POCHODNE RYBOFLAWINY JAKO FOTOSENSYBILIZATORY ...

Pozna 2010

Magorzata Insiska-Rak

POCHODNE RYBOFLAWINY JAKO FOTOSENSYBILIZATORY

TLENU SINGLETOWEGO

Praca przedstawiona Radzie Wydziau Chemii Uniwersytetu im. A. Mickiewicza w Poznaniu celem uzyskania stopnia doktora w dziedzinie Chemii Promotor: prof. UAM dr hab. Marek Sikorski

Pozna 2010

Praca wykonana w Pracowni Fotochemii Stosowanej Wydziau Chemii

Uniwersytetu im. A. Mickiewicza w Poznaniu

Promotor: prof. UAM dr hab. Marek Sikorski

Panu

prof. dr. hab. Markowi Sikorskiemu

za opiek naukow, przekazan wiedz,

umoliwienie i pomoc w wykonaniu pracy

skadam serdeczne podzikowania

Magorzata Insiska-Rak

Zespoowi Pracowni Fotochemii Stosowanej Moim Koleankom z Pracowni i spoza niej za dyskusje naukowe i nie tylko za wsparcie, yczliwo i wszelk pomoc

serdecznie dzikuj

Panu Prof. dr. hab. Wodzimierzowi Augustyniakowi za nieustanne przekazywanie wiedzy, dyskusje oraz yczliwo Pani dr hab. Ewie Sikorskiej za umoliwienie wykonania niektrych pomiarw, za zrozumienie i wszelk pomoc Panu prof. dr. hab. Andrzejowi Maciejewskiemu oraz Panu prof. dr. hab. Jackowi Koputowi za dyskusje naukowe, yczliwo i okazan pomoc

skadam serdeczne podzikowania

dedykuj mojemu Ojcu

Wykaz rysunkw, schematw i tabel

I. WSTP 1. Rysunek 1 str.2 Struktura zwizkw flawinowych wykazujcych aktywno biologiczn

III. CZ LITERATUROWA 2. Schemat 1 str. 6 Czsteczka flawiny w rnych formach utlenienia

3. Rysunek 2 str.18 Lumiflawina w trzech formach utlenienia

4. Rysunek 3 str.19 Procesy utleniania i redukcji oraz rwnowagi kwasowo zasadowe

dla zwizkw flawinowych 5. Schemat 2 str.23 Fotoindukowany cykl reakcji utleniania i redukcji w czsteczce

ryboflawiny na granicy faz woda/CCl4

6. Rysunek 4 str. 26 Struktury tautomeryczne powstajce w czasie procesu przeniesienia protonu w czsteczce 3-hydroksyflawonu obserwowane w szkliwach wglowodorowych

7. Rysunek 5 str. 26 Struktury tautomeryczne powstajce w czasie procesu przeniesienia protonu w czsteczce 7-azaindolu

8. Rysunek 6 str. 27 Struktury tautomeryczne powstajce w czasie procesu przeniesienia protonu w czsteczce adeniny i guaniny

9. Rysunek 7 str.27 Struktury tautomeryczne powstajce w czasie procesu przeniesienia protonu w czsteczce 7-azaindolu poprzez kompleks z alkoholem i z kwasem

10. Rysunek 8 str. 28 Ilustracja przeniesienia protonu w czsteczce 7-hydroksychinoliny

11. Rysunek 9 str. 29 Ilustracja procesu fotoindukowanego przeniesienia protonu w czsteczce 7,8-dimetyloalloksazyny A (lumichromu), z utworzeniem tautomeru 7,8-dimetyloizoalloksazyny B, w obecnoci kwasu octowego

12. Rysunek 10 str. 30 Ilustracja procesu fotoindukowanego przeniesienia protonu w czsteczce 7,8-dimetyloalloksazyny (lumichromu) w obecnoci pirydyny

13. Rysunek 11 str. 31 Ilustracja procesu fotoindukowanego przeniesienia protonu w czsteczce 7,8-dimetyloalloksazyny (lumichromu) w obecnoci wody

14. Rysunek 12 str. 34 Schemat procesu dysocjacji protonu w czsteczce lumichromu w stanie podstawowym z powstajc struktur izoalloksazynow

15. Rysunek 13 str. 34 Schemat procesu protonowania czsteczki lumichromu z powstajcymi dwoma kationami o strukturze alloksazynowej i izoalloksazynowej

16. Rysunek 14 str. 36 Struktura alloksazynowa (A) na przykadzie lumichromu i struktura izoalloksazynowa (B) na przykadzie lumiflawiny

17. Rysunek 15 str. 38 Widma absorpcji lumichromu i lumiflawiny w metanolu

18. Rysunek 16 str. 38 Widma fluorescencji lumichromu i lumiflawiny w metanolu

19. Tabela 1 str. 39 Dane spektralne i fotofizyczne dla alloksazyn i izoalloksazyn w stanie

singletowym w metanolu

20. Schemat 3 str.42 Schemat fotosensybilizowanych reakcji utleniania I i II typu

21. Tabela 2 str.43 Wydajnoci kwantowe fluorescencji (f), wydajnoci kwantowe przejcia midzysystemowego (ISC), oraz wydajnoci tworzenia tlenu singletowego (), dla wybranych sensybilizatorw

22. Rysunek 17 str.46 Stany elektronowe i ich energie dla czsteczki tlenu, T1/2 dla czsteczki w roztworze wodnym

23. Schemat 4 str.53 Mechanizm dziaania terapii fotodynamicznej z uwzgldnieniem zmodyfikowanego diagramu Jaboskiego

24. Schemat 5 str.56 Schemat reakcji fotosensybilizacji przebiegajcej z udziaem ryboflawiny jako fotosensybilizatora

IV. OMWIENIE WYNIKW BADA WASNYCH 25. Rysunek 18 str. 59 Struktury pochodnych ryboflawiny , ktrych waciwoci stanowi

przedmiot prezentowanej pracy

26. Rysunek 19 str.61 Znormalizowane widma absorpcji i emisji (wzb = 450 nm) dla ryboflawiny w metanolu

27. Rysunek 20 str.62 Widma absorpcji lumiflawiny, ryboflawiny i 3MeTARF w metanolu

28. Rysunek 21 str.63 Zestawienie widm absorpcji 3-benzylo-lumiflawiny (3BLfl), lumiflawiny (Lfl), 3-metylo-lumiflawiny (3MeLfl) i 3-etylo-lumiflawiny (3EtLfl) w metanolu

29. Rysunek 22 str. 64 Zestawienie widm absorpcji 5-deaza-ryboflawiny (5DRfl) i ryboflawiny (Rfl) w metanolu

30. Tabela 3 str. 65 Parametry spektralne i fotofizyczne dla 5-deaza-ryboflawiny w zestawieniu z danymi dla ryboflawiny w rnych rozpuszczalnikach

31. Rysunek 23 str. 66 Widma absorpcji izo-6,7-ryboflawiny (IR) i ryboflawiny (Rfl) w metanolu

32. Tabela 4 str. 67 Parametry spektralne i fotofizyczne dla izo-(6,7)-ryboflawiny w zestawieniu z danymi dla ryboflawiny w metanolu

33. Rysunek 24 str. 68 Widma absorpcji 3-metylo-tetraacetylo-ryboflawiny (3MeTARF) w metanolu i innych rozpuszczalnikach

34. Tabela 5 str. 68 Parametry spektralne i fotofizyczne dla 3-metylo-tetraacetylo-ryboflawiny (3MeTARF) i ryboflawiny w rnych rozpuszczalnikach

35. Rysunek 25 str. 69 Widma absorpcji 3-benzylo-lumiflawiny (3BLfl) i lumiflawiny (Lfl) w metanolu

36. Tabela 6 str. 70 Parametry spektralne i fotofizyczne dla 3-benzylo-lumiflawiny w zestawieniu z lumiflawin i innymi jej pochodnymi w metanolu

37. Rysunek 26 str. 72 Znormalizowane widma emisji 5-deaza-ryboflawiny (5DRfl) i ryboflawiny (Rfl) w metanolu ((wzb = 425 nm)

38. Rysunek 27 str. 73 Widma emisji izo-6,7-ryboflawiny(IR) i ryboflawiny (Rfl) w metanolu (wzb = 355 nm)

39. Rysunek 28 str. 74 Widma emisji 3-metylo-tetraacetylo-ryboflawiny (3MeTARF), ryboflawiny (Rfl) i lumiflawiny (Lfl) w metanolu (wzb = 450 nm)

40. Rysunek 29 str. 75 Widma emisji 3-benzylo-lumiflawiny (3BLfl) i lumiflawiny (Lfl) w metanolu, (wzb = 450 nm)

41. Rysunek 30 str. 78 Widmo absorpcji 5-deaza-ryboflawiny w metanolu w zestawieniu z wynikami oblicze teoretycznych (pionowe linie oznaczaj pasma - *, czerwone trjkty pasma n-*)

42. Tabela 7 str. 79 Przewidywane na podstawie oblicze (B3LYP /6-31G(d)) energie wzbudzenia stanw singletowych (S0Si) i trypletowych (S0Ti) oraz obliczone (UB3LYP /6-31G(d)) energie wzbudzenia od najniszego stanu trypletowego wyszych stanw trypletowych (T1Ti) wraz z si oscylatora dla 5-deaza ryboflawiny

43. Rysunek 31 str. 81 Widmo absorpcji izo-6,7-ryboflawiny w metanolu w zestawieniu z wynikami oblicze teoretycznych (pionowe linie oznaczaj pasma -*, czerwone trjkty pasma n-*)

44. Tabela 8 str.82 Przewidywane na podstawie oblicze (B3LYP /6-31G(d)) energie wzbudzenia stanw singletowych (S0Si) i trypletowych (S0Ti) oraz obliczone (UB3LYP /6-31G(d)) energie wzbudzenia od najniszego stanu trypletowego do wyszych stanw trypletowych (T1Ti) wraz z si oscylatora dla izo-6,7-ryboflawiny

45. Tabela 9 str. 83 Przewidywane na podstawie oblicze (B3LYP /6-31G(d)) energie wzbudzenia stanw singletowych (S0Si) i trypletowych (S0Ti) oraz obliczone (UB3LYP /6-31G(d)) energie wzbudzenia od najniszego stanu trypletowego do wyszych stanw trypletowych (T1Ti) wraz z si oscylatora dla ryboflawiny

46. Rysunek 32 str. 85 Widmo absorpcji 3-metylo-tetraacetylo-ryboflawiny w metanolu w zestawieniu z wynikami oblicze teoretycznych (pionowe linie oznaczaj pasma -*, czerwone trjkty pasma n-*)

47. Tabela 10 str. 86 Przewidywane na podstawie oblicze (B3LYP /6-31G(d)) energie wzbudzenia stanw singletowych (S0Si) i trypletowych (S0Ti) oraz obliczone (UB3LYP /6-31G(d)) energie wzbudzenia od najniszego stanu trypletowego do wyszych stanw trypletowych (T1Ti) wraz z si oscylatora dla 3-metylo-tetraacetylo-ryboflawiny

48. Rysunek 33 str. 88 Widmo absorpcji 3-benzylo-lumiflawiny w metanolu w

zestawieniu z wynikami oblicze teoretycznych (pionowe linie oznaczaj pasma -*, czerwone trjkty pasma n-*)

49. Tabela 11 str. 89 Przewidywane na podstawie oblicze (B3LYP /6-31G(d)) energie wzbudzenia stanw singletowych (S0Si) i trypletowych (S0Ti) oraz obliczone (UB3LYP /6-31G(d)) energie wzbudzenia od najniszego stanu trypletowego do wyszych stanw trypletowych (T1Ti) wraz z si oscylatora dla 3-benzylo-lumiflawiny

50. Tabela 12 str. 90 Przewidywane na podstawie oblicze metod (B3LYP) z bazami (6-31G(d)) /6-311G(d,p)) energie wzbudzenia do stanw singletowych (S0Si) w porwnaniu z wartociami energii obliczonymi z uwzgldnieniem makroskopowego efektu rozpuszczalnika (MeOH) w modelu PCM, metod (B3LYP) z bazami 6-31G(d)) i 6-311G(d.p) wraz z si oscylatora dla 3-benzylo-lumiflawiny

51. Rysunek 34 str. 92 Eksperymentalne widmo absorpcji przejciowej (panel dolny), zmierzone dla roztworu 5-deaza-ryboflawiny w metanolu (ex = 355 nm) w zestawieniu z danymi uzyskanymi z oblicze metod TD-DFT (panel grny), (pionowe linie reprezentuj przewidywane energie przej tryplet-tryplet dla badanej czsteczki)

52. Rysunek 35 str. 93 Widmo absorpcji T-T (panel dolny) zmierzone dla roztworu izo-6,7-ryboflawiny w metanolu (ex = 355 nm) w zestawieniu z danymi uzyskanymi z oblicze metod TD-DFT (panel grny) (pionowe linie reprezentuj przewidywane energie przej tryplet-tryplet dla badanej czsteczki)

53. Rysunek 36 str. 94 Widmo absorpcji przejciowej dla roztworu 3MeTARF w metanolu (ex = 355 nm) w zestawieniu z danymi uzyskanymi z oblicze metod TD-DFT (pionowe linie reprezentuj przewidywane energie przej tryplet-tryplet dla badanej czsteczki)

54. Rysunek 37 str. 95 Widmo absorpcji (panel dolny) zmierzone dla roztworu 3-benzylo-lumiflawiny w metanolu (ex = 355 nm) w zestawieniu z danymi uzyskanymi z oblicze metod TD-DFT (panel grny) (linie reprezentuj przewidywane energie przej tryplet-tryplet dla badanej czsteczki)

55. Rysunek 38 str. 97 Ksztat orbitali molekularnych HOMO, HOMO-1 i LUMO zaangaowanych w najnisze przejcia energetyczne w czsteczce 3-benzylo-lumiflawiny

56 Tabela 13 str. 98 Pooenie maksimw pasm emisji dla ryboflawiny i badanych pochodnych w roztworze metanolowym i w postaci polikrystalicznej

57. Rysunek 39 str. 99 Widma fluorescencji polikrysztaw 5-deaza-ryboflawiny, zarejestrowane w odstpach czasowych 5 ns, wzbudzenie 337 nm; grny wykres przedstawia dyfuzyjno odbiciowe widmo absorpcji polikrysztaw 5DRfl

58. Rysunek 40 str. 99 Widma fluorescencji polikrysztaw 5-deaza-ryboflawiny, zarejestrowane w odstpach czasowych 1 s, wzbudzenie 337 nm

59. Rysunek 41 str.100 Widma fluorescencji polikrysztaw izo-6,7-ryboflawiny,

zarejestrowane w odstpach czasowych 1 ns, wzbudzenie 337 nm

60. Rysunek 42 str. 101 Widma fluorescencji polikrysztaw 3-benzylo-lumiflawiny, zarejestrowane w odstpach czasowych 1 ns, wzbudzenie 337 nm; grny wykres przedstawia dyfuzyjno odbiciowe widmo absorpcji polikrysztaw 5BLfl

61. Rysunek 43 str. 102 Widma fluorescencji polikrysztaw 3MeTARF, zarejestrowane w odstpach czasowych 1 ns, wzbudzenie 337 nm

62. Tabela 14 str. 106 Czas ycia stanu trypletowego (T) badanych pochodnych izoalloksazynowych w metanolu, wydajno kwantowa fotosensybilizowanej produkcji tlenu singletowego (), oraz jego czas ycia (), w porwnaniu z odpowiednimi danymi dla lumiflawiny i innych jej pochodnych oraz z danymi dla ryboflawiny

63. Rysunek 44 str.108 Zmiany w widmie absorpcji 5-deaza-ryboflawiny w metanolu, obserwowane podczas nawietlania promieniowaniem = 366 nm

64. Schemat 6a str. 109 Gwne fotoprodukty powstajce w procesie nawietlania 5-deaza-ryboflawiny w metanolu

65. Schemat 6b str. 109 Proponowane struktury trzeciego fotoproduktu powstajcego w wynikunawietlania 5-deaza-ryboflawiny w metanolu

66. Rysunek 45 str. 110 Zmiany w widmie absorpcji izo-6,7-ryboflawiny w metanolu, zachodzce pod wpywem nawietlania promieniowaniem o dugoci fali = 366 nm

67. Schemat 7a str. 111 Gwne fotoprodukty powstajce w procesie nawietlania izo-6,7-ryboflawiny w metanolu

68. Schemat 7b str. 111 Proponowane struktury dodatkowych fotoproduktw nawietlania izo-6,7-ryboflawiny

69. Rysunek 46 str. 112 Zmiany w widmie absorpcji obserwowane podczas nawietlania roztworu ryboflawiny w metanolu (rys.lewy) i 3-metylo-tetraacetylo ryboflawiny w metanolu, (rys. prawy), naw. = 366 nm.

70. Schemat 8 str. 113 Schemat procesu nawietlania 3MeTARF w metanolu

71. Schemat 9 str. 114 Schemat procesu nawietlania i fotoprodukt powstajcy w wyniku fotolizy 3-benyzlo-lumiflawiny w metanolu

72. Tabela 15 str. 114 Wartoci wydajnoci kwantowych wyznaczone dla fotolizy ( = 366 nm) pochodnych ryboflawiny w metanolu w warunkach beztlenowych

73. Tabela 16 str. 115 Wartoci wydajnoci kwantowych wyznaczone dla fotolizy ( = 366 nm) pochodnych ryboflawiny w metanolu w warunkach nieodtlenionych

74. Schemat 10a str. 115 Mechanizm reakcji tworzenia lumiflawiny w roztworach alkalicznych

75. Schemat 10b str. 116 Mechanizm reakcji tworzenia lumichromu w roztworach alkalicznych

Wykaz oznacze i skrtw stosowanych w pracy Rfl ryboflawina

Lfl lumiflawina

5DRfl 5-deaza-ryboflawina

IR izo-6,7-ryboflawina

FAD dinukleotyd flawinowo-adeninowy

FMN mononukleotyd flawinowy

NADH dinukleotyd nikotynamidoadeninowy

NADPH fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego

DFT Teoria Funkcjonaw Gstoci

TD-DFT Czasowo-Zalena Teoria Funkcjonaw Gstoci

FMF formylo-metylo-flawina

MeOH metanol

Spis treci I. Wstp.............................................................................................................................. 1

II. Cel pracy ........................................................................................................................ 3 III. Cz literaturowa ....................................................................................................... 5 1. Charakterystyka pochodnych flawin................................................................................ 5 1.1 Wprowadzenie............................................................................................................. 5 1.2 Stany singletowe flawin .............................................................................................. 7 1.3 Stany trypletowe flawin ............................................................................................ 13 1.4 Waciwoci kwasowo-zasadowe flawin .................................................................. 17

2. Reakcje przeniesienia protonu w zwizkach flawinowych............................................ 24

3. Porwnawcza charakterystyka waciwoci izo- i alloksazyn ....................................... 36 4. Flawiny jako fotosensybilizatory tlenu singletowego.................................................... 41

IV. Omwienie wynikw bada wasnych ...................................................................... 58 1. Wprowadzenie................................................................................................................ 58 2. Waciwoci absorpcyjne i emisyjne.............................................................................. 60 3. Obliczenia metod DFT i TD-DFT................................................................................ 76 4. Waciwoci emisyjne pochodnych flawin w prbkach

polikrystalicznych .......................................................................................................... 98 5. Pochodne flawin jako fotosensybilizatory tlenu singletowego .................................... 103 6. Reaktywno fotochemiczna flawin w roztworach metanolowych ............................. 107

V. Cz eksperymentalna ............................................................................................ 120 1. Cz oglna ................................................................................................................ 120 2. Cz szczegowa....................................................................................................... 129

VI. Podsumowanie........................................................................................................... 134 VII. Literatura................................................................................................................... 138

I. Wstp ______________________________________________________________________________

1

I. Wstp Flawiny stanowi du grup zwizkw zaangaowanych w procesy biologiczne takie jak

np. fotosynteza czy fototropizm. Wystpuj w produktach ywnociowych, s obecne w

enzymach i fotoreceptorach, a dziki temu s obecne w kadej niemal komrce

organizmw ywych. Stanowi chromofory aktywne w procesach utleniania i redukcji

zachodzcych w komrkach. Zaburzenia w gospodarce ryboflawin mog powodowa

zaburzenia wzrostu i choroby skry [1]. Badanie waciwoci tych zwizkw szczeglnie

w stanach wzbudzonych wie si z przekonaniem o ich istotnym udziale m. in. w tzw.

procesie fotorecepcji wiata niebieskiego [1].

Najbardziej znanymi przedstawicielami flawin s ryboflawina, mononukleotyd

flawinowy (FMN), oraz dinukleotyd flawinowo-adeninowy (FAD). Zwizki te

zaprezentowano na rys.1. Element wsplny i podstawowy w strukturze flawin stanowi

piercie izoalloksazynowy, ktrego nazwa systematyczna brzmi - 7,8-

dimetylobenzo[g]pteridine 2,4(3H,10H)dione. Tradycyjnie okrelenie flawiny

zarezerwowane jest dla izalloksazyn z podstawnikiem metylowym w pozycjach 7 i 8, czyli

pochodnych 7,8-dimetyloizoalloksazyny. Czsto stosuje si jednak szersz definicj

flawin, w myl ktrej jako flawiny przyjmuje si wszystkie pochodne izoalloksazyn i

alloksazyn.

Flawoproteiny s biakami zdolnymi do przenoszenia elektronw, w ktrych rol

koenzymu speniaj zwizki z grupy flawin FMN lub FAD. Zwizki te, zwizane

kowalencyjnie lub niekowalencyjnie, zdolne s do katalizowania rnorodnych

przeksztace o charakterze utleniajco-redukujcym w ukadach biologicznych, np. w

procesie oddychania.

Poniewa zarwno FAD jak i FMN, zawieraj ten sam typ piercienia

izoalloksazynowego, ktry stanowi grup aktywn w procesach utleniania i redukcji,

istotne jest dokadne zbadanie m. in. waciwoci spektralnych i struktury elektronowej dla

tej grupy zwizkw [2].

I. Wstp ______________________________________________________________________________

2

Rysunek.1 Struktura zwizkw flawinowych wykazujcych aktywno biologiczn, wedug [3]

W ostatnich kilkudziesiciu latach przeprowadzono wiele bada dotyczcych

fotofizyki i fotochemii flawin in vitro, ktrych cel koncentrowa si na wyjanianiu

mechanizmw rzdzcych dziaaniem tych zwizkw w organizmach ywych [4].

Wyjanianie zagadnie zwizanych z waciwociami tego typu zwizkw w ukadach

modelowych pozwala m.in. lepiej zrozumie i wyjani znacznie bardziej skomplikowane

procesy zachodzce w organizmach ywych.

W nurt bada dotyczcych systemw modelowych, stosownie do zakresu

zainteresowa i moliwoci badawczych, niemiao wpisuje si take niniejsza praca.

N

NHN

N O

O

CH2

H3C

H3C

CHOH

CHOH

CHOH

CH2 PO

OH

O

N

NN

N

NH2

O

OHOH

HHH

CH2

H

OPO

OH

O

izoalloksazyna

ryboflawina

mononukleotyd flawinowy (FMN)

dinuleotyd flawinowo-adeninowy (FAD)

II. Cel pracy ______________________________________________________________________________

3

II. Cel pracy Due zainteresowanie, ktre towarzyszy zwizkom z grupy flawin wynika gwnie z ich

niebagatelnej roli w funkcjonowaniu organizmw ywych. Szczeglnie wiele uwagi

powica si w badaniach zagadnieniom biochemicznym. Zwizki te mog spenia rol

katalizatorw w procesach, takich jak utlenianie pestycydw lub w reakcjach z

pochodnymi fenolu i toluenu [5,6]. Wykazano take udzia flawin w niszczeniu patogenw

i inaktywacji wielu drobnoustrojw [7]. Niektre badania wskazuj na antynowotworow

aktywno pochodnych ryboflawiny, a take udzia w terapii innych chorb [8]. W

aspekcie waciwoci fotofizycznych i fotochemii wnikliwe badania nad flawinami

pokazay, e pod wpywem promieniowania UV-Vis flawiny wydajnie obsadzaj stany

trypletowe i w stanie wzbudzonym wchodz w reakcje z tlenem [9]. Waciwoci te le u

podstaw wspomnianych praktycznych zastosowa zwizkw z grupy flawin. Skania to do

poszukiwania nowych analogw ryboflawiny, charakteryzujcych si lepszymi

parametrami spektroskopowymi i fotofizycznymi, takimi jak absorpcja promieniowania w

zakresie dugofalowym, dua wydajno przejcia midzysystemowego, dua wydajno

tworzenia tlenu singletowego [6-9].

Celem niniejszej pracy byo okrelenie waciwoci spektralnych, fotofizycznych i

fotochemicznych pochodnych 5-deaza-ryboflawiny, izo-6,7-ryboflawiny, 3-metylo-

tetraacetylo-ryboflawiny i 3-benzylo-lumiflawiny w roztworach. i sprawdzenie ich jako

potencjalnych fotosensybilizatorw tlenu singletowego

Zbadanie waciwoci spektralnych flawin oraz procesw fotofizycznych, ktrym

ulegaj stanowi istotne zagadnienie w kontekcie wnikliwego poznania procesw

zachodzcych w czsteczkach flawin w stanie podstawowym i w stanach wzbudzonych.

Dokadne opisanie tych procesw wymaga wyznaczenia podstawowych waciwoci

spektralnych oraz fotofizycznych, tzn. pomiaru widm absorpcji i emisji, wyznaczenia

wydajnoci kwantowej fluorescencji, udziau procesw radiacyjnych i nieradiacyjnych w

dezaktywacji stanw wzbudzonych, pomiaru czasu ycia fluorescencji. Wykonanie

pomiarw absorpcji przejciowej pozwala na zapoznanie si z procesami zachodzcymi w

trypletowych stanach wzbudzonych. Zaplanowano zastosowanie metod obliczeniowych

DFT i TD-DFT do wyznaczenia energii przej pomidzy stanami singletowymi i

trypletowymi, oraz wyznaczenie konfiguracji przej pomidzy tymi stanami. Zestawienie

otrzymanych w wyniku oblicze danych z wynikami eksperymentalnymi otrzymanymi z

II. Cel pracy ______________________________________________________________________________

4

pomiaru widm absorpcji i absorpcji przejciowej pozwala na poszerzenie charakterystyki

badanych zwizkw we wzbudzonych stanach singletowych i trypletowych. W ramach

realizacji niniejszej pracy zaplanowano take wykonanie pomiarw absorpcyjnych i

emisyjnych dla prbek polikrystalicznych badanych zwizkw. Badania te umoliwiaj

zaobserwowanie wpywu oddziaywa pomidzy czsteczkami w sieci krystalicznej.

Celem byo zbadanie wykorzystania badanych pochodnych jako fotosensybilizatorw

tlenu singletowego. W tym celu wyznaczono parametry fotofizyczne stanw trypletowych,

takie jak czas ycia stanu trypletowego dla poszczeglnych pochodnych i wydajno

kwantow sensybilizowanego tworzenia tlenu singletowego.

Ponadto zaplanowano przeprowadzenie reakcji fotolizy badanych zwizkw w

roztworze metanolowym i wyznaczenie wydajnoci kwantowych tego procesu. Podjto

take prb zidentyfikowania gwnych fotoproduktw reakcji fotochemicznych, ktrym

ulegaj badane pochodne.

III. Cz literaturowa ______________________________________________________________________________

5

III. Cz literaturowa 1. Charakterystyka pochodnych flawin 1.1 Wprowadzenie Flawoenzymy stanowi rodzin biaek rnorodnych pod wzgldem strukturalnym i

funkcjonalnym, posiadajcych waciwoci utleniajco-redukujce. Katalizowanie

ogromnej liczby biotransformacji moliwe jest dziki komponentowi flawinowemu, ktry

w strukturze biakowej peni rol koenzymu. Reakcje te mog odbywa si poprzez

przeniesienie elektronu, wedug mechanizmu jedno- i dwuelektronowego, w szerokim

zakresie potencjau. Waciwoci utleniajco redukujce flawin s kontrolowane przez

niekowalencyjne oddziaywania pomidzy apoenzymem a flawin, poprzez wizania

wodorowe lub aromatyczne oddziaywania warstwowe [10].

Komponenty flawinowe (FAD, FMN), jako skadniki enzymw bior udzia w

procesach katalizowania wielu biologicznych reakcji o charakterze redoks, m.in.

dehydrogenacji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH) i fosforanu

dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH), utlenianiu amin do imin, tworzeniu i

rozpadzie mostkw disiarczkowych, aktywacji tlenu czsteczkowego, [1] i prace tam

cytowane. Ponadto uczestnicz w wielu reakcjach zachodzcych w bonach komrkowych,

mitochondriach czy cytoplazmie komrek. Dziaaj te jako fotoreceptory wiata

niebieskiego w rolinach, np. w takich zjawiskach jak fototropizm [11].

Zdolno flawoenzymw do udziau w reakcjach przeniesienia tak jednego jak i dwch

elektronw umoliwia im dziaanie pomidzy donorem dwch elektronw (np. NADH) i

akceptorem jednego elektronu (np. hemowy atom Fe). Analogicznie do chinonw, flawiny

dysponuj trzema miejscami utlenienia. Dziki temu mog wystpowa w rnych

formach jako: cakowicie utleniona forma flawochininowa (Flox); rodnik

flawosemichinonowy, czerwony w formie anionowej (Flrad-) lub niebieski w formie

obojtnej (Flrad H); oraz dwu-elektronowo-zredukowany flawohydrochinon, rwnie

istniejcy w dwch formach anionowej (FlredH-) lub obojtnej (FlredH2). Odpowiednie

struktury przedstawiono na schemacie 1.


6

Schemat 1, wedug [12]

N

N

N

NR

H3C

H3C

O

HO

e-

N

N

N

NR

H3C

H3C

O

HO

NH

N

N

N

R

H3C

H3C

O

HO

NH

N

N

N

R

H3C

H3C

O

HO

NH

N

N

HN

RH3C

H3C

O

HO

H+

H+

e-

Flox Flrad

FlradH FlredH

FlredH2

R - CH3 LumiflawinaR - CH2(CHOH)3CH2OH RyboflawinaR - CH2(CHOH)4-fosforan FMNR - CH2(CHOH)4-pirofosforan-adenozyna FADR - CH2CH(CH3)2 Flawina

flawochinon

rodnik flawosemichinonowy - forma obojtna

rodnik flawosemichinonowy forma anionowa

flawohydrochinon forma obojtna

flawohydrochinon forma anionowa

Czsteczka flawiny w rnych formach utlenienia (struktury proponowane przez Niemz i wsppr. [12])


7

1.2 Stany singletowe flawin Widma absorpcji flawin

Podstawowym elementem struktury ryboflawiny i jej pochodnych jest izoalloksazyna

(rys.1). Taka struktura, zawierajca trjczonowy piercie aromatyczny, skadajcy si z

piercienia benzenowego, pirazynowego i pirymidynowego oraz podwjny ukad

laktamowy, powoduje, e zwizki tego typu wykazuj charakterystyczne waciwoci

spektralne absorbujc promieniowanie elektromagnetyczne z zakresu ultrafioletu i wiata

widzialnego [13].

Widma absorpcji flawoprotein w wietle widzialnym i bliskim ultrafiolecie kryj w

sobie wiele informacji o strukturze i reaktywnoci zwizkw. Chromofor

izoalloksazynowy jest wyjtkowo czuy na zmiany rodowiska powodowane przez

przyczenie podstawnikw do piercienia lub zmiany konformacyjne caej czsteczki, a

take na reakcje chemiczne, ktrym ulegaj flawiny. Informacje dotyczce wpywu

rodowiska na waciwoci flawin, znajdujce m.in. swoje odzwierciedlenie w widmach

absorpcji pozostaj przedmiotem intensywnych bada. Pomocne w tych badaniach s

niewtpliwie obliczenia kwantowe wykonywane dla ukadw modelowych i porwnanie

wynikw tych oblicze z rezultatami uzyskanymi z eksperymentu. Przy zaoeniu

znacznego rozwoju metod oblicze kwantowych i usprawnie samego sprztu

obliczeniowego, powinno by moliwe dostarczanie podobnych danych rwnie dla flawin

wbudowanych w biaka [14].

Widmo absorpcji ryboflawiny w roztworze wodnym skada si z czterech pasm,

ktrych maksima pooone sa przy dugociach fali 220 nm (45,5 103 cm-1), 265 nm,

(37,7 103 cm-1) 375 nm (26,7 103 cm-1), i 446 nm (22,4 103 cm-1). Pasma absorpcji

charakteryzuj si molowymi wspczynnikami absorpcji, rzdu 104 dm3 mol-1 cm-1

[15,16]. Pooenie pasm absorpcji oraz molowe wspczynniki absorpcji zale od

rodowiska w jakim znajduje si chromofor flawinowy. To zagadnienie, cho samo w

sobie podstawowe, jednoczenie wydaje si by jednym z kluczowych dla zrozumienia

funkcjonowania tych zwizkw w ukadach biologicznych [17].

Pasmo absorpcji przy dugoci fali 375 nm (26,7 103 cm-1) pochodzi prawdopodobnie

od przejcia -*, chocia z nowszych oblicze wynika, e w tym przejciu pewien udzia

moe mie rwnie przejcie n-*, ktre angauje elektron z niewicej pary

elektronowej zlokalizowanej na orbitalu atomu N(1) piercienia izoalloksazynowego.


8

Wraz ze wzrostem polarnoci rozpuszczalnika widoczny jest wzrost intensywnoci pasma

pooonego przy 375 nm [15].

Pooenie pasm absorpcji flawin zaley od oddziaywa specyficznych tak wewntrz-

jaki i midzyczsteczkowych. Dla 3-metylo-lumiflawiny w chloroformie bardziej

krtkofalowe pasmo absorpcji pooone jest przy 347 nm (28,8 103 cm-1), przy zmianie

rozpuszczalnika na protyczny obserwuje si przesunicie tego pasma w kierunku fal

duszych, maksimum pasma w wodzie pooone jest przy 369 nm(27,1 103 cm-1)).

Przesunicie to odzwierciedla destabilizacj pary elektronowej na niewicym orbitalu

atomu N(1) spowodowan powstawaniem wizania wodorowego [15,17].

Wedug Heelisa [15]., pomiary widm w niskich temperaturach nie daj jednoznacznej

odpowiedzi dotyczcej struktury oscylacyjnej flawin w zakresie bliskiego UV, a co za tym

idzie rodzajw przej pomidzy poziomami wibracyjnymi w czsteczce. Wysokie

molowe wspczynniki absorpcji dugofalowego maksimum absorpcji wskazuj, e dla

ryboflawiny przejcie przy ok. 450 nm ma charakter -*. Na podstawie oblicze

kwantowo-mechanicznych przewidziano, e odpowiednie przejcie o najniszej energii ma

charakter -* i jego energia zbliona jest do wartoci 22,2 103 cm-1 (450 nm), co

wskazuje na du zgodno wynikw oblicze teoretycznych z rezultatami eksperymentu.

Pasmo absorpcji nie ulega przesuniciu przy zmianie rozpuszczalnika od wody do

rozpuszczalnika o mniejszej polarnoci, co sugeruje, e symetria najniszego przejcia

elektronowego zostaa przypisana prawidowo jako -* [15].

W pozycjach N(1), N(3), N(5) i N(10) oraz na atomach tlenu w pozycjach C(2)=O i

C(4)=O piercienia izoalloksazynowego, zlokalizowane s niewice pary elektronowe, a

wic moliwe s w czsteczce izoalloksazyn rwnie przejcia typu n-*. W czsteczkach

flawin z powodu braku symetrii przejcia typu n-* mog by intensywne. Jednake czsto

przejcia typu n-* znajduj si w ssiedztwie znacznie bardziej intensywnych przej

typu -* [4,15].

Znany jest te wpyw podstawnikw na ksztat widm absorpcji flawin. Visser i

wsppr. [18] zauwayli, e obecno dodatkowych podstawnikw metylowych w

czsteczce izoalloksazyn ma wpyw na ksztat widma absorpcji, pooenie maksimw

absorpcji, a take na wartoci molowego wspczynnika absorpcji. Analiza zmian w

widmach absorpcji pochodnych izoalloksazyny zawierajcych podstawniki metylowe w

czsteczce pokazaa [18], e w roztworach rozpuszczalnikw o wzrastajcej polarnoci

krtkofalowe pasmo absorpcji ulega niewielkim zmianom, podczas gdy pasmo bardziej

dugofalowe podlega wyranemu przesuniciu batochromowemu. Ponadto zarwno liczba


9

podstawnikw jak i pozycje podstawienia poszczeglnych grup metylowych decyduj o

zmianach w widmach absorpcji poszczeglnych zwizkw [18]. Badania Sikorskiej i

wsppr. [19] dotyczce potwierdziy, e dodatkowe podstawniki w czsteczce 3,10-

dimetyloizoalloksazyny obecne w pozycjach 6, 7, 8 i 9 powoduj charakterystyczne

zmiany w widmach absorpcji i emisji. Ponadto obecno grup metylowych w pozycjach

C(6) i C(9) powoduje obnienie wartoci wydajnoci kwantowej fluorescencji i skrcenie

czasu ycia fluorescencji. Natomiast podstawnik metylowy w pozycji C(7) wywouje efekt

przeciwny, a maksimum fluorescencji ulega przesuniciu w kierunku fal duszych, [19] i

prace tam cytowane. Elektronodonorowa grupa w pozycji C(8) powoduje wzrost

aktywnoci utleniajcej piercienia izoalloksazynowego [20].

Z danych teoretycznych publikowanych dla alloksazyn i izoalloksazyn [19,21,22]

wynika, e w czsteczkach flawin obok najniej energetycznie pooonych wzbudzonych

stanw singletowych o konfiguracji (, *) obecne s blisko pooone stany o konfiguracji

(n, *). Poniewa, jak pokazaa Sikorska i wsppr. [19], pooenie stanw (, *) zaley

od pooenia podstawnikw metylowych w piercieniu izoalloksazynowym, w

czsteczkach niektrych pochodnych izoalloksazyn moliwa jest inwersja stanw o

konfiguracji (n, *) i (, *) co ma istotny wpyw na waciwoci spektralne i fotofizyczne

tych zwizkw.

Z bada Weigela i wsppr. [23], dotyczcych fotoindukowanych procesw dla

ryboflawiny w wodzie i DMSO wynika, e mieszanie stanw 1-* i 1n-* zachodzi przez

sprzenie wibronowe w femtosekundowej skali czasowej (~20 fs) po wzbudzeniu.

Obsadzanie stanw zachodzi pod kontrol rozpuszczalnika, zaley wic gwnie od

oddziaywa czsteczek zwizku z czsteczkami rozpuszczalnika. Proces jest

kontrolowany przez solwatacj. Mieszanie stanw powoduje poszerzenie pasm absorpcji,

zarwno w wodzie jak i DMSO.

Waciwoci emisyjne flawin

Zwizki typu flawin fluoryzuj w roztworach wodnych w temperaturze pokojowej. Widma

fluorescencji wykazuj maksimum przy okoo 530 nm (18,9 103 cm-1). W

rozpuszczalnikach mniej polarnych od wody rejestruje si przesunicie maksimum emisji

w kierunku fal krtszych i pojawienie si struktury subtelnej widma. Badania w niskich

temperaturach wykazay znaczne przesunicie hipsochromowe widma, ktre wie si z


10

zablokowaniem ruchw oscylacyjnych w czsteczce, pozwalajc na wyznaczenie energii

przejcia 0-0 [15,17].

W roztworach wodnych o pH = 7 flawiny wykazuj wydajno kwantow fluorescencji

ok. = 0,25 (dla lumiflawiny, ryboflawiny, FMN), natomiast w mieszaninie dioksan-woda

(90:10 v/v) wydajno kwantowa ronie do wartoci 0,52, aby w samym dioksanie

osign warto = 0,72. Uwaa si, w przypadku flawin fluoryzuj wycznie formy

obojtne [15,17]. Flawiny wzbudzane promieniowaniem o rnej dugoci fali nie

wykazuj zmian ksztatu widma emisji ani wartoci wydajnoci kwantowej, co sugeruje, e

emituj ze stanu S1, a wysze stany wzbudzone dezaktywuj si do tego stanu poprzez

konwersj wewntrzn [15].

Zauwaono rwnie, e w acetonitrylu wydajno kwantowa fluorescencji wzrasta w

porwnaniu z odpowiednimi wartociami otrzymanymi dla roztworw wodnych. Yagi [24]

podaje, e wydajno kwantowa fluorescencji maleje, a pasmo fluorescencji ulega

poszerzeniu wraz ze wzrostem polarnoci rozpuszczalnika protycznego. Zjawisko to

tumaczy si udziaem wiza wodorowych pomidzy czsteczkami protycznego

rozpuszczalnika i flawiny. Wizania wodorowe mog take wpywa na stopie sprzenia

spin-orbita w stanie S1, wpywajc w ten sposb na szybko przejcia

midzysystemowego i w konsekwencji wydajno kwantow fluorescencji. Na podstawie

oblicze przewiduje si, e najbardziej podatnym na powstawanie wiza wodorowych

miejscem piercienia izoalloksazynowego jest pozycja N(1), charakteryzujca si

najsilniejszymi waciwociami zasadowymi [15,17,24].

Czas zaniku fluorescencji w wodzie (pH = 7) lumiflawiny, ryboflawiny i FMN jest

jednakowy i wynosi 5 ns, a dla FAD wyznaczona warto czasu ycia fluorescencji to

2,3 ns [15] i prace tam cytowane. Podane przez Grodowkiego i wsppr. [25] czasy ycia

fluorescencji pochodnych flawin w wodzie (pH = 2,2) s nisze i wynosz odpowiednio

2,5 i 2,4 ns dla lumiflawiny i ryboflawiny.

W sposb znaczcy fluorescencja flawin jest wygaszana, gdy flawiny s zwizane z

biakami w enzymach. Wyjanienie mechanizmu wygaszania fluorescencji we

flawoenzymach moe dostarczy wiele istotnych informacji dotyczcych rodowiska, w

ktrym znajduj si czsteczki flawin [15]. Nakashima i wsppr. [26] wyznaczyli

wydajno kwantow fluorescencji FAD zwizanego z protein. Jej warto zaley od

stenia badanego enzymu i dla niskich ste (1 M) wynosi = 0,25, tyle ile dla flawin

w wodzie. Dla duych ste enzymu (100M) warto ta maleje do wartoci 0,12.


11

W przypadku flawin, do opisu zmian intensywnoci fluorescencji konieczne jest uycie

dwch mechanizmw - tworzenie niefluoryzujcego kompleksu w stanie podstawowym

pomidzy flawin i czsteczk wygaszacza oraz mechanizm wygaszania dynamicznego. W

myl mechanizmu dynamicznego czsteczka ulega wzbudzeniu, a nastpnie na skutek

zderze czy te oddziaywa z czsteczkami wygaszacza jej fluorescencja ulega

wygaszaniu. Dla flawin dominujcy jest proces kompleksowania w stanie podstawowym.

Dziki pomiarom czasu ycia fluorescencji stwierdzono jednak, e w niewielkim stopniu w

procesie wygaszania ma te udzia mechanizm dynamiczny, jako e czas ycia stanu

wzbudzonego ulega nieznacznemu skrceniu [15].

Uzyskane przez Nakashim i wsppr. [26] dane dotyczce wydajnoci kwantowej

fluorescencji FAD w obecnoci proteiny pokazuj, e fluorescencja FAD w zastosowanych

warunkach zostaje wygaszona w procesie dynamicznym. Z przytaczanych przez

Nakashim wczeniejszych bada wynika, e w roztworze wodnym w obrbie samej

czsteczki FAD powstaje niefluoryzujcy kompleks pomidzy flawin a adenin,

angaujcy 82% FAD, a obserwowana fluorescencja pochodzi od pozostaych

niezwizanych czsteczek tego zwizku. W ten sposb jedynie czsteczki FAD

niezwizane w kompleksie mog podlega wygaszaniu dynamicznemu. Ponadto z

przedstawionych danych wynika, e czsteczki aminokwasw o waciwociach elektrono-

donorowych, takie jak tryptofan czy tyrozyna, take mog znaczco wygasza

fluorescencj FAD. Sugeruje si, e w tym przypadku moliwe jest przeniesienie elektronu

od aminokwasu do piercienia izoalloksazynowego, [26] i prace tam cytowane.

Fluorescencja flawin jest wydajnie wygaszana jony jodkowe i kationy metali

przejciowych [15] i prace tam cytowane. Stany wzbudzone flawin wygaszane s take

przez aminy poprzez mechanizm przeniesienia elektronu od aminy do czsteczki flawiny, z

utworzeniem formy przejciowej o charakterze charge-transfer. Z rezultatw Porcal i

wsppr. [27] wynika, e stae wygaszania stanw singletowych i trypletowych flawin

przez alifatyczne donory elektronu maj nisze wartoci ni stae wygaszania przez donory

aromatyczne o tym samym potencjale utleniania. Dla ryboflawiny w stanie singletowym w

obecnoci aniliny w roztworze metanolowym staa wygaszania wynosi 11,7 109 mol-1 s-1,

podczas gdy w obecnoci trietyloaminy przyjmuje warto 2,6 109 nol-1 s-1 [27].

Prowadzone przez Platza i wsppr.[28] badania reakcji tetraacetylo-ryboflawiny

(TARF) z indolem i guanozyn, pokazay, e zwizek we wzbudzonym stanie trypletowym

jest wygaszany przez obydwa zwizki, odpowiednio ze sta szybkoci dla reakcji z

indolem kq = 4,5 109 mol-1s-1 i dla reakcji z guanozyn kq = 1,0 108 mol-1s-1. Z bada z


12

zastosowaniem czasowo-zalenej spektroskopii IR wynika, e TARF reaguje z guanozyn

tworzc rodnik hydroflawinowy poprzez mechanizm przeniesienia elektronu i

przeniesienia protonu.

Dla flawin obserwuje si zjawisko fluorescencji opnionej typu E i typu P.

Fluorescencja typu E, pojawia si przy tej samej dugoci fali co zwyka fluorescencja, lecz

posiada znacznie duszy czas ycia np. dla ryboflawiny 58 ms, dla FMN 72 ms [15].

Fluorescencja typu P pochodzi od wzbudzonego dimeru lub wyszych kompleksw, ktre

tworz si w rozpuszczalnikach o maej polarnoci, [15] i prace tam cytowane.


13

1.3 Stany trypletowe flawin Widma fosforescencji flawin

Zwizki z grupy flawin wykazuj fosforescencj w niskich temperaturach z maksimum

przy dugoci fali ok. 600 nm. Grodowski i wsppr. [25] podaje, e wydajno przejcia

midzysystemowego dla flawin w roztworach w temperaturze pokojowej jest dua i dla

lumiflawiny w roztworze etanolowym wynosi ISC= 0,3. Obserwowan fosforescencj

charakteryzuje natomiast stosunkowo niska wydajno kwantowa (P = 0,0012 w etanolu,

77 K). Pomimo znacznego udziau przejcia interkombinacyjego zanik stanu trypletowego

w tego typu zwizkach musi wic odbywa si poprzez procesy nieradiacyjne. Warto

czasu ycia fosforescencji w temperaturze 77 K okrelono na poziomie ~0,1-0,2 s i zaley

ona od rodzaju flawiny i zastosowanego rozpuszczalnika. Heelis [15] podaje, e w

kwanych szkliwach etanolowych widmo fosforescencji formy kationowej flawin

przesunite jest w kierunku fal krtszych w stosunku do widma formy obojtnej [15,29].

Dla ryboflawiny pasmo fosforescencji obserwuje si w temperaturze 77 K z maksimum

przy dugoci fali 620 nm, oraz ramieniem przy 660 nm. Czas ycia fosforescencji dla

ryboflawiny i FMN wynosi okoo 0,2 s bez wzgldu na zastosowany ukad

rozpuszczalnikw, w zakresie temperatury od 77 K do 113 K [30].

Dla flawin w roztworach w temperaturze pokojowej czas ycia fosforescencji wynosi

10 100 s i ulega znacznemu skrceniu na skutek wygaszania przez czsteczki flawiny w

stanie podstawowym. Z bada fosforescencji wynika, e dimery flawin w stanie

trypletowym emituj fosforescencj o niszej energii i wykazuj krtszy czas ycia ni w

monomerach [15].

W starszych pracach Sun i wsppr. [4] zauwayli, e w rozpuszczalnikach polarnych,

w temperaturze pokojowej wydajno kwantowa fluorescencji jest stosunkowo niska,

podczas gdy wydajno kwantowa fosforescencji stosunkowo wysoka. Natomiast w

rozpuszczalnikach niepolarnych w niskich temperaturach obserwuje si spadek wartoci

ISC z jednoczesnym wzrostem wydajnoci kwantowej fluorescencji, co wskazuje, e na

obsadzanie stanw trypletowych istotnie wpywa temperatura oraz polarno

rozpuszczalnika [4].

Wyniki dotyczce zasadowoci formy podstawowej w stosunku do formy wzbudzonej

nie s jednoznaczne. Odwoanie si do rezultatw oblicze teoretycznych dotyczcych

gstoci elektronowej wskazuje, e w formie utlenionej [15];


14

- pozycja N(1) jest najbardziej zasadowa w stanie podstawowym,

- pozycja N(5) jest najbardziej zasadowa we wzbudzonym stanie trypletowym.

Wobec tego, fosforescencja obserwowana w szkliwie w 77 K pochodzi od formy

protonowanej powstaej jeszcze w stanie podstawowym, gdy proton zwizany jest w

pozycji N(1). W roztworze natomiast flawina jest sprotonowana w pozycji N(5). Okrelone

za pomoc fotolizy byskowej pKa odnosi si wic do stanu, gdy flawina jest sprotonowana

w pozycji N(5) [15].

Na podstawie danych pomiarw polaryzacji wzbudzenia fosforescencji oraz

wykonanych oblicze teoretycznych Song i wsppr. [4] zauwayli, e dla izoalloksazyn

stan, z ktrego zachodzi fosforescencja posiada konfiguracj 3(, *).

Struktura czsteczki flawiny charakteryzuje si brakiem symetrii, wykazuje

odchylenie od planarnoci oraz posiada dwa atomy wgla o charakterze karbonylowym i

dwa atomy azotu o charakterze pirydynowym, co sprawia, e prawdopodobiestwo przej

n* dla tej czsteczki jest potencjalnie due. W czsteczkach zwizkw

heterocyklicznych stany o konfiguracji n* wpywaj na ich cakowit luminescencj,

poniewa mog uczestniczy w sprzeniu spin-orbita. Dla flawin sugeruje si wic

znaczny udzia sprzenia spin orbita pomidzy stanami 1(n, *) a 3(, *) [4,29].

Grodowski i wsppr. [25] wykazali, e w rozpuszczalnikach polarnych wydajno

kwantowa przejcia midzysystemowego jest dua, co pozostaje w zgodzie z

postulowanym sprzeniem spin orbita pomidzy stanami singletowymi (n,*) i

trypletowymi o konfiguracji (,*).

Czynnikiem, ktry decyduje o reaktywnoci flawin jest niewtpliwie fakt, e posiadaj

wydajnie obsadzane, dugo yjce stany trypletowe. Wartoci staych szybkoci przejcia

midzystemowego dla FMN obliczone przez Salzmann i wsppr. [31] (metody

DFT/MRCI) wynosz w roztworze wodnym (kISC ~ 108 s-1) i dla czsteczek w stanie

gazowym (kISC ~ 109s-1). Konfiguracja trypletowych stanw flawin (-*) nie sprzyja

udziaowi w reakcjach redoks. Mimo to flawiny wykazuj du aktywno w procesach

utleniania i redukcji indukowanych wiatem. Przyczyny tego zjawiska upatruje si w

sprzeniu wibronowym pomiedzy stanami 3(, *) i 3(n, *). W zwizkach tych postuluje

si bowiem istnienie blisko pooonych najniszych trypletowych stanw wzbudzonych o

symetrii 3(-*) i ssiadujcych z nimi stanw 3(n-*). Taki ukad powoduje, e w

czsteczkach tych zwizkw mamy do czynienia ze stanem trypletowym okrelonym przez

Heelisa jako hybrydowy [15,29].


15

W najnowszych pracach Braslavsky, Marian i wsp. [32] sugeruj natomiast, e

przejcie midzysystemowe w czsteczkach pochodnych flawin (5-deaza-ryboflawina, 7,8-

didemetylo-ryboflawina, 8-izopropylo-ryboflawina) w roztworze wodnym zachodzi

pomidzy stanem S1 1(,*) a T2 3(,*) poprzez sprzenie spin-orbita.

Widma absorpcji przejciowej flawin

Stosunkowo dugi czas ycia stanu trypletowego powoduje, e reakcje pochodnych

flawinowych w tym stanie posiadaj istotne znaczenie z punktu widzenia fotochemii [33].

Grodowski i wsppr. [25] zarejestrowali widma absorpcji przejciowej w odtlenionych

roztworach wodnych o pH=2,2 dla lumiflawiny i ryboflawiny. Przy wzbudzeniu

promieniowaniem o dugoci fali = 347 nm pojawiaj si pasma absorpcji przejciowej,

o krtkim czasie zaniku (T10-20 s), lece w zakresie krtkofalowym (300 nm) oraz

dugofalowym (~400 nm i ~500 nm). Ponadto zaobserwowano obecno

charakterystycznego dla flawin intensywnego pasma przy okoo 640 nm. Porwnanie

wynikw uzyskanych dla roztworw odtlenionych i nieodtlenionych oraz pomiarw

wykonanych w szkliwach (77 K), pozwolio na przypisanie tych pasm jako

charakteryzujcych stan trypletowy.

Widmo absorpcji przejciowej zarejestrowane dla lumiflawiny w etanolu [25]

wykazuje obecno pasma o duej intensywnoci, lecego przy ok. 380 nm. Szcztkowa

absorpcja przejciowa > 500 nm, zanika w czasie 50-100 s. Pasmo dugofalowe (przy

ok. 570 nm) przypisywane jest rodnikowi semichinonowemu, ktrego obecno w

roztworze etanolowym postuluje si jako rezultat oddziaywania czsteczek lumiflawiny w

stanie trypletowym z czsteczkami rozpuszczalnika. Pasmo dugofalowe odpowiada take

pasmu opisanemu dla semichinonowego rodnika flawiny, zarejestrowanego w obojtnym

roztworze wodnym [25].

Pniejsze badania Lu i wsplpr. [33,34], dotyczce wodnych roztworw ryboflawiny

pokazay rnice w powstajcym ukadzie fotoproduktw. Widmo absorpcji przejciowej

uzyskane przy wzbudzeniu dugoci fali 248 nm skada si z pasm pochodzcych od

utlenionego rodnika ryboflawiny, uwodnionego elektronu oraz zredukowanego rodnika w

stanie trypletowym. Taki rozkad produktw sugeruje powstawanie zarwno ryboflawiny

w stanie wzbudzonym jak i reakcj fotojonizacji, a powstajcy utleniony rodnik

ryboflawiny posiada silniejsze waciwoci utleniajce ni ryboflawina wzbudzona do


16

stanu trypletowego. Natomiast przy uyciu promieniowania wzbudzajcego o dugoci fali

337 nm zaobserwowano powstawanie jedynie ryboflawiny w stanie trypletowym [33,34].


17

1.4 Waciwoci kwasowo-zasadowe flawin Pochodne ryboflawiny stanowi aktywne czci wielu enzymw i jako takie s

przedmiotem intensywnych bada, szczeglnie w kontekcie wyjaniania ich roli w

reakcjach enzymatycznych. Waciwoci utleniajco - redukujce flawin badane s m.in.,

w zalenoci od podstawnikw obecnych w czsteczce.

Ukad izoalloksazynowy, ktry stanowi podstawowy element strukturalny ryboflawiny

i jej pochodnych, posiada skomplikowan struktur bogat w wiele miejsc o potencjalnej

aktywnoci w reakcjach przeniesienia protonu, przyczenia atomu wodoru i wymiany

elektronu.

Warunki protonowania

Zwizki typu flawin, wykazuj tendencj do przyczania lub odszczepiania protonu w

roztworach wodnych. Badanie reakcji protonowania w przypadku flawin jest

skomplikowane i trudne, jako e flawiny posiadaj kilka miejsc aktywnych w reakcji

przyczania protonu czy atomu wodoru. Jak wspomniano wczeniej (Rozdzia 1.1,

Schemat 1) flawiny mog wystpowa w formie utlenionej, obojtnej oraz zredukowanej -

cakowicie utleniona forma flawochininowa (Flox); rodnik flawosemichinonowy, czerwony

w formie anionowej (Flrad-) lub niebieski w formie obojtnej (Flrad H); oraz

dwuelektronowo-zredukowany flawohydrochinon, rwnie istniejcy w dwch formach

anionowej (FlredH-) lub obojtnej (FlredH2) [12]. W zalenoci od wartoci pH roztworu,

poszczeglne formy wystpuj w formie kationw, anionw lub w formie obojtnej (rys.3)

[35,35]. W roztworze o pH obojtnym zwizki te wystpuj w postaci flawochinonowej

FloxH. Drssler i wsppr. [35] badali zachowanie ryboflawiny w roztworach wodnych o

rnym zakresie pH. Na podstawie widm absorpcji pokazano, e w roztworach silnie

kwanych, pH < 0.4, ryboflawina obecna jest w formie kationowej. W zakresie wartoci

0.4 < pH < 9.75 dominuje forma obojtna, a powyej pH=9.75 formia anionowa. W

zakresie pH 3-7 widmo pochodzi od formy utlenionej FloxH; w zakresie pH od 0.1 do -1.09

obecne s dwie formy zwizku FloxH i FloxH2+; w pH 13.35 widmo pochodzi natomiast od

formy anionowej Flox- [35].

Na rysunku 2 pokazano formy utlenienia lumiflawiny, natomiast rysunek 3 prezentuje

struktur czsteczki flawiny w rnych formach utlenienia w zalenoci od pH roztworu

wraz z przyblionymi wartociami pK.


18

N

N

N

NCH3

H3C

H3C

O

HO

N

N

N

NCH3

H3C

H3C

O

HO

N

N

N

N

CH3H3C

H3C

O

HO

Lumiflawinaforma utleniona

5-hydrolumiflawinaforma rodnikowa

1,5-dihydrolumiflawinaforma zredukowana

H H

H H

H

Rysunek 2. Lumiflawina w trzech formach utlenienia, na podstawie [36]

Intensywno fluorescencji flawin i ksztat widma zale od pH roztworu. Przy

wartociach pH>9 obserwowany jest spadek intensywnoci fluorescencji, natomiast

zmiana ksztatu widma jest niewielka. W tych warunkach w roztworze czsteczki flawin s

zdeprotonowane zarwno w stanie podstawowym jak i we wzbudzonym stanie

singletowym (pKa i pKa* ok. 10). Natomiast w warunkach gdy pH


19

N

N

NH

HN O

O

R

H3C

H3C

10

N

N

NH

N O

O

R

H3C

H3C N

N

N

N O

O

R

H3C

H3C

110pK~0 pK~10

Fl oxFlH+ox

10 11

Flox(- H+)flawochinon - forma utlenionaflawochinon - forma kationowa flawochinon - forma anionowa

a

NH

N

NH

HN O

O

R

H3C

H3C

10

N

N

NH

N O

OH

R

H3C

H3C N

N

NH

N O

O

R

H3C

H3C

110pK~2 pK~8

HFlH2Fl

10 11

Flrodnik flawosemichinonowy-forma obojtna rodnik flawosemichinonowy-

forma anionowarodnik flawosemichinonowy-forma kationowa

b

N

N

NH

HN O

O

R

H3C

H3C

10

NH

N

NH

HN O

O

R

H3C

H3C NH

N

NH

N O

O

R

H3C

H3C

110pK~0 pK~6

H2FlredH2FlHred

10 11

HFlred

H H

1,5 dihydroflawina - flawohydrochinon forma zredukowana

flawohydrochinon - forma anionowa

flawohydrochinon - forma kationowa

c Rysunek 3. Procesy utleniania i redukcji oraz rwnowagi kwasowo zasadowe dla zwizkw

flawinowych (struktury proponowane przez Heelisa), wedug [15]

Na podstawie wynikw analizy rentgenograficznej przyjmuje si, e czsteczka w formie

utlenionej (rys. 3a) jest paska i czciowo posiada cechy aromatycznoci. Jednake

pomiary spektroskopii NMR sugeruj pewne odchylenie atomu N(10) od paszczyzny

czsteczki obserwowane w rozpuszczalnikach aprotycznych. Dla formy zredukowanej

analiza struktury krystalograficznej wykazuje obecno dwch niemal paskich czci

czsteczki rozdzielonych osi przebiegajc od atomu N(5) do N(10). Podobnie

interpretuje si te dane spektroskopowe oraz wyniki oblicze uzyskane dla tej formy,

ktre jako najbardziej stabiln przyjmuj form pofadowan. Przewiduje si, e w tej

formie zwizek nie posiada charakteru aromatycznego. Dokadne okrelenie struktury

formy rodnikowej okazuje si zagadnieniem skomplikowanym, ze wzgldu na jej

niestabilno i zwizane z tym trudnoci eksperymentalne. Z danych uzyskanych metod

EPR i ENDOR oraz z oblicze ab initio wynika, e piercie izoalloksazynowy dla formy


20

rodnikowej powinien posiada struktur komplanarn, natomiast obliczenia MINDO/3

wskazuj jako najbardziej stabiln struktur pofadowan [36,40].

Li i wsppr. [41]dowodz, e pod wpywem protonowania zmienia si konformacja

czsteczek FAD i FMN, a w zwizku z tym waciwoci czsteczek w stanie wzbudzonym.

Widmo absorpcji przejciowej wzbudzonego kationu flawiny rni si od odpowiednich

widm dla anionu i dla formy obojtnej, co sugeruje zmiany konfiguracji elektronowej pod

wpywem proponowania.

W enzymach (fotoliazy) otoczenie biakowe FAD powoduje specyficzny rozkad

adunku, co reguluje elektrono-transferowe waciwoci kofaktora flawinowego. Gstoci

spinowe i elektronowe s najwysze w piercieniu pirazynowym i zewntrznym

piercieniu pirymidynowym w czsteczce FADH*. Nakadanie orbitali z ukadem

elektronowym adeniny jest wtedy najwiksze. Taki ukad uatwia np. przeniesienie

elektronu do i od dimerw cyklobutanowych pirymidyn (CPD, cyclobutane pyrimidine

dimer) w procesie naprawy DNA [42].

Wizania wodorowe

Wizania wodorowe stanowi istotne zagadnienie z punktu widzenia aktywnoci

zwizkw flawinowych w reakcjach enzymatycznych. Istnienie moliwoci powstawania

pocze o charakterze niekowalencyjnym jest bowiem istot funkcjonowania organizmw

ywych [43]. Oddziaywania niekowalencyjne takie jak wizania wodorowe,

oddziaywania warstwowe - i oddziaywania elektrostatyczne w enzymach uwaane s

za podstawowy czynnik regulujcy waciwoci utleniajco redukujce czsteczki FMN i

w konsekwencji kontrolujce katalityczn aktywno enzymu [44]. Wizania wodorowe

mog powstawa pomidzy czsteczkami naadowanymi i nienaadowanymi i mona je

rozpatrywa jako stan przejciowy w procesie przeniesienia atomu wodoru pomidzy

kwasem a zasad. W ukadach biologicznych donorem wodoru jest zwykle atom tlenu lub

azotu kowalencyjnie zwizany z atomem wodoru, natomiast w roli akceptora najczciej

wystpuj rwnie atomy tlenu lub azotu pochodzce od innych grup funkcyjnych, np.

pomidzy grupami amidowymi (-NH) i karbonylowymi (-CO) w czsteczkach kwasw

nukleinowych [43]. Rwnie FMN zwizany jest w biaku poprzez sie wiza

wodorowych. Niekowalencyjne oddziaywania tego typu musz wpywa na reaktywno

FMN w stanie podstawowym i wzbudzonym [45].

Dwyer i wsppr. [46] poszukiwali bezporedniego dowodu na istnienie wizania

wodorowego wewntrz czsteczki koenzymu. Wyjaniono funkcj jak peni wizanie


21

wodorowe pomidzy 4-rybitylow grup OH w acuchu bocznym a atomem N(1) w

piercieniu izoalloksazynowym w stabilizowaniu formy zredukowanej flawoproteiny

elektrono-transferowej. Analog zawierajcy flawoprotein suy jako akceptor elektronu.

Jednake flawoproteina zawierajca 4-deoxy-FAD nie moe by ani donorem, ani

akceptorem elektronu pochodzcego od enzymu flawoproteinowo-ubichinonowego, co

sugeruje, e wizanie wodorowe moe poredniczy w przejciu elektronu pomidzy

dwiema proteinami utleniajco-redukujcymi. Wewntrzflawinowe wizanie wodorowe

stabilizuje formy semichinonow i hydrochinonow wywierajc w ten sposb wpyw na

utleniajco-redukujce waciwoci flawin [46].

acuch rybitylowy czsto determinuje wizanie FAD i FMN we flawoenzymach

[47,48]. Wykazano te, e ma on bezporedni udzia w procesach katalizowanych za

porednictwem flawoprotein. Dla pewnych reakcji biochemicznych zachodzcych w

organizmach ywych wizanie wodorowe powoduje aktywacj substratu poprzez

obnienie wartoci pKa dla protonu z acucha acylowego. Niektre z badanych reakcji

enzymatycznych s cakowicie zablokowane w przypadku zastpienia w czsteczce

enzymu 2-analogw FAD analogami FAD. Niektre 2-analogi FAD obniaj stabilno

pewnych zredukowanych enzymw, co sugeruje znaczne zmiany potencjau redoks flawin

[46,49,50]. Widma absorpcji uzyskane dla zmodyfikowanych protein [46], zawierajcych

4-deoxy-FAD zachowuj co prawda ksztat widma natywnego FAD, jednake maksimum

absorpcji jest przesunite w kierunku fal duszych o okoo 7 nm, a maksimum

fluorescencji jest przesunite o okoo 30 nm w stron fal duszych [51].

Obecno wiza wodorowych pomidzy allokazyn w stanie podstawowym a

czsteczkami, ktre mog katalizowa proces przeniesienia protonu, determinuje ten

proces w stanie wzbudzonym. [52]. Jak pokazaa Sikorska i wsppr. [52] dla alloksazyn,

kwasowo wizania N(1) - H odgrywa kluczow rol w procesie przeniesienia protonu,

katalizowanym przez czsteczki alkoholu. Wizanie wodorowe powstaje bowiem

pomidzy atomem wodoru alloksazyny w pozycji N(1) a atomem tlenu w czsteczce

alkoholu. Autorzy pracy [52] zauwayli, e 5-deazalumichrom, ktry tautomeryzuje tylko

w obecnoci kwasu octowego, wykazuje znaczn zasadowo atomu azotu N(10) w stanie

podstawowym. Zwizek ten moe tworzy silniejsze wizania wodorowe ze zwizkami

protono-donorowymi w stanie podstawowym (kwas octowy), a w konsekwencji w stanie

wzbudzonym moe ulega przeniesieniu protonu z wiksz wydajnoci. Czsteczka

kwasu peni rol pomostu pomidzy atomami azotu w pozycjach N(1) i N(10), a

powstawanie kompleksu alloksazyna kwas octowy zaley od waciwoci kwasowo


22

zasadowych w pozycjach N(1) i N(10) piercienia alloksazynowego [52]. Natomiast

wizanie wodorowe w pozycji N(3) kofaktora flawinowego w mniejszym stopniu wpywa

na waciwoci utleniajco - redukujce flawoprotein. Zauwaono [53], e wizanie

wodorowe pomidzy atomem wodoru z N(3)H a grup karboksylow aminokwasu w

proteinie stabilizuje flawin w formie utlenionej. Atom wodoru w pozycji N(5) piercienia

izoalloksazynowego wykazuje dominujcy wpyw na stabilizowanie flawiny w stanie

zredukowanym, w szczeglnoci obojtnej formy semichinonowej [53].

Ishizaka i Kitamura [45] badali ryboflawin jako ukad modelowy. Wykazali, e

indukowany wiatem cykl reakcji utleniania i redukcji w czsteczce ryboflawiny

przebiega poprzez tworzenie potrjnego ukadu wiza wodorowych pomidzy

ryboflawin (RF) i pochodn triazynow (DTT, N,N-dioktadecyl-[1,3,5]triazyno-2,4,6-

triamina) na granicy faz woda / CCl4. Ponadto wykazano, e donorem protonu s

zgromadzone na granicy faz czsteczki wody, a powstanie kompleksu opartego na

wizaniach wodorowych jest pierwszym etapem w fotoindukowanym procesie

przeniesienia elektronu i przeniesienia adunku (elektron transfer) ET/CT (charge transfer)

w caym opisanym cyklu reakcji redoks (Schemat 2, str. 23) [45].

FAD i aniony lumiflawiny badano metod czasowo-zalenej spektroskopii w

podczerwieni [54]. Autorzy zauwayli, e wizania wodorowe powstajce pomidzy

czsteczkami FAD a czsteczk rozpuszczalnika modyfikuj wyranie widmo wibracyjne,

powodujc przesunicie pasm w kierunku fal duszych. W stanie wzbudzonym system

wiza wodorowych pomidzy FAD i protein ulega reorganizacji, co take powoduje

przesunicie widma w kierunku fal duszych.

Badanie flawin metod spektroskopii ramanowskiej pozwala bada udzia grup

metylowych w pozycji C(8) piercienia izoalloksazynowego w funkcji dziaania proteiny

[55].


23

Schemat 2, wedug [45]

RF

1RF* / 3RF*

O2

RF RFH RFH2

N NNN N

N

H

H

HH

h

NN

N

N

OOH

HOOH

HOOH

N NNN N

N

H

H

HH

NN

N

N

OOH

HOOH

HOOH

N NNN N

N

H

H

HH

NN

N

N

OOH

HOOH

HOOH

N NNN N

N

H

H

HH

NN

N

N

OOH

HOOH

HOOH

H2O RFH

R R R R R R R

em= 517 nm em= 490 nm=1.1 1.4 ns =170 - 210 ns

R= -(CH2)17 CH3

faza wodna

faza organiczna (CCl4)

granica faz

H H

R

RF

DTT

Fotoindukowany cykl reakcji utleniania i redukcji czsteczki ryboflawiny na granicy faz woda/ CCl4

Na granicy faz wodnej (roztwr ryboflawiny) i organicznej (roztwr DTT) pomidzy

czsteczkami tych zwizkw powstaje ukad trzech wiza wodorowych. Pod wpywem

impulsu wiata w roztworze ryboflawiny generowany jest proces ET/CT w wyniku czego

tworzy si anionorodnik RF. Pod wpywem czsteczek wody anionorodnik ulega

protonacji dajc rodnik semichinonowy RFH (pKa8.4) [45]. W kolejnym etapie rodnik

semichinonowy podlega reakcji dysmutacji dajc 1,5-dihydroflawin RFH2 i ryboflawin

RF. RFH2 moe ulega utlenieniu do ryboflawiny pod wpywem tlenu czsteczkowego

obecnego w warunkach reakcji, zamykajc w ten sposb cykl reakcji redoks [45].


24

2. Reakcje przeniesienia protonu w zwizkach flawinowych Przeniesienie protonu w stanie wzbudzonym Czsteczka zwizku w rnych stanach elektronowych, podstawowym czy wzbudzonym,

singletowym czy trypletowym, stanowi odrbne indywiduum z waciwymi sobie cechami,

takimi jak: dugo wiza, kty midzy wizaniami, rozkad adunku, wreszcie

reaktywno chemiczna, stanowic zesp izomerw elektronowych [56].

Wzbudzenie impulsem energii powoduje zmian rozkadu gstoci elektronowej

niekiedy przegrupowanie atomw w czsteczce, implikujc zmiany jej waciwoci

kwasowo-zasadowych, co w kocowym efekcie moe prowadzi do tautomeryzacji, czyli

zjawiska wewntrzczsteczkowego przeniesienia protonu [57-61]. Przeniesienie protonu w

czsteczce zwizku aromatycznego powoduje znaczne zmiany elektronowe i strukturalne,

ktrym mog towarzyszy znaczne zmiany momentw dipolowych i geometrii czsteczki.

Zmiany wewntrzczsteczkowe czsto odzwierciedlane s w obserwowanych efektach

spektroskopowych, takich jak znaczne przesunicie maksimum fluorescencji. Dynamika

transformacji ukadu silnie zaley od natury rozpuszczalnika, gwnie od jego zdolnoci do

tworzenia wiza wodorowych. Tautomery, jako rne indywidua charakteryzuj si

innymi waciwociami chemicznymi i fotochemicznymi. Tautomeryzacja stanowi wic

bardzo istotne zagadnienie nie tylko z punktu widzenia fizyki, ale take chemii i biologii

[58,62].

W ramach procesu przeniesienia protonu w stanie wzbudzonym wyrnia si trzy grupy

reakcji:

midzyczsteczkowe przeniesienie protonu w molekularnych dimerach i

heterodimerach, powstaych poprzez utworzenie wiza wodorowych oraz w

heterodimerach,

przeniesienie protonu w ukadach aromatycznych z udziaem rozpuszczalnika,

wewntrzczsteczkowe przeniesienie protonu.

Zasadnicz trudno w obrbie podanej klasyfikacji stanowi rozrnienie procesu

wewntrzczsteczkowego i efektw rozpuszczalnikowych, gdy te ostatnie s rdem

reakcji konkurujcych z przeniesieniem protonu zarwno w stanie podstawowym jak i

wzbudzonym, zaburzajc obraz samego procesu przeniesienia protonu [63].


25

Dla wikszoci reakcji wewntrzczsteczkowego przeniesienia protonu mamy do

czynienia z przeniesieniem protonu pomidzy nastpujcymi grupami donorowymi i

akceptorowymi [58]:

- od atomu tlenu grupy hydroksylowej do atomu tlenu grupy karbonylowej,

- od atomu tlenu grupy hydroksylowej do heterocyklicznego atomu azotu,

-od atomu azotu do heterocyklicznego atomu azotu,

- od atomu azotu do atomu wgla.

Do opisu zjawiska tautomeryzacji, stosuje si cztery podstawowe mechanizmy, wrd

ktrych wyrnia si [57,57,58].

1. ultra-szybkie przeniesienie protonu wzdu wewntrzczsteczkowego wizania wodorowego (intrinsic intramolecularproton transfers); obserwowane np. w 3-

hydroksyflawonie,

2. jednoczesne przeniesienie dwch protonw (concerted biprotonic transfers); obserwowane np. w dimerze 7-azaindolu,

3. statycznie i dynamicznie katalizowane przeniesienie protonu (static and dynamic catalysis of proton transfer); zachodzce np. w lumichromie, adeninie i guaninie),

4. wymiana protonu (proton relay transfer), zachodzce np. w 7-hydroksychinolinie).

Czsteczki tego samego zwizku mog ulega reakcji przeniesienia protonu wedug kilku

rnych mechanizmw w zalenoci od tego czy zachodzi ona wycznie w badanej

czsteczce, czy te z udziaem innych moleku [57]. Uwaa si, e tylko mechanizm

ultraszybkiego wewntrzczsteczkowego przeniesienia protonu (intrinsic intramolecular

proton transfers) opisuje rzeczywisty proces wewntrzczsteczkowego przeniesienia

protonu, pozostae natomiast charakteryzuj midzyczsteczkowe przeniesienie protonu w

klatce rozpuszczalnika [58].


26

Poniej zaprezentowano charakterystyczne przykady dla poszczeglnych przypadkw.

1. Ultra-szybkie przeniesienie protonu wzdu wewntrzczsteczkowego wizania wodorowego (intrinsic intramolecular proton transfers) zakada tworzenie wizania

wodorowego w obrbie czsteczki pomidzy grup donorow i akceptorow (rys. 4).

O

O

R

O

H

O

O

R

O

H

3-hydroksyflawon tautomer pyridyliowy Rysunek 4. Struktury tautomeryczne powstajce w czasie procesu przeniesienia protonu w

czsteczce 3-hydroksyflawonu obserwowane w szkliwach wglowodorowych, wedug [57]

2. Jednoczesne przeniesienie dwuprotonowe (concerted biprotonic transfers), w ktrym donor protonu znajduje si w znacznej odlegoci od akceptora i w zwizku z tym wymaga

porednictwa czsteczki rozpuszczalnika lub utworzenia wodorowo zwizanego dimeru; w

czsteczce 7-azaindolu ten typ tautomeryzacji obserwowany jest w etanolu, w eterze

etylowym lub dioksanie zawierajcych niewielk ilo wody, co umoliwia tworzenie

monosolwatw (rys. 5) [57,64].

N N NN

H

17 71

H OH

H

7-azaindol monohydrat 7-H-tautomeru Rysunek 5. Struktury tautomeryczne powstajce w czasie procesu przeniesienia protonu w

czsteczce 7-azaindolu, wedug [57]


27

3. Statycznie i dynamicznie katalizowane przeniesienie protonu (static and dynamic catalysis of proton transfer) obserwowane w przypadku zasad purynowych wymaga

silnego katalizatora, w postaci czsteczki kwasu octowego lub pirydyny (rys.6).

N

N N

N

NH2

N

N N

N

O

H2NH

93

6 H

93

6

H

adenina guanina

CO O

CH3

H

CO O

CH3

H

Rysunek 6. Struktury tautomeryczne powstajce w czasie procesu przeniesienia protonu w

czsteczce adeniny i guaniny, wedug [57]

Chang i wsppr. [65] donosz, e 7-azaindol moe rwnie ulega tautomeryzacji

wedug tego mechanizmu w rozpuszczalnikach niepolarnych poprzez kompleksy z

czsteczkami alkoholi i kwasw organicznych (rys.7).

N N

H

ORH

N N

H

O

R

H

N N

H

OH

przeniesienie protonu

* * *

R

N N

H

O

R

H

CO

*przeniesienie protonu

N N

H

O

R

H

CO

*

reorganizacja czsteczek rozpuszczalnika

Rysunek 7. Struktury tautomeryczne powstajce w czasie procesu przeniesienia protonu w

czsteczce 7-azaindolu poprzez kompleks z alkoholem i z kwasem, wedug [65]


28

4. Tautomeryzacja poprzez wymian protonu (proton relay transfer), obserwowana jest m.in. w czsteczce 7-hydroksychinoliny, wymaga udziau co najmniej dwch czsteczek

metanolu (rys.8).

NO

H

OH

R

OH

R

7-hydroksychinolina Rysunek 8. Ilustracja przeniesienia protonu w czsteczce 7-hydroksychinoliny, wedug [57]


29

Fototautomeryzacja w zwizkach flawinowych

Szczeglnie interesujcy przykad tautomeryzacji mona zaobserwowa w przypadku

czsteczki lumichromu. W tym przypadku mamy do czynienia z mechanizmem zarwno

statycznie jak i dynamicznie katalizowanego przeniesienia protonu. W obecnoci kwasu

octowego proces zachodzi wedug mechanizmu statycznej katalizy, w wyniku ktrej

dochodzi do podwjnego przeniesienia protonu (rys.9) [66-68].

N

N

N

N

N

N

N

N O

O

H

H

O

O

H

H

H3C

H3C

H3C

H3C

1 110 10

CO O

CH3

H

CO O

CH3

H

* *

N

N

N

N O

O

H

H

H3C

H3C

110

N

N

N

N O

O

H

H

H3C

H3C

110

h -h(455nm)

+ CH3COOH

-h(540nm)

A

A B Rysunek 9. Ilustracja procesu fotoindukowanego przeniesienia protonu w czsteczce 7,8-

dimetyloalloksazyny A (lumichromu), z utworzeniem tautomeru 7,8-dimetyloizoalloksazyny B, w obecnoci kwasu octowego, na podstawie [66]


30

Natomiast w przypadku zastosowania pirydyny jako czynnika wymuszajcego

przeniesienie protonu, zachodzi reakcja wedug mechanizmu dynamicznej katalizy. W

stanie podstawowym powstaje wodorowo zwizany kompleks pomidzy czsteczk

pirydyny i lumichromu. Po wzbudzeniu lumichromu czsteczki tworz par jonow. W

wyniku relaksacji rotacyjnej czsteczka pirydyny przenosi proton do pozycji N(10)

(rys.10) [57,66,69-71].

.

N

N

N

N

N

N

N

N O

O

H

O

O

H

H

H3C

H3C

H3C

H3C

1 110 10

*

N

N

N

N O

O

H

H3C

H3C

110

NH

relaksacja rotacyjnaprzeniesienie protonu

NN

H

para jonowa lumichrom-pirydyna w stanie wzbudzonym

h

kompleks lumichrom-pirydynaw stanie podstawowym zwizanywizaniem wodorowym

tautomer flawinowy- pirydynaw stanie wzbudzonym zwizane wizaniem wodorowym

*

Rysunek 10. Ilustracja procesu fotoindukowanego przeniesienia protonu w czsteczce 7,8-dimetyloalloksazyny (lumichromu) w obecnoci pirydyny, na podstawie [57,66,69]


31

Przeniesienie protonu w czsteczce lumichromu w wodzie stanowi odrbne i

skomplikowane zagadnienie (rys.11), poniewa rwnowagi w stanie wzbudzonym ustalaj

si w wyniku procesw tautomerii i jonizacji [67,72,73].

N

N

N

N

N

N

N

N O

O

H

H

O

O

H

H

H3C

H3C

H3C

H3C

1 110 10

O

H

H H* *

N

N

N

N O

O

H

H

H3C

H3C

110

N

N

N

N O

O

H

H

H3C

H3C

110

h -h(466nm) -h(505nm)

O

H

O

H

HHO

H

Rysunek 11. Ilustracja procesu fotoindukowanego przeniesienia protonu w czsteczce 7,8-dimetyloalloksazyny (lumichromu) w obecnoci wody, wedug [74]

Jedn z cech charakteryzujcych tautomery s ich waciwoci spektralne. W zwizku

z tym rozwj spektroskopii dotyczcej przeniesienia protonu umoliwia bardziej wnikliwe

badanie procesw tautomeryzacji. Stosowane s metody stacjonarne i czasowo zalene,

w szczeglnoci takie jak spektroskopia ramanowska czy fotoliza byskowa, a take

metody spektro- elektrochemiczne, pozwalajce bada procesy utleniania i redukcji [75].

Jedn z metod dostarczajcych informacji dotyczcych dynamiki procesw przeniesienia

protonu w ukadach z wizaniem wodorowym jest czasowo-zalena spektroskopia

oscylacyjna [63]. Moliwo stosowania metod spektroskopii czasowo-zalenej w

szerokim zakresie czasowym, od femtosekund do mikrosekund, umoliwia wyjanianie

procesw przeniesienia protonu od ultra-szybkich po zaskakujco powolne [57].


32

Tautomeryzacja alloksazynowo- izoalloksazynowa

Ustalono, e wzbudzona czsteczka lumichromu ulega indukowanemu wiatem

przeniesieniu protonu z pozycji N(1) do pozycji N(10) przechodzc w tautomer flawinowy

[57].

Zjawisko fotoindukowanej tautomeryzacji wie ze sob zwizki z grupy alloksazyn,

ktrej przedstawicielem jest lumichrom, z grup izoalloksazyn, ktra jest przedmiotem

prezentowanej rozprawy. Obie grupy zwizkw zaangaowane s w wiele biologicznych i

fotochemicznych procesw, a sam lumichrom (alloksazyny) jest gwnym produktem

biodegradacji ryboflawiny (izoalloksazyny) [76,77]. W stanie podstawowym w obecnoci

pirydyny entalpia procesu tautomeryzacji lumichromu do odpowiedniej pochodnej

izoalloksazynowej (7,8-dimetyloizoalloksazyny) wynosi 11,8 kcal/mol [78]. W zwizku z

tak znaczn endotermicznoci nie obserwuje si tego procesu w stanie podstawowym.

Pod wpywem absorpcji wiata wzrasta kwasowo atomu wodoru w pozycji N(1) i ronie

zasadowo pozycji N(10) [78]. Zjawisku przeniesienia protonu w stanie wzbudzonym

sprzyja tworzenie wiza wodorowych z czsteczk pirydyny i czsteczkami kwasu

octowego. W obecnoci tych czynnikw, na skutek absorpcji kwantu wiata zostaje

zainicjowane przeniesienie protonu pomidzy pozycj N(1) a pozycj N(10) piercienia

(Rysunek 9 i 10, str. 29-30), w wyniku czego ze struktury alloksazynowej powstaje

struktura izoalloksazynowa. Tautomer izoalloksazynowy w stanie podstawowym, jako

termodynamicznie nietrway, przechodzi w pochodn o strukturze alloksazynowej

[57,66,78,79]. Pasmo emisji tautomeru izoalloksazynowego zarejestrowali Kozio i

wsppr. [66] w widmie lumichromu w 5% roztworze pirydyny w glicerolu.

Widmo emisji anionu zdeprotonowanego w pozycji N(1) jest identyczne jak widmo

emisji izoalloksazyn [57]. Tautomeria alloksazynowo-izoalloksazynowa we wzbudzonym

stanie singletowym przejawia si m.in. spadkiem intensywnoci luminescencji z

maksimum przy ok. 480 nm (20,8 103 cm-1) i wyksztaceniem nowego pasma emisji z

maksimum przy ok. 525 nm (19,1 103 cm-1).

Jak wspomniano wczeniej, pod wpywem wzbudzenia do stanu trypletowego

zauwaa si wyrany wzrost zasadowoci zarwno dla czsteczek alloksazyn i

izoalloksazyn, widoczny we wzrocie wartoci pKa. (od -2 do 8 dla alloksazyn). Na

podstawie wynikw oblicze dotyczcych orbitali molekularnych (metod PPP i CNDO)

mona oczekiwa, e pozycja N(1) jest najbardziej zasadowa w stanie podstawowym, a w

stanie wzbudzonym, wskutek wzrostu gstoci elektronowej wiksz zasadowo zyskuje

pozycja N(5) [17,37,38]. Potwierzaj to take badania Salzmann i Marian [80], wykonane


33

dla czsteczki lumiflawiny protonowanej w pozycji N(1) i N(5), oraz zdeprotonowanej w

pozycji N(3) metodami DFT/MRCI).

Tautomeryzacja w stanie podstawowym jest moliwa jedynie w drastycznm pH

roztworu, a otrzymanie na drodze syntezy pochodnej z charakterystycznym dla

izoalloksazyn trans-diazadienowym ukadem wiza i jednoczenie niepodstawion

pozycj N(10) wydaje si niemoliwe [81].

Woda i kwas octowy dziaaj w reakcji tautomeryzacji jako katalizator zarwno

kwasowy jak i zasadowy. Tworz bowiem wizania wodorowe z czsteczk alloksazyny w

stanie podstawowym z udziaem pozycji N(10). W czsteczce zwizanej wizaniami

wodorowymi istnieje inny rozkad adunku, ktry powoduje wzrost zasadowoci na

atomach tlenu. W ten sposb powstaj kolejne wizania wodorowe (z udziaem pozycji

N(1) piercienia). Czsteczki kwasu octowego i wody pozostaj zwizane wizaniami

wodorowymi w pozycji N(1) tautomeru izoalloksazynowego [72].

Encinas i wsppr. [27,82] badali zachowanie lumichromu w roztworach

metanolowych w obecnoci amin o rnym stopniu zasadowoci. Zauwaono, e

zastosowanie amin o duej zasadowoci (pKa>9 w wodzie), takich jak butyloamina,

powoduje przeniesienie protonu w czsteczce lumichromu ju w stanie podstawowym, a

take we wzbudzonym stanie singletowym. Badania wykazay, e lumichrom w obecnoci

amin o mniejszej zasadowoci (trietanoloamina, aminy alifatyczne) nie ulega deprotonacji,

a podlega przeniesieniu elektronu w stanie wzbudzonym.

Rozkad adunku w czsteczce lumichromu.w roztworach wodnych zaley od

protonacji lub deprotonacji pozycji N(1) i N(10), a wic powstawanie ukadu

izoalloksazynowego moe by wynikiem tych procesw. Zmiana rozkadu gstoci

elektronowej w powstajcym w rezultacie deprotonacji anionie zlokalizowanym w pozycji

N(1), (rys.12), prowadzi do powstania struktury izoalloksazynowej [83,84].


34

N

N

N

NH3C

H3C

O

HO

N

N

N

NH3C

H3C

O

ON

N

N

NH3C

H3C

O

HO

H

H

N

N

N

NH3C

H3C

O

HO

anion o strukturze alloksazynowej zlokalizowany na N(3)

anion o strukturze alloksazynowej zlokalizowany na N(1)

anion o strukturze izoalloksazynowej zlokalizowany na N(1)

pKa =8.50 pKa=8.65

-H -H

Rysunek 12. Schemat procesu dysocjacji protonu w czsteczce lumichromu w stanie

podstawowym z powstajc struktur izoalloksazynow, na podstawie [83]

Obecno struktury izoalloksazynowej wykazano badajc waciwoci spektralne

powstajcych anionw zlokalizowanych na N(1) i N(3). Z uzyskanych danych wynika, e

widma emisji i wzbudzenia dla formy z adunkiem zlokalizowanym na atomie N(1)

posiadaj cechy charakterystyczne dla widma lumiflawiny [37].

N

N

N

NH3C

H3C

O

HO

H

+H

N

N

N

NH3C

H3C

O

HO

HH

N

N

N

NH3C

H3C

O

HO

HH

kation - struktura alloksazynowa kation - struktura izoalloksazynowa Rysunek 13. Schemat procesu protonowania czsteczki lumichromu z powstajcymi dwoma

kationami o strukturze alloksazynowej i izoalloksazynowej, na podstawie [83]

Rysunek 13 przedstawia schemat reakcji protonowania czsteczki lumichromu w stanie

podstawowym. Zmiana gstoci elektronowej pod wpywem protonowania moe

powodowa zmiany w ukadzie wiza podwjnych, a powstajce kationy mog mie

struktur alloksazynow jak i izoalloksazynow. Ich obecno zostaa potwierdzona

widmami absorpcji kationw 1-metylo lumichromu i 3-metylo-lumichromu otrzymanych

w drastycznyh warunkach pH. Ponadto zarejestrowano te widma FT IR i FT Ramana dla


35

lumichromu zaadsorbowanego na powierzchni jonw srebra, na podstawie ktrych

wykazano obecno struktury izoalloksazynowej. Stabilno struktury izoalloksazynowej

determinuje wic z jednej strony struktura kationowa, z drugiej anion zlokalizowany na

atomie azotu N(1) [83,84].


36

3. Porwnawcza charakterystyka waciwoci izo- i alloksazyn Alloksazyny i izoalloksazyny s zwizkami o zblionej strukturze, cho reprezentuj dwie

odrbne klasy zwizkw heterocyklicznych. Jak wspomniano wczeniej, podstawowy

element struktury czsteczek alloksazyn i izoalloksazyn stanowi trjczonowy piercie,

ktry skada si z piercienia benzenowego, pirazynowego i pirymidynowego, z centrami

aktywnymi w pozycjach N(10), N(5), N(3) i N(1), a w pozycjach C(2) i C(4) posiada

rwnie dwa atomy tlenu o charakterze karbonylowym. W zwizku z tym nazwa

systematyczna alloksazyn brzmi (7,8-dimetylo-benzo[g]-pterydyna-2,4-(1H,3H)-dion).

Najbardziej znanym zwizkiem nalecym do tej grupy zwizkw heterocyklicznych jest

lumichrom (Rysunek 14). Struktura alloksazynowa w okrelonych warunkach w wyniku

foto-indukowanej reakcji tautomeryzacji moe przechodzi w struktur izoalloksazynow

[66,67,78,85]. Struktury te rni si midzy sob obecnoci podstawnika w pozycji

N(10) piercienia (w przypadku izoalloksazyn), a co za tym idzie, innym pooeniem

ukadu diazadienowego -N=C-C=N- w czsteczce. W czsteczkach alloksazyn wystpuje

on w konfiguracji cis, a w izoalloksazynach w konfiguracji trans. Nazwa systematyczna

izoalloksazyn brzmi wic (10-podstawiona 2,3,4,10-tetrahydro-benzo[g]-pterydyna-2,4-

dion) [19]. Na rysunku 14 pokazano przykad struktury alloksazynowej (lumichrom) i

izoalloksazynowej (lumiflawina), z zaznaczeniem konfiguracji ukadu diazadienowego.

N

N

N

N

N

N

N

N O

O

CH3

H

O

O

H

H

H3C

H3C

H3C

H3C

1 110 10

A struktura alloksazynowa - Lumichrom B struktura izoalloksazynowa - Lumiflawina

33

BA

5 5

Rysunek 14. Struktura alloksazynowa (A) na przykadzie lumichromu i struktura izoalloksazynowa (B) na przykadzie lumiflawiny


37

Zarwno zwizki o strukturze alloksazynowej jak i izoalloksazynowej obecne s w

rodowisku naturalnym. S produktami metabolizmu organizmw ywych jako rezultat

bakteryjnej, chemicznej lub fotochemicznej degradacji flawin (7,8-dimetylo-pochodnych

izoalloksazyny) [76,77,86]. Zarwno pochodne lumichromu jak i flawiny znane s jako

czynniki fotosensybilizujce poprzez stan trypletowy utlenianie substancji biologicznych

takich jak aminokwasy czy biaka [9,79]. Flawiny, zwizki o strukturze izoalloksazynowej,

stanowi te m.in. naturalne koenzymy. Najbardziej znane to FMN i FAD (Rysunek 1,

str. 2).

Mogoby si wydawa, e zwizki o tak zblionej strukturze jak alloksazyny i

izoalloksazyny, charakteryzowane s przez podobne waciwoci spektalne i fotofizyczne.

Prowadzone od lat badania pokazuj jednak wyranie, e zwizki te wykazuj do istotne

rnice w tym zakresie.

W zakresie spektralnym UV-Vis alloksazyny i izoalloksazyny wykazuj intensywn

absorpcj promieniowania, przy czym pasma izoalloksazyn s przesunite w kierunku fal

duszych w stosunku do odpowiednich pasm rejestrowanych dla alloksazyn. Ilustruj to

odpowiednie widma absorpcji i emisji na rysunkach 15 i 16 (str.39). Wyrane rnice

obserwuje si rwnie w zakresie fluorescencji tych dwch klas zwizkw. Izoalloksazyny

fluoryzuj znacznie intensywniej, wykazujc wydajno kwantow fluorescencji

dziesiciokrotnie wysz, ni ich odpowiedniki w grupie alloksazyn. Maksimum pasma

fluorescencji dla izoalloksazyn jest przesunite w kierunku fal duszych w porwnaniu z

odpowiednim maksimum fluorescencji alloksazyn. Lumiflawina wykazuje fluorescencj z

maksimum przy 531 nm (18,8 103 cm-1) (w acetonitrylu), natomiast lumichrom (w

acetonitrylu) posiada widmo fluorescencji z maksimum przy 453 nm (22,1 103 cm-1),.

Rnica w pooeniu maksimw fluorescencji jest wic do znaczna i wynosi okoo 100

nm. Dugie czasy ycia fluorescencji izoalloksazyn wyranie odrniaj t grup

zwizkw od alloksazyn. Zaniki fluorescencji dobrze opisuj krzywe jednowykadnicze

[4,85]

III. Cz literaturowa _______________________________

POCHODNE RYBOFLAWINY JAKO FOTOSENSYBILIZATORY ...

Documents

Transcript of POCHODNE RYBOFLAWINY JAKO FOTOSENSYBILIZATORY ...