Przeciwciała monoklonalne w diagnostyce

Immunodiagnostyka

• Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne – cechy charakterystyczne i różnice, w kontekście zastosowań w diagnostyce

• Metody otrzymywania, modyfikacje

• Testy – techniki laboratoryjne

• Zastosowanie w diagnostyce

Problemy:

Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne mogą być stosowane w testach mających za zadanie:

o identyfikację

o oznaczenie ilościowe

o lokalizację

molekuł lub komórek (własnych lub obcych).

Immunodiagnostyka

Zastosowanie w medycynie i medycynie weterynaryjnej w dziedzinach:

• mikrobiologia

• immunologia

• hematologia i transfuzjologia

• patofizjologia

• histopatologia

• medycyna sądowa

Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne

Immunoglobuliny, białka wytwarzane przez w pełni zróżnicowana limfocyty B – plazmocyty Zdolne do swoistego wiązania z antygenem

http://www.bu.edu/research/news-events/research-magazine/2009-toc/features/research-realized/

Otrzymywanie przeciwciał poli- i monoklonalnych

Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych

Veterinary immunology. 9th edn. Edited by IR Tizard. Elsevier, St Louis, 2013

Pierwszy kontakt z antygenem

Drugi kontakt z antygenem

Wspólne miano

Miano przeciwcia

ł

Przeciwciała poliklonalne c.d.

www.slideshare.net-

Przemysłowa produkcja przeciwciał monoklonalnych

www.sciencephoto.com

• Wytwarzane przez nieróżnicujące się, stanowiące jeden klon limfocyty B

• Rozpoznają tylko jedną determinantę antygenową

• Produkcja jest znacznie bardziej skomplikowana i droższa

• Stosowane, gdy wymagana jest wysoka specyficzność i powtarzalność reakcji z antygenem

Przeciwciała monoklonalne (MAbs)

• Można ich używać w bardzo niskich stężeniach

• Umożliwiają odróżnienie minimalnie różniących się

antygenów (zmiana jednego aminokwasu)

• Pozwalają na wykrywanie modyfikacji antygenu

(utlenianie, fosforylacja itp.)

• Umożliwiają odróżnienie izoenzymu czy proenzymu od

enzymu, białka prawidłowego od nowotworowego,

szczepów bakterii czy mutacji wirusów

Zalety MAbs

• Niska zachłanność (awidność, siła wiązania poliwalentnego antygenu z kilkoma paratopami przeciwciała)

• Stąd ograniczone zastosowanie w immunoprecypitacji i aglutynacji

• Mogą rozpoznawać dwa antygeny na których jest obecny ten sam epitop

Wady stosowania MAbs w diagnostyce

• Najczęściej stosowane są przeciwciała mysie

• Stosowane do identyfikacji cząsteczek docelowych

i ekspresji białek w tkankach lub na poziomie

komórki

• Stosowane do wykrywania i określania stężeń leków,

hormonów, enzymów – nawet w bardzo niskich

stężeniach.

• Usprawniają diagnostykę chorób zakaźnych

Przeciwciała monoklonalne w diagnostyce

Funkcje efektorowe MAbs można wzmacniać przez wiązanie z:

• Radioizotopami

• Enzymami

• Fluorochromami

• Lekami

• Toksynami

Immunokoniugaty

przydatne w diagnostyce

Antibody conjugates can be generated by: targeting natural amino acids (1) interchain disulfides (2), ngineered cysteines (3), non-natural amino acids (4), the carbohydrate moiety (5), the N-terminus of heavy and light chain (6) engineered tags (7). Strong protein-protein interaction, i.e., Fc-binding domains (FcBD) can be used to form non-covalent antibody conjugates (8). Additionally, the nucleotide binding site (NBS) is a valuable antibody modification site for photoaffinity labeling (9) and antibodies with catalytic activity (10) can be exploited to form bioconjugates where the coupled pharmacophore, e.g., a peptide assumes the targeting function and the antibody acts as a cargo molecule.

Antibody Conjugates: From Heterogeneous Populations to Defined Reagents Patrick Dennler 1, Eliane Fischer 1 and Roger Schibli 1,2,*

Toxins2011, 3(7), 848-883; doi:10.3390/toxins3070848

Fluorochromy - przykłady

pochodne fluoresceiny (np. FITC), Cy2, AlexaFluor 488

pochodne rodaminy (np. TRITC), Cy3, Texas Red, AlexaFluor 555

pochodne kumaryny (np. AMCA), AlexaFluor 405

Cy5, AlexaFluor 647 – emisja

w widmie podczerwieni

Koniugaty z fluorochromami

Schematic diagram of conjugation. Latex was conjugated with glutaraldehyde and antibody by forming amide bonds in biocarbonate buffer (pH

8.5) (a-d).

Fluorescence absorption and emission spectra

Koniugat MAb z fluorochromem

Theranostics 2014; 4(12):1239-1249. doi:10.7150/thno.10255

Koniugaty z radioizotopami

a. monoclonal antibody conjugated directly to radionuclide. b. antibody-streptavidin (Ab-SA) conjugates, followed by radiolabelled DOTA-biotin. The tetrameric streptavidin molecule can bind four radio-DOTA-biotin moieties, amplifying tumour-targeted radioactivity. c. Bispecific antibody pre-targeting for RIT using radiolabelled bivalent haptens and affinity enhancement system. d. Pre-targeting using antibodies conjugated to an antisense phosphorodiamidate morpholino oligomer (MORF) oligonucleotide followed by administration of a radiolabelled complementary c-MORF oligomer. http://www.nature.com/nrc/journal/v15/n6/fig_tab/nrc3925_F4.html

Koniugaty z enzymami

Nature Biotechnology 23, 1147 - 1157 (2005)

Stosowane enzymy

peroksydaza chrzanowa (HRP)

alkaliczna fosfataza (AP)

oksydaza glukozowa (Aspergillus niger)

b-galaktozydaza (E. coli)

peroksydaza chrzanowa 3,3’diaminobenzydyna (DAB) 3amino-9etylokarbazol (AEC) 4chloro-1naftol (CN)

alkaliczna fosfataza new fuchsin fast red

Chromogeny

• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) • Testy radioimmunologiczne • Western blotting • Cytometria przepływowa • Immunohistochemia • Mikromacierze białkowe • Immunoprecypitacja • Immunodyfuzja • Immunoelektroforeza • Immunofiksacja • Aglutynacja • Test komplementacji

Testy diagnostyczne z zastosowaniem MAb

Wybór testu dla celu molekularnego

Immunoprecipitacja • Precypitacja tyko przy

właściwej proporcji antygen-przeciwciało

• Pozwala na ilościowe oznaczanie przeciwciał

• Stosowany np. w diagnostyce chorób zakaźnych

Immunodyfuzja

Testy aglutynacji

Aglutynacja –”wykłaczanie” (clumping)

Test aglutynacji lateksowej

okrągłe cząstki opłaszczone przeciwciałem (antygenem) zlepiają się (aglutynują) w obecności antygenu (przeciwciała), a efekt jest widoczny gołym okiem lub przy użyciu nefelometru (jak podczas hemaglutynacji niezgodnych grupowo krwinek)

Test komplementacji

Nowoczesne metody diagnostyczne, immunodiagnostyka, dr hab. B. Krawczyk

Test immunoenzymatyczny (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA)

• Metoda wykrywania antygenów patogennych we krwi i innych płynach ustrojowych

• Umożliwia analizę dużej liczby próbek w tym samym czasie

• Metoda diagnostyki serologicznej

• Test bardzo czuły

• Metoda relatywnie prosta

• Można ją zautomatyzować

• Istnieje kilkadziesiąt odmian

• Testy ELISA standardowo wykonywane są na polistyrenowych lub pleksiglasowych, 96-dołkowych płytkach

• Płytkę opłaszcza się odpowiednim antygenem lub przeciwciałem.

• Reakcję antygen-przeciwciało uwidacznia enzymatyczna reakcja barwna.

• Najczęściej stosowane enzymy to:. - fosfataza alkaliczna (przekształca bezbarwny fosforan p-nitrofenolu w żółty p-nitrofenol), - peroksydaza chrzanowa (daje niebieskie zabarwienie w obecności tetrametylobenzydyny), - oksydaza glukozowa (z kwasem 5-aminosalicylowym daje kolor brunatny).

• Zmiana barwy roztworu mierzona jest spektrofotometrycznie.

Wykonanie

Najczęściej stosowane wersje testu Elisa

https://www.thermofisher.com/

bezpośredni pośredni „sandwich”

Wszystkie wersje wymagają wyznaczonego enzymem przeciwciała

Test ELISA bezpośredni

.

1-opłaszczanie płytki antygenem. 2-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (połączonym z enzymem). 3-inkubacja z odpowiednim substratem powodująca reakcję http://metlab.pl/ELISA_(ang._enzyme-linked_immunosorbent_assay)_p28.html

Test ELISA- pośredni

1-opłaszczanie płytki antygenem. 2-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (o wysokim powinowactwie do antygenu). 3-inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym. 4-inkubacja z odpowiednim substratem.

http://metlab.pl/ELISA_(ang._enzyme-linked_immunosorbent_assay)_p28.html

1-opłaszczanie płytki antygenem-przeciwciałem.

2-inkubacja z z badanym białkiem.

3-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (o wysokim powinowactwie do badanego białka).

4-inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym.

5-inkubacja z odpowiednim substratem powodująca reakcję.

"Sandwich" ELISA

http://metlab.pl/ELISA_(ang._enzyme-linked_immunosorbent_assay)_p28.html

W kompetycyjnych (rywalizacyjnych) testach ELISA (c-ELISA, z ang. competitive ELISA) wykorzystuje się współzawodnictwo o miejsca wiązania na antygenie mieszaniny różnych przeciwciał. W schemacie doświadczenia wyróżnia się metodę pośrednią oraz bezpośrednią (z wykorzystaniem wyznakowanych enzymem przeciwciał pierwszorzędowych).

Kompetycyjny test ELISA

Metoda złożona

Bardzo specyficzna

Wykorzystywana jako ostateczne potwierdzenie diagnozy:

• w diagnostyce chorób bakteryjnych, jak borelioza wywoływana

przez krętka Borelia burgdorferi, gruźlica wywoływana przez prątki

Mycobacterium tuberculosis,

• w diagnostyce zakażeń wirusami, jak np. HIV, koronawirus wywołujący

SARS czy wirus HSV będący czynnikiem etiologicznym opryszczki ,

• w diagnostyce niektórych chorób pasożytniczych, jak wągrzyca

spowodowana przez larwy tasiemca uzbrojonego,

• w diagnostyce chorób genetycznych, jak pewne formy niedokrwistości

Fanconiego.

• Dane literaturowe wskazują, że możliwe jest również zastosowanie tej

techniki w diagnostyce nowotworów.

Western blotting

Western blotting

https://www.thermofisher.com

1. Rozdrobnienie próbki do uzyskania zawiesiny białek

2. Rozdział białek - elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym

3. Rozdzielone białka są przenoszone na trwałe podłoże (np. nitroceluloza)

4. Błona zanurzona w roztworze zawierającym określone „czyste” przeciwciała

5. Odpłukanie niezwiązanych z antygenem przeciwciał

6. Zanurzenie błony w roztworze zawierającym skoniugowane np. z enzymem przeciwciała rozpoznające fragmenty Fc przeciwciał związanych z antygenem

7. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję.

1. Rozdrobnienie próbki do uzyskania zawiesiny białek

2. Rozdział białek - elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym

3. Rozdzielone białka są przenoszone na trwałe podłoże (np. nitroceluloza)

4. Błona zanurzona w roztworze zawierającym określone przeciwciała skoniugowane np. z enzymem

5. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję.

Western blot –bezpośrednia metoda

Metoda wykrywania antygenów powierzchniowych przez immunofenotypowanie

Wykorzystane MAbs wyznakowane fluorochromami (FITC, PE)

Przeciwciała rozpoznają epitopy np. komórek krwi

Zawiesinę komórek analizuje się ilościowo przy użyciu cytometru przepływowego

Cytometr „zasysa” komórki układające się w

liniowy strumień

Wiązka laserowa wzbudza fluorescencję

Detektor określa wielkość i ziarnistość

komórek wyznakowanych przeciwciałami

Cytometria przepływowa

e-biotechnologia. pl

Immunofenotypowanie

Zastosowanie W hematologii: umożliwia określenie fenotypu komórek

białaczkowych lub chłoniaków

W chorobach zakaźnych: np. określa zaawansowanie AIDS

W diagnostyce niedoborów immunologicznych

Możliwe jest wykrywanie antygenów wewnątrzkomórkowych - po permeabilizowaniu komórek

Cytometria przepływowa

Metody immunohistochemiczne

• dzięki wykorzystaniu swoistych przeciwciał

pozwalają na identyfikację w materiale

histologicznym specyficznych białek

(antygeny)

• dzięki czułym metodom detekcji umożliwiają

rozpoznanie bardzo małych ilości antygenu

Immunohistochemia

Immunohistochemiczna metoda identyfikacji komórek CD133+ w glioblastoma

yadda.icm.edu.pl

• Uwidocznienie miejsca wiązania się przeciwciała z antygenem zlokalizowanym w komórce czy tkance możliwe jest jedynie pod warunkiem odpowiedniego znakowania przeciwciała

• Przeciwciała mogą być znakowane: • Fluorochromami – metoda immunofluorescencji, barwniki

fluorescencyjne, preparat ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym (czerwień teksańska TR - czerwona fluorescencja)

• Enzymami – metody immunoenzymatyczne, preparat ogląda się w mikroskopie świetlnym lub elektronowym (peroksydaza, fosfataza zasadowa)

• Metalami – preparat ogląda się w mikroskopie elektronowym - ferrytyna (białko zawierające żelazo), koloidalne złoto (mikroskopijne ziarenka metalicznego złota, widoczne w mikroskopie w postaci kontrastowych czarnych punktów)

Immunohistochemia

• Pobrana tkanka jest zamrożona lub utrwalana

• Utrwalana tkanka jest zatapiana w parafinie i cięta mikrotomem

• Skrawki są „przyklejane do szkiełek mikroskopowych

• Przeprowadzana jest inkubacja z przeciwciałami, najczęściej skoniugowanymi z enzymami

• Po odpłukaniu przeciwciał do preparatu dodawane są substraty enzymów

• Strąt barwnika pozostaje w miejscu w którym znajdował się antygen

Immunohistochemia c.d.

blog.ptglab.com

Produkt reakcji chemicznej musi spełniać dwa podstawowe warunki:

Musi być widoczny w obrazie mikroskopowym

Powinien być nierozpuszczalny w środowisku reakcji

Końcowa ocena reakcji histochemicznych odbywa się

przy użyciu wszystkich typów mikroskopów świetlnych

i elektronowych.

Wizualizacja sieci mikrotubul w komórkach nerki. Przeciwcialo I-rzędowe wyznakowane barwnikiem Alexa 486, co umożliwia wybarwienie tubuliny, a przeciwciało II-rzędowe wyznakowane barwnikiem Alexa 546, co umożliwia wybarwienie aktyny.

Radioimmunmologia (RIA)

Metody radioimmunologiczne (RIA) – izotopowe, oparte na pomiarze radioaktywności substancji znakowanej izotopem promieniotwórczym wchodzącej w skład reakcji antygen-przeciwciało. Znakowaniu można poddać antygen lub przeciwciało. Używa się izotopów: 125J, 131J oraz 14C, 3H, 99Tc, inne . Do znakowania antygenów białkowych używa się jodu a do związków drobnocząsteczkowych – trytu lub węgla.

Radioimmunmologia (RIA)

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/Radioimmunoassay.html

Protokół przypomina kompetycyjny test ELISA

1. Arcitumomab [CEA-Scan] – przeciwciało przeciw antygenowi karcynoembrionalnemu (CEA) znakowane radioaktywnym izotopem technetu (99Tc), stosowane do diagnostyki raka jelita grubego i odbytu (scyntygrafia).

2. 99Tc-Bectumomab [LymphoScan] – stosowane w radioimmunoscyntygrafii chłoniaków nieziarniczych typu B (NHL, ang. Non-Hodgkin Lymphoma).

3. Tecnemab – scyntygrafia nawrotów czerniaka

4. OncoScint – wykrywanie raka jelita grubego i jajnika

RIA w diagnostyce nowotworów (scyntygrafia)

Przykłady zastosowania MAbs w diagnostyce

- Wczesne wykrywanie ciąży (1-2 tydzień) - Wykrywanie infekcji wirusowych i bakteryjnych np • HIV • Herpes • Grypa • Chlamydie • Streptokokki - Identyfikacja i charakteryzacja specyficznych

antygenów nowotworowych; klasyfikacja nowotworów

- Obrazowanie; np. lokalizacja nowotworów

Test wykrywający ciążę Test oznacza gonadotropinę kosmówkową CG za pomocą

przeciwciał (3 rodzaje)

Rapid and Quantitative Detection of Zoonotic Influenza A Virus Infection Utilizing Coumarin-derived dendrimer-based

Fluorescent Immunochromatographic Strip Test (FICT)

Theranostics 2014; 4(12):1239-1249. doi:10.7150/thno.10255

Diagnostyka HIV