Poznanie genomu człowieka

(wg. artykułów z Science i Nature)

Jerzy TiurynInstytut Informatyki

Uniwersytet Warszawski

2

3

Dwa artykuły

• „Initial sequencing and analysis of the human genome”, International Human Genome Sequencing Consortium, Nature, 15.02, 2001 (860-921).

• „The sequence of the human genome”, J.C. Venter, et.al., Science, 16.02. 2001 (1304-1351).

4

Plan wykładu

• Historia poznania genomu człowieka.• Metoda konsorcjum (hierarchiczne

sekwencjonowanie metodą ‘shotgun’).• Metoda Ventera ‘whole-genome shotgun

approach’.• Co wiadomo o liczbie genów w genomie

człowieka?• Porównanie obu metod.

5

Historia poznania genomu człowieka

• 1953, James Watson, Francis Crick, : struktura DNA.

6

• 1977, F. Sanger (metoda dideoxy), 500-750bp.• 1977, F. Sanger: zsekewncjonowanie pierwszego

ludzkiego genu.• 1977-82, genomy bakteryjnych wirusów (φX174,

Lambda), genom wirusa zwierzęcego SV40, ludzkie mitochondrium.

• 1985, K. Mullis: technika PCR.• 1987, D. Burke, M. Olson, G. Carle: YAC.• 1989, Olson, Hood, Botstein, Cantor: strategia

mapowania przy użyciu STS.

7

• 1995, J.C. Venter (Heamophilus influenzae) 1.8 Mb, metoda ‘whole-genome shotgun sequencing’.

• 1996, Międzynarodowe konsorcjum (Saccharomyces cerevisiae) 13.5 Mb.

• 1997, Blattner, Plunkett (Escherichia coli) 5 Mb.• 1998, Venter: założenie firmy Celera Genomics

(deklaracja: sekwencja genomu człowieka w 3 lata, za 300 M$).

8

• 1998, Sulston, Waterson (Caenorhabditis elegans) 100 Mb.• 1999, GB, Japonia, USA: chromosom nr.22,

35 Mb.• 2000, Venter (Drosophila melanogaster) 120 Mb,

testowanie metody WGSS dla niezbyt dużego genomu.• 2000, Niemcy, Japonia: chromosom nr. 21,

34 Mb.• 2000, Międzynarodowe Konsorcjum (Arabidopsis

thaliana), 100 Mb.• 2001, HGP i Celera publikują draft genomu człowieka,

3.3Gb.

9

Główne trudności w sekwencjonowaniu genomu

człowieka• Rozmiar genomu (~3Gb).• Duża część genomu zawiera repetytywne

fragmenty. Przykładowo część genomu zawierająca repetytywne fragmenty dla różnych organizmów:– Bakterie: ~1.5%– Muszka owocowa: ~3%– Człowiek: >50%

10

Metoda Konsorcjummap-based, BAC-based, clone-by-clone• Pozyskiwanie materiału genetycznego.• Budowa mapy fizycznej genomu w oparciu o klony.• Trawienie poszczególnych klonów enzymami

restrykcyjnymi – ‘odcisk palca’.• Budowa kontigów i przypisanie ich do miejsc na

chromosomach (STS).• Wybór klonów z kontigów do sekwencjonowania.• Sekwencjonowanie metodą ‘shotgun’ wybranych

klonów.• Składanie genomu.

11

12

Pozyskiwanie materiału genetycznego

• Ochotnicy (różne środowiska etniczne), ‘kto pierwszy ten lepszy’.

• Samplig laboratory: usunięcie identyfikatorów, nadanie losowych oznaczeń, przesłanie do processing lab.

• Processing laboratory: usuwa wszystkie oznaczenia i zmienia je na inne, niszczy dokumentację oznaczeń, wybiera losowo 5-10 próbek do dalszej analizy.

13

Linia produkcyjna do przygotowywania próbekWhitehead Institute, Center for Genome Research

14

Klony

• Plazmidy (~ 4Kb).• Kosmidy (~ 40Kb).• Yeast Artificial Chromosome, YAC

(do 500Kb). • Bacterial Artificial Chromosome, BAC

(100-300Kb).

15

Mapa fizyczna• Biblioteki klonów zbudowane z materiału genetycznego.

(1.400.000 klonów BAC lub PAC, 65-krotne pokrycie genomu). Każdy klon rozmiaru 100-200Kb.

• Wybrano ~ 350.000 klonów do budowy mapy fizycznej. (20 krotne pokrycie genomu).

• Każdy klon poddano trawieniu enzymem restrykcyjnym i zmierzono rozmiary fragmentów przy pomocy elektroforezy na żelu z agarozy. Tak powstaje linia papilarna (fingerprint) klonu.

• Linie papilarne są użyte do identyfikacji klonów i do szacowania wielkości nałożenia jednego klonu na drugi.

16

Mapa fizyczna, c.d.• Linie papilarne klonów zostały użyte do budowy

tzw. kontigów (nakładające się na siebie spójne fragmenty utworzone z klonów).

• Kontigi zostały przyporządkowane miejscom na chromosomach przy pomocy znaczników STS (STS = Sequence Tagged Site ~ 500bp, jednoznaczna sekwencja na chromosomie, dla której są znane primery PCR).

17

Przykład dwóch kontigów

18

Faza sekwencjonowania• Wybór klonów z kontigów, tak aby uzyskać

pokrycie genomu (aby przyspieszyć proces, zrezygnowano z poszukiwania minimalnego pokrycia). Wybrano ~ 30.000 klonów.

19

Faza sekwencjonowania: każdy klon metodą ‘shotgun’

• Klon powiela się w wielu kopiach.• Wszystkie kopie tnie się na małe kawałki (enzymy

restrykcyjne) ‘losowo’. Porządek i orientacja kawałków są tracone.

• Wybiera się losowo dostatecznie dużo kawałków (5-10 krotne pokrycie, zgodnie z formułą Landera/Watermana) i dla każdego kawałka sekwencjonuje się prefiks o długości ~ 500bp. Powstają tzw. czyste odczyty.

20

Uwagi na temat metody ‘shotgun’

• W praktyce wybór fragmentów nie jest jednorodny (powody molekularno-biologiczne, a nie probabilistyczne). To powoduje powstawanie dziur w odczytywanej sekwencji.

• Są dwa stopnie jakości metody ‘shotgun’: – ‘half-shotgun’ 4-5 krotne pokrycie, w wyniku mamy

draft genomu.– ‘full-shotgun’ 8-10 krotne pokrycie, w wyniku mamy

podstawę do dokładnego opisu genomu.

21

• Uzyskano 23Gb danych w czystych odczytach.• Niektóre centra osiągnęły wydajność 100.000

reakcji sekwencjonowania na 12 godzin.• Wydajność wszystkich centrów osiągnięta w

czerwcu 2000: 1 pokrycie genomu na 6 tygodni (1Kb/sek. przez 24h/dobę, cały czas).

• Każdy nukleotyd był odczytany średnio 4.5 raza.

22

• 7.10.00 w postaci finalnej było 835Mb sekwencji genomu (wliczając chromosomy 21 i 22). Na koniec roku 2000 było ~ 1Gb sekwencji w finalnej postaci (finalna postać = prawdopodobieństwo błędu odczytu nukleotydu < 1/10.000, żadnych dziur)

23

Składanie sekwencji (1)

• Analiza nałożeń (overlap detection): dane dwa słowa W,V, znajdź sufiks w W oraz prefiks w V o maksymalnym podobieństwie (w sensie uliniowienia; mogą być wstawiane spacje). Jest to problem natury algorytmicznej. Dane o nałożeniach przechowujemy.

24

Składanie sekwencji (2)• Ułożenie podsłów (substring layout). Zachłanny

algorytm: znajdź parę słów o maksymalnym podobieństwie sufiks/prefiks. Później następną parę. Albo powstają dwa kontigi, albo jeden o trzech słowach. Podobne do wielokrotnego uliniowienia. Dodawanie nowych par powoduje wstawianie spacji (rozsuwanie). W ten sposób powstają kontigi nakrywające większość odtwarzanej sekwencji.

25

Składanie sekwencji (3)

• Decydowanie konsensusu: uzgodnienie jaka litera ma stać na danej pozycji w kontigu. Stosowane są różne podejścia, często metoda większościowa (tu są subtelne problemy).

• W projekcie średnie pokrycie klonu kontigami wynosiło 96%, a średnie przerwy pomiędzy kontigami miały ~ 500bp.

26

Dwa rodzaje kontigów

• Kontigi pochodzące z jednego klonu.

• Mega-kontigi pochodzące z analizy linii papilarnych poszczególnych klonów.

27

Logistyka składania genomu

• Składanie pojedynczych klonów.• Związanie zsekwencjonowanych klonów z

pozycjami na fizycznej mapie genomu.• Poprawianie niezgodności.

28

29

Kroki w procesie składania genomu z kontigów pochodzących z klonów A i B.

30

Jakość draftu genomu zsekwencjonowanego przez

konsorcjum• Użyto oprogramowanie PHRAP (program

przypisuje każdemu nukleotydowi prawdopodobieństwo błędu).

• 91% sekwencji ma błąd < 1/10.000.• 96% sekwencji ma błąd < 1/1.000• Są przerwy w sekwencji.

31

Przerwy w sekwencji (3 rodzaje)

• Pomiędzy kontigami w poszczególnych klonach: łącznie 2-4% genomu jest zawarte w takich przerwach (~80Mb). Tych przerw jest ~145.000.

• Pomiędzy klonami w mega-kontigach: 5% genomu (~150Mb). Jest ich ~4.000.

• Pomiędzy mega-kontigami (szacowanie na podstawie chr. 21 i 22) ~4% genomu.

32

Co wiadomo na temat liczby genów?

• W małych genomach geny są ściśle związane z ORFami (ORF = Open Reading Frame).

• U człowieka średnia długość eksonu ~145bp, natomiast introny są długie (średnio ~3300bp, ale zdarzają się introny długości > 10Kb). Przykładowo: introny (średnio) – u robaka (267bp), – u muchy (487bp).

33

Geny RNA (nie-kodujące)

• Takie jak tRNA, rRNA, itd.• Nie mają ORFów.• Są małe i nie zawierają ogonów poly(A).• Trudne do odróżnienia od pseudogenów. • Łącznie znaleziono w drafcie ~700 genów

RNA.

34

Przykład

• Klasyczne (podręcznikowe) oszacowanie liczby genów tRNA u człowieka to 1310, ale ... okazało się, że jest ich w drafcie genomu tylko 497.

35

Dla innych organizmów liczba genów tRNA wynosi:

36

Geny kodujące białka

• Znanych jest obecnie nieco ponad 10.000 sekwencji mRNA w bazie RefSeq (część bazy GenBank). Zrobiono uliniowienie z draftem genomu. Nieco ponad 9.000 dało się (przynajmniej częściowo) uliniowić. 16% sekwencji mRNA wykazało podobieństwo do więcej niż jednego wystąpienia w drafcie genomu (paralogi, pseudogeny).

37

Geny kodujące białka (rozmiary)• Duży rozrzut w rozmiarach genów (eksony i

introny) człowieka. Wiele jest dłuższych niż 100Kb (rekordzista: gen dystrofiny (DMD) ma 2.4Mb.

• Długość kodującej sekwencji też podlega dużym wahaniom. Np. gen titiny (najdłuższa obecnie znana długość kodującej sekwencji) ma 80.780bp, liczba eksonów 178, najdłuższy ekson 17.106bp.

38

Trudności w znajdowaniu genów w genomie człowieka

• Mały iloraz sygnał/szum w genach człowieka w związku z krótkimi eksonami i bardzo długimi intronami. Ponadto kodujące sekwencje stanowią bardzo małą część genomu. Tak nie jest w drożdżach, robaku i muszce.

• Znając nawet dokładnie genom (tak jak to jest dla chr. 21 i 22) nadal będzie bardzo trudno odkrywać geny ‘ab initio’ .

39

Przewidywanie liczby genów (1)• W latach 80-tych Gilbert zasugerował, że może

być ~100.000 genów w genomie człowieka. Jest to tzw. rachunek ‘back-of-the-envelope’Typowy gen ma rozmiar ~30.000bp, rozmiar genomu jest ~3Gb, więc otrzymujemy ~100.000 genów.

• Analiza na podstawie szacunku liczby wysp CpG oraz częstości związków z genami dała ~70.000-80.000 genów.

40

Przewidywanie liczby genów (2)

• Szacunki oparte o EST (EST = Expressed Sequence Tags) dawały rozrzut liczby genów w granicach 35.000-120.000.

41

Obecnie stosowane metody znajdowania genów

• Wystąpienie znanego EST lub mRNA.• Sekwencyjne podobieństwo do znanych genów

lub białek.• Ab initio metoda oparta na ukrytych modelach

Markowa (HMM) – używają one statystycznej informacji na temat miejsc splicingu, kodowego odchylenia (coding bias), długości eksonów i intronów (Genscan, Genie, FGENES).

42

Skuteczność metod ab initio• Szacuje się, że dla muchy pojedyncze eksony

mogą być odgadywane poprawnie z prawdopodobieństwem 90%, ale wszystkie eksony danego genu tylko z prawdopodobieństwem 40%.

• Dla człowieka podobne liczby wynoszą: 70% i 20%.

• Niektórzy uważają też, że w/w liczby są zbyt optymistyczne...

43

Initial Gene Index (IGI)• System Ensembl (używa Genscan, weryfikuje w

oparciu o podobieństwo do białek, mRNA, EST i białkowych motywów (zawarte w bazie Pfam) dla wszystkich organizmów). System ten wygenerował 35.000 predykcji genów oraz 44.860 transkryptów.

• Po wykonaniu pewnej redukcji fragmentacji otrzymano 31.778 predykcji genów. To stanowi podstawę do pierwszej wersji IGI.

44

Initial Gene Index (IGI)• W IGI jest 15.000 znanych genów i 17.000

predykcji nowych genów.• Przyjmuje się, że bardziej realna liczba genów w

IGI to 24.500 genów (20% błędnych predykcji lub pseudogenów, 1.4 współczynnik fragmentacji).

• Przyjmując, że predykcje genów zawierają 60% wcześniej nieznanych genów, można oszacować łączną liczbę genów człowieka na ~31.000.

45

Końcowe uwagi na temat liczby genów człowieka

• Obecne szacunki liczby genów oparte na próbkowaniu dają przedział 30.000-35.000.

• Jeśli w genomie człowieka jest 30.000-35.000 genów i średnia długość kodującej sekwencji wynosi 1.400bp oraz średnia długość całego genu wynosi 30Kb, to 1.5% całego genomu zajmują sekwencje kodujące, a 30% zajmują geny.

46

Końcowe uwagi na temat liczby genów człowieka

• Wydaje się, że człowiek ma dwa razy więcej genów niż robak lub mucha. Geny człowieka są bardziej rozciągnięte po genomie i są one używane do budowy większej liczby alternatywnych transkryptów. Łącznie, być może, człowiek wytwarza 5 razy więcej białkowych produktów niż robak czy mucha.

47

Jaka jest naprawdę liczba genówu człowieka ...?

Michael Zhang ze współpracownikami (Cold Spring Harbour Laboratory): opracowali program First Exon Finder (grudzień 2001, Nature Genetics). Program ten wyszukujeodcinki zawierające nie-kodujące pierwsze eksony oraz sekwencje promotorowe genów. Program poprawnie zlokalizował 90%genów w zsekwencjonowanych chromosomach 21 i 22.

First Exon Finder wytypował 68,000 genów w genomie człowieka. Autorzy szacują, że całkowita liczba genów w genomie człowieka waha się w granicach 50,000-60,000.

Co będzie dalej ... ?

Metoda firmy Celera Genomics

sekwencjonowania genomu

49

Plan

• Kontigi i rusztowania.• Dwie strategie asemblacji genomu (WGA,

CSA).• Poszukiwanie genów.• Analiza genomu.• Porównanie sekwencji Konsorcjum i

Celery.

50

Celera

• 3,000 m.kw.• 175,000 reakcji sekwencjonowania na dzień.• Wirtualna Farma Obliczeniowa (Compaq

Alpha):– 440 CPU (EV6 (400MHz), EV67(667MHz)).– Każdy 2-8GB RAM.– 100TB HD.

51

Dane do obróbki

• Biblioteka plazmidów (rozmiarów 2Kb, 10Kb, 50Kb).

• Konstrukcja stowarzyszonych par (mate pairs) – sekwencje 500-600bp, z każdego końca sekwencji z biblioteki plazmidów (27.27 milionów odczytów).

• Kontigi zbudowane z BAC’ów dostępnych z publicznych danych Konsorcjum (4.4Gb).

52

Kontigi, rusztowania i stowarzyszone pary

53

54

Dwie strategie asemblacji genomu

• Whole-genome assembly (WGA).• Compartmentalized shotgun assembly

(CSA).

55

Asemblacja WGA• Analiza nakryć (overlaps) – 10,000h czasu CPU, 40

komputerów (4-procesorowy Alpha), 4GB RAM każdy. Równoległość.

• Wybór jednoznacznych kontigów (unitigi) – 73.6% genomu.

• Wykorzystanie par stowarzyszonych do budowy rusztowań (scaffolds).

• Uzupełnianie dziur w rusztowaniach (fazy ‘rocks’ oraz ‘stones’).

56

Asemblacja CSA

• (Matcher): Rozdzielenie danych Celery na te, które pasują do BAC’ów z danych publicznych i na resztę (21 milionów odczytów pasowało, a 3 miliony były nowe).

57

Asemblacja CSA, c.d.

• (Combining Assembler): Dla tych z pierwszej grupy, dla każdego BAC’a wzięto kontigi z HGP oraz pasujące odczyty Celery.– Użyto WGA do zbudowania rusztowań (zwykle

1 lub 2) pokrywających w ~95% ten BAC. Asemblacja wysokiej jakości.

58

Asemblacja CSA, c.d.• (WGA): Dla drugiej grupy (nowe dane)

przeprowadzono WGA.• (Tiler): Analiza porządku i nakryć dla rusztowań

pochodzących z BAC’ów i z rusztowań zbudowanych dla nowych danych. Użyto: pary stowarzyszone dla klonów 50Kb i dla BAC’ów oraz markery STS. Powstało w ten sposób 3845 składowych (components) obejmujących ~2.92Gb.

59

Asemblacja CSA, c.d.

• (WGA+Shredder): Dla każdej ze składowych zastosowano WGA, po poszatkowaniu danych na kawałki. Dzięki poszatkowaniu możliwa była dodatkowa korekta błędów oraz eliminacja fragmentów chimerycznych z danych HGP.

60

61

Ostatni krok: Mapowanie rusztowań do genomu

• Do dalszej obróbki wybrano dane otrzymane z CSA.

• Wykorzystano dwie mapy fizyczne genomu: mapa markerów STS oraz mapa linii papilarnych BAC’ów.

• W ten sposób większość rusztowań została przyporządkowna pozycjom w genomie (~98% genomu). Powstało ~21,600 przerw pomiędzy rusztowaniami.

62

Analiza genomu (wg. Celery)

• Poszukiwanie genów.• Wstępny opis chromosomów.• Korelacja gęstości genów z innymi

wielkościami.• Rozkład genów wg. molekularnej funkcji.• Duplikacje genomu w skali makro.

63

Poszukiwanie genów

• System ekspercki Otto - symulacja czynności wykonywanych przez człowieka opisującego chromosomy. Otto wykrył 6538 genów homologicznych do znanych genów oraz 11,226 nowych fragmentów podejrzanych o bycie genem. Łącznie: 17,764 geny.

64

Poszukiwanie genów, c.d.

• Oprócz Otto użyto trzech programów odgadujących geny: GRAIL, Genescan, FgenesH. Zrobiły one łącznie 76,410 różnych predykcji, z czego 57,935 predykcji nie pokrywało się z predykcjami Otto.

• Dodatkowy filtr: co najmniej jedno potwierdzenie z następującej listy.

65

Cztery typy potwierdzeń dla predykcji genów

• Homologia ze znanym białkiem.• Zawieranie ludzkiego EST.• Zawieranie EST gryzonia.• Występowanie w genomie myszy.

66

Ile jest genów?

• Biorąc wszystkie predykcje Otto oraz predykcje w/w trzech programów spełniające dodatkowo warunek:– Co najmniej 1 potwierdzenie: 39,114 genów– Co najmniej 2 potwierdzenia: 26,383 geny.– Co najmniej 3 potwierdzenia: ~23,000 genów.

67

Wstępny opis Celery chromosomów

Chr. 1

Chr. 19

Chr. 21

Chr. 22

Chr. X

Chr. Y

68

Chromosomy 11, 12, 13:Korelacja gęstości genówZ innymi wielkościami

69Rozkład 26,383 genów wg. molekularnej funkcji

70

Duplikacje względem chromosomu 1

71

Duplikacje względem chromosomu 6

72

Duplikacje względem chromosomu 19 – rekordowo dużo

73

Duplikacje względem chromosomu 22 – rekordowo mało

74

Porównanie sekwencji HGP i Celery

• Praca: J. Aach, et.al. „Computational comparison of two draft sequences of the human genome.”, Nature, 409, 15.02.2001, (856-859).

• HGP-nr (2.9Gb).• Cel Celera Genomics (Human Genome D,

2.9Gb).

75

76

77

Porównania wykonane przez Celerę

• Zielony kolor: sekwencje Celery są w tej samej orientacji i kolejności w obu sekwencjach.

• Żółty kolor: sekwencje Celery są w tej samej orientacji, ale nie w tej samej kolejności w obu sekwencjach.

• Czerwony kolor: sekwencje Celery nie są w tej samej orientacji w obu sekwencjach.

78

Porównania wykonane przez Celerę, c.d.

• Górna część wykresu – Konsorcjum (2K, 10K, 50K).

• Dolna – Celera (2K, 10K, 50K).• Seledynowe kreski – przerwa co najmniej 10.000b.• Stowarzyszone pary (niezgodności):

– Czerwony – zła orientacja.– Żółty – zła odległość pomiędzy końcami.– Niebieskie kreski – złamania (breakpoint)

79

Porównanie dla chromosomu 21

80

Porównanie dla chromosomu 22

81

Porównanie dla chromosomu 19

82

Porównanie dla chromosomu 8

83

Przerwy i złamania w obu sekwencjach

• Górna cześć – Konsorcjum.• Dolna część – Celera.• Czerwona kreska – przerwa co najmniej

10Kb.• Niebieska kreska – złamanie (breakpoint):

sprzeczność z co najmniej 5 stowarzyszonymi parami.

84