko reakcji musi być alkaliczne.
Otrzymuje się to poprzez dodatek węglanu sodu do badanego roztworu. Następnie zachodzi
dysocjacja fenolowego protonu oraz powstaje anion fenolowy o zdolnościach redukcyjnych.
Związki fenolowe z odczynnikiem F-C tworzą niebieskie zabarwienie niezależnie
od struktury fenoli [13].
Metodą tą oznaczane są głównie polifenole. Inne związki, które mogą być reagować
z odczynnikiem: cukry, aminy aromatyczne, kwas askorbinowy, aminokwasy, białka czy
mocznik. Jest to metoda prosta, odznaczająca się dużą czułością i dokładnością.
2.2.2. Metoda TEAC (ang. trolox equivalent antioxidant capacity)
W metodzie tej oznaczany jest potencjał antyoksydacyjny w przeliczeniu na ilość
równoważników Troloksu – TE (pochodna witaminy E) na jednostkę masy badanej próbki
[15]. Troloks reaguje z rodnikiem ABTS* [rodnik 2,2’-azynobis(3-etylobenzenotiazolino-6-
sulfonian)] [13]. Rejestrowane jest wygaszanie przez antyoksydanty charakterystycznego
pasma absorpcji ABTS* (λ=734 nm). Zaletą tej metody jest możliwość stosowania jej
zarówno w środowisku kwaśnym, jak i zasadowym [15].
2.2.3. Metoda FRAP (ang. ferric ion reducing antioxidant parametr)
Metoda FRAP pozwala na oznaczanie zdolności redukcyjnej badanej substancji
w stosunku do jonów żelaza(III) zawartych w TPTZ (kompleks żelazowo-2,4,6-tripirydylo-S-
triazyny). Powstały produkt ma barwę niebieską z maksimum absorpcji przy długości fali
λ=595 nm.
( ) ( )
Aktywność przeciutleniająca wyliczana jest na podstawie różnicy absorbancji analizowanej
próbki i absorbancji wyznaczonej dla wzorca Fe(II). Wyznaczona wartość ΔA próbki
jest wprost proporcjonalna do stężenia przeciwutleniacza [13].
2.2.4. Metoda ABTS
W tej metodzie wykorzystywany jest Kationorodnik, ABTS•+
który może powstawać
w reakcjach chemicznych oraz enzymatycznych. Główna reakcja zachodzi między ABTS
13
i nadsiarczanem potasu, w wyniku której tworzy się kationorodnik. Do otrzymanego roztworu
ABTS•+
dodawane są przeciwutleniacze. Następnie zachodzi redukcja rodnika
oraz odbarwienie roztworu. Zmiana barwy roztworu jest proporcjonalna do zawartości
antyoksydantów w roztworze. Zawartość przeciwutleniaczy w badanych próbkach wyrażona
jest w ilości równoważników troloksu na jednostkę objętości lub masę próbki (TEAC).
2.2.5. Metoda DPPH
Metoda polega na użyciu związku DPPH, który jest stabilnym rodnikiem azowym.
Roztwory tego związku mają kolor purpurowy z maksimum absorpcji przy 515 nm. W reakcji
z utleniaczami zmienia się barwa roztworu. Postęp reakcji jest monitorowany
spektrofotometrycznie przez pomiar absorbancji w λmax. Ilość rodnika DPPH, która nie
przereagowała wylicza się z równania:
,
gdzie: - ilość nieprzereagowanego DPPH, -początkowa ilość DPPH.
Ilość pozostałego DPPHrem, który nie uległ reakcji jest proporcjonalna do stężenia
przeciwutleniacza oraz stężenia powodującego spadek początkowego stężenia rodnika o 50%,
jest określana jako parametr EC50. Czas potrzebny do zajścia tego procesu jest wyznaczany
z krzywej kinetyki reakcji i określany jako parametr TEC50. W celu wyznaczenia aktywności
antyoksydacyjnej określa się sprawność przeciwrodnikową AE (ang. antiradical efficiency)
[13].
gdzie: AE - sprawność przeciwrodnikowa, EC50 - stężenie DPPH powodujące spadek
początkowego stężenia rodnika o 50%, - czas, po którym stężenie DPPH zmniejszy się
o 50%.
3. Inne metody
Wyróżniamy również metody nieprzebiegające ani według mechanizmu HAT, ani SET. Taką
metodą jest m.in. metoda TOSC (ang. total oxidant scavenging capacity) [13].
14
Metoda TOSC (ang. total oxidant scavenging capacity)
Metoda ta służy do oznaczania całkowitej zdolności wychwytywania rodników
tlenowych. W badanej próbce oznaczana jest ilościowo zdolność antyoksydacyjna w stosunku
do trzech związków. Są nimi silne utleniacze: rodniki hydroksylowe, rodniki nadtlenkowe
oraz rodniki generowane w wyniku termicznej hemolizy związku ABAP. Substratem reakcji
jest KMBA (kwas-α-ketono--γ-metiolobutanowy), który ulega utlenieniu do etylenu. Analiza
fazy nadpowierzchniowej pozwala na śledzenie czasu tworzenia etylenu przy użyciu techniki
chromatografii gazowej. Zdolność antyoksydacyjną badanej próbki oznacza się jako zdolność
zawartych w niej przeciwutleniaczy spowolniających powstawanie etylenu. Odnośnikiem
jest próbka nie zawierająca przeciwutleniacza.
Wyznaczany jest parametr TOSC (zależność wartości pola powierzchni piku etylenu
w funkcji czasu) [13]. Reakcja może trwać nawet do 300 minut. Niestety wyznaczany
parametr TOSC nie jest liniową zależnością [5].
∫
∫
∫ - pole powierzchni pod krzywą kinetyki reakcji tworzenia etylenu w obecności próbki
∫ -pole powierzchni pod krzywą kinetyki reakcji kontrolowanej tworzenia etylenu [13].
4. Przechowywanie żywności
Istnieje wiele metod pozwalających na utrwalanie żywności, w tym owoców oraz warzyw.
Czynności te są niezbędne, gdyż świeżego pożywienia jest za mało w stosunku
do zapotrzebowania. Oprócz tego w dzisiejszych czasach konsumenci są bardziej świadomi
pozytywnych efektów spożywania owoców. Ludzie nie mają zbyt dużo czasu
na przygotowanie świeżych owoców, dlatego też spożywają produkty przetworzone [16].
Konserwacja żywności ma na celu zahamowanie rozwoju bakterii
oraz drobnoustrojów, które bardzo łatwo się namnażają w nieodpowiednich warunkach
przechowywania. Na warunki te może wpływać temperatura, wilgotność powietrza, światło,
a także czas przechowywania. Większość procesów chemicznych oraz biochemicznych
zachodzących w żywności powinno zostać wstrzymane lub w znacznym stopniu zmniejszone.
Zmianie nie powinny ulegać właściwości fizyczne żywności. Gdy utrwalana żywność będzie
przechowywana w odpowiednich warunkach wzrost drobnoustrojów zostanie zahamowany
15
[17]. Przetwórstwo spożywcze wpływa również na zwiększenie biodostępności składników
odżywczych [18].
Wśród metod utrwalania żywności można wyróżnić metody fizyczne, chemiczne
oraz biologiczne (Rysunek 3). Wiele z nich opiera się na całkowitym zniszczeniu
drobnoustrojów w żywności poddanej obróbce. Efekt ten można otrzymać poprzez
zwiększenie lub zmniejszenie temperatury, jak również poprzez zastosowanie czynników
chemicznych lub promieniowania jonizującego [17].
Rysunek 3. Podział metod utrwalania żywności.
4.1. Metody fizyczne utrwalania żywności
4.1.1. Utrwalanie przy użyciu niskich temperatur
Jedną z najbardziej znanych metod utrwalania żywności jest konserwacja
z wykorzystaniem niskich temperatur. Utrwalanie żywności przy użyciu niskich temperatur
dzieli się na chłodzenie oraz mrożenie, a także liofilizację. Metoda ta jest często stosowana,
ponieważ jest prosta oraz nie wymaga dużych kosztów. Jedynie do przeprowadzenia
liofilizacji potrzebna jest odpowiednia aparatura.
a ) Chłodzenie
W niskich temperaturach zmniejsza się znacznie szybkość zachodzących procesów
biologicznych, co pozwala na przedłużenie okresu przydatności pożywienia. Możemy
16
wyróżnić chłodzenie żywności, które polega na przechowywaniu jedzenia w obniżonej
temperaturze od około 0°C do 10°C. Każdy rodzaj pożywienia posiada swój optymalny
zakres temperatur do przechowywania. Przykładem mogą być warzywa oraz owoce,
przechowywanie ich w nieodpowiednich temperaturach może powodować na ich powierzchni
uszkodzenia chłodnicze [17].
b) Mrożenie
Mrożenie polega na przechowywaniu żywności w temperaturach poniżej 0 °C.
Najczęściej jest to temperatura ok. -25 °C. Szybkie zamrażanie powoduje niewielkie starty
wartości odżywczych. Tak zakonserwowana żywność może być długo przechowywana.
Woda, która jest zawarta w zamrażanym pożywieniu zamienia się w lód, co hamuje rozwój
drobnoustrojów i procesów mogących zachodzić w temperaturach dodatnich [17].
c) Liofilizacja
Oprócz suszenia kontrolowanego możemy wyróżnić również suszenie sublimacyjne,
nazywane liofilizacją. W pierwszym etapie żywność zostaje zamrożona. Jest to główny
warunek zajścia procesu. Kolejno żywność zostaje umieszczona w komorze pod niskim
ciśnieniem, w której lód ulega sublimacji (przejście ze stanu stałego do stanu pary,
z pominięciem fazy ciekłej). Końcowy produkt jest suchy, ale nie zamrożony [15]. Suszenie
żywności ze stanu zamrożonego czyni tę metodę nieinwazyjną, nie uszkadzającą żywności
[17]. Liofilizacji poddawane zostaje pożywienie o wrażliwej strukturze, aromacie
oraz wysokiej cenie [11]. Żywność zliofilizowana powinna być przechowywana
w odpowiednich pojemnikach, gdyż jest higroskopijna [17].
4.1.2. Utrwalanie przy użyciu wysokich temperatur
Możemy utrwalać żywność przy użyciu wysokich temperatur, co jest bardzo często
wykorzystywane. Wśród nich wyróżniamy: pasteryzację, suszenie oraz zagęszczanie. Metody
te nie wymagają korzystania ze skomplikowanej aparatury [17].
a) Pasteryzacja
Pasteryzacja polega na poddaniu żywności działaniu wysokiej temperatury,
nieprzekraczającej jednak 100 °C. Ma to na celu zabicie drobnoustrojów znajdujących się
w żywności [19].
17
Wyróżniamy trzy rodzaje pasteryzacji: niską, momentalną oraz wysoką. W pasteryzacji
niskiej żywność jest poddawana gotowaniu w temperaturach nie przekraczających 65 °C,
w czasie około 25 minut. Z kolei pasteryzacja momentalna polega na poddaniu żywności
działaniu wysokiej temperatury, około 90 °C, a następnie szybkiemu schłodzeniu.
Pasteryzacja wysoka charakteryzuje się bardzo wysoką temperaturą, czasem sięgającą nawet
100 °C. Może ona trwać od kilkunastu sekund do kilkudziesięciu minut.
Wysoka temperatura zabija również formy przetrwalnikowe bakterii, więc mamy pewność,
że żywność pozostanie długo świeża. W procesach pasteryzacji ważną rolę odgrywają
odpowiednie pojemniki na żywność. Jeśli pozostaną hermetycznie zamknięte przed
gotowaniem, to żywność będzie przechowywana w warunkach beztlenowych, które znacznie
poprawią warunki jej przechowywania [17].
b) Suszenie
Jednym z głównych sposobów utrwalenia żywności jest jej suszenie poprzez odwodnienie
[15]. Polega ono na zmniejszeniu zawartości wody w żywności do około 15%, a czasem
poniżej 5% [20]. Jest to proces powolny. Suszenie może być przeprowadzone przy użyciu:
- podwyższonej temperatury w warunkach domowych oraz laboratoryjnych,
- w przeciwprądzie gorącego powietrza drobno rozpylonych cząsteczek płynu,
- za pomocą promieni podczerwonych,
- w próżni pod zmniejszonym ciśnieniem.
Woda ulega odparowaniu, co hamuje rozwój drobnoustrojów [17]. W tym czasie rozkładowi
mogą ulegać również składniki odżywcze. Niekorzystne procesy, które mogą wtedy
zachodzić to m.in.: utlenianie (witamin, autooksydacja tłuszczu, substancji zapachowych),
zmiana barwy, utrata zdolności do rehydratacji oraz rozpuszczania się w wodzie [20].
Wadą suszenia jest otrzymywanie żywności o innej konsystencji, niż wyjściowa, a także
zmiana smaku otrzymanej w ten sposób żywności [17].
c) Zagęszczanie
Zagęszczanie polega na zmniejszeniu zawartości wody w substancjach płynnych
poddanych takiej obróbce. Zawartość wody lub innego rozpuszczalnika znacznie się
zmniejsza w wyniku odparowania. Zwykle zawartość wody na końcu procesu wynosi około
30% [17].
18
4.1.3. Metody osmoaktywne
Przykładem metod osomoaktywnych utrwalania żywności jest zwiększenie koncentracji
sacharozy lub chlorku sodu w przechowywanych produktach. Dodawane do przetworów
substancje zwiększają ciśnienie osmotyczne przechowywanej żywności [17]. Dodany cukier
wiąże wodę, która staje się niedostępna dla bakterii [15].
W wyniku dodatku cukru do owoców mogą powstawać dżemy, konfitury oraz marmolady.
Stężenie sacharozy przewyższające 60% powoduje odwodnienie komórek drobnoustrojów.
Odpowiednio zapasteryzowane słoiki z dżemami mogą być przechowywane wiele miesięcy.
Z kolei konserwujące właściwości chlorku sodu są widoczne przy stężeniu soli 12 – 16%.
Dodatek tej substancji silnie odwadnia środowisko hamując rozwój drobnoustrojów [17].
4.2. Metody chemiczne
Metody chemiczne wykorzystują dodatek niewielkiej ilości związków chemicznych
(konserwantów) do przechowywanej żywności. Pozwalają one na zahamowanie rozwoju
drobnoustrojów. Zaletą dodawanych związków jest brak negatywnego wpływu na organizm
człowieka, a także na walory smakowe utrwalanej żywności.
Do środków chemicznych pozwalających na utrwalanie półprzetworów zalicza się: ditlenek
siarki, kwas benzoesowy, kwas mrówkowy oraz kwas sorbowy. Z kolei czynnikiem
konserwującym w marynowanych warzywach oraz owocach jest kwas octowy z dodatkiem
kwasu mlekowego. W zależności od postaci końcowego produktu można używać różnych
ilości kwasu octowego (od 0,5% do 0,8%). Można również stosować dodatek kwasów
nieorganicznych, ale w ograniczonych ilościach. Polega ono głównie na zakwaszaniu
napojów chłodzących, gazowanych oraz niegazowanych. Nawet niewielka ilość kwasu
pozwala na skuteczne zapobieganie rozwojowi bakterii oraz drożdży. Innym znanym
dodatkiem konserwującym jest dwutlenek węgla stosowany do różnych napojów
gazowanych, a także alkoholowych.
4.3. Metody niekonwencjonalne i skojarzone
Niekonwencjonalne metody utrwalania żywności są rzadko spotykane, wykorzystane
są w nich interesujące rozwiązania techniczne. Do takich metod zalicza się: pulsujące światło,
pulsujące pole magnetyczne, promieniowania jonizujące oraz nadfioletowe, drgania
dźwiękowe i naddźwiękowe, działanie wysokiego ciśnienia hydraulicznego.
19
Z kolei w metodach skojarzonych wykorzystywanych jest kilka procesów pozwalających
na utrwalenie żywności, takich jak: ogrzewanie, chłodzenie, mrożenie czy suszenie. Mogą się
one odbywać zarówno jednocześnie, jak i zachodzić w odpowiedniej kolejności. Metoda
ta przynosi bardzo dobre rezultaty, gdyż może zagwarantować odpowiednią trwałość
produktów. Wykorzystanie kilku procesów jednocześnie pozwala na otrzymanie pożądanego
utrwalenia żywności [17].
5. Antocyjany
Antocyjany są liczną grupą barwników roślinnych, odpowiadających za różne odcienie
czerwieni oraz fioletu wielu owoców oraz kwiatów [21; 22].
W klasyfikacji są jedną z grup związków należących do flawonoidów. Charakteryzują się one
pierścieniem heterocyklicznym C6-C3-C6. Zaliczane są do nich: aglikony (antocyjanidyny)
oraz ich glikozydy (antocyjaniny). Wszystkie te związki są pochodnymi kationu
flawyliowego – 2-fenylobenzopiryliowego (Rysunek 4), który występuje w formie soli
karboniowych oraz oksoniowych. Druga ze struktur jest bardziej trwała oraz stanowi formę
dominującą.
Rysunek 4. Wzór strukturalny kationu flawyliowego.
Antocyjany różnią się między sobą oraz miejscem, w którym występuje podstawnik.
Poznanych antocyjanidyn jest ok. 20, jednak tylko niewielka ich część jest rozpowszechniona
w żywności pochodzenia roślinnego (Tabela 1).
Struktura barwników antocyjanowych jest bardzo zróżnicowana. Antocyjany występują
w postaci mono-, di- lub triglikozydów w produktach naturalnych. Reszty glikozydowe
występują najczęściej w pozycji 3, rzadziej w 5 lub 7. Barwniki, które występują w ściśle
określonych częściach rośliny są charakterystyczne dla danej odmiany. Ich liczba może się
wahać od kilku do kilkunastu [23].
20
Tabela 1. Aglikony najczęściej występujące w barwnikach antocyjanowych.
Antocyjanidyny R3’ R5’ λmaksimum [nm]
Pelargonidyna (Pg)
Cyjanidyna (Cy)
Delfinidyna (Dp)
Peonidyna (Pn)
Petunidyna (Pt)
Malwidyna (Mv)
-H
-OH
-OH
-OCH3
-OCH3
-OCH3
-H
-H
-OH
-H
-OH
-OCH3
520
535
546
532
543
542
Antocyjany są związkami niestabilnymi w roztworach. Ulegają odwracalnym przemianom
w środowisku wodnym w wyniku czego zmianie ulega ich barwa. W środowisku słabo
kwaśnym lub obojętnym występują w równowadze cztery formy barwników. Są nimi kation
flawyliowy AH+, zasada chinoidowa - A, pseudozasada karbinolowa - B oraz chalkon - C.
( ) ( )
( ) ( )
( ) ( )
Szybkość z jaką zachodzą te przemiany jest bardzo zróżnicowana. W dużym stopniu zależy
ona od struktury antocyjanów. Powyższe reakcje są endotermiczne. Najszybciej zachodzi
reakcja przeniesienia wodoru (reakcja 1), zaś najwolniejsza jest reakcja przemiany zasady
karbinolowej w chalkony (reakcja 3). Reakcja 2 przebiega niezależnie od pH. Równowaga
pomiędzy czterema opisanymi formami antocyjanów zależy od pH. Przy pH < 0,5 występuje
jedynie kation flawyliowy. Wraz ze wzrostem pH maleje udział tego kationu, a rośnie udział
bezbarwnej pseudozasady, w wyniku czego stopniowo zanika czerwona barwa. Przy pH > 4
kation flawyliowy zanika. Stężenie zasady chinoidowej oraz chalkonu jest niewielkie, zaś
formą dominującą w zakresie pH od 4 do 6 jest bezbarwna pseudozasada karbinolowa [21].
Jest to spowodowane faktem, iż stała równowagi reakcji hydratacji Kh jest znacznie wyższa
od reakcji przeniesienia protonu Ka. Dlatego też w celu uzyskania lepszej stabilności
barwnego kationu flawyliowgo należy obniżyć Kh lub zmniejszyć udział wody dostępnej
dla ataku nukleofilowego. Stąd suszenie, zagęszczanie czy zwiększanie zawartości cukru
w owocach powoduje wzrost trwałości barwy antocyjanów (poprzez obniżenie aktywności
wody) [23].
21
Antocyjany mogą ulegać procesom kopigmentacji, czyli tworzeniu się kompleksów
z innymi związkami. Należą do nich: flawanole, flawonole, alkaloidy, aminy, kwasy
fenolowe oraz same antocyjany. Proces kopigmentacji ma duży wpływ na odcień
oraz stabilność barw roślin, zawierających antocyjany. W wyniku procesu kopigmentacji
następuje zwiększenie intensywności barwy (efekt hiperchromowy) oraz przesunięcie
maksimum absorpcji w kierunku fal długich (efekt batochromowy). Proces zależy
od struktury, stosunku stężeń barwnika oraz kopigmentu, pH roztworu, składu
rozpuszczalnika oraz temperatury. Optymalne pH dla procesu wynosi około 3,5. W tym
zakresie stężeń zachodzi przyłączenie kopigmentu do kationu flawyliowego lub zasady
chinoidowej. Wartość pH stabilizuje barwę, ponieważ utrudnia atak nukleofilowy cząsteczki
wody na węgiel w pozycji 2, w wyniku czego równowaga reakcji hydratacji zostaje
przesunięta w kierunku wyższego pH.
Barwa produktów pochodzenia naturalnego, zawierających antocyjany zależy
od wielu czynników. Jest nim struktura oraz zawartość poszczególnych barwników. Wzrost
liczby grup hydroksylowych w pierścieniu B związku pozwala na zajście efektu
hiperchromowego oraz batochromowego. Z kolei zastąpienie grup hydroksylowych grupami
metoksylowymi powoduje cofnięcie się wcześniej opisanych zjawisk.
Również glikozydacja powoduje wzrost trwałości antocyjanów (poprzez acylację reszt
glikozydowych w środowisku kwaśnym). Dzieje się tak, gdyż cząsteczka jest stabilizowana
nowopowstałymi wiązaniami wodorowymi oraz hydrofobowe oddziaływanie pomiędzy
pierścieniami antocyjaniny oraz aromatycznymi pierścieniami grup acylujących.
Kopigmentacja jest ważną reakcją w stabilizacji barwy kwiatów oraz owoców. Niestety nie
znalazła ona zastosowania do utrwalania zabarwienia przetworów. Powodem jest potrzeba
użycia dużego nadmiaru kopigmentu w stosunku do barwnika. Jest to nieopłacalne oraz może
powodować zmiany właściwości organoleptycznych.
Zmiana barwy produktów zawierających antocyjany może być wynikiem reakcji
kompleksowania antocyjanów z jonami metali m.in. Fe3+
, Sn2+
, Al3+
. Takie kompleksy
najczęściej składają się z dwóch cząsteczek barwnika oraz dwóch innych ligandów.
Prawdopodobnie tak zbudowane kompleksy odgrywają ważną rolę w bogatej gamie
zabarwienia kwiatów.
Reakcje z jonami metali w żywności przynoszą efekty negatywne, barwa produktów ulega
zmianie, a także mogą wytrącać się osady.
Reakcja antocyjanów z siarczanami(IV) również powoduje zmianę barwy roztworu. Reszta
siarczanu(IV) przyłącza się do węgla w pozycji 4. Otrzymana forma nie jest jednak trwała
22
i ulega rozkładowi podczas wzrostu temperatury, powracając do czerwonej barwy. Takie
procesy zachodzą podczas produkcji dżemów z owoców, które były utrwalane ditlenkiem
siarki.
Nieodwracalne reakcje antocyjanów są wynikiem procesów oksydatywnej
polimeryzacji. Powoduje ona zmianę naturalnej barwy owoców na czerwonobrunatną, która
charakteryzuje owoce długo przechowywane. Zmiany te zależą przede wszystkim od
inicjatorów procesów utleniania, które są zawarte w żywności oraz czasu jego działania.
Pierwszym etapem jest rozdrobnienie owoców, w którym duże znaczenie ma aktywność
enzymów zawartych w surowcu. Kolejne etapy utleniania przebiegają bez obecności
enzymów. W celu opóźnienia degradacji barwników stosowany jest dodatek inhibitorów
enzymów (np. ditlenek siarki) oraz blanszowanie (zanurzenie produktu na kilkadziesiąt
sekund we wrzątku, a następnie włożenie do zimnej wody).
Do substancji powodujących przyśpieszenie nieodwracalnych procesów degradacji
antocyjanów zalicza się: tlen, fenylooksydazy, jony metali katalizujące procesy utleniania,
kwas askorbinowy oraz produkty jego degradacji.
Z kolei ogrzewanie owoców podczas zagęszczania oraz termicznego utrwalania powoduje
wzrost szybkości reakcji oksydatywnej polimeryzacji oraz zmianę barwy przetworów.
Krótkotrwałe ogrzewanie produktów owocowych (kilkanaście minut w temperaturze 100 ˚C)
nie powoduje widocznych zmian barwy. Również długoterminowe przechowywanie
w chłodniach powoduje jedynie niewielkie zmiany barwy owoców [21].
23
III. Część doświadczalna
1. Odczynniki i aparatura
W niniejszej pracy wykorzystano następujące odczynniki:
alkohol metylowy, cz.d.a., POCh,
alkohol etylowy, cz.d.a., POCh,
kwas chlorowodorowy, 36%, cz.d.a., POCh,
kwas mrówkowy, 85%, cz.d.a., POCh,
odczynnik Folin-Ciocalteu, 2N, Sigma Aldrich,
malwidyna, Sigma Aldrich,
węglan sodu, cz.d.a., POCh.
Korzystano także z następującej aparatury:
spektrofotometr UV/VIS, Perkin Elmer Lambda 20 (kiuweta kwarcowa
o drodze optycznej 1 cm),
spektrofotometr M 40 Specord,
suszarka, SML 32/350 Zaimel,
liofilizator, CHRIST Alpha 1-2/LD-2.
Obróbka zarejestrowanych spektrofotometrycznie widm została wykonana za pomocą
arkusza kalkulacyjnego Microsoft Excel „Spektrofotometria” wykonanego na potrzeby
Wydziału Chemicznego Politechniki Warszawskiej przez firmę KLIP.
2. Metodyka badań i sposób interpretacji otrzymanych wyników
Celem mojej pracy było zbadanie wpływu sposobu przygotowania i przechowywania
surowców roślinnych na ich aktywność antyoksydacyjną oraz zawartość antocyjanów.
Surowiec roślinny stanowiły świeże owoce jagody czarnej oraz wiśnie.
Przygotowanie surowca było najważniejszą częścią badań. Jagody oraz wiśnie utrwalano
różnymi sposobami. Jagody poddawano suszeniu, liofilizacji, sporządzono z nich również
przetwory, a część owoców pozostawiono świeże. Z kolei z wiśni sporządzono dżemy
oraz badano świeże owoce.
24
Owoce każdego gatunku były zebrane w tym samym okresie oraz pochodziły z tych samych
partii. Przygotowanie próbek polegało na sporządzeniu ekstraktów ze świeżych
oraz zakonserwowanych owoców. Ekstrakty umożliwiły przeprowadzenie (wydobycie)
związków zawartych w użytym surowcu do roztworu. Pozwoliło to na określenie zawartości
oraz aktywności antyoksydacyjnej związków o właściwościach przeciwutleniających, które
stanowiły antocyjany. Następnie ekstrakty były odpowiednio rozcieńczane do pomiarów
spektrofotometrycznych. Dzięki temu możliwe było oznaczanie antocyjanów w badanych
surowcach.
Wszystkie ekstrakty roślinne przygotowano w następujący sposób:
odważano określoną ilość owoców, przenoszono do kolby stożkowej
(o pojemności 100 mL dla jagody czarnej lub 250 mL dla wiśni),
owoce ekstrahowano odpowiednią ilością zakwaszonego rozpuszczalnika
w temperaturze ok. 25 ˚C w zaciemnionym miejscu w celu bardziej efektywnego
procesu ekstrakcji,
ekstrakt z owocami pozostawiono na odpowiedni okres czasu,
próbkę ekstraktu o objętości 20 μL rozcieńczano roztworem alkoholu metylowego
zakwaszonego 1% kwasem chlorowodorowym do objętości 1 mL,
rejestrowano widmo absorpcji w zakresie długości fal 200-700 nm.
Metodyka przygotowania próbek ze świeżych owoców została przedstawiona
w tabeli 2. Informacje zebrane w tej tabeli pozwoliły w późniejszym etapie pracy
na określenie najlepszych warunków prowadzenia ekstrakcji. Z kolei sposób przygotowania
ekstraktów z owoców w różny sposób przetworzonych przedstawiono w tabeli 3.
Na podstawie obliczonej zawartości antocyjanów oraz określania aktywności
antyoksydacyjnej w surowcach roślinnych wybrano optymalny rozpuszczalnik oraz kwas do
przeprowadzania ekstrakcji.
Jako ekstrahent stosowano alkohol metylowy, etylowy lub wodę z dodatkiem kwasu
chlorowodorowego lub mrówkowego. Do przygotowania niektórych ekstraktów używano
również mieszaninę alkoholu z wodą w różnych proporcjach.
25
Tabela 2. Sposób przygotowania próbek ekstraktów ze świeżych owoców.
rodzaj
owoców
oznakowanie
roztworu
masa
owoców
/g
rodzaj rozpuszczalnika objętość
rozp./ mL ja
goda
czar
na
JA 25 EtOH + 1% stęż. HCl 75
JB 25 MeOH + 1% stęż. HCl 75
JC 25 80% MeOH + 20% H2O+ 1% stęż.
HCl 60
JD 25 80% MeOH + 20% H2O+ 2% stęż.
HCl 60
JE 18 MeOH + 4% stęż. HCl 30
wiś
nia
WA 70 MeOH + 2% stęż. HCl 100
WB 70 H2O + 2% stęż. HCl 100
WC 70 H2O + 2% HCOOH 100
3. Przygotowanie surowca roślinnego
Istnieje wiele sposobów utrwalania żywności. W niniejszej pracy zostało wykorzystane
kilka z metod najczęściej wykorzystywanych w warunkach domowych, a także
przemysłowych.
3.1. Suszenie jagód
Jednym ze sposobów przygotowania jagód było suszenie. Jagody zostały umieszczone
w uprzednio zważonej parownicy. Do suszenia wzięto około 120 g jagód, które suszono
do stałej masy w suszarce do owoców, a następnie w suszarce laboratoryjnej w temperaturze
100 °C, do otrzymania stałej masy. Jagody suszono około 30 minut, a następnie pozostawiano
26
na 20 minut w eksykatorze. Tę czynność powtarzano czterokrotnie. Jagody były każdorazowo
ważone. Ostatecznie masa jagód wyniosła ok. 18 g, co stanowiło 15% świeżych jagód.
3.2. Sporządzenie przetworów z jagód
Jagody o masie wyjściowej wynoszącej 1600 g gotowano przez około 25 minut. Następnie
owoce podzielono na cztery porcje. Pierwszą z nich stanowił sam sok
z jagód, zaś trzy następne jagody z sokiem. Każdą z partii zakonserwowano w inny sposób.
a) przygotowanie soku
Oddzielono mechanicznie sok (około 250 mL) od jagód, następnie umieszczono go w słoiku
i zapasteryzowano.
b) przygotowanie owoców z sokiem
Jagody (około 250 g) umieszczono w słoiku, a następnie zapasteryzowano.
c) przygotowanie owoców z sokiem oraz dodatkiem cukru
Do pozostałej ilości jagód (około 1300 g) dodano cukier (650 g), całość gotowano przez 5
minut. Następnie około 500 g umieszczono w słoiku, szczelnie zamknięto
i zapasteryzowano.
d) przygotowanie dżemu
Do niewykorzystanych jagód z cukrem (około 1 kg) dodano środek żelujący*,
w ilościach zgodnych z przepisem na opakowaniu (1 opakowanie środka żelującego na 1
kilogram owoców + 0,5 kilogram sacharozy). Stosunek owoców do użytego cukru wynosił
2:1. Następnie dżem umieszczono w słoiku, który szczelnie zamknięto.
3.3. Liofilizacja jagód
Zamrożone jagody zostały poddane liofilizacji w liofilizatorze. Proces ten prowadzono
przez 5 dni, w temperaturze – 50 °C pod zmniejszonym ciśnieniem. Masa jagód przed
zamrożeniem wynosiła około 120 g, a po liofilizacji 16 g.
3.4. Sporządzenie dżemu z wiśni
Wiśnie (około 2 kg) gotowano z cukrem (około 700 g) oraz środkiem żelującym* przez
pięć minut. Stosunek użytych owoców do cukru wynosił 3:1. Następnie dżem umieszczono
w słoikach, które szczelnie zamknięto. W jednym słoiku znalazło się około 180 g wiśni
oraz 94,5 g cukru.
27
Tabela 3. Sposób przygotowania ekstraktów z owoców w różny sposób przetworzonych.
rodzaj oznakowanie
roztworu masa/ g rodzaj rozpuszczalnika
objętość
rozp./ mL
jagody suszone JS 3 MeOH+ 2% stęż. HCl 75
jagody bez cukru J1 20 MeOH + 1% stęż. HCl 75
jagody z cukrem J2 20 MeOH + 1% stęż. HCl 75
sok z jagód bez cukru J3 20 MeOH + 1% stęż. HCl 50
dżem jagodowy DJ 20 MeOH + 1% stęż. HCl 75
dżem wiśniowy
DW1 46 MeOH + 1% stęż. HCl 50
DW2 46 H2O + 1% stęż. HCl 50
jagody liofilizowane
L1 3,5 MeOH + 1% stęż. HCl 75
L2 3,5 MeOH + 2% stęż. HCl 75
*W przypadku przygotowywania dżemów zarówno z jagód, jak i z wiśni został użyty
środek żelujący, w którego skład wchodziły: cukier, substancja żelująca, pektyna
amidowana, regulator kwasowości: kwas cytrynowy, substancja konserwująca: kwas
sorbowy. Masa netto opakowania wynosiła 40 g.
4. Badania właściwości antocyjanów
Antocyjany posiadają charakterystyczne widmo absorpcji w zakresie nadfioletu
oraz światła widzialnego. Rozbieżności w maksimach absorpcji wynikają z różnych rodzajów
antocyjanidyn zawartych w surowcach roślinnych lub ich mieszaninach. Jagoda czarna
posiada maksimum absorpcji przy długości fali 280 nm dla zakresu UV oraz 541 nm
dla zakresu VIS, a wiśnia odpowiednio przy 282 nm oraz 529 nm.
28
Wraz z upływem czasu zawartość naturalnych barwników roślinnych maleje
(Rysunek 5).
Antocyjany nie są związkami stabilnymi w czasie, co potwierdzają dane literaturowe.
Na trwałość barwników może mieć wpływ światło, temperatura przechowywania oraz tlen
znajdujący się w powietrzu.
Obliczając iloraz absorbancji w zakresie światła widzialnego do absorbancji w zakresie
nadfioletu można ocenić stabilność antocyjanów oraz czystość ekstraktów (składniki
towarzyszące absorbują promieniowanie głównie w nadfiolecie).
Rysunek 5. Wpływ czasu na kształt widm adsorpcji dla malwidyny (od 30 minut
do 40 dni).
4.1. Malwidynyna - widmo absorpcji i krzywa wzorcowa
Malwidyna, czyli 2-(4-hydroksy-3,5-dimetoksyfenylo)chromenylio-3,5,7-triol (Rysunek
6) jest to barwnik roślinny będący związkiem fenolowym, należącym do grupy flawonoidów,
podgrupy antocyjanów. Odpowiada za barwę czerwono – fioletową wielu owoców i kwiatów,
w tym jagód oraz wiśni.
Przygotowano roztwór wzorcowy malwidyny o stężeniu 1,945 mg/mL w wodzie. W celu
obliczenia zawartości antocyjanów w przeliczeniu na malwidynę sporządzono krzywe
wzorcowe przy dwóch charakterystycznych długości fal 274 nm oraz 546 nm (rys. 7: a,b).
0
1
2
200 300 400 500 600 700
Ab
sorb
ancj
a
dł. fali [nm]
0,03 1 40
546 nm
274 nm
czas [dni]
29
Rysunek 6. Wzór strukturalny malwidyny.
W celu sporządzenia krzywej wzorcowej pobierano różne ilości roztworu malwidyny, ale nie
większe niż 200 µL. Objętość badanej próbki wynosiła 1 mL. Roztwór malwidyny do tej
objętości uzupełniano metanolem zakwaszonym 0,1% HCl. Krzywą wzorcową przedstawiono
na rysunku 7. Następnie rejestrowano widma absorpcji dla malwidyny w czasie.
Ze współczynników kierunkowych krzywych wzorcowych wyliczono molowy współczynnik
absorpcji (ε), a korzystając z prawa Lamberta-Beera wartość absorpcji właściwej (a).
Obydwie wielkości obliczono dla dwóch długości fal λ = 274 nm oraz λ = 546 nm (Tabela 4).
Tabela 4. Wartości absorpcji właściwej oraz molowego współczynnika absorpcji
dla malwidyny.
Długość fali
nm
Absorpcja właściwa – a
L·mg-1
·cm-1
Molowy współczynnik
absorpcji - ε
L·mol -1
·cm -1
274 0,154 5,08·104
546 0,353 1,17·105
Rysunek 7. Krzywa wzorcowa dla malwidyny, dla dwóch długości fali: 274 nm oraz 546 nm.
274 nm A = 0,1535x + 0,0164
546 nm A = 0,353x + 0,0336
0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Ab
sorb
ancj
a
c [µg/ml]
30
4.2. Wpływ czasu na zawartość antocyjanów w ekstrakcie
Następnym krokiem po sporządzeniu ekstraktów ze świeżych oraz utrwalonych jagód
oraz wiśni było zbadanie ich stabilności w czasie.
Ekstrakt (20 μL) rozcieńczano do objętości 1 mL metanolem z dodatkiem 0,1% kwasu
chlorowodorowego. Na rysunku 8: a) i b) zostały zamieszczone uzyskane widma absorpcji
dla ekstraktu ze świeżych jagód (MeOH + 1% HCl) w czasie.
Z kolei na rysunku 9: a) i b) przedstawiono krzywe zarejestrowane dla ekstraktu ze świeżych
wiśni w czasie. Zarówno z rysunku 8, jak i 9 wynika, że stężenie antocyjanów w roztworze
początkowo wzrasta w wyniku postępującej ekstrakcji. Około 9 – 10 dnia od rozpoczęcia
procesu ekstrakcji zawartość antocyjanów w jagodach osiąga maksymalną wartość. Dla wiśni
maksymalną zawartość antocyjanów zarejestrowano w dniu 7-8. W kolejnych dniach
ekstrakcji zawartość przeciwutleniaczy zmniejsza się.
W tabeli 5 zamieszczone zostały ilorazy absorbancji dla długości fali 280 nm oraz 540 nm
dla ekstraktu JA i WB. Pozwala on na ocenę trwałości antocyjanów. Wynika z niej,
że stosunek absorbancji w VIS do absorbancji w UV osiąga maksimum po 1 dniu ekstrakcji,
a następnie zmniejsza się wraz z upływem czasu. Świadczy to o tym, że antocyjany nie są
trwałe w czasie.
0
0,4
0,8
1,2
250 300 350 400 450 500 550 600
Ab
so
rban
cja
dł. fali [nm]
0,02 0,7 1 1,7 7 8 12 85
a
czas [dni]
31
Rysunek 8. a) Wpływ czasu na zmiany kształtu widma absorpcji dla ekstraktu JB (świeże
jagody: MeOH + 1% HCl) w czasie; b) Zmiany absorbancji w czasie.
0
0,4
0,8
1,2
1,6
0,02 0,7 1 2 8 9 12 85 90
Ab
sorb
ancj
a
czas [dni]
280 541 b
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
250 300 350 400 450 500 550 600
Ab
so
rban
cja
dł. fali [nm]
0,02 0,08 1 5 6 85czas [dni]
a
32
Rysunek 9. a) Wpływ czasu na zmiany kształtu widma absorpcji ekstraktu WC (świeże
wiśnie: H2O + 2% HCOOH) w czasie; b) Zmiany absorbancji w czasie.
Tabela 5. Stosunek absorbancji VIS (541 nm) do absorbancji UV (280 nm) dla ekstraktu JA,
JC oraz WB ze świeżych owoców.
doba EtOH +
+ 1% HCl
MeOH + 20% H2O +
+ 1% HCl
H2O +
+ 2% HCl
0 1,410 0,970 0,627
1 1,545 1,403 0,586
2 1,472 1,448 0,697
6 1,420 1,368 0,645
7 1,472 1,388 0,658
11 1,500 1,466 -
85 0,972 0,985 0,760
90 0,517 0,974 0,627
0
0,2
0,4
0,6
0,02 0,08 1 5 6 85 90
Ab
sorb
ancj
a
czas [dni]
280 541 b
33
4.3. Wpływ sposobu przechowywania owoców
Sporządzone ekstrakty ze świeżych oraz utrwalonych owoców różniły się między sobą
użytym ekstrahentem (rozpuszczalnikiem oraz kwasem). Kwas został dodany
do ekstrahowanych owoców w celu zwiększenia trwałości antocyjanów. Użyte do ekstrakcji
rozpuszczalniki to: etanol, metanol oraz woda, a kwasy to: chlorowodorowy oraz mrówkowy.
Wykorzystany do ekstrakcji rozpuszczalnik ma duży wpływ na zawartość antocyjanów
ekstrakcie. Dla porównywalnych ilości jagód przeprowadzono ekstrakcje, różniące się
stosowanymi ekstrahentemi (Rysunek 10: a, b). Najwyższą absorbancję zarejestrowano
dla ekstraktu JE i w tym roztworze zaszły największe zmiany w czasie. Dla pozostałych
ekstraktów, które zostały sporządzone z porównywalnej ilości owoców oraz ekstrahentów
zmiany zachodzą w jednakowy sposób.
Rysunek 10. Widma absorpcji ekstraktów ze świeżych jagód w czasie: a) po 6 dniach,
b) po 85 dniach.
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
250 300 350 400 450 500 550 600
Ab
so
rban
cja
dł. fali [nm]
JA JB JC JD JE
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
250 300 350 400 450 500 550 600
Ab
so
rban
cja
dł. fali [nm]
JA JB JC JD JE
a
b
34
4.4. Wyznaczanie aktywności antyoksydacyjnej metodą Folina–Ciocaletau
Aktywność antyoksydacyjną wyznaczano metodą Folina–Ciocaletau.
Wykonywano następujące czynności:
rozcieńczano badane ekstrakty dziesięciokrotnie,
pobierano 0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL, 0,4 mL oraz 0,5 mL ekstraktu
i umieszczano go w kolbkach miarowych o objętości 10 mL każda,
dodawano 2 mL rozcieńczonego dziesięciokrotnie odczynnika Folina-
Ciocaletau,
po pięciu minutach, dodawano 10 mL 20% węglanu sodu, kolbkę uzupełniano
do kreski wodą destylowaną,
po 30 minutach próbki badano spektrofotometrycznie, mierząc absorbancję
przy trzech długościach fali: 745 nm, 750 nm oraz 760 nm, ponieważ widmo
roztworu nie posiada charakterystycznego maksimum.
Ostatnim krokiem w obliczaniu aktywności antyoksydacyjnej było oszacowanie ilości kwasu
galusowego przypadającego na ilość owoców użytych do przygotowania ekstraktu.
Aktywność antyoksydacyjną wyrażoną w miligramach kwasu galusowego przypadającego
na gram owoców zawartych w ekstrakcie. Obliczono zawartość antocyjanów w ekstrakcie,
czyli ilość malwidyny (mg), która przypadała na masę użytych owoców (g). Zawartość
antocyjanów w ekstraktach z jagód oraz wiśni porównywano z aktywnością antyoksydacyjną
tego samego roztworu. Otrzymane wartości aktywności antyoksydacyjnych zostały
przestawione na wykresach. Na każdym z nich porównano ze sobą otrzymane wartości
aktywności antyoksydacyjnych z zawartością antocyjanów w tym samym ekstrakcie.
Na rysunku 11a przedstawiono aktywności przeciutleniające ekstraktów ze świeżych jagód,
różniące się użytym ekstrahentem, a na rysunku 11b zawartość antocyjanów w ekstrakcie.
Porównano również aktywności antyoksydacyjne ekstraktów z jagód w zależności od sposobu
utrwalania owoców (Rysunek 12: a, b).
Tę samą zależność wykonano także dla ekstraktów z wiśni w zależności od użytego
ekstrahenta oraz przechowywania surowca roślinnego (Rysunek 13: a,b).
Z otrzymanych danych wynika, że aktywność antyoksydacyjna obliczona metodą Folina–
Ciocaletau jest wprost proporcjonalna do antocyjanów znajdujących się we wszystkich
ekstraktach z jagód oraz wiśni.
35
Rysunek 11. Porównanie aktywności antyoksydacyjnej ekstraktów z jagód
w zależności od użytego ekstrahenta w przeliczeniu na: a) kwas galusowy,
b) malwidynę.
0
5
10
15
20
25
30Il
ość
kw
asu
gal
uso
we
go n
a g
jagó
d
[mg/
g]
ekstrakt z jagód w EtOH +1% HCl ekstrakt z jagód w MeOH +1% HCl
ekstrakt z jagód w MeOH + H2O+1% HCl ekstrakt z jagód w MeOH + H2O + 2% HCl
a
0
5
10
15
20
25
30
Ilo
ść m
alw
idyn
y n
a g
jagó
d [
mg/
g]
b
36
Rysunek 12. Porównanie aktywności antyoksydacyjnej ekstraktów z jagód
w zależności od sposobu przechowywania surowców roślinnych w przeliczeniu na: a) kwas
galusowy, b) malwidynę.
0
5
10
15
20
Ilo
ść k
was
u g
alu
sow
ego
na
g ja
gód
[m
g/g]
pasteryzowane ( MeOH + 1% HCl)dżem (MeOH + 1% HCl)pasteryzowane z cukrem (MeOH + 1% HCl)pasteryzowany sok (MeOH + 1% HCl)zliofilizowane (MeOH + 1% HCl)zliofilizowane (MeOH +2% HCl)suszone (MeOH + 2% HCl)
a
0
5
10
15
20
Ilo
ść m
alw
idyn
y n
a g
jagó
d [
mg/
g]
b
37
Rysunek 13. Porównanie aktywności antyoksydacyjnej ekstraktów z wiśni w zależności
od użytego ekstrahenta oraz przechowywania surowca roślinnego w przeliczeniu na: a) kwas
galusowy, b) malwidynę.
4.5. Zależność pomiędzy aktywnością antyoksydacyjną a zawartością antocyjanów
Na podstawie uzyskanych wyników (Rys. 11-13) zauważono korelację pomiędzy
aktywnością antyoksydacyjną oraz zawartością antocyjanów w ekstraktach roślinnych.
W tabeli 6 zostały przedstawione wartości ilorazów aktywności antyoksydacyjnej
do zawartości antocyjanów dla tych samych ekstraktów. Z otrzymanych danych wynika,
że wartość ilorazu aktywności antyoksydacyjnej (ilość kwasu galusowego) do zawartości
0
5
10
15
20
25
Ilo
ść k
was
u g
alu
sow
ego
na
g w
iśn
i [m
g/g]
a
0
5
10
15
20
25
Ilo
ść m
alw
idyn
y n
a g
wiś
ni [
mg/
g]
wiśnie (MeOH + 2% HCl) wiśnie (woda + 2% HCl) wiśnie (MeOH + 2% HCOOH)
dżem (MeOH +1% HCl) dżem (woda + 1% HCl)
b
38
antocyjanów (ilość malwidyny) jest stała. Nie zależy ona również od użytego surowca
roślinnego zawierającego barwniki należące do grupy antocyjanów. Iloraz ten wynosi
0,74 +/- 0,03 (Tabela 6).
Dzięki tej zależności można określić aktywność antyoksydacyjną badanego surowca
roślinnego, korzystając wyłącznie z obliczonej zawartości antocyjanów.
Tabela 6. Iloraz aktywności antyoksydacyjnej do zawartości antocyjanów w ekstraktach
z czarnej jagody oraz wiśni.
Ekstrakt
Iloraz aktywności
antyoksydacyjnej
do zawartości
antocyjanów
Ekstrakt
Iloraz aktywności
antyoksydacyjnej
do zawartości
antocyjanów
JA 0,735 DJ 0,751
JB 0,733 L1 0,751
JC 0,734 L2 0,752
JD 0,738 WA 0,742
JE 0,727 WB 0,753
JS 0,751 WC 0,739
J1 0,740 DW1 0,775
J2 0,747 DW2 0,724
J3 0,746 - -
IV. Wnioski
Antocyjany należą do grupy związków, które nie są stabilne w czasie. Ich stężenie
w roztworach będących w kontakcie z surowcem osiąga maksimum około 8-9 dnia
od rozpoczęcia ekstrakcji, a następnie stopniowo maleje. Dużą rolę odgrywa również użyty
do ekstrakcji rozpuszczalnik oraz kwas. Spośród sporządzonych ekstraktów najwyższą
39
zawartość antocyjanów w roztworze można uzyskać stosując jako ekstrahent metanol
zakwaszony kwasem mrówkowym. Najmniej efektywnym ekstrahentem jest woda.
Jagody posiadają wyższą aktywność antyoksydacyjną niż wiśnie. Wśród ekstraktów
ze świeżych owoców najwyższą aktywność antyoksydacyjną wykazuje ekstrakt ze świeżych
jagód w metanolu, najmniejszą zaś ekstrakt z wiśni w wodzie z dodatkiem kwasu
chlorowodorowego.
Utrwalanie owoców jest procesem bardzo ważnym, ponieważ większość owoców
jest dostępna sezonowo. Ich cena poza tym okresem jest wysoka, a spożywanie owoców
bogatych w antyoksydanty jest bardzo ważne dla organizmu człowieka przez cały rok. Wśród
zbadanych sposobów utrwalania żywności wyodrębnić można suszenie, pasteryzację,
liofilizację, a także sporządzanie dżemów. Większość z tych metod jest łatwo dostępna, tania
oraz powszechnie stosowana. Jedynie liofilizacja stanowi metodę bardziej skomplikowaną
do przeprowadzenia, której potrzebna jest odpowiednia aparatura.
Najmniejszą aktywność antyoksydacyjną wśród ekstraktów oszacowano dla ekstraktu
z dżemu wiśniowego w wodzie oraz z suszonych jagód.
Porównując sposoby utrwalania żywności ze względu na aktywność antyoksydacyjną
najlepszą z nich jest pasteryzacja całych owoców bez dodatku cukru. Dobry sposób
przechowywania żywności stanowi również pasteryzacja soku z owoców (bez dodatków).
Z kolei najmniej efektywną metodą przechowywania surowców roślinnych jest suszenie
oraz liofilizacja.
Liofilizacja, która jest często wykorzystywana w przemyśle spożywczym nie spełniła
wymagań co do zachowania jak największej ilości przeciwutleniaczy. Spełniają je za to proste
metody pasteryzacji, które nie zmniejszają aktywności antyoksydacyjnej utrwalonych
owoców w takim stopniu jak suszenie oraz liofilizacja.
Iloraz aktywności antyoksydacyjnej (ilość kwasu galusowego) do zawartości
antocyjanów (ilości malwidyny) w użytych surowcach roślinnych jest stały dla każdego
ekstraktu i wynosi 0,74 +/- 0,03. Ustalenie tej korelacji pozwala na oszacowanie wartości
aktywności antyoksydacyjnej ekstraktów roślinnych bez wykorzystywania metody Folina–
Ciocaletau. Zaletą tej metody jest krótszy czas potrzebny do otrzymania wyników,
a także mniejsze zużycie odczynników chemicznych.
40
41
V. Streszczenie
Wprowadzenie
Antyoksydanty, czyli przeciwutleniacze są to substancje opóźniające zajście procesu
utleniania związków chemicznych. Nawet ich niewielka ilość może całkowicie zapobiec
reakcjom utleniania substratów. Duża ilość związków przeciwutleniających znajduje się
w owocach jagodowych, przede wszystkim w owocach borówki wysokiej, nazywanej
potocznie czarną jagodą [1].
Cechą charakterystyczną dla antyoksydantów jest ich aktywność antyoksydacyjna.
Jest to zdolność określonych substancji do reagowania z czynnikami oksydacyjnymi,
hamująca aktywność wolnych rodników. Metody wyznaczania zdolności antyoksydacyjnej
związków dzieli się na addycyjne (pierwotne) i postaddycyjne (wtórne) [2, 3].
Dezaktywacja przeciwutleniaczy może przebiegać według dwóch mechanizmów: HAT (ang.
hydrogen atom transwer) oraz SET (ang. single electron transfer). Oba mechanizmy mogą
zachodzić jednocześnie, ale jeden z nich zawsze ma charakter dominujący. Mają na to wpływ
czynniki związane z właściwościami danego związku oraz środowisko reakcji [4]. Efekt
końcowy obydwu mechanizmów jest zawsze taki sam. Metoda Folina-Ciocalteau
wykorzystuje mechanizm SET [5].
Celem mojej pracy było sprawdzenie jak utrwalanie wybranych owoców wpływa
na ich aktywność antyoksydacyjną oraz zawartość antocyjanów. Surowiec roślinny stanowiły
świeże jagody oraz wiśnie. Owoce zostały w różny sposób utrwalone
i przechowywane. Zastosowano następujące metody utrwalania owoców: pasteryzację,
liofilizację oraz suszenie. Z części owoców sporządzono przetwory. Owoce każdego gatunku
były zebrane w tym samym okresie oraz pochodziły z tych samych partii.
Wyniki i dyskusja
Badanym surowcem roślinnym były jagody oraz wiśnie. Ekstrakty sporządzono dodając
do porównywalnych ilości owoców ekstrahent (metanol, etanol, woda) z dodatkiem kwasu
(chlorowodorowego lub mrówkowego).
Na podstawie sporządzonych ekstraktów określono zawartości oraz aktywności
antyoksydacyjnej związków o właściwościach przeciwutleniających. Widma absorpcji
związków o właściwościach antyoksydacyjnych rejestrowano spektrofotometrycznie.
Sprawdzono jaki wpływ na widmo absorpcji oraz aktywność antyoksydacyjną ma użyty
do ekstrakcji rozpuszczalnik oraz kwas. Aktywność antyoksydacyjna została wyznaczona
metodą Folina-Ciocaltau. Bardzo ważną rolę odgrywa zoptymalizowanie metody.
W celu określenia zawartości antocyjanów sporządzono roztwór wzorcowy malwidyny, która
jest barwnikiem roślinnym, należącym do flawonoidów (podgrupa antocyjany). Odpowiada
ona za barwę czerwono – fioletową wielu owoców i kwiatów.
Otrzymane wartości aktywności antyoksydacyjnej oraz zawartości antocyjanów w tym
samym ekstrakcie zostały porównane ze sobą. Aktywność antyoksydacyjną wyrażona została
w miligramach kwasu galusowego przypadającego na gram owoców zawartych w ekstrakcie,
zaś zawartość antocyjanów w ekstrakcie wyrażono jako ilość malwidyny (mg) przypadającej
na masę użytych owoców (g). Zawartość antocyjanów w ekstraktach z jagód oraz wiśni
porównywano z aktywnością antyoksydacyjną tego samego roztworu.
42
Wnioski
Spośród sporządzonych ekstraktów najwyższą zawartością antocyjanów w roztworze
charakteryzuje się stosując jako ekstrahent - metanol zakwaszony kwasem mrówkowym.
Najmniej efektywnym ekstrahentem jest woda.
Antocyjany należą do grupy związków, które nie są stabilne w czasie. Maksymalne stężenie
antocyjanów w roztworze osiąga się około 9 – 10 dnia od rozpoczęcia ekstrakcji dla jagód
oraz około 7 – 8 dnia dla wiśni. W kolejnych dniach stężenie antocyjanów stopniowo maleje.
Jagody posiadają wyższą aktywność antyoksydacyjną niż wiśnie. Wśród ekstraktów
ze świeżych owoców najwyższą aktywność antyoksydacyjną wykazuje ekstrakt świeżych
jagód w metanolu, najmniejszą zaś ekstrakt z wiśni w wodzie z dodatkiem kwasu
chlorowodorowego.
Ważne jest kontrolowanie jak sposób przechowywania owoców wpływa na zawartość
antocyjanów. Utrwalanie owoców jest procesem bardzo ważnym, ponieważ większość
owoców jest nie jest dostępna przez cały rok. Najmniejszą aktywność antyoksydacyjną wśród
ekstraktów oszacowano dla ekstraktu z dżemu wiśniowego w wodzie oraz z suszonych jagód.
Porównując sposoby utrwalania żywności ze względu na aktywność antyoksydacyjną
najlepsze efekty przyniosła pasteryzacja całych owoców bez dodatku cukru. Dobry sposób
przechowywania żywności stanowi również pasteryzacja soku z owoców. Z kolei najmniej
efektywną metodą przechowywania surowców roślinnych jest suszenie oraz liofilizacja.
Iloraz aktywności antyoksydacyjnej (ilość kwasu galusowego) do zawartości
antocyjanów (ilości malwidyny) w użytych surowcach roślinnych jest stały dla każdego
ekstraktu i wynosi 0,74 +/- 0,03.
Ustalenie tej korelacji pozwala na oszacowanie wartości aktywności antyoksydacyjnej
ekstraktów roślinnych bez konieczności wykorzystywania metody Folina–Ciocaletau.
Literatura
1. Praca zbiorowa pod redakcją W. Grajka: Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty
zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne. WNT, Warszawa, 2007.
2. Antolovich M., Prenzler P. D., Patsalides E., McDonald S., Robards K.: Analyst. 2002, 127,
183–198.
3. Woś A.: Wybrane problemy produkcji żywności i żywienia, Zakład Narodowy
im. Ossolińskich, Warszawa, 1979.
4. Bedner A. E.: Człowiek i żywność. PWN, Warszawa, 1980.
5. Prior R. L., Wu X., Schaich K.: J. Agric. Food Chemistry 2005, 53, 4290-4302.
43
VI. Bibliografia
1. Praca zbiorowa pod redakcją W. Grajka Przeciwutleniacze w żywności, Aspekty
zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne. Warszawa: WNT, 2007.
2. http://www.phytochemicals.info/plants/blueberry.php.
3. T. Krupa K. Tomala. Wpływ warunków przechowywania na zawartość antocyjanów i
aktywnośćprzeciutleniającą jagód borówki wysokiej. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość.
2 (47) Supl. (2006) 171 - 181.
4. J. A. Michiels C. Kevers, J. Pincemail, J. O. Defraigne, J. Dommes. Extraction
conditions can greatly influence antioxidant capacity assays in plant food matrices. Food
Chemistry . 130 (2012) 986–993.
5. Woś A. Wybrane problemy produkcji żywności i żywienia. Warszawa: Zakład Narodowy
im. Ossolińskich, 1979.
6. Piłat B. Biologicznie aktywne substancje pochodzenia roślinnego. Przewodnik do zajęć
laboratoryjnych. Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie. 2010.
7. A. Nawirska A. Sokół-Łętowska, A. Z. Kucharska. Właściwości przeciutleniające
wytłoków z wybranych owoców kolorowych. ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość. 4
(53) (2007) 120 – 125.
8. D. Gumul J. Korus, B. Achremowicz. Wpływ procesów przetwórczych na aktywność
przeciwutleniającą surowców pochodzenia roślinnego. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość.
4 (45) Supl. (2005) 41 – 48.
9. A. Szajdek J. Borowska. Właściwości przeciwutleniające żywności pochodzenia
roślinnego. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość. 4 (41) S (2004) 5 – 28.
10. M. Antolovich P. D. Prenzler, E. Patsalides, S. McDonald, K. Robards. Methods for
testing antioxidant activity. Analyst. 127 (2002) 183–198.
11. Bedner A. E. Człowiek i żywność. Warszawa: PWN, 1980.
12. R. L. Prior X. Wu, K. Schaich. Standardized Methods for the Determination of
Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements. J. Agric. Food
Chemistry. 53 (2005) 4290-4302.
13. Praca zbiorowa pod redakcją W. Grajka. Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty
zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne. Warszawa: WNT, 2007.
14. http://www.phytochemicals.info/orac-values.php.
15. Praca zbiorowa pod redakcją M. Obiedzińskiego. Wybrane zagadnienia z analizy
żywności. Warszawa: Wydawnictwo SGGW, 2009.
16. T. Mazzeo D. N’Dri, E. Chiavaro, A. Visconti, V. Fogliano, N. Pellegrini. Effect of
two cooking procedures on phytochemical compounds, total antioxidant capacity and colour
of selected frozen vegetables. Food Chemistry. 128 (2011) 627–633.
17. Typrowicz J. Metody utrwalania i przechowywania żywności, Materiały dydaktyczne dla
uczniów Zespołu Szkół Gastronomicznych i Przemysłu Spożywczego. Przemyśl. 2006.
18. B. Xu S. K.C. Chang. Effect of soaking, boiling, and steaming on total phenolic content
and antioxidant activities of cool season food legumes. Food Chemistry. 110 (2008) 1–13.
19. C. Oliveira L. F. Anaro, O. Pinho. Cooked Blueberries: Anthocyanin and
Anthocyanidin. J. Agric. Food Chem. 58 (2010) 9006–9012.
20. E. Pijanowski M. Dłużewski, A. Dłużewska. Ogólna Technologia Żywności. Warszawa :
WNT, 1996.
21. Praca zbiorowa pod redakcją Z. E. Sikorskiego. Chemia żywności. Wydanie piąte
zmienione. Warszawa: WNT, 2007.
44
22. K. Robards M. Antolovich. Analytical Chemistry of Fruit Bioflavonoids: A Review.
Analyst. 122 (1997) 11R–34R.
23. Praca zbiorowa pod redakcją Z. E. Sikorskiego. Chemiczne i funkcjonalne właściwości
składników żywności. Warszawa: WNT, 1994.
24. Sigma-Aldrich. Karta charakterystyki Malvidin chloride.
25. J. Tabart C. Kevers, J. Pincemail , J. O. Defraigne, J. Dommesa. Comparative
antioxidant capacities of phenolic compounds measured by various tests. Food Chemistry .
113 (2009) 1226–1233.
26. A. D. Rodarte Castrejo´n I. Eichholz, S. Rohn, L. W. Kroh, S. Huyskens-Keil.
Phenolic profile and antioxidant activity of highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.)
during fruit maturation and ripening. Food Chemistry. 109 (2008) 564–572.
27. E. E. Nicouea S. Savard, K. Belkacemi. Anthocyanins in Wild Blueberries of Quebec:
Extraction and Identification. J. Agric. Food Chem. 55 (2007) 5626-5635.