• Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne – cechy charakterystyczne i różnice, w kontekście zastosowań w diagnostyce
• Metody otrzymywania, modyfikacje
• Testy – techniki laboratoryjne
• Zastosowanie w diagnostyce
Problemy:
Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne mogą być stosowane w testach mających za zadanie:
o identyfikację
o oznaczenie ilościowe
o lokalizację
molekuł lub komórek (własnych lub obcych).
Immunodiagnostyka
Zastosowanie w medycynie i medycynie weterynaryjnej w dziedzinach:
• mikrobiologia
• immunologia
• hematologia i transfuzjologia
• patofizjologia
• histopatologia
• medycyna sądowa
Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne
Immunoglobuliny, białka wytwarzane przez w pełni zróżnicowana limfocyty B – plazmocyty Zdolne do swoistego wiązania z antygenem
http://www.bu.edu/research/news-events/research-magazine/2009-toc/features/research-realized/
Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych
Veterinary immunology. 9th edn. Edited by IR Tizard. Elsevier, St Louis, 2013
Pierwszy kontakt z antygenem
Drugi kontakt z antygenem
Wspólne miano
Miano przeciwcia
ł
• Wytwarzane przez nieróżnicujące się, stanowiące jeden klon limfocyty B
• Rozpoznają tylko jedną determinantę antygenową
• Produkcja jest znacznie bardziej skomplikowana i droższa
• Stosowane, gdy wymagana jest wysoka specyficzność i powtarzalność reakcji z antygenem
Przeciwciała monoklonalne (MAbs)
• Można ich używać w bardzo niskich stężeniach
• Umożliwiają odróżnienie minimalnie różniących się
antygenów (zmiana jednego aminokwasu)
• Pozwalają na wykrywanie modyfikacji antygenu
(utlenianie, fosforylacja itp.)
• Umożliwiają odróżnienie izoenzymu czy proenzymu od
enzymu, białka prawidłowego od nowotworowego,
szczepów bakterii czy mutacji wirusów
Zalety MAbs
• Niska zachłanność (awidność, siła wiązania poliwalentnego antygenu z kilkoma paratopami przeciwciała)
• Stąd ograniczone zastosowanie w immunoprecypitacji i aglutynacji
• Mogą rozpoznawać dwa antygeny na których jest obecny ten sam epitop
Wady stosowania MAbs w diagnostyce
• Najczęściej stosowane są przeciwciała mysie
• Stosowane do identyfikacji cząsteczek docelowych
i ekspresji białek w tkankach lub na poziomie
komórki
• Stosowane do wykrywania i określania stężeń leków,
hormonów, enzymów – nawet w bardzo niskich
stężeniach.
• Usprawniają diagnostykę chorób zakaźnych
Przeciwciała monoklonalne w diagnostyce
Funkcje efektorowe MAbs można wzmacniać przez wiązanie z:
• Radioizotopami
• Enzymami
• Fluorochromami
• Lekami
• Toksynami
Immunokoniugaty
przydatne w diagnostyce
Antibody conjugates can be generated by: targeting natural amino acids (1) interchain disulfides (2), ngineered cysteines (3), non-natural amino acids (4), the carbohydrate moiety (5), the N-terminus of heavy and light chain (6) engineered tags (7). Strong protein-protein interaction, i.e., Fc-binding domains (FcBD) can be used to form non-covalent antibody conjugates (8). Additionally, the nucleotide binding site (NBS) is a valuable antibody modification site for photoaffinity labeling (9) and antibodies with catalytic activity (10) can be exploited to form bioconjugates where the coupled pharmacophore, e.g., a peptide assumes the targeting function and the antibody acts as a cargo molecule.
Antibody Conjugates: From Heterogeneous Populations to Defined Reagents Patrick Dennler 1, Eliane Fischer 1 and Roger Schibli 1,2,*
Fluorochromy - przykłady
pochodne fluoresceiny (np. FITC), Cy2, AlexaFluor 488
pochodne rodaminy (np. TRITC), Cy3, Texas Red, AlexaFluor 555
pochodne kumaryny (np. AMCA), AlexaFluor 405
Cy5, AlexaFluor 647 – emisja
w widmie podczerwieni
Koniugaty z fluorochromami
Schematic diagram of conjugation. Latex was conjugated with glutaraldehyde and antibody by forming amide bonds in biocarbonate buffer (pH
8.5) (a-d).
Fluorescence absorption and emission spectra
Koniugat MAb z fluorochromem
Theranostics 2014; 4(12):1239-1249. doi:10.7150/thno.10255
Koniugaty z radioizotopami
a. monoclonal antibody conjugated directly to radionuclide. b. antibody-streptavidin (Ab-SA) conjugates, followed by radiolabelled DOTA-biotin. The tetrameric streptavidin molecule can bind four radio-DOTA-biotin moieties, amplifying tumour-targeted radioactivity. c. Bispecific antibody pre-targeting for RIT using radiolabelled bivalent haptens and affinity enhancement system. d. Pre-targeting using antibodies conjugated to an antisense phosphorodiamidate morpholino oligomer (MORF) oligonucleotide followed by administration of a radiolabelled complementary c-MORF oligomer. http://www.nature.com/nrc/journal/v15/n6/fig_tab/nrc3925_F4.html
Koniugaty z enzymami
Nature Biotechnology 23, 1147 - 1157 (2005)
Stosowane enzymy
peroksydaza chrzanowa (HRP)
alkaliczna fosfataza (AP)
oksydaza glukozowa (Aspergillus niger)
b-galaktozydaza (E. coli)
peroksydaza chrzanowa 3,3’diaminobenzydyna (DAB) 3amino-9etylokarbazol (AEC) 4chloro-1naftol (CN)
alkaliczna fosfataza new fuchsin fast red
Chromogeny
• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) • Testy radioimmunologiczne • Western blotting • Cytometria przepływowa • Immunohistochemia • Mikromacierze białkowe • Immunoprecypitacja • Immunodyfuzja • Immunoelektroforeza • Immunofiksacja • Aglutynacja • Test komplementacji
Testy diagnostyczne z zastosowaniem MAb
Immunoprecipitacja • Precypitacja tyko przy
właściwej proporcji antygen-przeciwciało
• Pozwala na ilościowe oznaczanie przeciwciał
• Stosowany np. w diagnostyce chorób zakaźnych
Test aglutynacji lateksowej
okrągłe cząstki opłaszczone przeciwciałem (antygenem) zlepiają się (aglutynują) w obecności antygenu (przeciwciała), a efekt jest widoczny gołym okiem lub przy użyciu nefelometru (jak podczas hemaglutynacji niezgodnych grupowo krwinek)
Test immunoenzymatyczny (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA)
• Metoda wykrywania antygenów patogennych we krwi i innych płynach ustrojowych
• Umożliwia analizę dużej liczby próbek w tym samym czasie
• Metoda diagnostyki serologicznej
• Test bardzo czuły
• Metoda relatywnie prosta
• Można ją zautomatyzować
• Istnieje kilkadziesiąt odmian
• Testy ELISA standardowo wykonywane są na polistyrenowych lub pleksiglasowych, 96-dołkowych płytkach
• Płytkę opłaszcza się odpowiednim antygenem lub przeciwciałem.
• Reakcję antygen-przeciwciało uwidacznia enzymatyczna reakcja barwna.
• Najczęściej stosowane enzymy to:. - fosfataza alkaliczna (przekształca bezbarwny fosforan p-nitrofenolu w żółty p-nitrofenol), - peroksydaza chrzanowa (daje niebieskie zabarwienie w obecności tetrametylobenzydyny), - oksydaza glukozowa (z kwasem 5-aminosalicylowym daje kolor brunatny).
• Zmiana barwy roztworu mierzona jest spektrofotometrycznie.
Wykonanie
Najczęściej stosowane wersje testu Elisa
https://www.thermofisher.com/
bezpośredni pośredni „sandwich”
Wszystkie wersje wymagają wyznaczonego enzymem przeciwciała
Test ELISA bezpośredni
.
1-opłaszczanie płytki antygenem. 2-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (połączonym z enzymem). 3-inkubacja z odpowiednim substratem powodująca reakcję http://metlab.pl/ELISA_(ang._enzyme-linked_immunosorbent_assay)_p28.html
Test ELISA- pośredni
1-opłaszczanie płytki antygenem. 2-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (o wysokim powinowactwie do antygenu). 3-inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym. 4-inkubacja z odpowiednim substratem.
http://metlab.pl/ELISA_(ang._enzyme-linked_immunosorbent_assay)_p28.html
1-opłaszczanie płytki antygenem-przeciwciałem.
2-inkubacja z z badanym białkiem.
3-inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (o wysokim powinowactwie do badanego białka).
4-inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym.
5-inkubacja z odpowiednim substratem powodująca reakcję.
"Sandwich" ELISA
http://metlab.pl/ELISA_(ang._enzyme-linked_immunosorbent_assay)_p28.html
W kompetycyjnych (rywalizacyjnych) testach ELISA (c-ELISA, z ang. competitive ELISA) wykorzystuje się współzawodnictwo o miejsca wiązania na antygenie mieszaniny różnych przeciwciał. W schemacie doświadczenia wyróżnia się metodę pośrednią oraz bezpośrednią (z wykorzystaniem wyznakowanych enzymem przeciwciał pierwszorzędowych).
Kompetycyjny test ELISA
Metoda złożona
Bardzo specyficzna
Wykorzystywana jako ostateczne potwierdzenie diagnozy:
• w diagnostyce chorób bakteryjnych, jak borelioza wywoływana
przez krętka Borelia burgdorferi, gruźlica wywoływana przez prątki
Mycobacterium tuberculosis,
• w diagnostyce zakażeń wirusami, jak np. HIV, koronawirus wywołujący
SARS czy wirus HSV będący czynnikiem etiologicznym opryszczki ,
• w diagnostyce niektórych chorób pasożytniczych, jak wągrzyca
spowodowana przez larwy tasiemca uzbrojonego,
• w diagnostyce chorób genetycznych, jak pewne formy niedokrwistości
Fanconiego.
• Dane literaturowe wskazują, że możliwe jest również zastosowanie tej
techniki w diagnostyce nowotworów.
Western blotting
Western blotting
https://www.thermofisher.com
1. Rozdrobnienie próbki do uzyskania zawiesiny białek
2. Rozdział białek - elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym
3. Rozdzielone białka są przenoszone na trwałe podłoże (np. nitroceluloza)
4. Błona zanurzona w roztworze zawierającym określone „czyste” przeciwciała
5. Odpłukanie niezwiązanych z antygenem przeciwciał
6. Zanurzenie błony w roztworze zawierającym skoniugowane np. z enzymem przeciwciała rozpoznające fragmenty Fc przeciwciał związanych z antygenem
7. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję.
1. Rozdrobnienie próbki do uzyskania zawiesiny białek
2. Rozdział białek - elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym
3. Rozdzielone białka są przenoszone na trwałe podłoże (np. nitroceluloza)
4. Błona zanurzona w roztworze zawierającym określone przeciwciała skoniugowane np. z enzymem
5. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję.
Western blot –bezpośrednia metoda
Metoda wykrywania antygenów powierzchniowych przez immunofenotypowanie
Wykorzystane MAbs wyznakowane fluorochromami (FITC, PE)
Przeciwciała rozpoznają epitopy np. komórek krwi
Zawiesinę komórek analizuje się ilościowo przy użyciu cytometru przepływowego
Cytometr „zasysa” komórki układające się w
liniowy strumień
Wiązka laserowa wzbudza fluorescencję
Detektor określa wielkość i ziarnistość
komórek wyznakowanych przeciwciałami
Cytometria przepływowa
e-biotechnologia. pl
Zastosowanie W hematologii: umożliwia określenie fenotypu komórek
białaczkowych lub chłoniaków
W chorobach zakaźnych: np. określa zaawansowanie AIDS
W diagnostyce niedoborów immunologicznych
Możliwe jest wykrywanie antygenów wewnątrzkomórkowych - po permeabilizowaniu komórek
Cytometria przepływowa
Metody immunohistochemiczne
• dzięki wykorzystaniu swoistych przeciwciał
pozwalają na identyfikację w materiale
histologicznym specyficznych białek
(antygeny)
• dzięki czułym metodom detekcji umożliwiają
rozpoznanie bardzo małych ilości antygenu
Immunohistochemia
Immunohistochemiczna metoda identyfikacji komórek CD133+ w glioblastoma
yadda.icm.edu.pl
• Uwidocznienie miejsca wiązania się przeciwciała z antygenem zlokalizowanym w komórce czy tkance możliwe jest jedynie pod warunkiem odpowiedniego znakowania przeciwciała
• Przeciwciała mogą być znakowane: • Fluorochromami – metoda immunofluorescencji, barwniki
fluorescencyjne, preparat ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym (czerwień teksańska TR - czerwona fluorescencja)
• Enzymami – metody immunoenzymatyczne, preparat ogląda się w mikroskopie świetlnym lub elektronowym (peroksydaza, fosfataza zasadowa)
• Metalami – preparat ogląda się w mikroskopie elektronowym - ferrytyna (białko zawierające żelazo), koloidalne złoto (mikroskopijne ziarenka metalicznego złota, widoczne w mikroskopie w postaci kontrastowych czarnych punktów)
Immunohistochemia
• Pobrana tkanka jest zamrożona lub utrwalana
• Utrwalana tkanka jest zatapiana w parafinie i cięta mikrotomem
• Skrawki są „przyklejane do szkiełek mikroskopowych
• Przeprowadzana jest inkubacja z przeciwciałami, najczęściej skoniugowanymi z enzymami
• Po odpłukaniu przeciwciał do preparatu dodawane są substraty enzymów
• Strąt barwnika pozostaje w miejscu w którym znajdował się antygen
Immunohistochemia c.d.
blog.ptglab.com
Produkt reakcji chemicznej musi spełniać dwa podstawowe warunki:
Musi być widoczny w obrazie mikroskopowym
Powinien być nierozpuszczalny w środowisku reakcji
Końcowa ocena reakcji histochemicznych odbywa się
przy użyciu wszystkich typów mikroskopów świetlnych
i elektronowych.
Wizualizacja sieci mikrotubul w komórkach nerki. Przeciwcialo I-rzędowe wyznakowane barwnikiem Alexa 486, co umożliwia wybarwienie tubuliny, a przeciwciało II-rzędowe wyznakowane barwnikiem Alexa 546, co umożliwia wybarwienie aktyny.
Radioimmunmologia (RIA)
Metody radioimmunologiczne (RIA) – izotopowe, oparte na pomiarze radioaktywności substancji znakowanej izotopem promieniotwórczym wchodzącej w skład reakcji antygen-przeciwciało. Znakowaniu można poddać antygen lub przeciwciało. Używa się izotopów: 125J, 131J oraz 14C, 3H, 99Tc, inne . Do znakowania antygenów białkowych używa się jodu a do związków drobnocząsteczkowych – trytu lub węgla.
Radioimmunmologia (RIA)
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/Radioimmunoassay.html
Protokół przypomina kompetycyjny test ELISA
1. Arcitumomab [CEA-Scan] – przeciwciało przeciw antygenowi karcynoembrionalnemu (CEA) znakowane radioaktywnym izotopem technetu (99Tc), stosowane do diagnostyki raka jelita grubego i odbytu (scyntygrafia).
2. 99Tc-Bectumomab [LymphoScan] – stosowane w radioimmunoscyntygrafii chłoniaków nieziarniczych typu B (NHL, ang. Non-Hodgkin Lymphoma).
3. Tecnemab – scyntygrafia nawrotów czerniaka
4. OncoScint – wykrywanie raka jelita grubego i jajnika
RIA w diagnostyce nowotworów (scyntygrafia)
Przykłady zastosowania MAbs w diagnostyce
- Wczesne wykrywanie ciąży (1-2 tydzień) - Wykrywanie infekcji wirusowych i bakteryjnych np • HIV • Herpes • Grypa • Chlamydie • Streptokokki - Identyfikacja i charakteryzacja specyficznych
antygenów nowotworowych; klasyfikacja nowotworów
- Obrazowanie; np. lokalizacja nowotworów
Rapid and Quantitative Detection of Zoonotic Influenza A Virus Infection Utilizing Coumarin-derived dendrimer-based
Fluorescent Immunochromatographic Strip Test (FICT)
Theranostics 2014; 4(12):1239-1249. doi:10.7150/thno.10255
Top Related