Enzymy w surowcach roślinnych

ENZYMY SUROWCW ROLINNYCHI ich zastosowaniadr n. farm. Micha Cichocki

ALLELOPATIA

BIOTECHNOLOGICZNE SPOJRZENIE NA ROLINYrdo cennych substancji odywczych i biologicznie czynnych

Alternatywne bioreaktory, produkujce biaka zwierzce i ludzkie

rdo enzymw, szeroko stosowanych w przemyle spoywczym, chemicznym, farmaceutycznym,

POTENCJALNE CELE BADA NAD SUBSTANCJAMI PRODUKOWANYMI W ROLINACH

poszukiwanie zwizkw o waciwociach odywczych (witaminy, nutraceutyki) poszukiwanie analogw substancji fizjologicznych (np. fitoestrogeny) poszukiwanie zwizkw czynnych o nowych waciwociach biologicznych (np. alkaloidy barwinka, terpeny cisu)

DLACZEGO POTRZEBUJEMY ENZYMW?

tradycyjna synteza organiczna dostarcza maksymalnie 200-300 nowych zwizkw rocznie wprowadzenie na rynek nowego leku wymaga syntezy ok. 6200 zwizkw chemicznych koszt wyprodukowania i skomercjalizowania nowego zwizku chemicznego przekracza 350 mln $ czas wprowadzenia na rynek nowego leku wynosi ok. 13 lat liczba ludnoci na wiecie do roku 2040 osignie 10 mld (wyzwanie dla medycyny i ywienia)

ENZYMY ROLINNE, JAKO TARGET:

nowoczesne rolnictwo zrwnowaone wymaga poszukiwania nowych rodkw ochrony rolin obecnie stosowane herbicydy opieraj si o zwizki czynne bdce inhibitorami:

syntezy acetylomleczanu utleniania protoporfirynogenu aktywnoci dioksygenazy phydroksyfenylopirogronianowej desaturazy fitoenowej

poszukiwanie nowych herbicydw w oparciu o rda naturalne

Ewolucja enzymw na przykadzie CYP450

mld lat

liczba genw CYP

WIAT WG ENZYMW

XIX w. Pasteur opisuje fermentacj

pocz. XX w. Bchner otrzymuje zymaz

liczba opisanych enzymw ok. 33 800(wg: http://www.brenda-enzymes.info/)

ENZYMY = BIOKATALIZATORY= biaka przyspieszajce reakcje biochemiczne

DLACZEGO TAK SI DZIEJE?porzdkowanie ukadu steryczne zblienie substratw zmiana stopnia uwodnienia substratw odksztacanie struktury substratuCMON !

ENZYMY NIE WPYWAJ NA RWNOWAG REAKCJI, LECZ PRZYSPIESZAJ JEJ OSIGNICIE, CO ZOSTAJE UZYSKANE PRZEZ STABILIZACJ STANU PRZEJCIOWEGO

S SSubstrat stan przejciowy

Pprodukt

Energia swobodna Gibbsa

G = GS GSSzybko reakcji jest proporcjonalna do stenia S, ktre zaley od G

S

S

P

CECHY KATALIZY ENZYMATYCZNEJ:

szybko przyspieszanie reakcji co najmniej 1 mln razy; anhydraza wglanowa (EC 4.2.1.1) uwadnia 100 tys. czsteczek CO2 na sekund! specyficzno (w tym stereospecyficzno) i precyzja: polimeraza DNA I myli si rzadziej ni raz na milion dziaanie w agodnych warunkach (Patm., rod. wodne, pH2.0-8.0 (~ 7.0), temp. 20-40C)

moliwo precyzyjnej regulacji enzymy s duymi biakami globularnymireszt aa, powyej 100 kDa, > 2.5 nm)

(powyej 100

ZACHOWANIE ODPOWIEDNIEJ STRUKTURY BIAKA WARUNKUJE AKTYWNO ENZYMU

ENZYMY: PRZYJACIELE CZY WROGOWIE?

PODZIA ENZYMW Z PUNKTU WIDZENIA TECHNOLOGW PRZEMYSU ZIELARSKIEGO:

HYDROLAZY POLIMERAZY

OKSYDOREDUKTAZY

SUSZENIE NAJSTARSZA FORMA STABILIZACJI SUROWCW ZIELARSKICH

BIOSYNTEZA ETYLENUOH S O NH2 CH3 O NH2 OH Ribose-Adenine S+

H2C

CH 2

CH3H2N

C COOH

Askorbinian

L-Met

SAM

ACC

Aktywacja kinaz biakowych

H2C

CH2

STABILIZACJA SUROWCW ZIELARSKICH ETANOLEM

temp. wrzenia = 78C, LD50 = 7060mg/kg m.c. denaturuje biako w wysokich steniach > 90% dziaanie antyseptyczne w steniu 70%

dziaanie na wiee surowce parami etanolu 9096% w temp. 75-90C, przy cinieniu 0,2-2,5 MPa, w cigu 1 - 3h

KLASYFIKACJA ENZYMW (wg IUBMB)EC 1 oksydoreduktazy (np. ligninazy) EC 2 transferazy (np. polimeraza DNA) EC 3 hydrolazy (np. celulaza) EC 4 liazy (np. pektynazy) EC 5 izomerazy (np. mutazy, racemazy) EC 6 ligazy (np. ligaza DNA)

EC 1 - OKSYDOREDUKTAZY

Dehydrogenazy np. ADH (EC 1.1.1.1)koenzymami (przenonikami) s dla tych enzymw NAD/NADP oraz FAD/FMN


Oksydazy np. GOx (EC 1.1.3.4)

sporo zastosowa w przemyle i medycynie uzyskiwane g. z drobnoustrojw (Aspergillus niger, Penicilium sp.) wystpuj take w miodzie

GOx oksydaza glukozowa i jej zastosowanie

powstajcy nadtlenek wodoru ma dziaanie antyseptyczne GOx jest wykorzystywana w tzw. oznaczeniach porednich, np. w testach diagnostycznych do oznacze glukozy razem z katalaz uywana w przemyle spoywczym w celu rozkadu glukozy (np. w sproszkowanym biaku jaja kurzego) oraz rozkadu tlenu w pakowanych hermetycznie produktach

OH H H OH HO H OH H H O OH

H2O

-D-glukoza

Kw. glukonowy

H2O2

pomiar glukozy moe odbywa si na podstawie pomiaru przepywu elektronw(np. Abbott Medisense Sensor electrodesTM)

kolorymetrycznie, na podstawie reakcji powstaego H2O2 w obecnoci peroksydazy z chromogenem (np. piramidon + kwas phydroksybenzoesowy)

2H2O2 + POD + 4-aminoantipyrine barwnik chinonoiminowy + 4H2Omax = 510nm


EC 1.11 peroksydazy (np. katalaza, HRP, APX)

PEROKSYDAZY FAM. CRUCIFERAE

15 izoenzymw, najbardziej znane HRP (EC 1.11.1.7) wystpuj w korzeniach chrzanu (Armoracia rusticana), najwaniejsza jest HRP C posiadaj hemow grup prostetyczn wykorzystuj nadtlenek wodoru do utleniania rnych substratw rola fizjologiczna HRP: metabolizm kwasu indolo-3-octowego, procesy lignifikacji, tworzenia polimerw ciany komkowej, suberyny, odporno na infekcje ZASTOSOWANIE HRP: enzym wykorzystywany w metodach immunoenzymatycznych (substrat: o-fenylenodiamina) POTENCJALNE ZASTOSOWANIE: wraz z IAA w terapii NWT

ZASTOSOWANIA HRPmetody immunoenzymatyczne (substraty: luminol, tetrametylobenzydyna, tetrachlorek diaminobenzydyny; DAB) oksydacja enancjoselektywna synteza chemiczna (np. w syntezie winkrystyny i wimblastyny) terapia NWT (POTENCJALNIE): poczenie wraz z IAA

HRP stosuje si do znakowania przeciwcia

H3C

CH3

H3C

CH3

H2N

NH2

HRP

HN

NH

H3C

CH3

H3C

CH3

3,3,5,5-Tetramethylbenzidine (TMB) max=285nm max=450nm

HRP stosuje si do znakowania przeciwcia (2)

substraty: luminol, cjalumen, lucygenina wzmacniacze: p-jodofenol, kwas p-kumarowy, fenol, anilinaNH2 O

NH2

O-

NH NH

HRP

O O

+

O

O

Luminol (3-aminohydrazyd kwasu ftalowego)

HRP I IAA: POCZENIE KORZYSTNE W TERAPII NWT

IAA naley do tzw. auksyn rolinnych jego metabolit, powst. w wyniku reakcji katalizowanej przez HRP jest cytotoksyczny metabolit reaguje ze zwizkami nukleofilowymi, jak GSH lub biaka histonwO

CH2OH

HRPN H

O N H

IAA

3-metyleno-2-oksoindol

APX peroksydaza L-askorbinianu (askorbinaza), EC 1.11.1.11

HO O HO HO O OH

H 2 O2

2H2O HO

HO O O

APX O OKw. askorbowy Kw. dehydroaskorbowy


Oksygenazy (mono- i di-)

EC 1.14 MFO

rolinne cytochromy P450 (CYP450) superrodzina enzymw zaangaowanych w metabolizm zwizkw endogennych (np. steroli, terpenw, izoflawonw, gibberelin) i ksenobiotykw (np.herbicydw)

> 1000 izoenzymw, zgrupowanych w 22 rodzinach katalizuj reakcje hydroksylacji, epoksydacji, dealkilacji, izomeryzacji, cyklizacji, aromatyzacji dekarboksylacji i wiele innych

WIELE SPORD ROLINNYCH ZWIZKW CZYNNYCH TO METABOLITY

SUBSTRATY ROLINNYCH CYP450:

zw. fenoloweizoprenoidy aminokwasy

lignina, barw. flawonoidowe, fitoaleksyny, izoflawonoidysteroidy, karotenoidy, gibbereliny, brasinolidy, cytokininy glukozynolany, glukozydy cjanogenne, cykliczne kwasy hydroksamowe kutyny, suberyny, czst. sygnaowe morfina, alkaloidy p/NWT

kw. tuszczowe alkaloidy ksenobiotyki

herbicydy (detoksykacja / aktywacja)

BIOSYNTEZA HORM. STEROIDOWYCH U ROLINCYP90B CYP724B

OH H3CCH3 H3C H3C CH3 CH3 CH3

H3CCYP?

CH3 HO CH3

H3C CH3

CYP450

HOCYP90C CYP90D

HOHO

O H OCYP85A2

CYP90A CYP85A1

Kampesterol

Brasinolidy (rol. h. wzrostu) Rzodkiewnik, Ry, Pomidor

METABOLIZM ZWIZKW FENOLOWYCHPEP + Erytrozo-4-P dehydrochinon

SUBST. ZAPACHOWE BARWNIKI ANTYOKSYDANTY

szikiminian

LIGNINA

choryzmian

COOH

COOH

COOH

COOH

COOH

CYP73

CYP98

CYP84

OH OH OH OH

OMe

HO OH

OMe

Kwas cynamonowy

Kwas p-kumarowy

Kwas kawowy

Kwas ferulowy

Kwas 5-hydroksyferulowy

METABOLIZM FLAWONOIDW

Morant M. et al. (2003) Current Opinion in Biotechnology

Morant M. et al. (2003) Current Opinion in Biotechnology

W SZLAKACH BIOSYNTEZY POLIFENOLI UCZESTNICZ KOMPLEKSY WIELOENZYMATYCZNE, ZLOKALIZOWANE W RE

CYP450 S ZAANGAOWANE W METABOLIZM HERBICYDWO N H3C NH CH3 HO

CYP76B1H3C NH

NH2

CYP76B1ClCl

fitotoksycznyO N H3C NH CH3 CH3

nietoksyczny dla rolin

CYP71A9Cl

O HO NH N

CH3

CH3

Cl

nietoksyczny dla rolin

Schemat biosyntezy niektrych polifenoli w owocach borwek(Jaakola L., et al. (2002) Plant Physiol)

PAL liaza Phe gr. aminowa CHS syntaza chalkonowa CHI izomeraza chalkonowa F3H hydroksylaza flawonoidowa ANS syntaza antocjanidyn LCR reduktaza leukantocjanidyn MT - metylotransferaza

Zmiany zawartoci flawonoli i antocjanin podczas procesu dojrzewania owocw borwki czernicy (Vaccinum myrtillus)

Biosynteza antocjanin i flawan-3-oli(Griesser M., et al. (2008) Plant Physiol)

FHT hydroksylaza flawanonw DFR reduktaza dihydroflawonoli ANS syntaza antocjanidyn LAR reduktaza leukantocjanidyn GT - glykozylotransferazy

Biosynteza taksanw

taksol (PaclitaxelTM) jest naturalnym diterpenem, uzyskiwanym gwnie z kory cisu (Taxus sp.) aktywno p/NWT polega na zakcaniu depolimeryzacji mikrotubul, co prowadzi do zatrzymania podziaw komrki wysoka skuteczno w raku jajnikw; czsto stosowany w poczeniu z cisplatyn istnieje moliwo syntezy taksolu z prekursorw: 10-deacetylobakatyny III (10-DAB) lub z bakatyny III (obecnej m.in. w igach cisu)

Badania nad syntez diterpenw we woniczkach tytoniu (Wang E, Wagner GJ, 2003)IPP + DMAPPCH3 CH3 CH3

OPP

??

CH3 H3C

TAKSOIDY>300 taksoidw 13 miejsc ulegajcych oksydacjiCH3

GGPPOH

H3C

H3C CH3CH3

H3C

1

CH3

CH3

H3CCH3

kembratrieno-dioleH3C OH CH3 CH3 CH3

CH3

EC 2 - TRANSFERAZY

enzymy przenoszce grupy funkcyjne (np.polimerazy DNA)

kluczowy enzym w biosyntezie aminokwasw aromatycznych EPSPS(syntetaza fosforanu 5-enolopirogronianoszikimianu)

Polimeraza Taqtermostabilna trwaa w temp. >90C; optimum aktywnoci w 74-80C oryginalnie wystpuje u bakterii Thermus aquaticus 1989: Molecule of the year (by Science) zastosowanie: PCR obecnie pozyskiwana z rekombinowanych szczepw E. coli modyfikacje: np. Hot start polymerase

BIOSYNTEZA AMINOKWASW AROMATYCZNYCH SPECJALNO ROLINEPSPS = syntaza 5-enolopirogroniano-szikimowo-3-fosforanowa

E-4-P + PEP

EPSPS

szikimian

choryzmian

prefenianantranilan

Phe

Tyr Trp

EC 3 - HYDROLAZY

EC 3.1 esterazy (np. lipazy, AP) EC 3.2 glikozydazy (np. emulsyna, myrozynaza) EC 3.4 proteazy (np. bromelaina, papaina, pepsyna)

AP (ALP)

Fosfataza zasadowa, EC 3.1.3.1 typowe substraty: alkaloidy, biaka, nukleotydy wystpowanie: szeroko w wiecie rolinnym i zwierzcym; do celw komercyjnych pozyskiwana z bakterii (g. E. coli) ZASTOSOWANIE:

marker pasteryzacji mleka biologia molekularna (wizualizacja) utrzymywanie jednoniciowego DNA

PULLULANAZA ????????

Enzym amylolityczny, rozkadajcy rozgazione wizania -1,6 w acuchach skrobi, dekstryn i oligosacharydw Wystpuje w bawenie, ryu. Do produkcji przemysowej pozyskiwana z bakterii (np. Geobacillus stearothermophilus)

Zastosowanie: browarnictwo (PROMOZYME Brew Q), gorzelnictwo (PullDistill 100) -> przyspieszone scukrzanie skrobii

AP stosuje si do znakowania przeciwcia (3)

substrat: fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolylu utleniacz: p-nitroblue tetrazolium (NBT)O Cl O P O-

O

-

Cl

OH

Cl

O H N

Br

AP

Br

NBTN H

Br

N H

N H O Cl

Br

BCIP

PROTEAZY CYSTEINOWE

aktinidaina (kiwi) bromelaina (ananas) papaina (papaja) fikaina (figa)

AKTINIDAINA (EC 3.4.22.14)obecna w owocach kiwi, ananasa, papaja i mango proteaza cysteinowa waciwoci allergenne wykorzystywana do zmikczania misa

BROMELAINA (EC 3.4.22.33)wystpuje w owocach ananasa rodek wspomagajcy trawienie biaek pokarmowych leczenie ropni, zakrzepw, obrzkw, zewntrznie do leczenia owrzodze i stanw zapalnych skry waciwoci p/zapalne potwierdzone in vitro i in vivo postulowane dziaanie przeciwnowotworoweOrsini RA , (2006) Plast Reconstr Surg.

PAPAINA (EC 3.4.22.2)z owocw Carica papaya proteaza cysteinowa zastosowanie: przemys spoywczy (misny) niweluje dziaanie niekt. jadw (pszczoy, komara) uywana w hodowlach komrkowych (obok trypsyny) oczyszczanie ran z tk. martwiczej

CHYMOPAPAINA (EC 3.4. ???)

z owocw Carica papaya (z mleczka lateksowego) proteaza cysteinowa zastosowanie: leczenie przepukliny dyskowej (CHYMODIACTIN)

FIKAINAaktywno proteazy cysteinowej oraz esterazy wystpuje w owocach figowca

NUKLEAZY (FOSFODIESTERAZY) E.C. 3.1

egzo i endonukleazy (fosfodiesterazy) g. pochodzenia bakteryjnego (np. Eco RI, Bam HI, Hin DIII) nukleaza fasoli zotej (Mung Beam, Vigna radiata) wysokie powinowactwo do ssDNA

GLUKOZYNOLANY I MYROZYNAZY ENZYMY ROZKADAJCE GLUKOZYNOLANY

nieznana rola glukozynolanw w fizjologii rolin posiadaj wysok aktywno biologiczn dziaanie wolotwrcze oddziaywanie na inne organizmy atraktanty lub deterenty funkcje substancji sygnaowych

MYROZYNAZY (TIOGLUKOZYDAZY)

Pod wpywem enzymatycznej hydrolizy z glukozynolanw powstaj aktywne biologicznie izotiocyjaniany i indole (Higden JV et al., PharmacolRes, 2007, 55)

Enzymatyczna hydroliza synigryny

OCHRONA GLUKOZYDW W KOMRKACH ROLIN

przez umiejscowienie enzymw tylko w specjalistycznych komrkach (idioblastach) przez rozdzielenie glikozydu i enzymu w organellach komrkowych przez odpowiedni mechanizm regulacji aktywnoci enzymu

Wakuola

Cytosol

CJANOGENEZA

cjanogeneza jest istotnym mechanizmem obronnym rolin glikozydy cjanogenne s nietoksyczne; wystpuj w wakuolach rolinnych toksyczny efekt jest uwarunkowany obecnoci glikozydazy i liazy hydroksynitrylowej zachodzi u licznych ok. 2650 gatunkw rolin (m.in. len, kauczukowiec, mczennica, fasola, maniok, rol. rodz. Asteraceae) HCN moe by te produktem ubocznym syntezy etylenu z ACC (kw. 1-amino-cyklopropano-1-karboksylowego), pod wpywem dziaania HRP zidentyfikowano ok. 60 zwizkw cjanogennych

Cjanogeneza enzymatyczna hydroliza amygdalinyGlukozydaza migdaw ma zastosowanie do oznaczania HCN

PODSUMOWANIEszerokie spektrum zastosowa enzymw rolinnych atwo pozyskiwania wystpowanie najczciej w kompleksach wieloenzymatycznych wygodne skalowanie produkcji moliwo uzyskania czystych preparatw moliwo wprowadzania modyfikacji genetycznych

INNE

Fitaza Fenoloksydaza Dioksygenaza hydroksylujca Amylaza Syntaza izoflawonowa RuBisCO Lipooksygenaza Chlorofilaza Fosforylaza alfa-glukanowa

DZIKUJ [email protected]

Enzymy w surowcach roślinnych

Documents

Transcript of Enzymy w surowcach roślinnych