IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO

IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO

• opracowano szereg metod oczyszczania plazmidowego DNA, z których każda

obejmuje trzy etapy: hodowlę bakterii (i ewentualnie amplifikację plazmidu), lizę

bakterii, oczyszczanie plazmidowego DNA

• plazmidy izoluje się najczęściej z hodowli płynnych, w których podłoże uzupełnione

jest odpowiednim antybiotykiem

• wysokokopijne wektory plazmidowe (np. z serii pUC), otrzymywane są z hodowli

znajdującej się w późnej fazie logarytmicznej wzrostu, podczas gdy wektory nisko- i

średniokopijne (np. pBR322) powinny być przed izolacją amplifikowane

• w tym celu do częściowo wyrośniętej hodowli dodaje się w tym celu chloramfenikol,

który selektywnie zapobiega replikacji chromosomu bakteryjnego

• we wszystkich metodach izolacji plazmidowego DNA wykorzystuje się dwie istotne

różnice pomiędzy DNA genomowym a DNA plazmidowym bakterii:

1. DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA plazmidu

2. podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale

zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang.

covalently closed circle).

IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO

• odwirowane komórki bakteryjne ulegają lizie pod wpływem niejonowych lub jonowych

detergentów (SDS, Sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalników organicznych, roztworów

alkalicznych (liza alkaliczna) lub wysokiej temperatury (liza termiczna)

• stosowany może być również lizozym - enzym trawiący ścianę komórkową bakterii (nie

działa w pH<8.0)

• w metodzie lizy alkalicznej bufor o wysokim pH zawierający NaOH i SDS powoduje

całkowitą lizę komórki jak również denaturację genomowego DNA, natomiast plazmidowy

DNA w formie CCC zostaje zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach

• w przypadku otrzymywania plazmidowego DNA metodą termiczną, czynnikiem

denaturującym jest wysoka temperatura, w której DNA genomowy i plazmidowy

zachowują się podobnie jak w wysokim pH

• następny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu DNA od związanych z nim

białek. Zwykle stosuje się do tego celu nasycony buforem roztwór fenolu lub jego

mieszaninę z chloroformem i alkoholem izoamylowym.

• białka można również usunąć przez trawienie ich proteinazami (zwykle proteinazą K).

Usunięcie kwasu RNA przeprowadza się enzymatycznie, inkubując próbki z RNazą

(wolną od DNazy), przez sączenie molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości

(patrz, dalej)

IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO

• w metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cząsteczki DNA ulegają denaturacji,

natomiast superzwinięte formy CCC plazmidu są po denaturacji nadal splecione,

neutralizacja pH roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan amonu) prowadzi do

renaturacji jedynie DNA plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i

białkami wytrąca się w postaci serowatego osadu

• z odbiałczonych próbek DNA wytrącany jest alkoholem etylowym lub izopropanolem

w obecności octanu potasowego, sodowego lub amonowego

• wszystkie metody otrzymywania plazmidowego DNA, z wyjątkiem lizy alkalicznej,

wymagają oddzielenia tego DNA od DNA genomowego w gradiencie chlorku cezu w

obecności bromku etydyny

• wykorzystuje się tu fakt, że bromek etydyny intensywniej interkaluje do

zdenaturowanego DNA genomowego niż do DNA plazmidowego, powodując

częściowe rozwinięcie helisy DNA i wydłużenie cząsteczki, co powoduje

zmniejszenie jej gęstości pławnej

• różnica w gęstości pomiędzy formą CCC a liniową i kolistą OC (ang. open circle)

wynosi około 0.04 g/ml i jest wystarczająca do oddzielenia superzwiniętego DNA

podczas wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu w obecności bromku etydyny

IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO

• pasmo superzwiniętego DNA układa się poniżej pasma utworzonego przez liniowe

fragmenty chromosomowego DNA oraz formy liniowej i OC plazmidu

• cząsteczki RNA mają największą gęstość i zbierają się na dnie probówki, zaś białka

pozostają w górnej warstwie roztworu

• oczyszczanie plazmidowego DNA przeprowadzić można również metodą wirowania

lizatów komórkowych w gradiencie alkalicznej sacharozy stosując wymieniacze

jonowe (np. kolumienki Qiagen) lub filtrację na żelach.

• w środowisku alkalicznym formy liniowe i OC ulegają rozdzieleniu na pojedyncze nici

i sedymentują 3-4 razy wolniej niż niezdenaturowana superzwinięta forma CCC,

Protokół 7Izolacja plazmidowego DNA przy pomocy zestawu Plasmid Mini (DNA Gdańsk)

• zestaw przeznaczony jest do izolacji plazmidowego DNA z 1.5-3 ml hodowli bakteryjnej

• zastosowana w zestawie procedura opiera się na zdolności wiązania DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chaotropowych

• w pierwszym etapie bakterie poddawane są lizie alkalicznej, a następnie lizat zobojętniamy jest buforem GL3, który powoduje precypitację chromosomalnego DNA i białek, pozostawiając jednocześnie plazmidowe DNA w roztworze

• po odwirowaniu próbki, supernatant zawierający plazmidowe DNA nanoszony jest na minikolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym; DNA przechodząc przez złoże osiada na nim, podczas gdy zanieczyszczenia przechodzą nie wiążąc się

• po wypłukaniu z kolumny resztek zanieczyszczeń, oczyszczone DNA plazmidowe wymywane jest buforem TE lub wodą i nadaje się do bezpośredniego wykorzystania bez konieczności precypitacji

• DNA uzyskane przy użyciu tego zestawu doskonale nadaje się do wszelkich metod stosowanych w biologii molekularnej, w tym do automatycznego sekwencjonowania.

Uwagi1. Pojemność minikolumny do oczyszczania DNA wynosi 20μg2. SDS znajdujący się w roztworze L2 precypituje w niskich temperaturach, dlatego gdy roztwór

nie jest klarowny należy ogrzać go w temperaturze 40ºC do uzyskania całkowitej klarowności

Protokół izolacji

1. Osad z 1.5-3 ml nocnej hodowli bakterii dokładne zawiesić przez pipetowanie lub

worteksowanie w 200 µl roztworu do zawieszania L1.

2. Dodać 200 µl alkalicznego roztworu lizującego L2 i po wymieszaniu przez kilkukrotne

odwracanie probówki pozostawić na 3 minuty w temperaturze pokojowej.

Uwaga!

Po dodaniu roztowru L2 należy ostrożnie mieszać zawartość probówki aby nie spowodować

fragmentacji chromosomalnego DNA. Zwykle wystarczy 5-6 krotne odwrócenie probówki. Po 3

minutach inkubacji lizat powinien być całkowicie klarowny. Jeżeli nie jest należy odwrócić lizat

kilka razy i przedłużyć czas inkubacji o dalsze 3 minuty.

3. Dodać 400 µl roztworu zobojętniającego GL3 i wymieszać przez kilkukrotne

odwracanie probówki

4. Wirować 10 minut przy 11 tys. RPM.

5. Ostrożnie wlać supernatant do minikolumny do oczyszczania plazmidowego DNA.

6. Wirować 1 minutę przy 11 tys. RPM. Wyciągnąć minikolumnę z probówki, wylać

przesącz i ponownie włożyć ją do probówki.

Protokół izolacji

7. Dodać do kolumny 500 µl pierwszego roztworu płuczącego W. Wirować 1 minutę

przy 11 tys. RPM.

8. Wyciągnąć minikolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do

probówki. Dodać do kolumny 700 µl drugiego roztworu płuczącego A1.

9. Wirować 2 minuty przy 11 tys. RPM. Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej

probówce 1.5 ml i do złoża znajdującego się na dnie kolumny dodać 60 µl roztworu

TE lub wody.

10.Próbkę inkubować 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wirować 1 minutę przy 12

tys. RPM.

11.Kolumnę usunąć a oczyszczone plazmidowe DNA znajdujące się w probówce

przetrzymywać w lodówce do czasu dalszych analiz.