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QCWS 参考プロトコル抗 HLA 抗体検査

QCWS 参考プロトコル

抗 HLA 抗体検査（ICFA）

2019 年度版

作成者

日本組織適合性学会認定制度委員会ワーキンググループ

抗 HLA抗体 WG


制定・改訂履歴

版

数

制定日制定理由

作成

責任者施行日

初

版

日本組織適合性学会が開催する QCWS での HLA 検

査を実施する際に用いる QCWS 参考プロトコルと

して制定した。

WG

版

数

改訂日改訂理由改訂内容

改訂

責任者施行日

２ 2019 年 9月１日

プロトコルの変更な

どに伴い、現状に合わ

せた記載変更

プロトコルの追加・変更

解析方法の説明を追加 WG


目次

１．検査の準備 .................................................................. 1

１．１検査機器の準備検体処理 .............................................. 1

１．２検体の準備 ............................................................ 1

１．３検査法の原理 .......................................................... 2

２．検査手順 .................................................................... 3

２．１準備 .................................................................. 3

２．２操作手順：クラスⅠ＆Ⅱ(ICFA) .......................................... 3

２．３操作手順：クラスⅠ (ICFA) ............................................. 6

２．４検査結果判定 .......................................................... 9

３．検査時の注意点 ............................................................. 14

３．１検体の準備 ........................................................... 14

３．２検体レイアウト ....................................................... 14

３．３操作時の注意点 ....................................................... 15

〔参考文献〕 ................................................................. 15

1


１．検査の準備

ICFA法については市販キット（WAKFlow® HLA抗体クラスⅠ（ICFA）およびWAKFlow® HLA抗体ク

ラスⅠ&Ⅱ（ICFA）：湧永製薬）を用いた、検査法の原理、試薬、検体の準備について示す。

１．１検査機器の準備検体処理

1.1.1 測定機器、器具・資材、試薬の準備

測定機器 Luminexシステム，パーソナルコンピュータ

器具・資材 96穴V底プレート（*Thermo），96穴U底プレート（*Corning），

1.5mLサンプルチューブ, マイクロピペット（可変式），ボ

ルテックスミキサー，プレートミキサー，マイクロ遠心機，

マイクロプレート遠心分離機 (2,000×ｇで使用可能なも

の) ，37℃恒温水槽

*参考商品を示す

試薬ビーズミックス

10倍濃度溶血試薬

10倍濃度洗浄液Ⅰ

10倍濃度洗浄液Ⅱ

10倍濃度Lysis液

10倍濃度PBS

標識抗体

陰性コントロール血清

１．２検体の準備

1.2.1 検体準備(血清（血漿)）

血清(血漿：EDTA採血)を 10,000×gで 2分間遠心する。

1.2.2 検体準備（ACD加全血）

抗原として使用する検体が ACD加全血の場合、以下のプロトコルに従って検体処理を行う。

1) 2 mLの ACD加全血を 15mL遠沈管に分注する。（この時、液面の高さをマーカーでチェッ

クしておく。）

2) PBSを 10 mL加え、5～6回、転倒混和する。

3) 2,000×g, 2分間遠心分離し、上清除去。（赤血球と白血球の層が沈殿するので、その層

を残す。）

4) PBSを加え、2 mLまで（操作 1. でチェックした位置まで）メスアップし、5～6回転倒

混和する。調製した検体を使用する。

2


１．３検査法の原理

1.3.1 ICFA法の概要および原理

immunocomplex capture fluorescence analysis （ICFA）法は，Luminex システムに antigen

capture法を応用した方法であり，ICFA法の開発により交差適合試験に Luminexシステムの応用

が可能となった。ICFA法による抗 HLA抗体検査（交差適合試験）は蛍光ビーズに HLAクラスⅠ分

子および HLA クラスⅡ分子に対するモノクローナル抗体を結合して、可溶化した白血球から HLA

クラスⅠ分子および HLAクラスⅡ分子をそれぞれ単離（捕捉・精製）するものである。血清 (血

漿)と反応させた白血球から HLA クラスⅠ分子および HLA クラスⅡ分子を単離すると、血清 (血

漿)中に抗 HLA クラスⅠ抗体または抗 HLA クラスⅡ抗体が存在している場合、抗体が抗原と結合

した状態（抗原抗体複合物＝免疫複合体）でビーズに捕捉されることから、R-phycoerythrin 標

識抗ヒト IgGでそれぞれ HLAクラスⅠ分子および HLAクラスⅡ分子に特異的な抗体を検出するこ

とが可能である（図 1）。多種類の免疫複合体を特異的に同時に捕捉することによって抗体を検出

する原理から、1）非特異的な反応が少ない、2）抗 HLAクラスⅠ抗体と抗 HLAクラスⅡ抗体が同

時に存在している場合でも容易に抗体の特異性解析が可能である、などの特徴がある。また、ICFA

法は 96 ウエルマイクロプレートによる処理が可能であることから多検体処理に適応し、処理速

度も約 2～3時間でハイスループットな方法である。

3


２．検査手順

２．１準備

（1）ビーズの処理

ビーズミックスをボルテックスにて 15秒間攪拌する。

（2）洗浄液の調製

1）10倍濃度試薬に析出物がある場合は 37℃以下で加温して溶解し、析出物がなくなったこ

とを確認する。

2）10倍濃度試薬は精製水で 10倍に希釈する。希釈調製した各試薬は 2～8℃で保存し、1週

間以内に使用する。

２．２操作手順：クラスⅠ&Ⅱ（ICFA）

2.2.1 患者血清 (血漿)と白血球の 1次反応および可溶化

1）1.5mLサンプルチューブに溶血試薬を 500μL分注し、37℃恒温水槽で 5分間加温した後、

抗原として使用する EDTA加全血を 500μL添加する（ACD加全血の場合、前述の「1.2 検

体の準備」の方法に従って前処理を行う）。陰性コントロール血清用と患者血清（血漿）

用として、1検体あたり 2チューブずつ用意する。

2）ボルテックスにて攪拌した後、37℃恒温水槽で 10分間反応し、溶血させる。

3) 2,000×gで 2分間遠心後、溶血していない赤血球が沈殿し、2層に分離するため、上層の

みを除去する。

4) 37℃に加温した溶血試薬を 1,000 µL添加し、ボルテックスにて撹拌後、37℃恒温水槽で

10分間反応し、再度溶血する。

5）2,000×gで 2分間遠心後、上清を除去する。

6）洗浄液Ⅰを 500μL添加し、ボルテックスにて白血球ペレットを再浮遊させる。


8）6)～7)の操作を再度繰り返す。

9）ボルテックスにて白血球ペレットを再浮遊させた後、各チューブに PBS を 60μL 分注す

る。

10）該当する各チューブに陰性コントロール血清 20μL、患者血清 (血漿)20μLをそれぞれ

分注する。

11）しっかりフタを閉めた後、ボルテックスにて懸濁し、37℃恒温水槽で 30分間反応させる。

12）各チューブに洗浄液Ⅱを 500μL添加し、2,000×gで 2分間遠心する。

13）上清を除去する。

14）12) ～13)の操作をさらに 2回繰り返す。

15）各チューブに Lysis 液を 50μL添加し、しっかりフタを閉めた後、室温で 10分間ミキ

サーにて攪拌し続ける。

16）10,000×gで 5分間遠心する。

4


2.2.2 蛍光ビーズによる免疫複合体の捕捉および標識抗体との 2次反応

1）96穴 V底プレートのサンプル数に応じた各ウエルにビーズミックスを 5μL分注する。

2）対応するウエルに 2.2.1 で得られた可溶化白血球の上清を 25μL添加する。

3）シールをした後、遮光しながら室温で 20分間プレートミキサーを用いて攪拌して反応さ

せる。

4）シールに反応液が付着している場合は、隣のウエルに混入しないよう注意しながら、慎重

にシールを剥がす。

5）各ウエルに洗浄液Ⅱを 200μL添加し、2,000×gで 2分間遠心する。

6）スナッピングで上清を除去し、ペーパータオルで水分を良く吸い取る。

7）ボルテックスにて蛍光ビーズを再浮遊する。

8）5）～6）の操作を再度行う。

9）各ウエルに洗浄液Ⅱで 100倍に希釈した標識抗体を 50μL添加する。


せる。

11）反応液が隣のウエルに混入しないよう注意しながら、慎重にシールを剥がす。



14) ボルテックスにて蛍光ビーズを再浮遊する。

15）各ウエルに洗浄液Ⅱを 75μL添加する（ビーズ塊が見える場合はシールをしてボルテッ

クスにて分散させる）。

2.2.3 Luminexシステムによる蛍光値の測定

1）Luminexシステムを用いて、ビーズミックスの Lot番号に対応したテンプレートファイル

を使用して測定する（LuminexXYPの温度設定が OFFになっていることを確認すること）。

5


2.2.4 操作概要（ICFA(I&II)ワークフロー）

6


２．３操作手順：クラスⅠ(ICFA)

2.3.1 患者血清 (血漿)と白血球の 1次反応および可溶化

1）96 穴 U 底プレートに溶血試薬：200μL を分注し、EDTA 加全血：20μL を添加する。陰

性コントロール血清用と患者血清 (血漿)用として、1 検体あたり 2 ウエルずつ用意す

る。

2）ボルテックスにて攪拌した後，37℃恒温水槽で 10分間反応し、溶血させる。

3) 2,000×gで 2分間遠心後、上清を除去し、白血球ペレットを得る。

4) ボルテックスにて白血球ペレットを再浮遊させ、洗浄液Ⅰ：200μLを加える。


6）4)～5)の操作を再度繰り返す。

7）ボルテックスにて白血球ペレットを再浮遊させ、PBS：60μLを分注する。

8）該当するウエルに陰性コントロール血清：20μL、または患者血清（血漿）：20μLをそれ

ぞれ分注する。

9）しっかりシールをした後、ボルテックスにて懸濁し、37℃恒温水槽で 30分間反応させる。


11）上清を除去する。

12）ボルテックスにて白血球ペレットを再浮遊させる。

13）10) ～12)の操作を再度繰り返す。

14）各ウエルに Lysis 液を 50μL添加し、しっかりシールした後、室温で 10分間プレート

ミキサーにて攪拌し続ける。

15）2,000×gで 5分間遠心する。

2.3.2 蛍光ビーズによる免疫複合体の捕捉および標識抗体との 2次反応

1）96穴 V底プレートのサンプル数に応じた各ウエルにビーズミックスを 5μL分注する。

2）対応するウエルに 2.3.1 で得られた可溶化白血球の上清を 25μL添加する。


せる。

4）シールに反応液が付着している場合は、隣のウエルに混入しないよう注意しながら、慎重

にシールを剥がす。



7）ボルテックスにて蛍光ビーズを再浮遊する。

7


8）5）～6）の操作を再度行う。

9）各ウエルに洗浄液Ⅱで 100倍に希釈した標識抗体を 50μL添加する。


せる。

11）反応液が隣のウエルに混入しないよう注意しながら、慎重にシールを剥がす。



14) ボルテックスにて傾向ビーズを再浮遊する。

15) 12)～14)の操作を再度行う。

16）各ウエルに洗浄液Ⅱを 75μL添加する（ビーズ塊が見える場合はシールをしてボルテッ

クスにて分散させる）。

2.3.3 Luminexシステムによる蛍光値の測定

1）Luminexシステムを用いて、ビーズミックスの Lot番号に対応したテンプレートファイル

を使用して測定する（LuminexXYPの温度設定が OFFになっていることを確認すること）。

8


2.3.4 操作概要：クラスⅠ（ICFA）ワークフロー

フローシート：「WAKFlow HLA抗体クラスⅠ(ICFA)」-原理および操作概要

ビーズに結合した抗原抗体複合

体と標識抗体との反応を行う

PE-anti human IgG

標識抗体

洗浄液Ⅰ

所要時間

96 ウエル反応プレート

白血球

血清 (血漿)

Luminex 装置を用いて測定、

専用の判定用ソフトウェアにより

解析する

抗原抗体複合体

溶血用試薬

洗浄液Ⅱ

Lysis液

ビーズミックス

洗浄液Ⅱ

洗浄液Ⅱ

HLA クラスⅠに対する

モノクローナル抗体

EDTA加全血の溶血（37℃） 10分

洗浄（2回） 4分

血清 (血漿)との反応（37℃） 30分


白血球の可溶化（室温） 15分

蛍光ビーズとの反応（室温） 20分


標識抗体との反応（室温） 10分


測定＆判定

抗HLA抗体

白血球

HLA

蛍光ビーズ

9


２．４検査結果判定

測定結果の CSV ファイルを ICFA 解析ソフトウエアで判定する。ソフトウエアでは各ビーズの蛍

光シグナルからインデックス値を算出し判定する。判定方法は、WAKFlow HLA抗体（ICFA）判定

ソフトウエア使用方法に従う。

2.4.1 解析方法の紹介

Main Pageの画面設定

詳細

① Main Pageに移動します。

② 過去の解析データを一覧で表示します。

③ ソフトウエアのセッティングを行う画面に移動します。ロットファイルの登

録、データベース、コンバーターの登録を行うことが可能です。

④ 解析するデータを登録する画面に移動します。

①

②

③

④

10


CSVファイルの登録方法

＊ここでは手動で Negative Controlを設定する場合の方法を説明する。

New Projectの Analysis Modeで「Manual」を選択する。

詳細

① 解析データの名前を設定します。

② 測定データを登録します。

③ オペレーターの名前を登録します。

④ 解析の方法を選択します。自動もしくは手動で Negative Controlを設定する

か選択します。

⑤ 次の画面に移動します。

①

③

④

②

⑤

11


Analysis Setの画面に移り、Assayのグループの Negative Controlを選択する。

Negative Controlを選択した後、Assayのグループの検体を選択する。

12


「Execute」⇒「OK」の順で選択し、解析画面に移動する。

13


CSVデータの解析画面構成

詳細

① Project Name、試薬の種類、ロット、Assayの日付を表示します。

② Sample ID (Sample名)を表示します。

③

陽性コントロールビーズ (PB)、陰性コントロールビーズ (BB)の Median 値を表示

します。PB の Median 値が低い場合、または BB の Median 値が高い場合は再検査を

行ってください。PBの Median 値は 10,000 未満、BBの Median値は 200程度を再検

査の目安としてください。

④ ClassⅠの Median値を表示します。

⑤ ClassⅡの Median値を表示します。

⑥ ClassⅠの Index値と判定結果を表示します。

⑦ ClassⅡの Index値と判定結果を表示します。

⑧ 検体に対するコメント、オペレーター名を表示します。

⑨ Project Name、ロット、Assayの日付などを表示します。

⑩ Serum の基本情報を表示します。Serum ID、HLA Specificity、Comment、および

オペレーター名を表示します。直接編集を行うことも可能です。

⑪ サンプル名とHLAタイピング結果を表示します。HLAタイピング結果を入力していた

場合に表示されます。解析画面で直接入力し編集を行うことが可能です。

⑫ ClassⅠ、ClassⅡの Median値を表示します。

⑬ ClassⅠ、ClassⅡの Index値と判定結果を表示します。

① ② ③ ④ ⑧

⑤ ⑦ ⑥

⑪

⑨ ⑩

⑫

⑬

14


3．検査時の注意点

３．１検体の準備

溶血が不十分な場合、測定される蛍光値のバックグラウンドが高くなることがあるため，

溶血させる時間や温度を厳守する。ACDまたはヘパリン加血を用いた場合、1回の溶血反応

では十分溶血できないため、1.2.2 検体準備(ACD 加全血) の項に従った前処理を実施す

るか、または 2回以上の溶血操作を実施する。クラスⅠ(ICFA)の場合、96穴 U底プレート

を上から見て、赤血球で白血球ペレットが隠れてしまう場合、再度溶血操作を行う（写真 1，

2）。

３．２検体レイアウト

ICFA法は、血液細胞と血清 (血漿)中の抗 HLA抗体の反応強度を陰性コントロール血清と

比較して判定するため、検体毎に陰性コントロール血清を使用する必要がある。図 2の検

体レイアウトに従い検査を行う。

図 2 検体レイアウト

写真 1 十分な溶血

写真 2 不十分な溶血

（再溶血が必要）

15


３．３操作時の注意点

3.3.1 使用する検体

抗原として使用する検体の白血球数が少ない場合、偽陰性を呈することがある。

3.3.2 可溶化上清採取

1 次反応後、可溶化した上清を採取する場合、沈殿を巻き込まないように注意する。（沈殿

を一緒に取ってしまうと Luminex機器の流路が詰まる恐れがある）。

〔参考文献〕

Fujiwara K et al.: Application of bead array technology to simultaneous detection

of human leucocyte antigen and human platelet antigen antibodies. Vox Sang 2009;

96: 244-251.

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