1

Załącznik nr 2

Ewa Tykarska

AUTOREFERAT

Katedra Technologii Chemicznej Środków Leczniczych

Wydział Farmaceutyczny

Uniwersytet Medyczny w Poznaniu

Poznań 2015

2

1. Imię i nazwisko: Ewa Tykarska

2. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe

• 1981 – Magister Nauk Biologicznych. Dyplom Wydziału Biologii i Nauk

o Ziemi Uniwersytetu im. A. Mickiewicza w Poznaniu w zakresie biologii ze

specjalnością biologii molekularnej, specjalizacją biochemii. Praca magisterska

pt. „Tb3+ jako marker fluoroscencyjny w badaniach interakcji tRNA z różnymi

ligandami”, promotor: prof. dr hab. Jacek Augustyniak.

• 1984 – Doktor Nauk Chemicznych. Dyplom Wydziału Chemii Uniwersytetu

im. A. Mickiewicza w Poznaniu. Rozprawa doktorska pt. „Badania strukturalne

cząsteczek z przeszkodami przestrzennymi”, promotor: prof. dr hab. Zofia

Kosturkiewicz.

3. Przebieg pracy zawodowej

1981-­1982 Zakład Krystalografii, Wydział Chemii Uniwersytetu im. Adama

Mickiewicza w Poznaniu – pracownik naukowo-­techniczny

1982-­1984 Zakład Krystalografii, Wydział Chemii Uniwersytetu im. Adama

Mickiewicza w Poznaniu – asystent

1984-­1986 Zakład Krystalografii, Wydział Chemii Uniwersytetu im. Adama

Mickiewicza w Poznaniu – asystent z doktoratem

1986-­2005 Zakład Krystalografii, Wydział Chemii Uniwersytetu im. Adama

Mickiewicza w Poznaniu – adiunkt

2006-­obecnie Katedra Technologii Chemicznej Środków Leczniczych, Wydział

Farmaceutyczny Uniwersytetu Medycznego im. Karola

Marcinkowskiego w Poznaniu – adiunkt

3

4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca

2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule

w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.):

a) Tytuł osiągnięcia naukowego:

Supramolekularna organizacja kwasu glicyryzynowego, jego soli oraz

farmakologicznie aktywnych związków pokrewnych.

b) Osiągnięcia naukowe będące podstawą ubiegania się o tytuł doktora

habilitowanego przedstawiają cykl 4 powiązanych tematycznie publikacji

naukowych.

Analiza scientometryczna:

Sumaryczny Impact Factor (IF) dla 4 publikacji wynosi 15.9 (w roku wydania

według Journal Citation Reports),

Punktacja Ministerstwa Nauki MNiSW = 145

H1. Ewa Tykarska, Stanisław Sobiak, Maria Gdaniec

Supramolecular Organization of Neutral and Ionic Forms of Pharmaceutically

Relevant Glycyrrhizic Acid – Amphiphile Self-­Assembly and Inclusion of

Small Drug Molecules.

Crystal. Growth & Design, 2012, 12, 2133-­2137.

IF = 4.689;; punktacja KBN/MNiSW = 40

H2. Ewa Tykarska, Maria Gdaniec

Toward Better Understanding of Isomorphism of Glycyrrhizic Acid and its

Mono-­ and Dibasic Salts.

Crystal. Growth & Design, 2013, 13, 1301-­1308.

IF = 4.558;; punktacja KBN/MNiSW = 40

4

H3. Ewa Tykarska, Zbigniew Dutkiewicz, Daniel Baranowski, Zofia Gdaniec,

Maria Gdaniec

Effect of neighbors on the conformational preferences of glycosidic linkages in

glycyrrhizic acid and its mono-­ and dideprotonated forms: X-­ray, NMR and

computational studies.

Crystal. Growth & Design, 2014, 14, 5871−5880.

IF= 4.558;; punktacja KBN/MNiSW = 40

H4. Ewa Tykarska, Maria Gdaniec

Solid State Supramolecular Architecture of Carbenoxolone – Comparative

Studies with Glycyrrhetinic and Glycyrrhizic Acids.

Acta Cryst. B, 2015, 71, 25-­33.

IF= 2.095;; punktacja KBN/MNiSW = 25

*Do wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego dołączono oświadczenia

wszystkich współautorów określające udział każdego z nich w przygotowanie

poszczególnych prac (załącznik 5). Oświadczenia dotyczące wkładu habilitanta w

powstanie publikacji znajdują się w załączniku 4.

Z tematyką kwasu glicyryzynowego związane są trzy publikacje przeglądowe

(publikacje 42-­44, załącznik 4), które nie zostały włączone do cyklu prac

oryginalnych stanowiących podstawę ubiegania się o tytuł doktora habilitowanego.

W publikacjach 42 i 43 zostały przedstawione badania z ostatnich lat dotyczące

właściwości farmakologicznych kwasu glicyryzynowego i jego aglikonu kwasu

glicyretynowego oraz możliwości zastosowania wyżej wymienionych związków

w nowoczesnej technologii farmaceutycznej. Praca 43 omawia zagrożenia dla

zdrowia płynące z niekontrolowanego spożycia lukrecji, której głównym,

aktywnym biologicznie składnikiem jest kwas glicyryzynowy.

5

5. Komentarz dotyczący najważniejszych osiągnięć naukowych zawartych

w pracach będących przedmiotem postępowania habilitacyjnego

5.1 WPROWADZENIE

Chemia supramolekularna jest dziedziną nauki zajmującą się badaniem złożonych

układów chemicznych powstających samorzutnie w wyniku łączenia komponentów

molekularnych za pomocą międzycząsteczkowych, odwracalnych, niekowalencyjnych

oddziaływań takich, jak wiązania wodorowe, oddziaływania van der Waalsa,

oddziaływania typu π-­π lub oddziaływania elektrostatyczne typu jon-­jon, czy też jon-­dipol.

Tworzące się agregaty mają zwykle odmienne właściwości fizykochemiczne od

wchodzących w ich skład poszczególnych komponentów. Poszukiwanie

samoorganizujących się układów tj. układów zdolnych do spontanicznego organizowania

się w supramolekularne architektury o określonej strukturze i funkcji jest przedmiotem

zainteresowań chemii, biologii i medycyny.1-­3

Materia ożywiona dostarcza wielu przykładów funkcjonalnych systemów

supramolekularnych ważnych z punktu widzenia procesów fizjologicznych. Budowa błon

komórkowych, podwójnej helisy DNA, oddziaływania typu receptor-­cząsteczka

sygnałowa, różne formy transportu, reakcje enzymatyczne, czy reakcje obronne organizmu

(np. oddziaływania przeciwciało-­antygen) zawdzięczają swoje funkcje zdolności

cząsteczek do samoorganizacji i tzw. „rozpoznania molekularnego”. Dążenie badaczy do

odwzorowania tego typu układów w warunkach in vitro prowadzi do poznania istoty oraz

mechanizmów oddziaływań niekowalencyjnych, a także ich wpływu na strukturę i funkcję

supramolekularnych architektur. Pozwala to z jednej strony pełniej zrozumieć procesy

zachodzące w komórkach organizmów żywych, a z drugiej nadaje badaniom charakter

aplikacyjny.4-­6

Rozwój chemii supramolekularnej wywiera ogromny wpływ na farmację i medycynę.

Poznanie właściwości układów supramolekularnych pozwala na: (a) projektowanie

bardziej skutecznych substancji aktywnych (API -­ Active Pharmaceutical Ingredient) o

grupach funkcyjnych i konformacji komplementarnej do struktury układu docelowego (np.

centrum aktywnego enzymu, czy receptora), (b) opracowanie nowoczesnych systemów

dostarczania leku (DDS -­ Drug Delivery System) takich, jak micele, mikrosfery, liposomy,

kropki kwantowe, dendrymery, nanocząstki polimerowe i nieorganiczne, czy kompleksy

typu gospodarz-­gość, w których uczestniczą np. cyklodekstryny. To właśnie systemy

dostarczania leków ułatwiają kontrolę transportu i uwalniania leku w organizmie,

6

modyfikują właściwości farmakokinetyczne i profil dystrybucji substancji aktywnej,

zwiększają jej biodostępność i obniżają działania niepożądane.7-­15

Charakterystyka układów supramolekularnych w roztworach jest znacznie utrudniona

ze względu na ich labilność. Rentgenowska analiza strukturalna umożliwia określenie

konformacji cząsteczek oraz ich supramolekularnej organizacji w fazie krystalicznej, co

może prowadzić do ustalenia zależności pomiędzy strukturą i funkcją, przyczynić się do

lepszego zrozumienia procesów asocjacji cząsteczek, czy wpływu sposobu organizacji

cząsteczek na właściwości fizykochemiczne związków.

5.2 CHARAKTERYSTYKA I UZASADNIENIE WYBORU ZWIĄZKÓW

BĘDĄCYCH PRZEDMIOTEM BADAŃ

Obiektem moich naukowych zainteresowań jest saponina -­ kwas glicyryzynowy oraz

jego półsyntetyczny, aktywny biologicznie związek pokrewny – karbenoksolon (Schemat

1)

Schemat 1

Saponiny stanowią niezwykle ciekawy obiekt badań dla chemii supramolekularnej.

Związki te są metabolitami wtórnymi szeroko rozpowszechnionymi w świecie roślin.

Wytwarzane są również przez niższe zwierzęta morskie (np. szkarłupnie) oraz przez

niektóre owady.16-­17 Należą do glikozydów, jednej z największych i najbardziej

zróżnicowanych grup substancji biologicznie czynnych występujących w świecie

organizmów żywych.

7

Saponiny wykazują niezwykle szerokie spektrum działań farmakologicznych.16,18,19

Zbudowane są z części cukrowej -­ hydrofilowego glikonu oraz aktywnej biologicznie

części niecukrowej – hydrofobowego aglikonu połączonych wiązaniem glikozydowym. Ze

względu na charakter aglikonu związki te dzielone są na dwie zasadnicze grupy: saponiny

triterpenowe i steroidowe. Amfifilowa budowa cząsteczki określa właściwości

fizykochemiczne saponin, które są związkami powierzchniowo czynnymi zdolnymi do

tworzenia supramolekularnych układów np. micel20 oraz podnoszenia rozpuszczalności

substancji hydrofobowych. Nazwa saponin pochodzi od łacińskiego słowa „sapo”

oznaczającego mydło, gdyż ich wodne roztwory po wstrząśnięciu wytwarzają pianę.16

Pomimo dużego zainteresowania tą grupą związków oraz ciągle wzrastającą liczbą

wyizolowanych i scharakteryzowanych saponin, w światowym piśmiennictwie istnieje

bardzo niewiele informacji dotyczących ich trójwymiarowej struktury oraz sposobu

asocjacji cząsteczek w ciele stałym. W Bazie Danych CSD (Cambridge Structural

Database version 5.35 updates May 2014)21 znajduje się zaledwie 25 struktur saponin

triterpenowych (20 o szkielecie tetracyklicznym i 5 o szkielecie pentacyklicznym),

3 prosapogeniny typu β-­amyryny oraz 15 saponin steroidowych o aglikonie typu

cholostanu lub spirostanu. Z tych względów uznałam za celowe podjęcie badań nad tą

ważną, ale mało poznaną pod względem strukturalnym grupą związków bioaktywnych.

Kwas glicyryzynowy(GA)

Jednym z przedstawicieli saponin triterpenowych, od lat cieszącym się dużym

zainteresowaniem, jest kwas glicyryzynowy (GA). Związek ten jest głównym, aktywnym

biologicznie składnikiem korzenia lukrecji (od 2 do 25% suchej masy w zależności od

gatunku), rośliny znanej z właściwości leczniczych już w czasach starożytnych.22-­24

Występuje w postaci mieszaniny soli potasowej i wapniowej nazywanej glicyryzyną.16

GA, jako naturalna substancja posiadająca właściwości immunomodulacyjne25

charakteryzuje się niezwykle szerokim spektrum działań farmakologicznych. Liczne

badania eksperymentalne i kliniczne26 wykazały, że GA i jego sole mogą być skutecznie

stosowane w infekcjach wirusowych27-­29, chorobach nowotworowych30,31, zapaleniu

wątroby28-­29, wrzodach żołądka i jelit32 oraz alergiach.33-­34 Użyte w systemach dostarczania

leków jako substancje aktywne lub pomocnicze zwiększają efektywność terapii

celowanych.35,36

8

Cząsteczka GA jest zbudowana z hydrofilowej części cukrowej, którą stanowi dimer

kwasu glukuronowego (glikon) oraz hydrofobowej reszty kwasu glicyretynowego

będącego aglikonem typu β-­amyryny (Schemat 1a). Ze względu na obecność trzech grup

karboksylowych, kwas glicyryzynowy może występować w formie neutralnej oraz

zjonizowanej o różnym stopniu deprotonacji, co jest o tyle istotne, że w przemyśle

farmaceutycznym przeprowadzanie związków kwasowych w różnego typu sole jest

jednym ze sposobów poszukiwania substancji czynnej charakteryzującej się lepszą

rozpuszczalnością w wodzie, a tym samym większą efektywnością kliniczną. Z powodu

amfifilowej budowy, GA jest związkiem powierzchniowo czynnym, który w wodnych

roztworach agreguje tworząc micele (krytyczne stężenie miceli CMC = 0.05-­1.0 mM)20,37,

a w wyższych stężeniach żeluje.20,38

Zarówno kwas glicyryzynowy, jak i jego sole podnoszą rozpuszczalność, stabilność

i bioaktywność wielu, nierozpuszczalnych w wodzie substancji leczniczych. Badania

ostatnich lat wykazały, że właściwości te związane są ze zdolnością GA do tworzenia

kompleksów z hydrofobowymi lekami.37,39,40 Tworzenie kompleksów jest jedną z metod

stosowaną w celu zwiększenia efektywności farmakologicznej związku aktywnego,

poprzez zmianę jego właściwości fizykochemicznych, kontrolę transportu i uwalniania

leku w organizmie. W medycynie od wielu lat stosowane są cyklodekstryny tworzące

z lekami kompleksy typu „gość – gospodarz”, w których cyklodekstryna pełni funkcję

gospodarza, a kompleksowany związek hydrofobowy jest gościem.41-­44 Jednak budowa

cyklodekstryn -­ hydrofilowa powierzchnia i niepolarna, wewnętrzna kieszeń ograniczają

zastosowanie tych związków do leków o określonej wielkości, kształcie oraz

hydrofobowości. Ze względu na swoją budowę, kwas glicyryzynowy jest doskonałym

kandydatem do tworzenia kompleksów inkluzyjnych z lekami. W przeciwieństwie do

cyklodekstryn jest cząsteczką o strukturze liniowej, a więc nie występują tutaj

rygorystyczne restrykcje dotyczące wielkości cząsteczki „gościa”. Obecność w GA

hydrofilowego i hydrofobowego fragmentu sprawia, że oddziaływania pomiędzy

cząsteczkami „gospodarza” i „gościa” mogą być różnej natury -­ oddziaływania

hydrofobowe, wiązania wodorowe, a także jonowe w przypadku soli GA. Według

doniesień literaturowych, w porównaniu z cyklodekstrynami, kompleksy GA

charakteryzują się dużo wyższą stabilnością.40,45

Badania NMR i spektroskopii optycznej20 dostarczają pewnych informacji na temat

budowy i stechiometrii supramolekularnych kompleksów kwasu glicyryzynowego. Brak

jest jednak dokładnych informacji na temat molekularnej struktury tworzonych

9

kompleksów. Sugeruje się powstawanie cyklicznych dimerów GA, które połączone

międzycząsteczkowymi wiązaniami wodorowymi, tworzą hydrofobową kieszeń.40 Tak

więc, powstawanie kompleksów typu „gospodarz-­gość” byłoby podobne, jak w przypadku

cyklodekstryn. Jednakże amfifilowa budowa cząsteczki sprawia, że GA w wodnych

i alkoholowych roztworach może tworzyć micele. Ponadto wykryto różnego typu agregaty,

w których w zależności od stężenia, różna liczba cząsteczek „gościa” może przypadać na

cząsteczkę „gospodarza”.37 Mimo wielu przeprowadzonych badań zdolność GA do

tworzenia kompleksów i ich rozpuszczalność w wodzie jest nieprzewidywalna. Nieznany

jest też sposób asocjacji cząsteczek GA i jego soli.

W mojej ocenie lepsze zrozumienie licznych właściwości kwasu glicyryzynowego

wymagało znajomości jego molekularnych i supramolekularnych właściwości

strukturalnych. Celem podjętych badań rentgenograficznych było ustalenie sposobu

agregacji neutralnych i zjonizowanych form kwasu glicyryzynowego. Ze względu na

zdolność GA do modyfikowania właściwości leków, zostały podjęte próby otrzymania

krystalicznych kompleksów kwasu glicyryzynowego z biologicznie czynnymi związkami

zarówno rozpuszczalnymi, jak i nierozpuszczalnymi w wodzie.

Uzyskane wyniki miały szansę rzucić światło na sposób asocjacji cząsteczek GA

w roztworach i w żelu oraz przyczynić się do wzbogacenia wiedzy na temat mechanizmów

tworzenia kompleksów GA wykazujących aktywność biologiczną. W dalszej perspektywie

powinny pozwolić na zaprojektowanie całego szeregu nowych pochodnych o określonych

właściwościach umożliwiających transport różnego rodzaju leków.

Karbenoksolon (CBXH2)

Podobnie jak naturalnie występujące saponiny, ich związki pokrewne również

posiadają szerokie spektrum aktywności biologicznej. Prowadzone od wielu lat badania

wykazały, że niektóre syntetyczne analogi GA o właściwościach przeciwzapalnych,

przeciwwrzodowych, przeciwwirusowych i immunostymulacyjnych charakteryzują się

lepszymi właściwościami farmakokinetycznymi, większą skutecznością działania

i obniżoną toksycznością w stosunku do tradycyjnie stosowanych leków.46-­48

Jednym z biologicznie czynnych analogów kwasu glicyryzynowego jest karbenoksolon

-­ CBXH2 (Schemat 1b), którego dobrze rozpuszczalna w wodzie sól disodowa została

w latach 60-­tych ubiegłego stulecia zarejestrowana w Wielkiej Brytanii jako lek

przeciwwrzodowy.49 W CBXH2 słabo hydrofilowa, stosunkowo niewielka reszta kwasu

10

bursztynowego zastępuje duży, silnie hydrofilowy dimer kwasu glukuronowego GA.

Związek ten został włączony w prowadzone przeze mnie badania, gdyż: (1)

w przeciwieństwie do amfifilowego charakteru kwasu glicyryzynowego, CBXH2 jest

cząsteczką o właściwościach lipofilnych, trudno rozpuszczalną w wodzie, (2) podobnie jak

kwas glicyryzynowy, CBXH2 może występować w formie neutralnej lub zjonizowanej

o różnym stopniu deprotonacji, (3) struktura karbenoksolonu i jego soli w fazie stałej nie

została dotąd określona. Porównanie supramolekularnej organizacji amfifilowych

cząsteczek GA i lipofilnych CBXH2 oraz ich form anionowych powinno prowadzić do

lepszego zrozumienia wpływu niekowalencyjnych, odwracalnych oddziaływań na

właściwości fizykochemiczne tych pokrewnych substancji.

5.3 OMÓWIENIE WYNIKÓW

Z powodu żelujących właściwości kwasu glicyryzynowego ustalenie powtarzalnych

warunków krystalizacji oraz otrzymanie monokryształów odpowiednich do badań

rentgenograficznych okazało się zadaniem niezwykle trudnym. W początkowym okresie,

wszelkie próby krystalizacji kończyły się niepowodzeniem. Określenie minimalnego

stężenia rozpuszczalnika, który zapobiegał żelowaniu oraz optymalizacja warunków

krystalizacji dla GA i jego monoamonowej soli zajęły prawie trzy lata i wymagały

zastosowania techniki wiszącej kropli stosowanej do krystalizacji białek. Wszystkie

kryształy były bardzo nietrwałymi solwatami, które trzymane w roztworze ulegały

rozkładowi, a wyjęte z roztworu macierzystego bardzo szybko pękały i ulegały

dezintegracji, co w dużej mierze utrudniało rejestrowanie dobrej jakości danych

dyfrakcyjnych. Biorąc pod uwagę problemy związane z krystalizacją GA przestaje dziwić

tak niewielka liczba struktur saponin zdeponowanych w krystalograficznej bazie danych

CSD i brak systematycznych badań rentgenograficznych nad tą interesującą grupą

związków. Podobną nietrwałością charakteryzowała się również większość otrzymanych

kryształów karbenoksolonu.

Ze względu na tendencję GA i jego soli do krystalizacji w postaci solwatów,

szczególnie niewdzięcznym i żmudnym zadaniem okazało się otrzymanie kokryształów

GA z biologicznie aktywnymi związkami (API). Dodatkowym utrudnieniem

prowadzonych badań był izomorfizm GA i jego soli oraz ich kompleksów z API, gdyż

identyfikacja składu kryształu wymagała pełnego pomiaru dyfrakcyjnego. Uzyskanie

struktur kompleksów zajęło kilka lat. W tym czasie zostały wykonane pomiary

11

i rozwiązane struktury dla ponad 80 kryształów, lecz efekt tych prac był mało

satysfakcjonujący, gdyż większość dobrze rozpraszających kryształów okazała się

wcześniej otrzymanymi solwatami GA lub jego soli. W rezultacie, jedynie dla kompleksu

soli monoamonowej (AGA) z kwasem p-­aminobenzoesowym (PABA) uzyskano dobrej

jakości dane dyfrakcyjne. Próby krystalizacji AGA-­PABA wykazały, że elementem

warunkującym powstanie kryształów kompleksu był wzajemny stosunek

AGA:PABA:metanol:woda. Ścisła zależność pomiędzy tymi czterema składnikami układu

w znacznym stopniu utrudniała optymalizację warunków, a niewielkie zmiany prowadziły

do otrzymania żelu, kryształów AGA, PABA lub kompleksu AGA-­PABA.

Celem badań przedstawionych w publikacji H1 było określenie trójwymiarowej

struktury cząsteczki i sposobu agregacji obojętnej i anionowej formy kwasu

glicyryzynowego. W początkowej fazie prac zostały ustalone warunki krystalizacji dla GA

i jego monoamonowej soli (AGA), która wykazuje podobne właściwości biologiczne do

GA i jest stosowana na szeroką skalę w różnych gałęziach przemysłu m. in. w przemyśle

spożywczym, tytoniowym, farmaceutycznym i kosmetycznym.50,51 Z uwagi na

właściwości kompleksujące kwasu glicyryzynowego i jego soli oraz brak przekonującej

teorii wyjaśniającej wzrost rozpuszczalności wielu lipofilnych leków prowadzone były

również próby kokrystalizacji AGA z wieloma API rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi

w wodzie. Odpowiedniej wielkości kryształy zostały otrzymane jedynie dla kompleksu

AGA z kwasem p-­aminobenzoesowym (PABA).

Ku mojemu ogromnemu zaskoczeniu wszystkie badane kryształy okazały się

praktycznie izomorficzne. Konformacja cząsteczki kwasu i jego formy monoanionowej,

a także supramolekularna organizacja GA, AGA oraz kompleksu AGA-­PABA były niemal

identyczne. Rentgenowska analiza strukturalna wykazała, że budowa kwasu i jego anionu

przypomina kształtem literę L, której podstawę stanowią dwie skręcone względem siebie

reszty kwasu glukuronowego (Rysunek 1).

12

Rysunek 1. Konformacja cząsteczki GA

Przedstawione struktury potwierdziły konfigurację β obu wiązań glikozydowych oraz

pozwoliły na identyfikację grupy karboksylowej GA, która w pierwszej kolejności ulega

deprotonacji. Badania wykazały przede wszystkim, że asocjacja amfifilowych cząsteczek

saponiny prowadzi do powstania struktury warstwowej (Rysunek 2a) z naprzemiennie

ułożonymi obszarami hydrofilowymi (dimer kwasu glukuronowego) i hydrofobowymi

(szkielet triterpenowy). Podstawową jednostką supramolekularnej budowy kryształów jest

dwuwymiarowy agregat zbudowany z cukrowej platformy, której obie powierzchnie

pokryte są luźno rozmieszczonymi, nie oddziałującymi ze sobą szkieletami

triterpenowymi. Częściowe przenikanie się tego typu jednostek prowadzi do powstania

w hydrofobowej warstwie przecinających się kanałów, w których znajdują się cząsteczki

rozpuszczalnika i gościa (PABA). Miejscem wiązania PABA jest grupa karboksylowa

triterpenoidu (Rysunek 2b) znajdująca się wewnątrz obszaru hydrofobowego, co może

wyjaśniać zdolność GA do podnoszenia rozpuszczalności w wodzie związków słabo

hydrofilnych. W solwatach GA i AGA grupa ta jest związana z cząsteczką

rozpuszczalnika.

13

Rysunek 2. Struktura AGA-­PABA: (a) budowa warstwowa, (b) miejsce wiązania

PABA. R oznacza dimer kwasu glukuronowego

Z kolei, obszar hydrofilowy w postaci cukrowej dwuwarstwy zbudowany jest

z łańcuchów utworzonych przez połączone wiązaniami wodorowymi reszty kwasu

glukuronowego. Integralną częścią warstwy hydrofilowej są w GA trzy cząsteczki wody

(jedna nieuporządkowana), które znajdują się w miejscach oznaczonych jako I-­III i spinają

łańcuchy dodatkowo stabilizując strukturę cukrowej platformy (Rysunek 3). W strukturze

AGA cząsteczka wody z miejsca I jest wymieniona na jon NH4+. Modyfikacja ta nie

wpływa jednak na supramolekularną budowę kryształu, gdyż warstwa cukrowa, poprzez

reorganizację wiązań wodorowych, jest zdolna do akomodacji zmian wynikających

z zastąpienia cząsteczki wody, która jest podwójnym akceptorem i podwójnym donorem

wiązań wodorowych na czterodonorowy kation amonowy.

14

Rysunek 3. Budowa obszaru hydrofilowego. Miejsca zajmowane przez (a) trzy

cząsteczki wody w GA, (b) kation NH4+ i dwie cząsteczki wody w AGA.

(c) Struktura podwójnej warstwy cukrowej w AGA. R oznacza aglikon.

Prezentowane w publikacji H1 struktury dostarczają informacji na temat nieznanej do

tej pory konformacji cząsteczki kwasu (GA) i jego anionu oraz budowy molekularnego

kompleksu AGA-­PABA. Budowa warstwy hydrofobowej pozwala wyjaśnić zdolności GA

do zwiększania rozpuszczalności związków słabo hydrofilowych, natomiast izomorfizm

GA i AGA tłumaczy podobne właściwości fizykochemiczne i biologiczne badanej

saponiny i jej monoamonowej soli.

Wyniki opisane w powyżej pracy skłoniły mnie do syntezy i krystalizacji innych soli

GA w celu lepszego zrozumienia izomorfizmu GA i AGA. Chciałam ustalić, czy inne sole

też będą izostrukturalne, a jeśli tak, to jaki wpływ na budowę warstwy cukrowej będzie

miało wprowadzenie kationów (Na+, K+, Cs+, Mg2+, Ca2+) różniących się wielkością

promienia jonowego, wartościowością i typem oddziaływań (zamiana wiązań wodorowych

występujących w soli amonowej na oddziaływania typu jon-­dipol), a także jaka będzie

trójwymiarowa struktura i sposób agregacji anionów GA o różnym stopniu jonizacji.

Z zsyntezowanych soli: amonowej, sodowej, potasowej i cezowej, a także soli magnezowej

i wapniowej otrzymano nadające się do dalszych badań rentgenowskich kryształy soli

jedno-­ i dwuamonowej (AGA i A2GA), jedno-­ i dwupotasowej (KGA i K2GA) oraz jedno-­

i dwucezowej (CsGA i Cs2GA). Rentgenowska analiza strukturalna wykazała niezwykłą

15

stabilność architektury supramolekularnej badanych soli GA -­ kryształy były w znacznym

stopniu izomorficzne niezależnie od liczby, typu i wielkości kationów. Kationy

wbudowały się w warstwę cukrową w miejsca oznaczone jako I i IIa, które w strukturze

GA zajmowane były przez cząsteczki wody (Rysunki 3, 4).

Rysunek 4. Kationy potasu w miejscach I i IIb w dwupotasowej soli GA.

Dynamiczna budowa warstwy cukrowej umożliwia zmianę kierunku wiązań

wodorowych bez istotnej przebudowy strukturalnej warstwy pozwalając na zastąpienie

neutralnej cząsteczki GA na jej formy zjonizowane oraz wymianę kationów NH4+ na jony

K+ i Cs+. Struktura kryształu dostosowuje się do różnic w wielkości promienia jonowego

poprzez niewielkie zmiany położenia kationów w kierunku prostopadłym do powierzchni

warstwy cukrowej, natomiast duża liczba położonych w niewielkiej od siebie odległości

atomów tlenu pozwala na wbudowanie kationów różniących się liczbą koordynacyjną.

Szczegółowe wyniki badań wraz z analizą przyczyn niezwykłego zjawiska izomorfizmu

kwasu i jego soli zostały przedstawione w publikacji H2.

Struktura molekularna badanej saponiny zależy w głównej mierze od konformacji

reszty disacharydowej i jej orientacji względem sztywnego aglikonu. Możliwość

swobodnej rotacji wokół pojedynczych wiązań glikozydowych zwykle prowadzi do

giętkości konformacyjnej cząsteczki. Powstaje więc pytanie, czy identyczna

trójwymiarowa budowa GA i jego anionów w fazie stałej jest wynikiem oddziaływań

międzycząsteczkowych występujących w krysztale, czy też obserwowana konformacja

cząsteczki/anionów jest stabilizowana już w roztworze. W jednej z zarejestrowanych

struktur soli monoamonowej GA w warstwę hydrofilową, w miejscu oznaczonym jako IV

(publikacja H3), została wbudowana dodatkowa cząsteczka wody w wyniku czego powstał

16

łańcuch zbudowany z kationu NH4+ (miejsce I) i dwóch cząsteczek H2O (miejsce IIa i IV)

łączący grupy karboksylanową i karboksylową reszt kwasu glukuronowego (Rysunek 5).

Rysunek 5. Kation NH4

+ (miejsce I) i dwie cząsteczki wody (miejsca IIa i IV) mostkują

grupy COOH i COO¯disacharydu w jednej ze struktur AGA

Podobna sytuacja występuje w dwuzasadowych solach GA (publikacja H2), gdzie

kationy mostkują grupy COO¯ disacharydu (Rysunek 4). Tego typu schemat sugeruje, że

kationy oraz grupy OH rozpuszczalnika umieszczone w warstwie cukrowej nie tylko

wzmacniają supramolekularną budowę obszaru hydrofilowego łącząc poszczególne

łańcuchy cukrowe (publikacja H1) lecz mogą również stabilizować konformację

disacharydu oraz jego orientację względem aglikonu. Obliczenia DFT (Density Functional

Theory) przedstawione w publikacji H3 pomogły ustalić wpływ H2O/kationów obecnych w

strukturach krystalicznych w miejscach oznaczonych jako I-­IV na konformację wiązań

glikozydowych. W celu monitorowania rotacji jednostek: kwas glukuronowy A – kwas

glukuronowy B oraz kwas glukuronowy A – aglikon (Rysunek 1) wokół dwóch

pojedynczych wiązań za pomocą jednego parametru, wprowadzony został kąt torsyjny H-­

C…C-­H, w którym atomy węgla wiązań glikozydowych nie są ze sobą bezpośrednio

połączone (opuszczony eterowy atom tlenu), co w znacznym stopniu ułatwiło analizę

otrzymanych wyników. Obliczenia wykazały, że kationy/cząsteczki wody znajdujące się

w miejscach I, II i IV w istotny sposób zmieniają wzajemne ułożenie pierścieni

piranozowych, natomiast konformacja syn wiązania glikozydowego pomiędzy resztą

cukrową i triterpenoidem jest dość stabilna. Czynnikiem odpowiedzialnym za skręcenie

pierścieni disacharydu jest mostkowanie grup COOH/COO¯ za pomocą łańcucha

zbudowanego z kationów/cząsteczek wody. Badania NMR (publikacja H3) pozwoliły

ustalić, że w roztworze konformacje obu wiązań glikozydowych w anionie AGA są

17

podobne do ich odpowiedników w strukturach krystalicznych. Skręcona konformacja

dwucukru sugeruje, że w roztworze dochodzi do asocjacji pomiędzy grupami COOH

COO¯ glikonu.

Porównanie wyników rentgenowskich, spektroskopowych i obliczeniowych pozwoliło

na określenie preferowanej konformacji na wiązaniach glikozydowych w fazie

krystalicznej, roztworze i próżni oraz umożliwiło analizę wpływu kationów i cząsteczek

rozpuszczalnika obecnych w warstwie cukrowej kryształów na molekularną strukturę

badanej saponiny.

Kolejne prace zostały podjęte w celu uzyskania informacji na temat sposobu asocjacji

lipofilnego analogu GA – karbenoksolonu (CBXH2) i jego soli sodowej oraz porównania

supramolekularnej architektury otrzymanych kryształów z wcześniej określonymi

strukturami amfifilowego GA i dostępnymi w krystalograficznej bazie danych CSD

strukturami aktywnego biologicznie hydrofobowego aglikonu GA – kwasu

glicyretynowego (GE). Te trzy związki różnią się wielkością i hydrofilowym charakterem

podstawnika przy atomie C3 (Schemat 1) i uznałam, że są one idealnymi kandydatami do

badania strukturalnych właściwości i oddziaływań o charakterze supramolekularnym w

fazie krystalicznej.

W publikacji H4 przedstawiono struktury CBXH2(1), jego dwóch solwatowanych form

(2, 3) oraz solwatu kokryształu CBXH2:CBXHNa (4). Rentgenowska analiza strukturalna

wykazała, że chociaż istnieją znaczące różnice w supramolekularnej architekturze

badanych kryształów, istnieje pewien element budowy wspólny dla wszystkich czterech

form krystalicznych karbenoksolonu. Tym powtarzającym się, najmniej zróżnicowanym

motywem jest jednowymiarowa wstęga zbudowana z ułożonych obok siebie jednostek

CBXH2/CBXH¯ pomiędzy, którymi występują jedynie oddziaływania typu van der

Waalsa. Orientacja triterpenowych szkieletów sprawia, że obie strony wstęgi, oznaczone

jako α i β są strukturalnie zróżnicowane. Na stronie β znajdują się grupy COOH i C=O

aglikonu podczas, gdy strona α pokryta jest wyłącznie grupami CH terpenoidu (Rysunek

6).

18

Rysunek 6. Budowa wstęgi CBXH2 w strukturze 2: a) strona β, b) strona α

Wstęgi asocjują głowa-­do-­ogona (głową jest reszta kwasu bursztynowego, a ogonem

grupa karboksylowa aglikonu) tworząc różnego typu dwuwymiarowe agregaty, które

można opisać jako warstwy zbudowane z hydrofobowego rdzenia (triterpenowe szkielety)

i hydrofilowych powierzchni zewnętrznych (grupy COOH aglikonu i grupy COOH/COO¯

reszty kwasu bursztynowego) [Rysunek 7]. W niesolwatowanej strukturze 1 warstwy

posiadają prawie płaską powierzchnię, a typowe dla grup karboksylowych syntony

supramolekularne wiązań wodorowych [cykliczny motyw R22(8)] łączą sąsiadujące ze

sobą warstwy. W kryształach 2-­4 cząsteczki rozpuszczalnika lub kation Na+ wbudowują

się w położone na granicy warstw, biegnące wzdłuż wstęgi kanały, modyfikując

występujący w 1 układ wiązań wodorowych, w wyniku czego zmienia się również

struktura warstwy. Różnice dotyczą budowy powierzchni warstwy (płaska lub

pofałdowana), konformacji reszty kwasu bursztynowego, orientacji szkieletów

triterpenowych, wzajemnego przesunięcia wstęg w kierunku prostopadłym do powierzchni

warstwy oraz dwóch odmiennych sposobów asocjacji sąsiadujących ze sobą wstęg: (a) typ

α-­β (1, 3-­4), gdzie strona α jednej wstęgi oddziałuje ze stroną β drugiej bądź (b) typ α-­α

i β-­β (2), w którym sąsiadujące wstęgi kontaktują się stronami α lub β. Szczegółowa

analiza zróżnicowania strukturalnego warstwy oraz parametry pozwalające na

monitorowanie zmian występujących w budowie zarówno wstęgi, jak i warstwy zostały

przedstawione w publikacji H4.

19

Rysunek 7. Budowa warstwy w strukturach karbenoksolonu 1-­4. Rzut wzdłuż osi

wstęgi. Atom tlenu grupy karbonylowej narysowany jako sfera wskazuje stronę β wstęgi.

Analogiczny schemat budowy wstęgi i warstwy występuje również w dwóch z trzech

znajdujących się w bazie danych CSD strukturach farmakologicznie aktywnego aglikonu

GA -­ kwasu glicyretynowego (GE), w którym podstawnikiem przy atomie C3 jest grupa

hydroksylowa. Jedna ze struktur reprezentuje budowę warstwy typu α-­β52, a druga typu

α-­α i β-­β53.

Wstęga obecna w różnych formach krystalicznych CBXH2 i GE, w strukturach GA jest

zastąpiona przez jednowymiarowy motyw nazwany przeze mnie łańcuchem (Rysunek 8).

W przeciwieństwie do wstęgi, gdzie jednostki CBXH2/CBXH¯ oddziałują ze sobą jedynie

poprzez słabe siły van der Waalsa, łańcuchy powstają w wyniku utworzenia wiązań

wodorowych pomiędzy dimerami kwasu glukuronowego. Wielkość glikonu prowadzi do

rozdzielenia aglikonów sąsiadujących ze sobą cząsteczek/anionów GA, na skutek czego

w strukturze łańcucha pojawiają się wnęki, w których znajdują się lipofilne fragmenty

cząsteczek rozpuszczalnika lub gościa. W strukturze AGA-­PABA w miejscu tym

umieszczony jest pierścień benzenowy kwasu p-­aminobenzoesowego. Podobnie jak

wstęgi, łańcuchy również posiadają wyróżnione strony α i β, a szkielety triterpenowe

ułożone głowa-­do-­ogona tworzą w krysztale hydrofobową warstwę (Rysunek 9).

20

Rysunek 8. Łańcuchy w strukturach GAi jego soli: a) strona α, b) strona β.

Rysunek 9. Dwuwymiarowy agregat GA pokazujący asocjację łańcuchów

głowa-­do-­ogona. Rzut wzdłuż osi łańcucha. Atom tlenu grupy karbonylowej

narysowany jako sfera wskazuje stronę β łańcucha.

Porównanie form krystalicznych CBXH2 i GE z formami krystalicznymi GA

wykazało, że ich trójwymiarowa struktura zbudowana jest z naprzemiennie ułożonych

hydrofilowych i hydrofobowych regionów. Warstwowa budowa badanych struktur wynika

z kooperatywnego działania sił van der Waalsa i kierunkowych oddziaływań

specyficznych, stąd wzajemna proporcja pomiędzy hydrofilowym, a hydrofobowym

fragmentem cząsteczki jest niezwykle istotnym czynnikiem wpływającym na

supramolekularną architekturę kryształu. W strukturach GA duży, silnie hydrofilowy

dimer kwasu glukuronowego tworzy warstwę cukrową, która jest stabilizowana licznymi

wiązaniami wodorowymi i oddziaływaniami typu jon-­dipol, stąd sposób asocjacji

cząsteczek GA jest niemal identyczny, a otrzymane do tej pory kryształy są izomorficzne.

21

Hydrofilowe ugrupowania CBXH2 i GE nie są zdolne do utworzenia trwałych motywów

strukturalnych opartych na silnych oddziaływaniach specyficznych, co prowadzi do

odmiennego sposobu agregacji cząsteczek, a w konsekwencji do różnorodności

strukturalnej badanych kryształów. Zmiany w wzajemnym przesunięciu sąsiadujących

wstęg w kierunku prostopadłym do powierzchni warstwy (określone w publikacji H4

odległością między leżącymi po obu stronach warstwy płaszczyznami policzonymi przez

atomy C3 terpenoidu) sugerują, że istnieje możliwość otrzymania kryształów GA,

w których grupa karboksylowa aglikonu mogłaby utworzyć wiązanie wodorowe z cukrową

platformą. W takim przypadku doszłoby do zamknięcia kanałów, a jedynym obszarem

dostępnym dla cząsteczek rozpuszczalnika lub gościa stałyby się wnęki obecne

w strukturze łańcucha.

Struktury krystaliczne GA i jego lipofilnych analogów umożliwiają monitorowanie

zmian zachodzących w supramolekularnej organizacji cząsteczek tych trzech pokrewnych

związków. Różnice w budowie pozwalają lepiej zrozumieć kompleksujące właściwości

GA oraz sugerują, że chociaż siłą napędową tworzenia micel są oddziaływania typu van

der Waalsa, obecność dużej liczby wiązań wodorowych lub/i oddziaływań typu jon-­dipol

jest czynnikiem niezbędnym do uzyskania w roztworach stabilnych konstrukcji w skali

nano.

5.4 NAJWAŻNIEJSZE OSIĄGNIĘCIA I DALSZE PERSPEKTYWY ROZWOJU BADAŃ

Wiele saponin, włączając GA tworzy w wodzie koloidalne zawiesiny lub żele stąd

krystalizacja tych związków jest niezwykle trudnym zadaniem. Świadczy o tym niewielka

liczba struktur saponin określonych metodami dyfrakcji rentgenowskiej. Wykorzystanie

techniki wiszącej kropli stosowanej do krystalizacji białek pozwoliło na opracowanie

warunków krystalizacji dla kwasu glicyryzynowego, jego jedno-­ i dwuzasadowych soli

(NH4+, K+, Cs+) i kompleksu AGA z PABA. Otrzymanie całej serii kryształów saponiny

oraz jej lipofilnego analogu karbenoksolonu umożliwiło rozpoczęcie systematycznych

badań nad tą interesującą grupą związków.

Najważniejszym, a jednocześnie najbardziej zaskakującym odkryciem prowadzonych

przeze mnie badań było ustalenie, że w ciele stałym konformacja neutralnej i anionowej

formy kwasu glicyryzynowego jest niemal identyczna, a otrzymane kryształy są

izomorficzne niezależnie od typu i wielkości kationu, stopnia jonizacji GA i rodzaju

wbudowanego rozpuszczalnika. Badania wykazały, że izomorficzna jest również struktura

22

kompleksu AGA z kwasem p-­aminobenzoesowym. Analiza supramolekularnej budowy

otrzymanych kryształów pozwoliła na określenie przyczyn izomorfizmu oraz umożliwiła

lepsze zrozumienie właściwości kompleksujących GA i jego zdolności do podnoszenia

rozpuszczalności w wodzie hydrofobowych leków. Struktury krystaliczne jedno-­

i dwuzasadowych soli GA umożliwiły ustalenie kolejności deprotonacji grup

karboksylowych. Badania spektroskopowe wykazały, że pomimo możliwości rotacji wokół

pojedynczych wiązań glikozydowych, konformacja monoanionu GA w środowisku

wodnym i w ciele stałym jest niezwykle podobna, a metody obliczeniowe pozwoliły na

określenie czynników stabilizujących strukturę disacharydu. Porównanie

supramolekularnej budowy kryształów GA, CBXH2 i GE wykazało, że zarówno

amfifilowe jak i lipofilne cząsteczki badanych związków asocjują tworząc trójwymiarowe

architektury o budowie warstwowej, których różnorodność strukturalna wzrasta wraz ze

spadkiem liczby wiązań wodorowych/oddziaływań elektrostatycznych. Obecność

uporządkowanej warstwy cukrowej w strukturach GA sugeruje, że kluczem do uzyskania

stabilnych nano-­agregatów w roztworze mogą być wiązania wodorowe.

Do najważniejszych osiągnięć pracy habilitacyjnej zaliczam:

• opracowanie warunków krystalizacji dla GA i jego soli -­ związków żelujących

w wodzie, które jednocześnie wykazywały zbyt niską rozpuszczalność

w rozpuszczalnikach organicznych, aby otrzymać kryształy o wymiarach

odpowiednich do badań rentgenowskich,

• ustalenie, że kryształy GA, jego jedno-­ i dwuzasadowych soli (NH4+, K+, Cs+)

oraz kompleksu AGA-­PABA są izomorficzne,

• określenie przyczyn izomorfizmu kryształów GA, jego soli i kompleksu AGA-­

PABA,

• określenie grupy COOH, która jest odpowiedzialna za kompleksujące

właściwości GA i jego soli,

• określenie kolejności w jakiej grupy karboksylowe GA są deprotonowane,

• ustalenie, że dla soli amonowej kwasu glicyryzynowego konformacja wiązań

glikozydowych w roztworze i ciele stałym jest podobna

• określenie czynników stabilizujących preferowaną konformację wiązań

glikozydowych w dimerze kwasu glukuronowego

• ustalenie, że cząsteczki GA i jego lipofilnych analogów agregują tworząc

struktury warstwowe

23

• określenie wpływu wielkości i hydrofilowego charakteru podstawnika na

supramolekularną architekturę kryształów GA, CBXH2 i GE

Uzyskane wyniki dostarczają informacji na temat nieznanej do tej pory

supramolekularnej struktury kwasu glicyryzynowego, jego soli i lipofilnych analogów

w fazie krystalicznej oraz stanowią istotny wkład w zrozumienie i wyjaśnienie właściwości

solubilizacyjnych badanej saponiny. Praca poszerza wiedzę dotyczącą kooperatywnego

efektu wiązań wodorowych i oddziaływań typu van der Waalsa na agregację badanych

cząsteczek. Różnice w supramolekularnej organizacji tych trzech pokrewnych związków

mogą mieć szersze przełożenie na właściwości fizykochemiczne badanych substancji.

W chwili obecnej kontynuuję temat badawczy dotyczący supramolekularnej

organizacji cząsteczek GA i karbenoksolonu w fazie stałej. W swoich badaniach skupiam

się nad uzyskaniem nowych kokryształów saponiny z różnego rodzaju API. W świetle

dotychczasowych wyników, szczególnie interesującym wydaje się otrzymanie

kompleksów GA z cząsteczkami gościa, który nie ma żadnych atomów o właściwościach

protono-­donorowych. Zakładając, że istnieje możliwość przesunięcia grupy COOH

aglikonu w kierunku warstwy cukrowej, próbuję uzyskać kryształy desolwatowanej lub

w nieznacznym stopniu solwatowanej formy GA. W dalszym ciągu zajmuję się

krystalizacją różnych soli GA i karbenoksolonu, szczególnie z metalami ziem alkalicznych

oraz próbuję uzyskać kryształy trójzasadowych soli GA. W celu określenia wpływu

ugrupowań hydrofilowych na warstwową budowę kryształów planuję syntezę

i krystalizację szeregu pochodnych kwasu glicyretynowego i karbenoksolonu o

zmodyfikowanych zarówno grupach COOH aglikonu, jak i podstawnikach przy atomie C3.

Dalsze badania mogą przyczynić się do jeszcze lepszego zrozumienia właściwości

solubilizacyjnych GA oraz pogłębienia wiedzy na temat oddziaływań o charakterze

supramolekularnym dla tego typu cząsteczek. Uzyskane wyniki mogą w przyszłości

umożliwić zaprojektowanie samoorganizujących się układów, które podobnie jak GA będą

tworzyły micele o 100% zawartości substancji aktywnej (którą jest GE), a jednocześnie

będą zdolne do transportowania dodatkowych trudno rozpuszczalnych w wodzie API

zwiększając ich biodostępność oraz wykazując synergistyczny efekt działania,

5.5 PIŚMIENNICTWO

1. Lehn, J.-­M. Toward Self-­Organization and Complex Matter. Science 2002, 295,

2400-­2403.

24

2. Lehn, J.-­M. Toward complex matter: Supramolecular chemistry and self-­

organization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, 99, 4763-­4768.

3. Steed, J. W.;; Atwood, J. L. Supramolecular chemistry, John Wiley & Sons, 2009, 2

nd ed.

4. Tseng, Y.-­H.;; Birkbak, M. E.;; Birkedal, H. Spatial Organization of Hydroxyapatite

Nanorods on a Substrate via a Biomimetic Approach. Cryst. Growth Des. 2013, 13,

4213−4219.

5. Fuhrhop, J. H.;; Wang, T. Bolaamphiphiles. Chem. Rev. 2004, 104, 2901-­2937.

6. Lehn, J.-­M. Supramolecular Chemistry—Scope and Perspectives Molecules,

Supermolecules, and Molecular Devices (Nobel Lecture). Angew. Chem., Int. Ed.

Engl. 1988, 27, 89-­112.

7. Reddy, P. D.;; Swarnalatha, D. Recent Advances in Novel Drug Delivery Systems.

Int. J. PharmTech. Res. 2010, 2, 2025-­2027.

8. Müller-­Goymann, C. C. Physicochemical characterization of colloidal drug

delivery systems such as reverse micelles, vesicles, liquid crystals and

nanoparticles for topical administration. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004, 58, 343-­

356.

9. Benson, H. A. E. Transdermal Drug Delivery: Penetration Enhancement

Techniques. Curr. Drug Deliver. 2005, 2, 23-­33.

10. Malmsten, M. Soft drug delivery systems. Soft Matter 2006, 2, 760-­769.

11. Kingsley, J. D.;; Dou, H.;; Morehead, J.;; Rabinow, B.;; Gendelman, H. E.;; Destache,

C. J. Nanotechnology: A Focus on Nanoparticles as a Drug Delivery System. J.

Neuroimmune Pharmacol. 2006, 1, 340–350.

12. Bae, Y.;; Kataoka, K. Intelligent polymeric micelles fromfunctional poly(ethylene

glycol)-­poly(amino acid) block copolymers. Adv. Drug Deliver. Rev. 2009, 61,

768–784.

13. Yoon, H.-­J.;; Jang, W-­D. Polymeric supramolecular systems for drug delivery. J.

Mater. Chem. 2009, 20, 211-­222.

14. Saraf, A. S. Applications of novel drug delivery system for herbal formulations.

Fitoterapia, 2010, 81, 680-­689.

15. Lembo, D.;; Cavalli, R. Applications of novel drug delivery system for herbal

formulations. Antiviral Chem. Chemother. 2010, 21, 53-­70.

16. Hostettmann, K.;; Marston, A. in Chemistry & Pharmacology of Natural Products:

Saponins;; Cambridge University Press: New York , 2005;; Chapter 7, pp 312-­318.

25

17. Vincken, J. P.;; Heng, L.;; de Groot, A.;; Gruppen, H. Saponins, classification and

occurrence in the plant kingdom. Phytochemistry 2007, 68, 275–297.

18. Lacaille-­Dubois, M.A.;; Wagner, H. A review of the biological and pharmacological

activities of saponins. Phytomedicine 1996, 2, 363-­386.

19. Sparg, S. G.;; Light, M. E.;; Van Staden, J. Biological activities and distribution of

plant saponins. J. Ethnopharmacol. 2004, 94, 219-­243.

20. Kornievskaja, V. S.;; Kruppa, A. I.;; Leshina, T. V. NMR and photo-­CIDNP

investigations of the glycyrrhizinic acid micelles influence on solubilized

molecules. J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem., 2008, 60, 123-­130.

21. Allen, F. H. The Cambridge Structural Database: a quarter of a milion crystal

structures and rising. Acta Cryst 2002, B58, 380-­388.

22. Fiore C.;; Eisenhut M.;; Ragazzi E.;; Zanchin G.;; Armanini D. A history of the

therapeutic use of liquorice in Europe. J. Ethnopharmacol. 2005, 99, 317-­324.

23. Olukoga, A.;; Donaldson, D. The history of liquorice: the plant, its extract,

cultivation,comercialisation and entymology. J. Roy. Soc .Health, 1998, 118, 300-­

304.

24. Davis, E. A.;; Morris, D. J. Medicinal uses of licorice through the millennia: the

good and plenty of this Mol. Cell. Endocrinol. 1991, 78, 1-­6.

25. Patwardhan, B.;; Gautam M. Botanical immunodrugs: scope and opportunities.

Drug Discov. Today 2005, 10, 495-­502.

26. Asl M. N., Hosseinzadeh H. Review of Pharmacological Effects of Glycyrrhiza sp.

and its Bioactive Compounds. Phytother. Res. 2008, 22, 709–724.

27. Fiore, C.;; Eisenhut, M.;; Krausse, R.;; Ragazzi, E.;; Pelatti, D.;; Armanini, D.;;

Bielenberg, J. Antiviral Effects of Glycyrrhiza species. Phytother. Res. 2008, 22,

141-­148.

28. Ashfag, U. A.;; Masoud, M. S.;; Nawaz, Z.;; Riazuddin, S. Glycyrrhizin as antiviral

agent against Hepatitis C Virus. J. Transl. Med. 2011, 9, 112-­119.

29. Van Rossum T. G. J.;; Vulto A. G.;; De Man, R. A., Brouver J. T.;; Schlam, S. W.

Glycyrrhizin as antiviral agent against Hepatitis C Virus. Aliment Pharmacol Ther.

1998, 12;; 199-­205.

30. Khan R.;; Khan A.Q.;; Lateef A.;; Rehman, M. U.;; Tahir, M.;; Ali, F.;;. Hamiza, O. O.;;

Sultana, S. Glycyrrhizic acid suppresses the development of precancerous lesions

via regulating the hyperproliferation, inflammation, angiogenesis and apoptosis in

the colon of wistar rats. PLOS ONE, 2013, 8, e56020-­42.

26

31. Smolarczyk, R.;; Cichon, T.;; Matuszczak, S.;; Mitrus, I.;; Lesiak, M.;; Kobusinska,

M.;; Kamysz, W.;; Jarosz, M.;; Sieron, A.;; Szala, S. The Role of Glycyrrhizin, an

Inhibitor of HMGB1 Protein in Anticancer Therapy. Arch. Immunol. Ther. Exp.

2012, 60, 391-­399.

32. Yuan, H.;; Ji, W.-­S.;; Wu, K.-­X.;; Jiao, J.-­X.;; Sun, L.-­H.;; Feng, Y.-­T. Anti-­infl

ammatory effect of Diammonium Glycyrrhizinate in a rat model of ulcerative

colitis. World J. Gastroenterol. 2006, 12, 4578-­4581.

33. Ram, A.;; Mabalirajan, U.;; Das, M.;; Battacharya, I.;; Dinda, A. K.;; Gangal, S. V.;;

Ghosh, B. Glycyrrhizin alleviates experimental allergic asthma in mice. Int.

Immunopharmacol. 2006, 6, 1468-­1477.

34. Li, X.-­L.;; Zhou, A.-­G. Evaluation of the Immunity Activity of Glycyrrhizin in AR

Mice. Molecules 2012, 17, 716-­727.

35. Zhao M.-­X.;; Ji, L.-­N.;; Mao, Z.-­W. β-­Cyclodextrin/glycyrrhizic acid functionalized

quantum dots selectively enter cells and induce apoptosis. Chem. Eur. J. 2012, 18,

1650-­1658.

36. Paolino D.;; Lucania, G.;; Mardente, D.;; Alhaique, F.;; Fresta, M. Ethosomes for Skin

Delivery of Ammonium Glycyrrhizinate: In Vitro Percutaneous Permeation

through Human Skin and in Vivo Anti-­Inflammatory Activity on Human

Volunteers J. Control. Release, 2005, 106, 99-­110.

37. Polyakov, N. E.;; Leshina, T. V. Glycyrrhizic Acid as a Novel Drug Delivery

Vector: Synergy of Drug Transport and Efficacy. Open Conf. Proc. J. 2011, 2, 64-­

72.

38. Yoshioka H. Kinetics of the Gel-­Sol Transition of the Aqueous Solutions of β-­

Glycyrrhizin Studied by the Temperature Jump-­Spin Probe Method. J. Colloid

Interf. Sci. 1985, 105, 65-­72.

39. Polyakov, N. E.;; Khan, V. K.;; Taraban, M. B.;; Leshina, T. V. Complex of Calcium

Receptor Blocker Nifedipine with Glycyrrhizic Acid. J. Phys. Chem. B 2008, 112,

4435−4440.

40. Polyakov, N. E.;; Leshina, T. V.;; Salakhutdinov, N. F.;; Kispert, L.D. Host-­Guest

Complexes of Carotenoids with â-­Glycyrrhizic Acid. J. Phys. Chem. B 2006, 110,

6991−6998.

41. Zhou, J.;; Ritter, H. Cyclodextrin functionalized polymers as drug delivery systems.

Polym. Chem. 2010, 1, 1552-­1559.

27

42. Brewster, M. E.;; Loftsson, T. Cyclodextrins as pharmaceutical solubilizers. Adv.

Drug Deliver. Rev. 2007, 59, 645-­666.

43. Loftson, T.;; Duchene, D. Cyclodextrins and their pharmaceutical applications. Int.

J. Pharm. 2007, 329, 1-­11.

44. Uekama, K.;; Hirayama, F.;; Irie, T. Cyclodextrin Drug Carrier Systems. Chem. Rev.

1998, 98, 2045-­2076.

45. Connors K.A. The stability of cyclodextrin complexes in solution. Chem. Rev.

1997, 97, 1325-­1357.

46. Baltina, L. A. Chemical Modification of Glycyrrhizic Acid As A Route to New

Bioactive Compounds for Medicine. Curr. Med. Chem. 2003, 10, 155-­171.

47. Du, D.;; Yan, J.;; Ren, J.;; Lv, H.;; Li, Y.;; Xu, S.;; Wang, Y.;; Ma, S.;; Qu, J.;; Tang, W.;;

Hu, Z.;; Yu, S. Synthesis, biological evaluation, and molecular modeling of

glycyrrhizin derivatives as potent high-­mobility group box-­1 inhibitors with anti-­

heart-­failure activity in vivo. J. Med. Chem. 2013, 56, 97–108.

48. Kang, L.;; Li, X.;; Chen, C.;; Wang, F. Research progress on structure modification

and biological activity of 18b-­Glycyrrhetinic acid. Curr. Opin. Complement Altern.

Med. 2014;; 1, 34–44.

49. Brown, H. M.;; Christie, B. G. B.;; Colin-­Jones, E;;. Finney, R. S. H.;; Macgregor, W.

G.;; Morrison Smith, J.;; Smith, W. G.;; Sullivan, F. M.;; Tarnoky, A. L.;; Turner, E.

E.;; Watkinson, G.;; Wotton, D. E. M. Glycyrrhetinic acid hydrogen succinate

(disodium salt). A new anti-­inflammatory compound. Lancet 1959;; 274: 492–493.

50. Fenwick, G. R.;; Lutomski, J.;; Nieman, C. Liquorice, Glycyrrhiza glabra L. Composition, Uses and Analysis. Food Chem. 1990, 38, 119-­143.

51. Isbrucker, R. A.;; Burdock, G. A. Risk and safety assessment on the consumption of

Licorice root (Glycyrrhiza sp.), its extract and powder as a food ingredient, with

emphasis on the pharmacology and toxicology of glycyrrhizin. Regul. Toxicol.

Pharmacol. 2006;; 46: 167–192.

52. Campsteyn, H.;; Dupont, L.;; Lamotte, J.;; Dideberg, O.;; Vermeire, M. Crystal and

Molecular Structure of Glycyrrhetinic Acid Acetone Monohydrate. Acta Cryst.

1977, B33, 3443–3448.

53. Beseda, I.;; Czollner, L.;; Shah, P. S.;; Khunt, R.;; Gaware, R.;; Kosma, P.;; Stanetty,

C.;; del Ruiz-­Ruiz, M. C.;; Am, H., Mereiter, K.;; Cunha, T. D.;; Odermatt, A.,

Claßen-­Houben, D.;; Jordis, U. Synthesis of glycyrrhetinic acid derivatives for the

treatment of metabolic diseases. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 433–454.

28

6. Pozostałe osiągnięcia naukowe

6.1. Omówienie działalności naukowo-­badawczej przed doktoratem

Moje zainteresowania naukowe związane z zagadnieniami chemii

supramolekularnej datują się już od czasów studiów. W pracy magisterskiej pt. „Tb3+

jako marker fluoroscencyjny w badaniach interakcji tRNA z różnymi ligandami”

wykonywanej na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu im. A. Mickiewicza

w Poznaniu pod kierunkiem prof. dr hab. Jacka Augustyniaka zajmowałam się

określaniem zmian konformacyjnych tRNA zachodzących pod wpływem różnych

kationów, poliamin, czy też białek histonowych (zależność struktura-­funkcja). Wyniki

badań zostały przedstawione na międzynarodowej konferencji i opublikowane jako

rozdział w książce (załącznik 4).

Stopień magistra nauk biologicznych w zakresie biologii ze specjalnością biologii

molekularnej, specjalizacją biochemii uzyskałam w 1981 r. W tym samym roku,

jeszcze przed ukończeniem pracy dyplomowej, zostałam zatrudniona na Wydziale

Chemii UAM w Poznaniu w Zakładzie Krystalografii, gdzie rozpoczęłam intensywną

naukę w zakresie krystalografii i rentgenografii strukturalnej. Wiedzę tę pogłębiałam

uczestnicząc w szkołach organizowanych w kraju (krystalografia małych cząsteczek)

i za granicą (krystalografia białek). Pierwsze postawione przede mną zadanie badawcze

dotyczyło określenia warunków krystalizacji hemoglobiny wołowej i wstępnej

charakterystyki rentgenowskiej otrzymanych kryształów. W tym czasie w Polsce nie

były prowadzone żadne badania w zakresie krystalografii białek, a kierowany przez

prof. dr hab. Zofię Kosturkiewicz projekt był unikatowy w skali krajowej.

W zależności od warunków krystalizacji (środowisko redukujące lub utleniające)

otrzymałam różne formy krystaliczne tego białka, co świadczyło o zmianach

konformacyjnych makrocząsteczki zachodzących pod wpływem tlenu. Wyniki badań

zostały zaprezentowane na Konwersatorium Krystalograficznym w Wrocławiu.

Równolegle do prac związanych z krystalizacją hemoglobiny zajmowałam się

badaniami strukturalnymi kryształów związków organicznych. Przedmiotem

prowadzonych przeze mnie badań były (i) amidyny -­ związki biologicznie czynne,

które w zależności od rodzaju podstawników wykazują właściwości grzybobójcze,

karcynogenne lub antykarcynogenne oraz (ii) związki Reisserta znajdujące

zastosowanie w syntezie m. in. alkaloidów izochinoliny. Wspólną cechą obu grup

związków jest obecność układów skoniugowanych oraz znaczna liczba objętościowo

29

dużych podstawników, które zakłócają energetycznie faworyzowaną planarną

konformację układów sprzężonych. Analiza defektów konformacyjnych powstających

pod wpływem zawad sterycznych w cząsteczkach przestrzennie zatłoczonych była

przedmiotem mojej rozprawy doktorskiej pt. „Badania strukturalne cząsteczek

z przeszkodami przestrzennymi” przygotowanej pod kierunkiem prof. dr hab. Zofii

Kosturkiewicz. Stopień doktora nauk chemicznych uzyskałam w roku 1984.

Wyniki prowadzonych w latach 1982-­1984 badań zostały opublikowane w cyklu 6

prac o zasięgu międzynarodowym (publikacje 1-­6, załącznik 4), z których jedna

ukazała się przed uzyskaniem stopnia doktora oraz przedstawione na 9 konferencjach

krajowych i międzynarodowych, z czego 4 komunikaty prezentowane były przed

obroną doktoratu.

6.2. Omówienie działalności naukowo-­badawczej po doktoracie

W pierwszych latach po doktoracie mój rozwój naukowy przebiegał dwutorowo.

W kraju zajmowałam się badaniami rentgenostrukturalnymi cząsteczek organicznych,

a za granicą dokształcałam się w dziedzinie krystalografii białek.

W latach 1985-­1986 przebywałam na półtorarocznym stażu naukowym w USA

na Uniwersytecie Południowej Karoliny (University of South Carolina), gdzie mogłam

rozwijać swoje zainteresowania dotyczące struktur enzymów oraz zależności pomiędzy

strukturą i funkcją białek. Badania, które wówczas rozpoczęłam kontynuowałam

podczas kolejnych lat na dwóch krótkoterminowych, trzymiesięcznych stażach

(w 1987 i 1989 r.). Pracując w zespole prof. Lebiody zapoznałam się z metodami

krystalizacji białek w skali mikro, sposobami krioprotekcji kryształów, wykonywaniem

pomiarów na synchrotronie oraz programami obliczeniowymi stosowanymi do

rozwiązywania i udokładniania struktur makrocząsteczek. W ramach grantów

przyznanych przez NIH (National Institutes of Health), NSF (US National Science

Foundation) and ACS (American Cancer Society) brałam udział w krystalizacji oraz

badaniach struktury (i) syntazy tymidylanowej -­ enzymu będącego celem

molekularnym chemioterapeutyków w kilku rodzajach nowotworu, (ii) oksydazy

alkoholowej – enzymu metabolizującego metanol oraz (iii) kompleksów enolazy

(białka będącego przedstawicielem metaloenzymów) z analogami substratów i jonami

metali, z których kation cynku (Zn2+) jest aktywatorem enzymu, a kation wapnia (Ca2+)

hamuje jego aktywność. Wyniki badań były prezentowane na konferencji naukowej w

Waszyngtonie oraz opublikowane w trzech pracach (publikacje 7, 9, 12, załącznik 4).

30

W roku 1989 przebywałam na miesięcznym stażu w Instytucie Maxa Plancka

w Hamburgu, gdzie w grupie prof. Ady Yonath, przyszłej Laureatki Nagrody Nobla,

szkoliłam się w rozwiązywaniu tak złożonych struktur jak rybosomy.

W tym czasie na UAM kontynuowałam rozpoczęty jeszcze przed doktoratem temat

badawczy dotyczący wpływu przeszkód przestrzennych na konformację amidyn

(publikacje 8, 13, załącznik 4). W ramach rozpoczętej współpracy z prof. dr hab. Zofią

Dega-­Szafran i prof. dr hab. Mieczysławem Szafranem z Wydziału Chemii

Uniwersytetu im. A. Mickiewicza w Poznaniu zajmowałam się badaniami

strukturalnymi kompleksów molekularnych z silnym wiązaniem wodorowym

i zdolnością do przeniesienia protonu. Efektem tej działalności jest szereg

komunikatów zjazdowych (12) oraz 13 prac współautorskich, które ukazały się

w latach 1991 – 2004 (publikacje 10, 14-­17, 19-­22, 24, 25, 27, 39).

W roku 1998, po przejściu na emeryturę prof. dr hab. Zofii Kosturkiewicz,

dołączyłam do grupy badawczej prof. dr hab. Mariusza Jaskólskiego włączając się

w prowadzone przez niego badania strukturalne białek. W ramach współpracy z prof.

Iva Pichova z Instytutu Chemii Organicznej i Biochemii Czeskiej Akademii Nauk

w Pradze zajmowałam się krystalizacją proteazy aspartylowej retrowirusa Masona-­

Pfizera wywołującego u małp chorobę podobną do AIDS oraz kompleksu tego enzymu

z inhibitorem statynowym. Otrzymane wyniki zostały przedstawione na konferencjach

naukowych. Zostałam również włączona w projekt badawczy dotyczący badań

strukturalnych proteazy HIV-­1 i jej inhibitorów. Enzym ten bierze udział w procesie

replikacji wirusa HIV, stąd zrozumienie mechanizmu oddziaływania inhibitora

w miejscu aktywnym enzymu ma istotne znaczenie w projektowaniu efektywnych

leków w terapii AIDS (publikacje 23, 40). W ramach kolejnej tematyki badawczej

zajmowałam się krystalizacją i określeniem struktury zmutowanej formy Met8Leu

CMTI-­1 – małego białka będącego inhibitorem trypsyny. Białko CMTI-­1 oraz inne

białka z tej rodziny izolowane z pestek dyni są najmniejszymi znanymi inhibitorami

proteaz serynowych. Ze względu na małą liczbę aminokwasów ich struktura jest

stabilizowana przez mostki dwusiarczkowe. W otrzymanych kryształach

nieoczekiwanie w strukturę białka został wbudowany kation Zn2+. Wyniki

prowadzonych badań zostały zaprezentowane na konferencjach i opublikowane w Acta

Cryst. D w 2002 roku (publikacja 26).

W roku 2006 zostałam zatrudniona na Wydziale Farmaceutycznym Uniwersytetu

Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu w Zakładzie i Katedrze

31

Technologii Chemicznej Środków Leczniczych kierowanej przez prof. dr hab.

Stanisława Sobiaka, gdzie pracuję do chwili obecnej. Równocześnie z badaniami

dotyczącymi tematyki rozprawy habilitacyjnej, w ramach badań własnych, statutowych

oraz grantów realizowanych w Katedrze (załącznik 4) zajmowałam się rentgenowską

analizą strukturalną kryształów należących do dwóch grup związków o potencjalnym

zastosowaniu w medycynie:

(1) pochodne nitroimidazoli, dla których fragmentem farmakoforowym

odpowiedzialnym za aktywność biologiczną jest 5(4)-­bromo-­2-­metylo-­4(5)-­

nitroimidazol wykazujący zdolność hamowania wzrostu komórek Hela. Ze względu na

obecność atomu bromu oraz przynajmniej jednej elektroakceptorowej grupy

karbonylowej cząsteczki te tworzą wiązania halogenowe, które są bardzo istotnym

elementem rozpoznawania i wiązania cząsteczkowego

(2) porfirazyny, ftalocyjaniny oraz ich prekursorowe pochodne maleo-­

i ftalonitrylowe. Porfirazyny i ftalocyjaniny są związkami syntetycznymi,

spokrewnionymi z porfirynami. Zastąpienie atomów węgla w pozycjach mezo przez

atomy azotu wprowadza istotne zmiany właściwości tej klasy związków, chociaż nadal

zachowują one wiele cech wykazywanych przez porfiryny. Obecność wolnych par

elektronowych, układu podwójnych wiązań, możliwość różnej koordynacji atomów

metali i synteza analogów o zmienionych właściwościach fizykochemicznych czyni te

związki interesującym obiektem badań w różnych dziedzinach nauki i przemysłu m. in.

w chemii, fizyce, biologii, przemyśle farmaceutycznym i nanotechnologii.

Obie grupy związków są syntetyzowane w zespołach badawczych naszej Katedry.

Otrzymane wyniki pozwoliły na pełną geometryczną i konformacyjną charakterystykę

badanych cząsteczek. Wyniki badań prezentowane były na 17 konferencjach w kraju

i za granicą oraz opublikowane w 9 pracach naukowych o zasięgu międzynarodowym

(publikacje 28-­32, 34, 35, 37, 38). Jestem również współautorem zgłoszenia

patentowego dotyczącego dinitrili (załącznik 4).

W ramach współpracy z prof. dr hab. Marcinem Chmielewskim i prof. dr hab.

Wojciechem Rypniewskim z Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu zajmowałam się

badaniami struktury kryształów pirydyloaminoalkoholi – prekursorów termolabilnych

grup ochronnych w chemicznej syntezie kwasów nukleinowych. Analiza

rentgenograficzna umożliwiła identyfikację czynnika odpowiedzialnego za aktywność

badanych związków oraz określenie zależności pomiędzy strukturą a termoprotekcją.