POLITECHNIKA WARSZAWSKA

WYDZIAŁ CHEMICZNY

Kierunek: TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Joanna Wysiadecka

Przygotowanie surowców roślinnych

do wyznaczania aktywności antyoksydacyjnej

Praca dyplomowa

na stopień inżyniera

wykonana w Katedrze Chemii Analitycznej

Kierująca pracą dr inż. Elżbieta Święcicka-Füchsel

Opiekun naukowy dr. inż Stanisław Kuś

WARSZAWA 2012

2

3

Warszawa,.....................................

........................................................

Nazwisko i imię

........................................................

nr albumu

........................................................

PESEL

Tytuł pracy dyplomowej inżynierskiej

.......................................................................................................................................................

.......................................................................................................................................................

.......................................................................................................................................................

Oświadczenie autora pracy

Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że praca dyplomowa o w/w tytule nie

zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami. Oświadczam

również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych

z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni.

Oświadczam, że wyniki zamieszczone w mojej pracy dyplomowej zostały

sfinansowane i wykonane z wykorzystaniem aparatury i urządzeń będących własnością

Wydziału Chemicznego Politechniki Warszawskiej. Niniejsza praca dyplomowa jest utworem

zbiorowym i jest własnością intelektualną Kierującego pracą, opiekuna naukowego

oraz moją.

Zobowiązuję się, że nie wykorzystam ani nie opublikuję wyników pracy bez zgody

Kierującego pracą i Kierownika Jednostki Wydziału Chemicznego Politechniki Warszawskiej

w której wykonano pracę.

.........................................

Podpis Studenta

..................................................... .................................................

Imię i Nazwisko Kierującego pracą Podpis Kierującego pracą

.............................................................. ....................................................

Imię i nazwisko Opiekuna Naukowego Podpis Opiekuna Naukowego

...........................................................................................

Specjalność

4

5

Spis treści

I. Wstęp .................................................................................................................................. 7

II. Część literaturowa ............................................................................................................. 8

1. Aktywność antyoksydacyjna .............................................................................................. 8

2. Metody wyznaczania aktywności antyoksydacyjnej .......................................................... 9

2.1. Mechanizm HAT ........................................................................................................ 10

2.1.1. Metoda ORAC (ang. oxygen radical absorbance capacity) ................................ 10

2.1.2. Metoda TRAP (ang. total radical trapping antioxidant parametr) ...................... 10

2.2. Mechanizm SET ......................................................................................................... 11

2.2.1. Metoda Folina-Ciocaltau (F-C) ........................................................................... 11

2.2.2. Metoda TEAC (ang. trolox equivalent antioxidant capacity) ............................. 12

2.2.3. Metoda FRAP (ang. ferric ion reducing antioxidant parametr) .......................... 12

2.2.4. Metoda ABTS ..................................................................................................... 12

2.2.5. Metoda DPPH ..................................................................................................... 13

3. Inne metody ...................................................................................................................... 13

4. Przechowywanie żywności ............................................................................................... 14

4.1. Metody fizyczne utrwalania żywności ....................................................................... 15

4.1.1. Utrwalanie przy użyciu niskich temperatur ........................................................ 15

4.1.2. Utrwalanie przy użyciu wysokich temperatur ..................................................... 16

4.1.3. Metody osmoaktywne ......................................................................................... 18

4.2. Metody chemiczne ..................................................................................................... 18

4.3. Metody niekonwencjonalne i skojarzone ................................................................... 18

5. Antocyjany ........................................................................................................................ 19

III. Część doświadczalna ..................................................................................................... 23

1. Odczynniki i aparatura ...................................................................................................... 23

2. Metodyka badań i sposób interpretacji otrzymanych wyników ....................................... 23

3. Przygotowanie surowca roślinnego .................................................................................. 25

4. Badania właściwości antocyjanów ................................................................................... 27

4.1. Malwidynyna, - widmo absorpcji i krzywa wzorcowa .............................................. 28

4.2. Wpływ czasu na zawartość antocyjanów w ekstrakcie .............................................. 30

4.3. Wpływ sposobu przechowywania owoców ............................................................... 33

4.4. Wyznaczanie aktywności antyoksydacyjnej metodą Folina–Ciocaletau ................... 34

6

4.5. Zależność pomiędzy aktywnością antyoksydacyjną a zawartością antocyjanów ..... 37

IV. Wnioski .................................................................................................................... 38

V. Streszczenie ............................................................................................................... 41

VI. Bibliografia .............................................................................................................. 43

7

I. Wstęp

Antyoksydanty, czyli przeciwutleniacze są to substancje, które opóźniają zajście

procesu utleniania związków chemicznych. Nawet ich niewielka ilość może całkowicie

zapobiec reakcjom utleniania substratów [1]. Duża ilość związków przeciwutleniających

znajduje się w owocach jagodowych, przede wszystkim w owocach borówki wysokiej,

nazywanej potocznie czarną jagodą [2]. Różne gatunki oraz odmiany roślin charakteryzują się

szczególną dla nich zawartością związków antyoksydacyjnych [3]. Przeciwutleniacze

występujące w surowcach roślinnych to: kwasy fenolowe, flawonoidy, flawony, polifenole

czy kwas askorbinowy.

Materiał roślinny do badań w niniejszej pracy stanowiły jagody oraz wiśnie. Owoce

jagód są bogate w antyoksydanty. Są to jednak owoce sezonowe, których całoroczne

spożywanie wiąże się z dużymi kosztami. Suszone oraz pasteryzowane produkty mogą być

wybierane ze względu na wygodę oraz długi czas przechowywania.

Celem mojej pracy było sprawdzenie jak utrwalanie wybranych owoców wpływa

na ich aktywność antyoksydacyjną. Owoce w różny sposób utrwalano i przechowywano.

Zastosowano następujące metody utrwalania owoców: pasteryzację, liofilizację oraz suszenie.

Dla porównania wpływu przechowywania sporządzono ekstrakty ze świeżych owoców

oraz poddanych różnym sposobom konserwacji [4].

W ekstraktach zbadano zawartość antocyjanów oraz określono ich aktywność

antyoksydacyjną metodą Folina-Ciocaltau.

8

II. Część literaturowa

1. Aktywność antyoksydacyjna

Możemy wyróżnić dwie grupy antyoksydantów: pierwotne (pierwszorzędowe)

oraz wtórne (drugorzędowe) (Rysunek 1). Przeciwutleniacze pierwotne przerywają reakcję

łańcuchową poprzez przyłączenie się atomu wodoru do wolnego rodnika w wyniku czego

powstają bardziej stabilne związki, już niereaktywne [5]. Z kolei przeciwutleniacze wtórne

wyłącznie opóźniają reakcje utleniania, nie przerywając reakcji łańcuchowej. Dzieje się

to m.in. dzięki: wiązaniu jonów metali (chelatowanie) katalizujących autooksydację,

dezaktywacji tlenu singletowego, absorpcji promieniowania UV [6].

Antyoksydanty dostarczane do organizmu człowieka wraz z żywnością pozwalają

na zapobieganie negatywnym skutkom działania wolnych rodników. Dodatek naturalnych

przeciwutleniaczy do żywności nie jest regulowany przez prawo i nie wymaga zgody na ich

zastosowanie [7]. Jedną z przyczyn badań przeciwutleniaczy pochodzenia naturalnego jest

rozbieżność pomiędzy badaniami klinicznymi a epidemiologicznymi. Pierwsze z nich

nie zawsze potwierdzają korzystne efekty spożywania antyoksydantów, drugie zaś wykazują

zmniejszenie się częstotliwości występowania chorób nowotworowych oraz układu

krwionośnego [8]. Dlatego też przeciwutleniacze odgrywają tak ważną rolę w profilaktyce

i leczeniu m.in. cukrzycy, miażdżycy oraz chorób serca [7].

Rysunek 1. Podział antyoksydantów.

9

Cechą charakterystyczną dla antyoksydantów jest ich potencjał lub pojemność

antyoksydacyjna. Pojemność antyoksydacyjna wyrażana jest najczęściej jako aktywność

antyoksydacyjna. Jest to zdolność do reagowania substancji z substancjami oksydacyjnymi

tzn. z utleniaczami cząsteczkowymi i rodnikowymi. Zdolność ta oznacza opóźnienie działania

danego antyoksydanta na związek o właściwościach utleniających. Aktywność biologiczna

antyoksydantów uwarunkowana jest ich przyswajalnością [9].

2. Metody wyznaczania aktywności antyoksydacyjnej

Istnieje wiele metod pozwalających na obliczenie względnego potencjału

antyoksydacyjnego związków i ich mieszanin.

Metody wyznaczania zdolności antyoksydacyjnej związków można podzielić

na addycyjne (pierwotne) i postaddycyjne (wtórne) (Rysunek 2). Metody pierwotne polegają

na opóźnieniu procesu oksydacyjnego zachodzącego w mieszaninie reakcyjnej w obecności

antyoksydantów. Metody wtórne polegają na reakcji badanej substancji z określoną ilością

przeciwutleniacza i oznaczeniu jego zawartości po pewnym czasie. Pozostała ilość

przeciwutleniacza jest odwrotnie proporcjonalna do aktywności przeciwutleniacza [5; 10].

Wyznaczona aktywność antyoksydacyjna wyrażana jest poprzez całkowity potencjał

oksydacyjny (ang. total activity control – TAC).

Rysunek 2. Podział metod wyznaczania aktywności antyoksydacyjnej.

Dezaktywacja przeciwutleniaczy może przebiegać według dwóch mechanizmów:

mechanizmu przeniesienia atomu wodoru – HAT (ang. hydrogen atom transwer) oraz według

mechanizmu przeniesienia pojedynczego elektronu – SET (ang. single electron transfer). Oba

mechanizmy mogą zachodzić jednocześnie, ale jeden z nich ma zawsze charakter dominujący.

Mają na to wpływ czynniki związane z właściwościami danego związku oraz środowisko

reakcji [11]. Efekt końcowy obydwu mechanizmów jest zawsze taki sam [12].

10

2.1. Mechanizm HAT

Mechanizm HAT zachodzi w rozpuszczalniku, niezależnie od jego pH. Trwa on

od kilku sekund do kilku minut, dlatego też aktywność jest liczona w stosunku do kinetyki

reakcji. Obecne w rozpuszczalniku reduktory mogą być przyczyną widocznych zmian

reaktywności. Do metod HAT należą m. in. metoda ORAC (ang. oxygen radical absorbance

capacity) oraz TRAP (ang. total radical trapping antioxidant parametr). Mechanizm HAT

przebiega w następujący sposób [12]:

gdzie: AH - związek będący donorem atomu wodoru, - wolny rodnik.

2.1.1. Metoda ORAC (ang. oxygen radical absorbance capacity)

Metoda ta służy do oznaczania zdolności absorpcji rodników tlenowych. Znalazła ona

zastosowanie do pomiaru aktywności przeciwutleniaczy hydrofilowych.

Rejestrowany w tej metodzie jest spadek fluorescencji, spowodowany uszkodzeniem

chemicznym sondy molekularnej. Traci ona swoje właściwości fluorescencyjne w wyniku

reakcji z termicznie generowanymi rodnikami nadtlenkowymi (pochodzącymi z AAPH [2,2’-

diazobis (2-amidinopropan) dichlorowodorku] – związek azowy). Jako sonda molekularna

jest wykorzystywana m.in. fluoresceina czy dichlorofluoresceina. W tej metodzie aktywność

oksydacyjna jest wyznaczana na podstawie integracji pola powierzchni między krzywymi

fluorescencji dla próbki badanej oraz ślepej próby [13; 14]. Metoda ta pozwala na oznaczanie

aktywności związków o właściwościach przeciwutleniających rozpuszczonych w tłuszczach

czy wodzie [15].

W celu określenia aktywności antyoksydacyjnej wyznacza się krzywą fluorescencji dla próbki

badanej oraz dla ślepej próby, a następnie integruje się pole powierzchni pomiędzy nimi. Pole

powierzchni oznaczane jest jako AUC (ang. area under curve) [13]. Pomiar metodą ORAC

trwa około godziny [5].

2.1.2. Metoda TRAP (ang. total radical trapping antioxidant parametr)

Metoda TRAP pozwala oznaczyć całkowitą zdolność wychwytywania wolnych rodników.

Mierzony jest spadek fluorescencji białka R-fikoerytyny (R-PE). Dzieje się tak w wyniku

działania rodników nadtlenkowych ROO•, które są generowane są w wyniku rozpadu AAPH.

Przeciwutleniacz znajdujący się w mieszaninie reakcyjnej powoduje opóźnienie zaniku

11

fluorescencji roztworu proporcjonalnie do ich potencjału antyoksydacyjnego [13]. Reakcje

zachodzące w tej metodzie są bardzo podobne do zachodzących w mechanizmie ORAC [5].

Sonda R-PE reaguje 100 razy wolniej przerywając łańcuch reakcji wolnorodnikowych,

niż przeciwutleniacze posiadające tę zdolność [13]. Czas, w którym substancja badana

jest indukowana porównuje się z czasem indukcji troloksu [15].

2.2. Mechanizm SET

W mechanizmie SET mieszaninę reakcyjną stanowi antyoksydant i utleniacz. Barwa

związku o właściwościach redukcyjnych ulega zmianie w wyniku zmiany stopnia utlenienia.

Punkt końcowy jest rejestrowany w momencie osiągnięcia stabilnej barwy. Zmiana

absorbancji w funkcji stężenia antyoksydanta w próbce stanowi zależność liniową. Uzyskane

wyniki przelicza się najczęściej na równoważnik troloksu [13].

Mechanizm SET można opisać następującymi reakcjami [12]:

(1)

(2)

(3)

(4) ( ) ( )

gdzie: AH - związek będący donorem atomu wodoru, - wolny rodnik.

Mechanizm SET jest znacznie wolniejszy niż mechanizm HAT. W celu określenia

aktywności antyoksydacyjnej w obliczeniach wykorzystuje się procentowy spadek ilości

produktu. Mechanizm SET jest wykorzystywany w następujących metodach: TEAC, FRAP

(ang. ferric ion reducing antioxidant parametr), Folina-Ciocalteau, z zastosowaniem

odczynnika ABTS (2’-azynobis(3-etylobenzenotiazolino-6-sulfonianu)) oraz DPPH (2,2-

difenylo-1-pikrylohydrazylu) [13].

2.2.1. Metoda Folina-Ciocaltau (F-C)

Odczynnik F-C ulega redukcji w wyniku przeniesienia elektronu. W skład odczynnika

Folina-Ciocaltau wchodzą wolframnian sodu (Na2WO4), molibdenian sodu (Na2MoO4),

siarczan litu (Li2SO4), woda bromowa oraz stężony kwas solny oraz kwas fosforowy. Niestety

struktura otrzymanego związku nie została jeszcze w pełni zidentyfikowana. Podejrzewa się,

że w wyniku reakcji tworzy się heteropolifosfowolframian molibdenu.

12

Odczynnik F-C reaguje z wieloma związkami posiadającymi właściwości

przeciwutleniające.

Podczas oznaczania związków fenolowych tą metodą środowisko reakcji musi być alkaliczne.

Otrzymuje się to poprzez dodatek węglanu sodu do badanego roztworu. Następnie zachodzi

dysocjacja fenolowego protonu oraz powstaje anion fenolowy o zdolnościach redukcyjnych.

Związki fenolowe z odczynnikiem F-C tworzą niebieskie zabarwienie niezależnie

od struktury fenoli [13].

Metodą tą oznaczane są głównie polifenole. Inne związki, które mogą być reagować

z odczynnikiem: cukry, aminy aromatyczne, kwas askorbinowy, aminokwasy, białka czy

mocznik. Jest to metoda prosta, odznaczająca się dużą czułością i dokładnością.

2.2.2. Metoda TEAC (ang. trolox equivalent antioxidant capacity)

W metodzie tej oznaczany jest potencjał antyoksydacyjny w przeliczeniu na ilość

równoważników Troloksu – TE (pochodna witaminy E) na jednostkę masy badanej próbki

[15]. Troloks reaguje z rodnikiem ABTS* [rodnik 2,2’-azynobis(3-etylobenzenotiazolino-6-

sulfonian)] [13]. Rejestrowane jest wygaszanie przez antyoksydanty charakterystycznego

pasma absorpcji ABTS* (λ=734 nm). Zaletą tej metody jest możliwość stosowania jej

zarówno w środowisku kwaśnym, jak i zasadowym [15].

2.2.3. Metoda FRAP (ang. ferric ion reducing antioxidant parametr)

Metoda FRAP pozwala na oznaczanie zdolności redukcyjnej badanej substancji

w stosunku do jonów żelaza(III) zawartych w TPTZ (kompleks żelazowo-2,4,6-tripirydylo-S-

triazyny). Powstały produkt ma barwę niebieską z maksimum absorpcji przy długości fali

λ=595 nm.

( ) ( )

Aktywność przeciutleniająca wyliczana jest na podstawie różnicy absorbancji analizowanej

próbki i absorbancji wyznaczonej dla wzorca Fe(II). Wyznaczona wartość ΔA próbki

jest wprost proporcjonalna do stężenia przeciwutleniacza [13].

2.2.4. Metoda ABTS

W tej metodzie wykorzystywany jest Kationorodnik, ABTS•+

który może powstawać

w reakcjach chemicznych oraz enzymatycznych. Główna reakcja zachodzi między ABTS

13

i nadsiarczanem potasu, w wyniku której tworzy się kationorodnik. Do otrzymanego roztworu

ABTS•+

dodawane są przeciwutleniacze. Następnie zachodzi redukcja rodnika

oraz odbarwienie roztworu. Zmiana barwy roztworu jest proporcjonalna do zawartości

antyoksydantów w roztworze. Zawartość przeciwutleniaczy w badanych próbkach wyrażona

jest w ilości równoważników troloksu na jednostkę objętości lub masę próbki (TEAC).

2.2.5. Metoda DPPH

Metoda polega na użyciu związku DPPH, który jest stabilnym rodnikiem azowym.

Roztwory tego związku mają kolor purpurowy z maksimum absorpcji przy 515 nm. W reakcji

z utleniaczami zmienia się barwa roztworu. Postęp reakcji jest monitorowany

spektrofotometrycznie przez pomiar absorbancji w λmax. Ilość rodnika DPPH, która nie

przereagowała wylicza się z równania:

,

gdzie: - ilość nieprzereagowanego DPPH, -początkowa ilość DPPH.

Ilość pozostałego DPPHrem, który nie uległ reakcji jest proporcjonalna do stężenia

przeciwutleniacza oraz stężenia powodującego spadek początkowego stężenia rodnika o 50%,

jest określana jako parametr EC50. Czas potrzebny do zajścia tego procesu jest wyznaczany

z krzywej kinetyki reakcji i określany jako parametr TEC50. W celu wyznaczenia aktywności

antyoksydacyjnej określa się sprawność przeciwrodnikową AE (ang. antiradical efficiency)

[13].

gdzie: AE - sprawność przeciwrodnikowa, EC50 - stężenie DPPH powodujące spadek

początkowego stężenia rodnika o 50%, - czas, po którym stężenie DPPH zmniejszy się

o 50%.

3. Inne metody

Wyróżniamy również metody nieprzebiegające ani według mechanizmu HAT, ani SET. Taką

metodą jest m.in. metoda TOSC (ang. total oxidant scavenging capacity) [13].

14

Metoda TOSC (ang. total oxidant scavenging capacity)

Metoda ta służy do oznaczania całkowitej zdolności wychwytywania rodników

tlenowych. W badanej próbce oznaczana jest ilościowo zdolność antyoksydacyjna w stosunku

do trzech związków. Są nimi silne utleniacze: rodniki hydroksylowe, rodniki nadtlenkowe

oraz rodniki generowane w wyniku termicznej hemolizy związku ABAP. Substratem reakcji

jest KMBA (kwas-α-ketono--γ-metiolobutanowy), który ulega utlenieniu do etylenu. Analiza

fazy nadpowierzchniowej pozwala na śledzenie czasu tworzenia etylenu przy użyciu techniki

chromatografii gazowej. Zdolność antyoksydacyjną badanej próbki oznacza się jako zdolność

zawartych w niej przeciwutleniaczy spowolniających powstawanie etylenu. Odnośnikiem

jest próbka nie zawierająca przeciwutleniacza.

Wyznaczany jest parametr TOSC (zależność wartości pola powierzchni piku etylenu

w funkcji czasu) [13]. Reakcja może trwać nawet do 300 minut. Niestety wyznaczany

parametr TOSC nie jest liniową zależnością [5].

∫

∫

∫ - pole powierzchni pod krzywą kinetyki reakcji tworzenia etylenu w obecności próbki

∫ -pole powierzchni pod krzywą kinetyki reakcji kontrolowanej tworzenia etylenu [13].

4. Przechowywanie żywności

Istnieje wiele metod pozwalających na utrwalanie żywności, w tym owoców oraz warzyw.

Czynności te są niezbędne, gdyż świeżego pożywienia jest za mało w stosunku

do zapotrzebowania. Oprócz tego w dzisiejszych czasach konsumenci są bardziej świadomi

pozytywnych efektów spożywania owoców. Ludzie nie mają zbyt dużo czasu

na przygotowanie świeżych owoców, dlatego też spożywają produkty przetworzone [16].

Konserwacja żywności ma na celu zahamowanie rozwoju bakterii

oraz drobnoustrojów, które bardzo łatwo się namnażają w nieodpowiednich warunkach

przechowywania. Na warunki te może wpływać temperatura, wilgotność powietrza, światło,

a także czas przechowywania. Większość procesów chemicznych oraz biochemicznych

zachodzących w żywności powinno zostać wstrzymane lub w znacznym stopniu zmniejszone.

Zmianie nie powinny ulegać właściwości fizyczne żywności. Gdy utrwalana żywność będzie

przechowywana w odpowiednich warunkach wzrost drobnoustrojów zostanie zahamowany

15

[17]. Przetwórstwo spożywcze wpływa również na zwiększenie biodostępności składników

odżywczych [18].

Wśród metod utrwalania żywności można wyróżnić metody fizyczne, chemiczne

oraz biologiczne (Rysunek 3). Wiele z nich opiera się na całkowitym zniszczeniu

drobnoustrojów w żywności poddanej obróbce. Efekt ten można otrzymać poprzez

zwiększenie lub zmniejszenie temperatury, jak również poprzez zastosowanie czynników

chemicznych lub promieniowania jonizującego [17].

Rysunek 3. Podział metod utrwalania żywności.

4.1. Metody fizyczne utrwalania żywności

4.1.1. Utrwalanie przy użyciu niskich temperatur

Jedną z najbardziej znanych metod utrwalania żywności jest konserwacja

z wykorzystaniem niskich temperatur. Utrwalanie żywności przy użyciu niskich temperatur

dzieli się na chłodzenie oraz mrożenie, a także liofilizację. Metoda ta jest często stosowana,

ponieważ jest prosta oraz nie wymaga dużych kosztów. Jedynie do przeprowadzenia

liofilizacji potrzebna jest odpowiednia aparatura.

a ) Chłodzenie

W niskich temperaturach zmniejsza się znacznie szybkość zachodzących procesów

biologicznych, co pozwala na przedłużenie okresu przydatności pożywienia. Możemy

16

wyróżnić chłodzenie żywności, które polega na przechowywaniu jedzenia w obniżonej

temperaturze od około 0°C do 10°C. Każdy rodzaj pożywienia posiada swój optymalny

zakres temperatur do przechowywania. Przykładem mogą być warzywa oraz owoce,

przechowywanie ich w nieodpowiednich temperaturach może powodować na ich powierzchni

uszkodzenia chłodnicze [17].

b) Mrożenie

Mrożenie polega na przechowywaniu żywności w temperaturach poniżej 0 °C.

Najczęściej jest to temperatura ok. -25 °C. Szybkie zamrażanie powoduje niewielkie starty

wartości odżywczych. Tak zakonserwowana żywność może być długo przechowywana.

Woda, która jest zawarta w zamrażanym pożywieniu zamienia się w lód, co hamuje rozwój

drobnoustrojów i procesów mogących zachodzić w temperaturach dodatnich [17].

c) Liofilizacja

Oprócz suszenia kontrolowanego możemy wyróżnić również suszenie sublimacyjne,

nazywane liofilizacją. W pierwszym etapie żywność zostaje zamrożona. Jest to główny

warunek zajścia procesu. Kolejno żywność zostaje umieszczona w komorze pod niskim

ciśnieniem, w której lód ulega sublimacji (przejście ze stanu stałego do stanu pary,

z pominięciem fazy ciekłej). Końcowy produkt jest suchy, ale nie zamrożony [15]. Suszenie

żywności ze stanu zamrożonego czyni tę metodę nieinwazyjną, nie uszkadzającą żywności

[17]. Liofilizacji poddawane zostaje pożywienie o wrażliwej strukturze, aromacie

oraz wysokiej cenie [11]. Żywność zliofilizowana powinna być przechowywana

w odpowiednich pojemnikach, gdyż jest higroskopijna [17].

4.1.2. Utrwalanie przy użyciu wysokich temperatur

Możemy utrwalać żywność przy użyciu wysokich temperatur, co jest bardzo często

wykorzystywane. Wśród nich wyróżniamy: pasteryzację, suszenie oraz zagęszczanie. Metody

te nie wymagają korzystania ze skomplikowanej aparatury [17].

a) Pasteryzacja

Pasteryzacja polega na poddaniu żywności działaniu wysokiej temperatury,

nieprzekraczającej jednak 100 °C. Ma to na celu zabicie drobnoustrojów znajdujących się

w żywności [19].

17

Wyróżniamy trzy rodzaje pasteryzacji: niską, momentalną oraz wysoką. W pasteryzacji

niskiej żywność jest poddawana gotowaniu w temperaturach nie przekraczających 65 °C,

w czasie około 25 minut. Z kolei pasteryzacja momentalna polega na poddaniu żywności

działaniu wysokiej temperatury, około 90 °C, a następnie szybkiemu schłodzeniu.

Pasteryzacja wysoka charakteryzuje się bardzo wysoką temperaturą, czasem sięgającą nawet

100 °C. Może ona trwać od kilkunastu sekund do kilkudziesięciu minut.

Wysoka temperatura zabija również formy przetrwalnikowe bakterii, więc mamy pewność,

że żywność pozostanie długo świeża. W procesach pasteryzacji ważną rolę odgrywają

odpowiednie pojemniki na żywność. Jeśli pozostaną hermetycznie zamknięte przed

gotowaniem, to żywność będzie przechowywana w warunkach beztlenowych, które znacznie

poprawią warunki jej przechowywania [17].

b) Suszenie

Jednym z głównych sposobów utrwalenia żywności jest jej suszenie poprzez odwodnienie

[15]. Polega ono na zmniejszeniu zawartości wody w żywności do około 15%, a czasem

poniżej 5% [20]. Jest to proces powolny. Suszenie może być przeprowadzone przy użyciu:

- podwyższonej temperatury w warunkach domowych oraz laboratoryjnych,

- w przeciwprądzie gorącego powietrza drobno rozpylonych cząsteczek płynu,

- za pomocą promieni podczerwonych,

- w próżni pod zmniejszonym ciśnieniem.

Woda ulega odparowaniu, co hamuje rozwój drobnoustrojów [17]. W tym czasie rozkładowi

mogą ulegać również składniki odżywcze. Niekorzystne procesy, które mogą wtedy

zachodzić to m.in.: utlenianie (witamin, autooksydacja tłuszczu, substancji zapachowych),

zmiana barwy, utrata zdolności do rehydratacji oraz rozpuszczania się w wodzie [20].

Wadą suszenia jest otrzymywanie żywności o innej konsystencji, niż wyjściowa, a także

zmiana smaku otrzymanej w ten sposób żywności [17].

c) Zagęszczanie

Zagęszczanie polega na zmniejszeniu zawartości wody w substancjach płynnych

poddanych takiej obróbce. Zawartość wody lub innego rozpuszczalnika znacznie się

zmniejsza w wyniku odparowania. Zwykle zawartość wody na końcu procesu wynosi około

30% [17].

18

4.1.3. Metody osmoaktywne

Przykładem metod osomoaktywnych utrwalania żywności jest zwiększenie koncentracji

sacharozy lub chlorku sodu w przechowywanych produktach. Dodawane do przetworów

substancje zwiększają ciśnienie osmotyczne przechowywanej żywności [17]. Dodany cukier

wiąże wodę, która staje się niedostępna dla bakterii [15].

W wyniku dodatku cukru do owoców mogą powstawać dżemy, konfitury oraz marmolady.

Stężenie sacharozy przewyższające 60% powoduje odwodnienie komórek drobnoustrojów.

Odpowiednio zapasteryzowane słoiki z dżemami mogą być przechowywane wiele miesięcy.

Z kolei konserwujące właściwości chlorku sodu są widoczne przy stężeniu soli 12 – 16%.

Dodatek tej substancji silnie odwadnia środowisko hamując rozwój drobnoustrojów [17].

4.2. Metody chemiczne

Metody chemiczne wykorzystują dodatek niewielkiej ilości związków chemicznych

(konserwantów) do przechowywanej żywności. Pozwalają one na zahamowanie rozwoju

drobnoustrojów. Zaletą dodawanych związków jest brak negatywnego wpływu na organizm

człowieka, a także na walory smakowe utrwalanej żywności.

Do środków chemicznych pozwalających na utrwalanie półprzetworów zalicza się: ditlenek

siarki, kwas benzoesowy, kwas mrówkowy oraz kwas sorbowy. Z kolei czynnikiem

konserwującym w marynowanych warzywach oraz owocach jest kwas octowy z dodatkiem

kwasu mlekowego. W zależności od postaci końcowego produktu można używać różnych

ilości kwasu octowego (od 0,5% do 0,8%). Można również stosować dodatek kwasów

nieorganicznych, ale w ograniczonych ilościach. Polega ono głównie na zakwaszaniu

napojów chłodzących, gazowanych oraz niegazowanych. Nawet niewielka ilość kwasu

pozwala na skuteczne zapobieganie rozwojowi bakterii oraz drożdży. Innym znanym

dodatkiem konserwującym jest dwutlenek węgla stosowany do różnych napojów

gazowanych, a także alkoholowych.

4.3. Metody niekonwencjonalne i skojarzone

Niekonwencjonalne metody utrwalania żywności są rzadko spotykane, wykorzystane

są w nich interesujące rozwiązania techniczne. Do takich metod zalicza się: pulsujące światło,

pulsujące pole magnetyczne, promieniowania jonizujące oraz nadfioletowe, drgania

dźwiękowe i naddźwiękowe, działanie wysokiego ciśnienia hydraulicznego.

19

Z kolei w metodach skojarzonych wykorzystywanych jest kilka procesów pozwalających

na utrwalenie żywności, takich jak: ogrzewanie, chłodzenie, mrożenie czy suszenie. Mogą się

one odbywać zarówno jednocześnie, jak i zachodzić w odpowiedniej kolejności. Metoda

ta przynosi bardzo dobre rezultaty, gdyż może zagwarantować odpowiednią trwałość

produktów. Wykorzystanie kilku procesów jednocześnie pozwala na otrzymanie pożądanego

utrwalenia żywności [17].

5. Antocyjany

Antocyjany są liczną grupą barwników roślinnych, odpowiadających za różne odcienie

czerwieni oraz fioletu wielu owoców oraz kwiatów [21; 22].

W klasyfikacji są jedną z grup związków należących do flawonoidów. Charakteryzują się one

pierścieniem heterocyklicznym C6-C3-C6. Zaliczane są do nich: aglikony (antocyjanidyny)

oraz ich glikozydy (antocyjaniny). Wszystkie te związki są pochodnymi kationu

flawyliowego – 2-fenylobenzopiryliowego (Rysunek 4), który występuje w formie soli

karboniowych oraz oksoniowych. Druga ze struktur jest bardziej trwała oraz stanowi formę

dominującą.

Rysunek 4. Wzór strukturalny kationu flawyliowego.

Antocyjany różnią się między sobą oraz miejscem, w którym występuje podstawnik.

Poznanych antocyjanidyn jest ok. 20, jednak tylko niewielka ich część jest rozpowszechniona

w żywności pochodzenia roślinnego (Tabela 1).

Struktura barwników antocyjanowych jest bardzo zróżnicowana. Antocyjany występują

w postaci mono-, di- lub triglikozydów w produktach naturalnych. Reszty glikozydowe

występują najczęściej w pozycji 3, rzadziej w 5 lub 7. Barwniki, które występują w ściśle

określonych częściach rośliny są charakterystyczne dla danej odmiany. Ich liczba może się

wahać od kilku do kilkunastu [23].

20

Tabela 1. Aglikony najczęściej występujące w barwnikach antocyjanowych.

Antocyjanidyny R3’ R5’ λmaksimum [nm]

Pelargonidyna (Pg)

Cyjanidyna (Cy)

Delfinidyna (Dp)

Peonidyna (Pn)

Petunidyna (Pt)

Malwidyna (Mv)

-H

-OH

-OH

-OCH3

-OCH3

-OCH3

-H

-H

-OH

-H

-OH

-OCH3

520

535

546

532

543

542

Antocyjany są związkami niestabilnymi w roztworach. Ulegają odwracalnym przemianom

w środowisku wodnym w wyniku czego zmianie ulega ich barwa. W środowisku słabo

kwaśnym lub obojętnym występują w równowadze cztery formy barwników. Są nimi kation

flawyliowy AH+, zasada chinoidowa - A, pseudozasada karbinolowa - B oraz chalkon - C.

( ) ( )

( ) ( )

( ) ( )

Szybkość z jaką zachodzą te przemiany jest bardzo zróżnicowana. W dużym stopniu zależy

ona od struktury antocyjanów. Powyższe reakcje są endotermiczne. Najszybciej zachodzi

reakcja przeniesienia wodoru (reakcja 1), zaś najwolniejsza jest reakcja przemiany zasady

karbinolowej w chalkony (reakcja 3). Reakcja 2 przebiega niezależnie od pH. Równowaga

pomiędzy czterema opisanymi formami antocyjanów zależy od pH. Przy pH < 0,5 występuje

jedynie kation flawyliowy. Wraz ze wzrostem pH maleje udział tego kationu, a rośnie udział

bezbarwnej pseudozasady, w wyniku czego stopniowo zanika czerwona barwa. Przy pH > 4

kation flawyliowy zanika. Stężenie zasady chinoidowej oraz chalkonu jest niewielkie, zaś

formą dominującą w zakresie pH od 4 do 6 jest bezbarwna pseudozasada karbinolowa [21].

Jest to spowodowane faktem, iż stała równowagi reakcji hydratacji Kh jest znacznie wyższa

od reakcji przeniesienia protonu Ka. Dlatego też w celu uzyskania lepszej stabilności

barwnego kationu flawyliowgo należy obniżyć Kh lub zmniejszyć udział wody dostępnej

dla ataku nukleofilowego. Stąd suszenie, zagęszczanie czy zwiększanie zawartości cukru

w owocach powoduje wzrost trwałości barwy antocyjanów (poprzez obniżenie aktywności

wody) [23].

21

Antocyjany mogą ulegać procesom kopigmentacji, czyli tworzeniu się kompleksów

z innymi związkami. Należą do nich: flawanole, flawonole, alkaloidy, aminy, kwasy

fenolowe oraz same antocyjany. Proces kopigmentacji ma duży wpływ na odcień

oraz stabilność barw roślin, zawierających antocyjany. W wyniku procesu kopigmentacji

następuje zwiększenie intensywności barwy (efekt hiperchromowy) oraz przesunięcie

maksimum absorpcji w kierunku fal długich (efekt batochromowy). Proces zależy

od struktury, stosunku stężeń barwnika oraz kopigmentu, pH roztworu, składu

rozpuszczalnika oraz temperatury. Optymalne pH dla procesu wynosi około 3,5. W tym

zakresie stężeń zachodzi przyłączenie kopigmentu do kationu flawyliowego lub zasady

chinoidowej. Wartość pH stabilizuje barwę, ponieważ utrudnia atak nukleofilowy cząsteczki

wody na węgiel w pozycji 2, w wyniku czego równowaga reakcji hydratacji zostaje

przesunięta w kierunku wyższego pH.

Barwa produktów pochodzenia naturalnego, zawierających antocyjany zależy

od wielu czynników. Jest nim struktura oraz zawartość poszczególnych barwników. Wzrost

liczby grup hydroksylowych w pierścieniu B związku pozwala na zajście efektu

hiperchromowego oraz batochromowego. Z kolei zastąpienie grup hydroksylowych grupami

metoksylowymi powoduje cofnięcie się wcześniej opisanych zjawisk.

Również glikozydacja powoduje wzrost trwałości antocyjanów (poprzez acylację reszt

glikozydowych w środowisku kwaśnym). Dzieje się tak, gdyż cząsteczka jest stabilizowana

nowopowstałymi wiązaniami wodorowymi oraz hydrofobowe oddziaływanie pomiędzy

pierścieniami antocyjaniny oraz aromatycznymi pierścieniami grup acylujących.

Kopigmentacja jest ważną reakcją w stabilizacji barwy kwiatów oraz owoców. Niestety nie

znalazła ona zastosowania do utrwalania zabarwienia przetworów. Powodem jest potrzeba

użycia dużego nadmiaru kopigmentu w stosunku do barwnika. Jest to nieopłacalne oraz może

powodować zmiany właściwości organoleptycznych.

Zmiana barwy produktów zawierających antocyjany może być wynikiem reakcji

kompleksowania antocyjanów z jonami metali m.in. Fe3+

, Sn2+

, Al3+

. Takie kompleksy

najczęściej składają się z dwóch cząsteczek barwnika oraz dwóch innych ligandów.

Prawdopodobnie tak zbudowane kompleksy odgrywają ważną rolę w bogatej gamie

zabarwienia kwiatów.

Reakcje z jonami metali w żywności przynoszą efekty negatywne, barwa produktów ulega

zmianie, a także mogą wytrącać się osady.

Reakcja antocyjanów z siarczanami(IV) również powoduje zmianę barwy roztworu. Reszta

siarczanu(IV) przyłącza się do węgla w pozycji 4. Otrzymana forma nie jest jednak trwała

22

i ulega rozkładowi podczas wzrostu temperatury, powracając do czerwonej barwy. Takie

procesy zachodzą podczas produkcji dżemów z owoców, które były utrwalane ditlenkiem

siarki.

Nieodwracalne reakcje antocyjanów są wynikiem procesów oksydatywnej

polimeryzacji. Powoduje ona zmianę naturalnej barwy owoców na czerwonobrunatną, która

charakteryzuje owoce długo przechowywane. Zmiany te zależą przede wszystkim od

inicjatorów procesów utleniania, które są zawarte w żywności oraz czasu jego działania.

Pierwszym etapem jest rozdrobnienie owoców, w którym duże znaczenie ma aktywność

enzymów zawartych w surowcu. Kolejne etapy utleniania przebiegają bez obecności

enzymów. W celu opóźnienia degradacji barwników stosowany jest dodatek inhibitorów

enzymów (np. ditlenek siarki) oraz blanszowanie (zanurzenie produktu na kilkadziesiąt

sekund we wrzątku, a następnie włożenie do zimnej wody).

Do substancji powodujących przyśpieszenie nieodwracalnych procesów degradacji

antocyjanów zalicza się: tlen, fenylooksydazy, jony metali katalizujące procesy utleniania,

kwas askorbinowy oraz produkty jego degradacji.

Z kolei ogrzewanie owoców podczas zagęszczania oraz termicznego utrwalania powoduje

wzrost szybkości reakcji oksydatywnej polimeryzacji oraz zmianę barwy przetworów.

Krótkotrwałe ogrzewanie produktów owocowych (kilkanaście minut w temperaturze 100 ˚C)

nie powoduje widocznych zmian barwy. Również długoterminowe przechowywanie

w chłodniach powoduje jedynie niewielkie zmiany barwy owoców [21].

23

III. Część doświadczalna

1. Odczynniki i aparatura

W niniejszej pracy wykorzystano następujące odczynniki:

alkohol metylowy, cz.d.a., POCh,

alkohol etylowy, cz.d.a., POCh,

kwas chlorowodorowy, 36%, cz.d.a., POCh,

kwas mrówkowy, 85%, cz.d.a., POCh,

odczynnik Folin-Ciocalteu, 2N, Sigma Aldrich,

malwidyna, Sigma Aldrich,

węglan sodu, cz.d.a., POCh.

Korzystano także z następującej aparatury:

spektrofotometr UV/VIS, Perkin Elmer Lambda 20 (kiuweta kwarcowa

o drodze optycznej 1 cm),

spektrofotometr M 40 Specord,

suszarka, SML 32/350 Zaimel,

liofilizator, CHRIST Alpha 1-2/LD-2.

Obróbka zarejestrowanych spektrofotometrycznie widm została wykonana za pomocą

arkusza kalkulacyjnego Microsoft Excel „Spektrofotometria” wykonanego na potrzeby

Wydziału Chemicznego Politechniki Warszawskiej przez firmę KLIP.

2. Metodyka badań i sposób interpretacji otrzymanych wyników

Celem mojej pracy było zbadanie wpływu sposobu przygotowania i przechowywania

surowców roślinnych na ich aktywność antyoksydacyjną oraz zawartość antocyjanów.

Surowiec roślinny stanowiły świeże owoce jagody czarnej oraz wiśnie.

Przygotowanie surowca było najważniejszą częścią badań. Jagody oraz wiśnie utrwalano

różnymi sposobami. Jagody poddawano suszeniu, liofilizacji, sporządzono z nich również

przetwory, a część owoców pozostawiono świeże. Z kolei z wiśni sporządzono dżemy

oraz badano świeże owoce.

24

Owoce każdego gatunku były zebrane w tym samym okresie oraz pochodziły z tych samych

partii. Przygotowanie próbek polegało na sporządzeniu ekstraktów ze świeżych

oraz zakonserwowanych owoców. Ekstrakty umożliwiły przeprowadzenie (wydobycie)

związków zawartych w użytym surowcu do roztworu. Pozwoliło to na określenie zawartości

oraz aktywności antyoksydacyjnej związków o właściwościach przeciwutleniających, które

stanowiły antocyjany. Następnie ekstrakty były odpowiednio rozcieńczane do pomiarów

spektrofotometrycznych. Dzięki temu możliwe było oznaczanie antocyjanów w badanych

surowcach.

Wszystkie ekstrakty roślinne przygotowano w następujący sposób:

odważano określoną ilość owoców, przenoszono do kolby stożkowej

(o pojemności 100 mL dla jagody czarnej lub 250 mL dla wiśni),

owoce ekstrahowano odpowiednią ilością zakwaszonego rozpuszczalnika

w temperaturze ok. 25 ˚C w zaciemnionym miejscu w celu bardziej efektywnego

procesu ekstrakcji,

ekstrakt z owocami pozostawiono na odpowiedni okres czasu,

próbkę ekstraktu o objętości 20 μL rozcieńczano roztworem alkoholu metylowego

zakwaszonego 1% kwasem chlorowodorowym do objętości 1 mL,

rejestrowano widmo absorpcji w zakresie długości fal 200-700 nm.

Metodyka przygotowania próbek ze świeżych owoców została przedstawiona

w tabeli 2. Informacje zebrane w tej tabeli pozwoliły w późniejszym etapie pracy

na określenie najlepszych warunków prowadzenia ekstrakcji. Z kolei sposób przygotowania

ekstraktów z owoców w różny sposób przetworzonych przedstawiono w tabeli 3.

Na podstawie obliczonej zawartości antocyjanów oraz określania aktywności

antyoksydacyjnej w surowcach roślinnych wybrano optymalny rozpuszczalnik oraz kwas do

przeprowadzania ekstrakcji.

Jako ekstrahent stosowano alkohol metylowy, etylowy lub wodę z dodatkiem kwasu

chlorowodorowego lub mrówkowego. Do przygotowania niektórych ekstraktów używano

również mieszaninę alkoholu z wodą w różnych proporcjach.

25

Tabela 2. Sposób przygotowania próbek ekstraktów ze świeżych owoców.

rodzaj

owoców

oznakowanie

roztworu

masa

owoców

/g

rodzaj rozpuszczalnika objętość

rozp./ mL ja

goda

czar

na

JA 25 EtOH + 1% stęż. HCl 75

JB 25 MeOH + 1% stęż. HCl 75

JC 25 80% MeOH + 20% H2O+ 1% stęż.

HCl 60

JD 25 80% MeOH + 20% H2O+ 2% stęż.

HCl 60

JE 18 MeOH + 4% stęż. HCl 30

wiś

nia

WA 70 MeOH + 2% stęż. HCl 100

WB 70 H2O + 2% stęż. HCl 100

WC 70 H2O + 2% HCOOH 100

3. Przygotowanie surowca roślinnego

Istnieje wiele sposobów utrwalania żywności. W niniejszej pracy zostało wykorzystane

kilka z metod najczęściej wykorzystywanych w warunkach domowych, a także

przemysłowych.

3.1. Suszenie jagód

Jednym ze sposobów przygotowania jagód było suszenie. Jagody zostały umieszczone

w uprzednio zważonej parownicy. Do suszenia wzięto około 120 g jagód, które suszono

do stałej masy w suszarce do owoców, a następnie w suszarce laboratoryjnej w temperaturze

100 °C, do otrzymania stałej masy. Jagody suszono około 30 minut, a następnie pozostawiano

26

na 20 minut w eksykatorze. Tę czynność powtarzano czterokrotnie. Jagody były każdorazowo

ważone. Ostatecznie masa jagód wyniosła ok. 18 g, co stanowiło 15% świeżych jagód.

3.2. Sporządzenie przetworów z jagód

Jagody o masie wyjściowej wynoszącej 1600 g gotowano przez około 25 minut. Następnie

owoce podzielono na cztery porcje. Pierwszą z nich stanowił sam sok

z jagód, zaś trzy następne jagody z sokiem. Każdą z partii zakonserwowano w inny sposób.

a) przygotowanie soku

Oddzielono mechanicznie sok (około 250 mL) od jagód, następnie umieszczono go w słoiku

i zapasteryzowano.

b) przygotowanie owoców z sokiem

Jagody (około 250 g) umieszczono w słoiku, a następnie zapasteryzowano.

c) przygotowanie owoców z sokiem oraz dodatkiem cukru

Do pozostałej ilości jagód (około 1300 g) dodano cukier (650 g), całość gotowano przez 5

minut. Następnie około 500 g umieszczono w słoiku, szczelnie zamknięto

i zapasteryzowano.

d) przygotowanie dżemu

Do niewykorzystanych jagód z cukrem (około 1 kg) dodano środek żelujący*,

w ilościach zgodnych z przepisem na opakowaniu (1 opakowanie środka żelującego na 1

kilogram owoców + 0,5 kilogram sacharozy). Stosunek owoców do użytego cukru wynosił

2:1. Następnie dżem umieszczono w słoiku, który szczelnie zamknięto.

3.3. Liofilizacja jagód

Zamrożone jagody zostały poddane liofilizacji w liofilizatorze. Proces ten prowadzono

przez 5 dni, w temperaturze – 50 °C pod zmniejszonym ciśnieniem. Masa jagód przed

zamrożeniem wynosiła około 120 g, a po liofilizacji 16 g.

3.4. Sporządzenie dżemu z wiśni

Wiśnie (około 2 kg) gotowano z cukrem (około 700 g) oraz środkiem żelującym* przez

pięć minut. Stosunek użytych owoców do cukru wynosił 3:1. Następnie dżem umieszczono

w słoikach, które szczelnie zamknięto. W jednym słoiku znalazło się około 180 g wiśni

oraz 94,5 g cukru.

27

Tabela 3. Sposób przygotowania ekstraktów z owoców w różny sposób przetworzonych.

rodzaj oznakowanie

roztworu masa/ g rodzaj rozpuszczalnika

objętość

rozp./ mL

jagody suszone JS 3 MeOH+ 2% stęż. HCl 75

jagody bez cukru J1 20 MeOH + 1% stęż. HCl 75

jagody z cukrem J2 20 MeOH + 1% stęż. HCl 75

sok z jagód bez cukru J3 20 MeOH + 1% stęż. HCl 50

dżem jagodowy DJ 20 MeOH + 1% stęż. HCl 75

dżem wiśniowy

DW1 46 MeOH + 1% stęż. HCl 50

DW2 46 H2O + 1% stęż. HCl 50

jagody liofilizowane

L1 3,5 MeOH + 1% stęż. HCl 75

L2 3,5 MeOH + 2% stęż. HCl 75

*W przypadku przygotowywania dżemów zarówno z jagód, jak i z wiśni został użyty

środek żelujący, w którego skład wchodziły: cukier, substancja żelująca, pektyna

amidowana, regulator kwasowości: kwas cytrynowy, substancja konserwująca: kwas

sorbowy. Masa netto opakowania wynosiła 40 g.

4. Badania właściwości antocyjanów

Antocyjany posiadają charakterystyczne widmo absorpcji w zakresie nadfioletu

oraz światła widzialnego. Rozbieżności w maksimach absorpcji wynikają z różnych rodzajów

antocyjanidyn zawartych w surowcach roślinnych lub ich mieszaninach. Jagoda czarna

posiada maksimum absorpcji przy długości fali 280 nm dla zakresu UV oraz 541 nm

dla zakresu VIS, a wiśnia odpowiednio przy 282 nm oraz 529 nm.

28

Wraz z upływem czasu zawartość naturalnych barwników roślinnych maleje

(Rysunek 5).

Antocyjany nie są związkami stabilnymi w czasie, co potwierdzają dane literaturowe.

Na trwałość barwników może mieć wpływ światło, temperatura przechowywania oraz tlen

znajdujący się w powietrzu.

Obliczając iloraz absorbancji w zakresie światła widzialnego do absorbancji w zakresie

nadfioletu można ocenić stabilność antocyjanów oraz czystość ekstraktów (składniki

towarzyszące absorbują promieniowanie głównie w nadfiolecie).

Rysunek 5. Wpływ czasu na kształt widm adsorpcji dla malwidyny (od 30 minut

do 40 dni).

4.1. Malwidynyna - widmo absorpcji i krzywa wzorcowa

Malwidyna, czyli 2-(4-hydroksy-3,5-dimetoksyfenylo)chromenylio-3,5,7-triol (Rysunek

6) jest to barwnik roślinny będący związkiem fenolowym, należącym do grupy flawonoidów,

podgrupy antocyjanów. Odpowiada za barwę czerwono – fioletową wielu owoców i kwiatów,

w tym jagód oraz wiśni.

Przygotowano roztwór wzorcowy malwidyny o stężeniu 1,945 mg/mL w wodzie. W celu

obliczenia zawartości antocyjanów w przeliczeniu na malwidynę sporządzono krzywe

wzorcowe przy dwóch charakterystycznych długości fal 274 nm oraz 546 nm (rys. 7: a,b).

0

1

2

200 300 400 500 600 700

Ab

sorb

ancj

a

dł. fali [nm]

0,03 1 40

546 nm

274 nm

czas [dni]

29

Rysunek 6. Wzór strukturalny malwidyny.

W celu sporządzenia krzywej wzorcowej pobierano różne ilości roztworu malwidyny, ale nie

większe niż 200 µL. Objętość badanej próbki wynosiła 1 mL. Roztwór malwidyny do tej

objętości uzupełniano metanolem zakwaszonym 0,1% HCl. Krzywą wzorcową przedstawiono

na rysunku 7. Następnie rejestrowano widma absorpcji dla malwidyny w czasie.

Ze współczynników kierunkowych krzywych wzorcowych wyliczono molowy współczynnik

absorpcji (ε), a korzystając z prawa Lamberta-Beera wartość absorpcji właściwej (a).

Obydwie wielkości obliczono dla dwóch długości fal λ = 274 nm oraz λ = 546 nm (Tabela 4).

Tabela 4. Wartości absorpcji właściwej oraz molowego współczynnika absorpcji

dla malwidyny.

Długość fali

nm

Absorpcja właściwa – a

L·mg-1

·cm-1

Molowy współczynnik

absorpcji - ε

L·mol -1

·cm -1

274 0,154 5,08·104

546 0,353 1,17·105

Rysunek 7. Krzywa wzorcowa dla malwidyny, dla dwóch długości fali: 274 nm oraz 546 nm.

274 nm A = 0,1535x + 0,0164

546 nm A = 0,353x + 0,0336

0

0,4

0,8

1,2

1,6

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

Ab

sorb

ancj

a

c [µg/ml]

30

4.2. Wpływ czasu na zawartość antocyjanów w ekstrakcie

Następnym krokiem po sporządzeniu ekstraktów ze świeżych oraz utrwalonych jagód

oraz wiśni było zbadanie ich stabilności w czasie.

Ekstrakt (20 μL) rozcieńczano do objętości 1 mL metanolem z dodatkiem 0,1% kwasu

chlorowodorowego. Na rysunku 8: a) i b) zostały zamieszczone uzyskane widma absorpcji

dla ekstraktu ze świeżych jagód (MeOH + 1% HCl) w czasie.

Z kolei na rysunku 9: a) i b) przedstawiono krzywe zarejestrowane dla ekstraktu ze świeżych

wiśni w czasie. Zarówno z rysunku 8, jak i 9 wynika, że stężenie antocyjanów w roztworze

początkowo wzrasta w wyniku postępującej ekstrakcji. Około 9 – 10 dnia od rozpoczęcia

procesu ekstrakcji zawartość antocyjanów w jagodach osiąga maksymalną wartość. Dla wiśni

maksymalną zawartość antocyjanów zarejestrowano w dniu 7-8. W kolejnych dniach

ekstrakcji zawartość przeciwutleniaczy zmniejsza się.

W tabeli 5 zamieszczone zostały ilorazy absorbancji dla długości fali 280 nm oraz 540 nm

dla ekstraktu JA i WB. Pozwala on na ocenę trwałości antocyjanów. Wynika z niej,

że stosunek absorbancji w VIS do absorbancji w UV osiąga maksimum po 1 dniu ekstrakcji,

a następnie zmniejsza się wraz z upływem czasu. Świadczy to o tym, że antocyjany nie są

trwałe w czasie.

0

0,4

0,8

1,2

250 300 350 400 450 500 550 600

Ab

so

rban

cja

dł. fali [nm]

0,02 0,7 1 1,7 7 8 12 85

a

czas [dni]

31

Rysunek 8. a) Wpływ czasu na zmiany kształtu widma absorpcji dla ekstraktu JB (świeże

jagody: MeOH + 1% HCl) w czasie; b) Zmiany absorbancji w czasie.

0

0,4

0,8

1,2

1,6

0,02 0,7 1 2 8 9 12 85 90

Ab

sorb

ancj

a

czas [dni]

280 541 b

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

250 300 350 400 450 500 550 600

Ab

so

rban

cja

dł. fali [nm]

0,02 0,08 1 5 6 85czas [dni]

a

32

Rysunek 9. a) Wpływ czasu na zmiany kształtu widma absorpcji ekstraktu WC (świeże

wiśnie: H2O + 2% HCOOH) w czasie; b) Zmiany absorbancji w czasie.

Tabela 5. Stosunek absorbancji VIS (541 nm) do absorbancji UV (280 nm) dla ekstraktu JA,

JC oraz WB ze świeżych owoców.

doba EtOH +

+ 1% HCl

MeOH + 20% H2O +

+ 1% HCl

H2O +

+ 2% HCl

0 1,410 0,970 0,627

1 1,545 1,403 0,586

2 1,472 1,448 0,697

6 1,420 1,368 0,645

7 1,472 1,388 0,658

11 1,500 1,466 -

85 0,972 0,985 0,760

90 0,517 0,974 0,627

0

0,2

0,4

0,6

0,02 0,08 1 5 6 85 90

Ab

sorb

ancj

a

czas [dni]

280 541 b

33

4.3. Wpływ sposobu przechowywania owoców

Sporządzone ekstrakty ze świeżych oraz utrwalonych owoców różniły się między sobą

użytym ekstrahentem (rozpuszczalnikiem oraz kwasem). Kwas został dodany

do ekstrahowanych owoców w celu zwiększenia trwałości antocyjanów. Użyte do ekstrakcji

rozpuszczalniki to: etanol, metanol oraz woda, a kwasy to: chlorowodorowy oraz mrówkowy.

Wykorzystany do ekstrakcji rozpuszczalnik ma duży wpływ na zawartość antocyjanów

ekstrakcie. Dla porównywalnych ilości jagód przeprowadzono ekstrakcje, różniące się

stosowanymi ekstrahentemi (Rysunek 10: a, b). Najwyższą absorbancję zarejestrowano

dla ekstraktu JE i w tym roztworze zaszły największe zmiany w czasie. Dla pozostałych

ekstraktów, które zostały sporządzone z porównywalnej ilości owoców oraz ekstrahentów

zmiany zachodzą w jednakowy sposób.

Rysunek 10. Widma absorpcji ekstraktów ze świeżych jagód w czasie: a) po 6 dniach,

b) po 85 dniach.

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

2,4

250 300 350 400 450 500 550 600

Ab

so

rban

cja

dł. fali [nm]

JA JB JC JD JE

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

250 300 350 400 450 500 550 600

Ab

so

rban

cja

dł. fali [nm]

JA JB JC JD JE

a

b

34

4.4. Wyznaczanie aktywności antyoksydacyjnej metodą Folina–Ciocaletau

Aktywność antyoksydacyjną wyznaczano metodą Folina–Ciocaletau.

Wykonywano następujące czynności:

rozcieńczano badane ekstrakty dziesięciokrotnie,

pobierano 0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL, 0,4 mL oraz 0,5 mL ekstraktu

i umieszczano go w kolbkach miarowych o objętości 10 mL każda,

dodawano 2 mL rozcieńczonego dziesięciokrotnie odczynnika Folina-

Ciocaletau,

po pięciu minutach, dodawano 10 mL 20% węglanu sodu, kolbkę uzupełniano

do kreski wodą destylowaną,

po 30 minutach próbki badano spektrofotometrycznie, mierząc absorbancję

przy trzech długościach fali: 745 nm, 750 nm oraz 760 nm, ponieważ widmo

roztworu nie posiada charakterystycznego maksimum.

Ostatnim krokiem w obliczaniu aktywności antyoksydacyjnej było oszacowanie ilości kwasu

galusowego przypadającego na ilość owoców użytych do przygotowania ekstraktu.

Aktywność antyoksydacyjną wyrażoną w miligramach kwasu galusowego przypadającego

na gram owoców zawartych w ekstrakcie. Obliczono zawartość antocyjanów w ekstrakcie,

czyli ilość malwidyny (mg), która przypadała na masę użytych owoców (g). Zawartość

antocyjanów w ekstraktach z jagód oraz wiśni porównywano z aktywnością antyoksydacyjną

tego samego roztworu. Otrzymane wartości aktywności antyoksydacyjnych zostały

przestawione na wykresach. Na każdym z nich porównano ze sobą otrzymane wartości

aktywności antyoksydacyjnych z zawartością antocyjanów w tym samym ekstrakcie.

Na rysunku 11a przedstawiono aktywności przeciutleniające ekstraktów ze świeżych jagód,

różniące się użytym ekstrahentem, a na rysunku 11b zawartość antocyjanów w ekstrakcie.

Porównano również aktywności antyoksydacyjne ekstraktów z jagód w zależności od sposobu

utrwalania owoców (Rysunek 12: a, b).

Tę samą zależność wykonano także dla ekstraktów z wiśni w zależności od użytego

ekstrahenta oraz przechowywania surowca roślinnego (Rysunek 13: a,b).

Z otrzymanych danych wynika, że aktywność antyoksydacyjna obliczona metodą Folina–

Ciocaletau jest wprost proporcjonalna do antocyjanów znajdujących się we wszystkich

ekstraktach z jagód oraz wiśni.

35

Rysunek 11. Porównanie aktywności antyoksydacyjnej ekstraktów z jagód

w zależności od użytego ekstrahenta w przeliczeniu na: a) kwas galusowy,

b) malwidynę.

0

5

10

15

20

25

30Il

ość

kw

asu

gal

uso

we

go n

a g

jagó

d

[mg/

g]

ekstrakt z jagód w EtOH +1% HCl ekstrakt z jagód w MeOH +1% HCl

ekstrakt z jagód w MeOH + H2O+1% HCl ekstrakt z jagód w MeOH + H2O + 2% HCl

a

0

5

10

15

20

25

30

Ilo

ść m

alw

idyn

y n

a g

jagó

d [

mg/

g]

b

36

Rysunek 12. Porównanie aktywności antyoksydacyjnej ekstraktów z jagód

w zależności od sposobu przechowywania surowców roślinnych w przeliczeniu na: a) kwas

galusowy, b) malwidynę.

0

5

10

15

20

Ilo

ść k

was

u g

alu

sow

ego

na

g ja

gód

[m

g/g]

pasteryzowane ( MeOH + 1% HCl)dżem (MeOH + 1% HCl)pasteryzowane z cukrem (MeOH + 1% HCl)pasteryzowany sok (MeOH + 1% HCl)zliofilizowane (MeOH + 1% HCl)zliofilizowane (MeOH +2% HCl)suszone (MeOH + 2% HCl)

a

0

5

10

15

20

Ilo

ść m

alw

idyn

y n

a g

jagó

d [

mg/

g]

b

37

Rysunek 13. Porównanie aktywności antyoksydacyjnej ekstraktów z wiśni w zależności

od użytego ekstrahenta oraz przechowywania surowca roślinnego w przeliczeniu na: a) kwas

galusowy, b) malwidynę.

4.5. Zależność pomiędzy aktywnością antyoksydacyjną a zawartością antocyjanów

Na podstawie uzyskanych wyników (Rys. 11-13) zauważono korelację pomiędzy

aktywnością antyoksydacyjną oraz zawartością antocyjanów w ekstraktach roślinnych.

W tabeli 6 zostały przedstawione wartości ilorazów aktywności antyoksydacyjnej

do zawartości antocyjanów dla tych samych ekstraktów. Z otrzymanych danych wynika,

że wartość ilorazu aktywności antyoksydacyjnej (ilość kwasu galusowego) do zawartości

0

5

10

15

20

25

Ilo

ść k

was

u g

alu

sow

ego

na

g w

iśn

i [m

g/g]

a

0

5

10

15

20

25

Ilo

ść m

alw

idyn

y n

a g

wiś

ni [

mg/

g]

wiśnie (MeOH + 2% HCl) wiśnie (woda + 2% HCl) wiśnie (MeOH + 2% HCOOH)

dżem (MeOH +1% HCl) dżem (woda + 1% HCl)

b

38

antocyjanów (ilość malwidyny) jest stała. Nie zależy ona również od użytego surowca

roślinnego zawierającego barwniki należące do grupy antocyjanów. Iloraz ten wynosi

0,74 +/- 0,03 (Tabela 6).

Dzięki tej zależności można określić aktywność antyoksydacyjną badanego surowca

roślinnego, korzystając wyłącznie z obliczonej zawartości antocyjanów.

Tabela 6. Iloraz aktywności antyoksydacyjnej do zawartości antocyjanów w ekstraktach

z czarnej jagody oraz wiśni.

Ekstrakt

Iloraz aktywności

antyoksydacyjnej

do zawartości

antocyjanów

Ekstrakt

Iloraz aktywności

antyoksydacyjnej

do zawartości

antocyjanów

JA 0,735 DJ 0,751

JB 0,733 L1 0,751

JC 0,734 L2 0,752

JD 0,738 WA 0,742

JE 0,727 WB 0,753

JS 0,751 WC 0,739

J1 0,740 DW1 0,775

J2 0,747 DW2 0,724

J3 0,746 - -

IV. Wnioski

Antocyjany należą do grupy związków, które nie są stabilne w czasie. Ich stężenie

w roztworach będących w kontakcie z surowcem osiąga maksimum około 8-9 dnia

od rozpoczęcia ekstrakcji, a następnie stopniowo maleje. Dużą rolę odgrywa również użyty

do ekstrakcji rozpuszczalnik oraz kwas. Spośród sporządzonych ekstraktów najwyższą

39

zawartość antocyjanów w roztworze można uzyskać stosując jako ekstrahent metanol

zakwaszony kwasem mrówkowym. Najmniej efektywnym ekstrahentem jest woda.

Jagody posiadają wyższą aktywność antyoksydacyjną niż wiśnie. Wśród ekstraktów

ze świeżych owoców najwyższą aktywność antyoksydacyjną wykazuje ekstrakt ze świeżych

jagód w metanolu, najmniejszą zaś ekstrakt z wiśni w wodzie z dodatkiem kwasu

chlorowodorowego.

Utrwalanie owoców jest procesem bardzo ważnym, ponieważ większość owoców

jest dostępna sezonowo. Ich cena poza tym okresem jest wysoka, a spożywanie owoców

bogatych w antyoksydanty jest bardzo ważne dla organizmu człowieka przez cały rok. Wśród

zbadanych sposobów utrwalania żywności wyodrębnić można suszenie, pasteryzację,

liofilizację, a także sporządzanie dżemów. Większość z tych metod jest łatwo dostępna, tania

oraz powszechnie stosowana. Jedynie liofilizacja stanowi metodę bardziej skomplikowaną

do przeprowadzenia, której potrzebna jest odpowiednia aparatura.

Najmniejszą aktywność antyoksydacyjną wśród ekstraktów oszacowano dla ekstraktu

z dżemu wiśniowego w wodzie oraz z suszonych jagód.

Porównując sposoby utrwalania żywności ze względu na aktywność antyoksydacyjną

najlepszą z nich jest pasteryzacja całych owoców bez dodatku cukru. Dobry sposób

przechowywania żywności stanowi również pasteryzacja soku z owoców (bez dodatków).

Z kolei najmniej efektywną metodą przechowywania surowców roślinnych jest suszenie

oraz liofilizacja.

Liofilizacja, która jest często wykorzystywana w przemyśle spożywczym nie spełniła

wymagań co do zachowania jak największej ilości przeciwutleniaczy. Spełniają je za to proste

metody pasteryzacji, które nie zmniejszają aktywności antyoksydacyjnej utrwalonych

owoców w takim stopniu jak suszenie oraz liofilizacja.

Iloraz aktywności antyoksydacyjnej (ilość kwasu galusowego) do zawartości

antocyjanów (ilości malwidyny) w użytych surowcach roślinnych jest stały dla każdego

ekstraktu i wynosi 0,74 +/- 0,03. Ustalenie tej korelacji pozwala na oszacowanie wartości

aktywności antyoksydacyjnej ekstraktów roślinnych bez wykorzystywania metody Folina–

Ciocaletau. Zaletą tej metody jest krótszy czas potrzebny do otrzymania wyników,

a także mniejsze zużycie odczynników chemicznych.

40

41

V. Streszczenie

Wprowadzenie

Antyoksydanty, czyli przeciwutleniacze są to substancje opóźniające zajście procesu

utleniania związków chemicznych. Nawet ich niewielka ilość może całkowicie zapobiec

reakcjom utleniania substratów. Duża ilość związków przeciwutleniających znajduje się

w owocach jagodowych, przede wszystkim w owocach borówki wysokiej, nazywanej

potocznie czarną jagodą [1].

Cechą charakterystyczną dla antyoksydantów jest ich aktywność antyoksydacyjna.

Jest to zdolność określonych substancji do reagowania z czynnikami oksydacyjnymi,

hamująca aktywność wolnych rodników. Metody wyznaczania zdolności antyoksydacyjnej

związków dzieli się na addycyjne (pierwotne) i postaddycyjne (wtórne) [2, 3].

Dezaktywacja przeciwutleniaczy może przebiegać według dwóch mechanizmów: HAT (ang.

hydrogen atom transwer) oraz SET (ang. single electron transfer). Oba mechanizmy mogą

zachodzić jednocześnie, ale jeden z nich zawsze ma charakter dominujący. Mają na to wpływ

czynniki związane z właściwościami danego związku oraz środowisko reakcji [4]. Efekt

końcowy obydwu mechanizmów jest zawsze taki sam. Metoda Folina-Ciocalteau

wykorzystuje mechanizm SET [5].

Celem mojej pracy było sprawdzenie jak utrwalanie wybranych owoców wpływa

na ich aktywność antyoksydacyjną oraz zawartość antocyjanów. Surowiec roślinny stanowiły

świeże jagody oraz wiśnie. Owoce zostały w różny sposób utrwalone

i przechowywane. Zastosowano następujące metody utrwalania owoców: pasteryzację,

liofilizację oraz suszenie. Z części owoców sporządzono przetwory. Owoce każdego gatunku

były zebrane w tym samym okresie oraz pochodziły z tych samych partii.

Wyniki i dyskusja

Badanym surowcem roślinnym były jagody oraz wiśnie. Ekstrakty sporządzono dodając

do porównywalnych ilości owoców ekstrahent (metanol, etanol, woda) z dodatkiem kwasu

(chlorowodorowego lub mrówkowego).

Na podstawie sporządzonych ekstraktów określono zawartości oraz aktywności

antyoksydacyjnej związków o właściwościach przeciwutleniających. Widma absorpcji

związków o właściwościach antyoksydacyjnych rejestrowano spektrofotometrycznie.

Sprawdzono jaki wpływ na widmo absorpcji oraz aktywność antyoksydacyjną ma użyty

do ekstrakcji rozpuszczalnik oraz kwas. Aktywność antyoksydacyjna została wyznaczona

metodą Folina-Ciocaltau. Bardzo ważną rolę odgrywa zoptymalizowanie metody.

W celu określenia zawartości antocyjanów sporządzono roztwór wzorcowy malwidyny, która

jest barwnikiem roślinnym, należącym do flawonoidów (podgrupa antocyjany). Odpowiada

ona za barwę czerwono – fioletową wielu owoców i kwiatów.

Otrzymane wartości aktywności antyoksydacyjnej oraz zawartości antocyjanów w tym

samym ekstrakcie zostały porównane ze sobą. Aktywność antyoksydacyjną wyrażona została

w miligramach kwasu galusowego przypadającego na gram owoców zawartych w ekstrakcie,

zaś zawartość antocyjanów w ekstrakcie wyrażono jako ilość malwidyny (mg) przypadającej

na masę użytych owoców (g). Zawartość antocyjanów w ekstraktach z jagód oraz wiśni

porównywano z aktywnością antyoksydacyjną tego samego roztworu.

42

Wnioski

Spośród sporządzonych ekstraktów najwyższą zawartością antocyjanów w roztworze

charakteryzuje się stosując jako ekstrahent - metanol zakwaszony kwasem mrówkowym.

Najmniej efektywnym ekstrahentem jest woda.

Antocyjany należą do grupy związków, które nie są stabilne w czasie. Maksymalne stężenie

antocyjanów w roztworze osiąga się około 9 – 10 dnia od rozpoczęcia ekstrakcji dla jagód

oraz około 7 – 8 dnia dla wiśni. W kolejnych dniach stężenie antocyjanów stopniowo maleje.

Jagody posiadają wyższą aktywność antyoksydacyjną niż wiśnie. Wśród ekstraktów

ze świeżych owoców najwyższą aktywność antyoksydacyjną wykazuje ekstrakt świeżych

jagód w metanolu, najmniejszą zaś ekstrakt z wiśni w wodzie z dodatkiem kwasu

chlorowodorowego.

Ważne jest kontrolowanie jak sposób przechowywania owoców wpływa na zawartość

antocyjanów. Utrwalanie owoców jest procesem bardzo ważnym, ponieważ większość

owoców jest nie jest dostępna przez cały rok. Najmniejszą aktywność antyoksydacyjną wśród

ekstraktów oszacowano dla ekstraktu z dżemu wiśniowego w wodzie oraz z suszonych jagód.

Porównując sposoby utrwalania żywności ze względu na aktywność antyoksydacyjną

najlepsze efekty przyniosła pasteryzacja całych owoców bez dodatku cukru. Dobry sposób

przechowywania żywności stanowi również pasteryzacja soku z owoców. Z kolei najmniej

efektywną metodą przechowywania surowców roślinnych jest suszenie oraz liofilizacja.

Iloraz aktywności antyoksydacyjnej (ilość kwasu galusowego) do zawartości

antocyjanów (ilości malwidyny) w użytych surowcach roślinnych jest stały dla każdego

ekstraktu i wynosi 0,74 +/- 0,03.

Ustalenie tej korelacji pozwala na oszacowanie wartości aktywności antyoksydacyjnej

ekstraktów roślinnych bez konieczności wykorzystywania metody Folina–Ciocaletau.

Literatura

1. Praca zbiorowa pod redakcją W. Grajka: Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty

zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne. WNT, Warszawa, 2007.

2. Antolovich M., Prenzler P. D., Patsalides E., McDonald S., Robards K.: Analyst. 2002, 127,

183–198.

3. Woś A.: Wybrane problemy produkcji żywności i żywienia, Zakład Narodowy

im. Ossolińskich, Warszawa, 1979.

4. Bedner A. E.: Człowiek i żywność. PWN, Warszawa, 1980.

5. Prior R. L., Wu X., Schaich K.: J. Agric. Food Chemistry 2005, 53, 4290-4302.

43

VI. Bibliografia

1. Praca zbiorowa pod redakcją W. Grajka Przeciwutleniacze w żywności, Aspekty

zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne. Warszawa: WNT, 2007.

2. http://www.phytochemicals.info/plants/blueberry.php.

3. T. Krupa K. Tomala. Wpływ warunków przechowywania na zawartość antocyjanów i

aktywnośćprzeciutleniającą jagód borówki wysokiej. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość.

2 (47) Supl. (2006) 171 - 181.

4. J. A. Michiels C. Kevers, J. Pincemail, J. O. Defraigne, J. Dommes. Extraction

conditions can greatly influence antioxidant capacity assays in plant food matrices. Food

Chemistry . 130 (2012) 986–993.

5. Woś A. Wybrane problemy produkcji żywności i żywienia. Warszawa: Zakład Narodowy

im. Ossolińskich, 1979.

6. Piłat B. Biologicznie aktywne substancje pochodzenia roślinnego. Przewodnik do zajęć

laboratoryjnych. Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie. 2010.

7. A. Nawirska A. Sokół-Łętowska, A. Z. Kucharska. Właściwości przeciutleniające

wytłoków z wybranych owoców kolorowych. ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość. 4

(53) (2007) 120 – 125.

8. D. Gumul J. Korus, B. Achremowicz. Wpływ procesów przetwórczych na aktywność

przeciwutleniającą surowców pochodzenia roślinnego. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość.

4 (45) Supl. (2005) 41 – 48.

9. A. Szajdek J. Borowska. Właściwości przeciwutleniające żywności pochodzenia

roślinnego. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość. 4 (41) S (2004) 5 – 28.

10. M. Antolovich P. D. Prenzler, E. Patsalides, S. McDonald, K. Robards. Methods for

testing antioxidant activity. Analyst. 127 (2002) 183–198.

11. Bedner A. E. Człowiek i żywność. Warszawa: PWN, 1980.

12. R. L. Prior X. Wu, K. Schaich. Standardized Methods for the Determination of

Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements. J. Agric. Food

Chemistry. 53 (2005) 4290-4302.

13. Praca zbiorowa pod redakcją W. Grajka. Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty

zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne. Warszawa: WNT, 2007.

14. http://www.phytochemicals.info/orac-values.php.

15. Praca zbiorowa pod redakcją M. Obiedzińskiego. Wybrane zagadnienia z analizy

żywności. Warszawa: Wydawnictwo SGGW, 2009.

16. T. Mazzeo D. N’Dri, E. Chiavaro, A. Visconti, V. Fogliano, N. Pellegrini. Effect of

two cooking procedures on phytochemical compounds, total antioxidant capacity and colour

of selected frozen vegetables. Food Chemistry. 128 (2011) 627–633.

17. Typrowicz J. Metody utrwalania i przechowywania żywności, Materiały dydaktyczne dla

uczniów Zespołu Szkół Gastronomicznych i Przemysłu Spożywczego. Przemyśl. 2006.

18. B. Xu S. K.C. Chang. Effect of soaking, boiling, and steaming on total phenolic content

and antioxidant activities of cool season food legumes. Food Chemistry. 110 (2008) 1–13.

19. C. Oliveira L. F. Anaro, O. Pinho. Cooked Blueberries: Anthocyanin and

Anthocyanidin. J. Agric. Food Chem. 58 (2010) 9006–9012.

20. E. Pijanowski M. Dłużewski, A. Dłużewska. Ogólna Technologia Żywności. Warszawa :

WNT, 1996.

21. Praca zbiorowa pod redakcją Z. E. Sikorskiego. Chemia żywności. Wydanie piąte

zmienione. Warszawa: WNT, 2007.

44

22. K. Robards M. Antolovich. Analytical Chemistry of Fruit Bioflavonoids: A Review.

Analyst. 122 (1997) 11R–34R.

23. Praca zbiorowa pod redakcją Z. E. Sikorskiego. Chemiczne i funkcjonalne właściwości

składników żywności. Warszawa: WNT, 1994.

24. Sigma-Aldrich. Karta charakterystyki Malvidin chloride.

25. J. Tabart C. Kevers, J. Pincemail , J. O. Defraigne, J. Dommesa. Comparative

antioxidant capacities of phenolic compounds measured by various tests. Food Chemistry .

113 (2009) 1226–1233.

26. A. D. Rodarte Castrejo´n I. Eichholz, S. Rohn, L. W. Kroh, S. Huyskens-Keil.

Phenolic profile and antioxidant activity of highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.)

during fruit maturation and ripening. Food Chemistry. 109 (2008) 564–572.

27. E. E. Nicouea S. Savard, K. Belkacemi. Anthocyanins in Wild Blueberries of Quebec:

Extraction and Identification. J. Agric. Food Chem. 55 (2007) 5626-5635.