ENZYMY SUROWCW ROLINNYCHI ich zastosowaniadr n. farm. Micha Cichocki
ALLELOPATIA
BIOTECHNOLOGICZNE SPOJRZENIE NA ROLINYrdo cennych substancji odywczych i biologicznie czynnych
Alternatywne bioreaktory, produkujce biaka zwierzce i ludzkie
rdo enzymw, szeroko stosowanych w przemyle spoywczym, chemicznym, farmaceutycznym,
POTENCJALNE CELE BADA NAD SUBSTANCJAMI PRODUKOWANYMI W ROLINACH
poszukiwanie zwizkw o waciwociach odywczych (witaminy, nutraceutyki) poszukiwanie analogw substancji fizjologicznych (np. fitoestrogeny) poszukiwanie zwizkw czynnych o nowych waciwociach biologicznych (np. alkaloidy barwinka, terpeny cisu)
DLACZEGO POTRZEBUJEMY ENZYMW?
tradycyjna synteza organiczna dostarcza maksymalnie 200-300 nowych zwizkw rocznie wprowadzenie na rynek nowego leku wymaga syntezy ok. 6200 zwizkw chemicznych koszt wyprodukowania i skomercjalizowania nowego zwizku chemicznego przekracza 350 mln $ czas wprowadzenia na rynek nowego leku wynosi ok. 13 lat liczba ludnoci na wiecie do roku 2040 osignie 10 mld (wyzwanie dla medycyny i ywienia)
ENZYMY ROLINNE, JAKO TARGET:
nowoczesne rolnictwo zrwnowaone wymaga poszukiwania nowych rodkw ochrony rolin obecnie stosowane herbicydy opieraj si o zwizki czynne bdce inhibitorami:
syntezy acetylomleczanu utleniania protoporfirynogenu aktywnoci dioksygenazy phydroksyfenylopirogronianowej desaturazy fitoenowej
poszukiwanie nowych herbicydw w oparciu o rda naturalne
Ewolucja enzymw na przykadzie CYP450
mld lat
liczba genw CYP
WIAT WG ENZYMW
XIX w. Pasteur opisuje fermentacj
pocz. XX w. Bchner otrzymuje zymaz
liczba opisanych enzymw ok. 33 800(wg: http://www.brenda-enzymes.info/)
ENZYMY = BIOKATALIZATORY= biaka przyspieszajce reakcje biochemiczne
DLACZEGO TAK SI DZIEJE?porzdkowanie ukadu steryczne zblienie substratw zmiana stopnia uwodnienia substratw odksztacanie struktury substratuCMON !
ENZYMY NIE WPYWAJ NA RWNOWAG REAKCJI, LECZ PRZYSPIESZAJ JEJ OSIGNICIE, CO ZOSTAJE UZYSKANE PRZEZ STABILIZACJ STANU PRZEJCIOWEGO
S SSubstrat stan przejciowy
Pprodukt
Energia swobodna Gibbsa
G = GS GSSzybko reakcji jest proporcjonalna do stenia S, ktre zaley od G
S
S
P
CECHY KATALIZY ENZYMATYCZNEJ:
szybko przyspieszanie reakcji co najmniej 1 mln razy; anhydraza wglanowa (EC 4.2.1.1) uwadnia 100 tys. czsteczek CO2 na sekund! specyficzno (w tym stereospecyficzno) i precyzja: polimeraza DNA I myli si rzadziej ni raz na milion dziaanie w agodnych warunkach (Patm., rod. wodne, pH2.0-8.0 (~ 7.0), temp. 20-40C)
moliwo precyzyjnej regulacji enzymy s duymi biakami globularnymireszt aa, powyej 100 kDa, > 2.5 nm)
(powyej 100
ZACHOWANIE ODPOWIEDNIEJ STRUKTURY BIAKA WARUNKUJE AKTYWNO ENZYMU
ENZYMY: PRZYJACIELE CZY WROGOWIE?
PODZIA ENZYMW Z PUNKTU WIDZENIA TECHNOLOGW PRZEMYSU ZIELARSKIEGO:
HYDROLAZY POLIMERAZY
OKSYDOREDUKTAZY
SUSZENIE NAJSTARSZA FORMA STABILIZACJI SUROWCW ZIELARSKICH
BIOSYNTEZA ETYLENUOH S O NH2 CH3 O NH2 OH Ribose-Adenine S+
H2C
CH 2
CH3H2N
C COOH
Askorbinian
L-Met
SAM
ACC
Aktywacja kinaz biakowych
H2C
CH2
STABILIZACJA SUROWCW ZIELARSKICH ETANOLEM
temp. wrzenia = 78C, LD50 = 7060mg/kg m.c. denaturuje biako w wysokich steniach > 90% dziaanie antyseptyczne w steniu 70%
dziaanie na wiee surowce parami etanolu 9096% w temp. 75-90C, przy cinieniu 0,2-2,5 MPa, w cigu 1 - 3h
KLASYFIKACJA ENZYMW (wg IUBMB)EC 1 oksydoreduktazy (np. ligninazy) EC 2 transferazy (np. polimeraza DNA) EC 3 hydrolazy (np. celulaza) EC 4 liazy (np. pektynazy) EC 5 izomerazy (np. mutazy, racemazy) EC 6 ligazy (np. ligaza DNA)
EC 1 - OKSYDOREDUKTAZY
Dehydrogenazy np. ADH (EC 1.1.1.1)koenzymami (przenonikami) s dla tych enzymw NAD/NADP oraz FAD/FMN
EC 1 - OKSYDOREDUKTAZY
Oksydazy np. GOx (EC 1.1.3.4)
sporo zastosowa w przemyle i medycynie uzyskiwane g. z drobnoustrojw (Aspergillus niger, Penicilium sp.) wystpuj take w miodzie
GOx oksydaza glukozowa i jej zastosowanie
powstajcy nadtlenek wodoru ma dziaanie antyseptyczne GOx jest wykorzystywana w tzw. oznaczeniach porednich, np. w testach diagnostycznych do oznacze glukozy razem z katalaz uywana w przemyle spoywczym w celu rozkadu glukozy (np. w sproszkowanym biaku jaja kurzego) oraz rozkadu tlenu w pakowanych hermetycznie produktach
OH H H OH HO H OH H H O OH
H2O
-D-glukoza
Kw. glukonowy
H2O2
pomiar glukozy moe odbywa si na podstawie pomiaru przepywu elektronw(np. Abbott Medisense Sensor electrodesTM)
kolorymetrycznie, na podstawie reakcji powstaego H2O2 w obecnoci peroksydazy z chromogenem (np. piramidon + kwas phydroksybenzoesowy)
2H2O2 + POD + 4-aminoantipyrine barwnik chinonoiminowy + 4H2Omax = 510nm
EC 1 - OKSYDOREDUKTAZY
EC 1.11 peroksydazy (np. katalaza, HRP, APX)
PEROKSYDAZY FAM. CRUCIFERAE
15 izoenzymw, najbardziej znane HRP (EC 1.11.1.7) wystpuj w korzeniach chrzanu (Armoracia rusticana), najwaniejsza jest HRP C posiadaj hemow grup prostetyczn wykorzystuj nadtlenek wodoru do utleniania rnych substratw rola fizjologiczna HRP: metabolizm kwasu indolo-3-octowego, procesy lignifikacji, tworzenia polimerw ciany komkowej, suberyny, odporno na infekcje ZASTOSOWANIE HRP: enzym wykorzystywany w metodach immunoenzymatycznych (substrat: o-fenylenodiamina) POTENCJALNE ZASTOSOWANIE: wraz z IAA w terapii NWT
ZASTOSOWANIA HRPmetody immunoenzymatyczne (substraty: luminol, tetrametylobenzydyna, tetrachlorek diaminobenzydyny; DAB) oksydacja enancjoselektywna synteza chemiczna (np. w syntezie winkrystyny i wimblastyny) terapia NWT (POTENCJALNIE): poczenie wraz z IAA
HRP stosuje si do znakowania przeciwcia
H3C
CH3
H3C
CH3
H2N
NH2
HRP
HN
NH
H3C
CH3
H3C
CH3
3,3,5,5-Tetramethylbenzidine (TMB) max=285nm max=450nm
HRP stosuje si do znakowania przeciwcia (2)
substraty: luminol, cjalumen, lucygenina wzmacniacze: p-jodofenol, kwas p-kumarowy, fenol, anilinaNH2 O
NH2
O-
NH NH
HRP
O O
+
O
O
Luminol (3-aminohydrazyd kwasu ftalowego)
HRP I IAA: POCZENIE KORZYSTNE W TERAPII NWT
IAA naley do tzw. auksyn rolinnych jego metabolit, powst. w wyniku reakcji katalizowanej przez HRP jest cytotoksyczny metabolit reaguje ze zwizkami nukleofilowymi, jak GSH lub biaka histonwO
CH2OH
HRPN H
O N H
IAA
3-metyleno-2-oksoindol
APX peroksydaza L-askorbinianu (askorbinaza), EC 1.11.1.11
HO O HO HO O OH
H 2 O2
2H2O HO
HO O O
APX O OKw. askorbowy Kw. dehydroaskorbowy
EC 1 - OKSYDOREDUKTAZY
Oksygenazy (mono- i di-)
EC 1.14 MFO
rolinne cytochromy P450 (CYP450) superrodzina enzymw zaangaowanych w metabolizm zwizkw endogennych (np. steroli, terpenw, izoflawonw, gibberelin) i ksenobiotykw (np.herbicydw)
> 1000 izoenzymw, zgrupowanych w 22 rodzinach katalizuj reakcje hydroksylacji, epoksydacji, dealkilacji, izomeryzacji, cyklizacji, aromatyzacji dekarboksylacji i wiele innych
WIELE SPORD ROLINNYCH ZWIZKW CZYNNYCH TO METABOLITY
SUBSTRATY ROLINNYCH CYP450:
zw. fenoloweizoprenoidy aminokwasy
lignina, barw. flawonoidowe, fitoaleksyny, izoflawonoidysteroidy, karotenoidy, gibbereliny, brasinolidy, cytokininy glukozynolany, glukozydy cjanogenne, cykliczne kwasy hydroksamowe kutyny, suberyny, czst. sygnaowe morfina, alkaloidy p/NWT
kw. tuszczowe alkaloidy ksenobiotyki
herbicydy (detoksykacja / aktywacja)
BIOSYNTEZA HORM. STEROIDOWYCH U ROLINCYP90B CYP724B
OH H3CCH3 H3C H3C CH3 CH3 CH3
H3CCYP?
CH3 HO CH3
H3C CH3
CYP450
HOCYP90C CYP90D
HOHO
O H OCYP85A2
CYP90A CYP85A1
Kampesterol
Brasinolidy (rol. h. wzrostu) Rzodkiewnik, Ry, Pomidor
METABOLIZM ZWIZKW FENOLOWYCHPEP + Erytrozo-4-P dehydrochinon
SUBST. ZAPACHOWE BARWNIKI ANTYOKSYDANTY
szikiminian
LIGNINA
choryzmian
COOH
COOH
COOH
COOH
COOH
CYP73
CYP98
CYP84
OH OH OH OH
OMe
HO OH
OMe
Kwas cynamonowy
Kwas p-kumarowy
Kwas kawowy
Kwas ferulowy
Kwas 5-hydroksyferulowy
METABOLIZM FLAWONOIDW
Morant M. et al. (2003) Current Opinion in Biotechnology
Morant M. et al. (2003) Current Opinion in Biotechnology
W SZLAKACH BIOSYNTEZY POLIFENOLI UCZESTNICZ KOMPLEKSY WIELOENZYMATYCZNE, ZLOKALIZOWANE W RE
CYP450 S ZAANGAOWANE W METABOLIZM HERBICYDWO N H3C NH CH3 HO
CYP76B1H3C NH
NH2
CYP76B1ClCl
fitotoksycznyO N H3C NH CH3 CH3
nietoksyczny dla rolin
CYP71A9Cl
O HO NH N
CH3
CH3
Cl
nietoksyczny dla rolin
Schemat biosyntezy niektrych polifenoli w owocach borwek(Jaakola L., et al. (2002) Plant Physiol)
PAL liaza Phe gr. aminowa CHS syntaza chalkonowa CHI izomeraza chalkonowa F3H hydroksylaza flawonoidowa ANS syntaza antocjanidyn LCR reduktaza leukantocjanidyn MT - metylotransferaza
Zmiany zawartoci flawonoli i antocjanin podczas procesu dojrzewania owocw borwki czernicy (Vaccinum myrtillus)
Biosynteza antocjanin i flawan-3-oli(Griesser M., et al. (2008) Plant Physiol)
FHT hydroksylaza flawanonw DFR reduktaza dihydroflawonoli ANS syntaza antocjanidyn LAR reduktaza leukantocjanidyn GT - glykozylotransferazy
Biosynteza taksanw
taksol (PaclitaxelTM) jest naturalnym diterpenem, uzyskiwanym gwnie z kory cisu (Taxus sp.) aktywno p/NWT polega na zakcaniu depolimeryzacji mikrotubul, co prowadzi do zatrzymania podziaw komrki wysoka skuteczno w raku jajnikw; czsto stosowany w poczeniu z cisplatyn istnieje moliwo syntezy taksolu z prekursorw: 10-deacetylobakatyny III (10-DAB) lub z bakatyny III (obecnej m.in. w igach cisu)
Badania nad syntez diterpenw we woniczkach tytoniu (Wang E, Wagner GJ, 2003)IPP + DMAPPCH3 CH3 CH3
OPP
??
CH3 H3C
TAKSOIDY>300 taksoidw 13 miejsc ulegajcych oksydacjiCH3
GGPPOH
H3C
H3C CH3CH3
H3C
1
CH3
CH3
H3CCH3
kembratrieno-dioleH3C OH CH3 CH3 CH3
CH3
EC 2 - TRANSFERAZY
enzymy przenoszce grupy funkcyjne (np.polimerazy DNA)
kluczowy enzym w biosyntezie aminokwasw aromatycznych EPSPS(syntetaza fosforanu 5-enolopirogronianoszikimianu)
Polimeraza Taqtermostabilna trwaa w temp. >90C; optimum aktywnoci w 74-80C oryginalnie wystpuje u bakterii Thermus aquaticus 1989: Molecule of the year (by Science) zastosowanie: PCR obecnie pozyskiwana z rekombinowanych szczepw E. coli modyfikacje: np. Hot start polymerase
BIOSYNTEZA AMINOKWASW AROMATYCZNYCH SPECJALNO ROLINEPSPS = syntaza 5-enolopirogroniano-szikimowo-3-fosforanowa
E-4-P + PEP
EPSPS
szikimian
choryzmian
prefenianantranilan
Phe
Tyr Trp
EC 3 - HYDROLAZY
EC 3.1 esterazy (np. lipazy, AP) EC 3.2 glikozydazy (np. emulsyna, myrozynaza) EC 3.4 proteazy (np. bromelaina, papaina, pepsyna)
AP (ALP)
Fosfataza zasadowa, EC 3.1.3.1 typowe substraty: alkaloidy, biaka, nukleotydy wystpowanie: szeroko w wiecie rolinnym i zwierzcym; do celw komercyjnych pozyskiwana z bakterii (g. E. coli) ZASTOSOWANIE:
marker pasteryzacji mleka biologia molekularna (wizualizacja) utrzymywanie jednoniciowego DNA
PULLULANAZA ????????
Enzym amylolityczny, rozkadajcy rozgazione wizania -1,6 w acuchach skrobi, dekstryn i oligosacharydw Wystpuje w bawenie, ryu. Do produkcji przemysowej pozyskiwana z bakterii (np. Geobacillus stearothermophilus)
Zastosowanie: browarnictwo (PROMOZYME Brew Q), gorzelnictwo (PullDistill 100) -> przyspieszone scukrzanie skrobii
AP stosuje si do znakowania przeciwcia (3)
substrat: fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolylu utleniacz: p-nitroblue tetrazolium (NBT)O Cl O P O-
O
-
Cl
OH
Cl
O H N
Br
AP
Br
NBTN H
Br
N H
N H O Cl
Br
BCIP
PROTEAZY CYSTEINOWE
aktinidaina (kiwi) bromelaina (ananas) papaina (papaja) fikaina (figa)
AKTINIDAINA (EC 3.4.22.14)obecna w owocach kiwi, ananasa, papaja i mango proteaza cysteinowa waciwoci allergenne wykorzystywana do zmikczania misa
BROMELAINA (EC 3.4.22.33)wystpuje w owocach ananasa rodek wspomagajcy trawienie biaek pokarmowych leczenie ropni, zakrzepw, obrzkw, zewntrznie do leczenia owrzodze i stanw zapalnych skry waciwoci p/zapalne potwierdzone in vitro i in vivo postulowane dziaanie przeciwnowotworoweOrsini RA , (2006) Plast Reconstr Surg.
PAPAINA (EC 3.4.22.2)z owocw Carica papaya proteaza cysteinowa zastosowanie: przemys spoywczy (misny) niweluje dziaanie niekt. jadw (pszczoy, komara) uywana w hodowlach komrkowych (obok trypsyny) oczyszczanie ran z tk. martwiczej
CHYMOPAPAINA (EC 3.4. ???)
z owocw Carica papaya (z mleczka lateksowego) proteaza cysteinowa zastosowanie: leczenie przepukliny dyskowej (CHYMODIACTIN)
FIKAINAaktywno proteazy cysteinowej oraz esterazy wystpuje w owocach figowca
NUKLEAZY (FOSFODIESTERAZY) E.C. 3.1
egzo i endonukleazy (fosfodiesterazy) g. pochodzenia bakteryjnego (np. Eco RI, Bam HI, Hin DIII) nukleaza fasoli zotej (Mung Beam, Vigna radiata) wysokie powinowactwo do ssDNA
GLUKOZYNOLANY I MYROZYNAZY ENZYMY ROZKADAJCE GLUKOZYNOLANY
nieznana rola glukozynolanw w fizjologii rolin posiadaj wysok aktywno biologiczn dziaanie wolotwrcze oddziaywanie na inne organizmy atraktanty lub deterenty funkcje substancji sygnaowych
MYROZYNAZY (TIOGLUKOZYDAZY)
Pod wpywem enzymatycznej hydrolizy z glukozynolanw powstaj aktywne biologicznie izotiocyjaniany i indole (Higden JV et al., PharmacolRes, 2007, 55)
Enzymatyczna hydroliza synigryny
OCHRONA GLUKOZYDW W KOMRKACH ROLIN
przez umiejscowienie enzymw tylko w specjalistycznych komrkach (idioblastach) przez rozdzielenie glikozydu i enzymu w organellach komrkowych przez odpowiedni mechanizm regulacji aktywnoci enzymu
Wakuola
Cytosol
CJANOGENEZA
cjanogeneza jest istotnym mechanizmem obronnym rolin glikozydy cjanogenne s nietoksyczne; wystpuj w wakuolach rolinnych toksyczny efekt jest uwarunkowany obecnoci glikozydazy i liazy hydroksynitrylowej zachodzi u licznych ok. 2650 gatunkw rolin (m.in. len, kauczukowiec, mczennica, fasola, maniok, rol. rodz. Asteraceae) HCN moe by te produktem ubocznym syntezy etylenu z ACC (kw. 1-amino-cyklopropano-1-karboksylowego), pod wpywem dziaania HRP zidentyfikowano ok. 60 zwizkw cjanogennych
Cjanogeneza enzymatyczna hydroliza amygdalinyGlukozydaza migdaw ma zastosowanie do oznaczania HCN
PODSUMOWANIEszerokie spektrum zastosowa enzymw rolinnych atwo pozyskiwania wystpowanie najczciej w kompleksach wieloenzymatycznych wygodne skalowanie produkcji moliwo uzyskania czystych preparatw moliwo wprowadzania modyfikacji genetycznych
INNE
Fitaza Fenoloksydaza Dioksygenaza hydroksylujca Amylaza Syntaza izoflawonowa RuBisCO Lipooksygenaza Chlorofilaza Fosforylaza alfa-glukanowa
DZIKUJ [email protected]
Top Related