Kutury zawiesinoweSomatyczna embriogeneza

Kultura zawiesinowa• ang.: suspension culture• populacja różnej wielkości

agregatów komórkowych ulegających fragmentacji oraz uwalniających pojedyncze komórki, zawieszona w pożywce płynnej w kolbach wytrząsanych.

• kultury zawiesinowe mogą być inicjowane z eksplantatów pierwotnych lub wtórnych. http://www.mm.helsinki.fi/mmsbl/english/research/

Gerberalab/lignin_tissue_culture.html

Kultura zawiesinowa - wytrząsanie• zapewnia jednolite zaopatrzenie komórek

w składniki odżywcze• wymianę gazową• umożliwia odprowadzanie produktów

przemiany materii• przeciwdziała powstawaniu dużych agregatów• Intensywność wytrząsania 30-180 rpm,

objętość zawiesiny < ¼ objętości naczynia

Ustalona kultura zawiesinowa (UKZ)

• powtarza parametry wzrostu w kolejnych subkulturach

• Stabilność struktury populacji agregatów komórkowych w UKZ wynika z zachowania równowagi pomiędzy rozpadaniem się agregatów na mniejsze i pojedyncze komórki (dyspersja) a trwającymi nieustannie podziałami, prowadzącymi do powstawania większych agregatów z małych i pojedynczych komórek.

Procesy morfogenetyczne dotyczące wczesnego rozwoju roślin w warunkach kultury in vitro

• embriogeneza somatyczna (SE),• organogeneza pędowa,• organogeneza korzeniowa (ryzogeneza).

Somatyczna embriogeneza• proces powstawania zarodków z komórek innych

niż zygota, zachodzi m. in w kulturze embriogenicznej

• proces SE zachodzi podobnie jak w przypadku embriogenezy zygotycznej

• może być zaindukowana bezpośrednio w komórkach eksplantatu (embriogeneza bezpośrednia) lub w komórkach kalusa w wyniku kolejnych subkultur tkanki, także na tej samej pożywce

Zarodki somatyczne• struktury o wyraźnej biegunowości, która w wyniku

ich dalszego rozwoju odpowiada polaryzacji pęd- korzeń

• bardzo przypominają zygotyczne pod względem morfologicznym, przynajmniej we wczesnych stadiach, w późniejszych stadiach mogą pojawiać się różnego rodzaju nienormalności

• składają się z większej liczby komórek, nie mają zdolności akumulacji materiałów zapasowych ani samodzielnego przechodzenia w spoczynek

Stadia rozwoju zarodka

• globularne• sercowate• torpedy

http://www.as-bcst.sinica.edu.tw/enac/wo/4?page=1http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132006000100006

Stadia rozwoju zarodka

http://www.wtcc.wur.nl/UK/Technologies/Somatic+embryogenesis/http://plant-tc.cfans.umn.edu/maize-tc/zmseg.htm

somatyczna embriogeneza - przebieg

dwa etapy:• indukcja embriogeniczności:

– proces wyzwolenia w pojedynczej komórce lub grupie komórek potencjału do formowania zarodka

– w tkance zróżnicowanej związana jest z odróżnicowaniem i nadaniem komórkom merystematycznego charakteru. Płaszczyzny zachodzących podziałów nie wykazują znamion uporządkowania.

• indukcja embriogenezy – zmiana profilu ekspresji genów, inicjacja przestrzennie

zorientowanych, nieprzypadkowych podziałów, podobnie jak ma to miejsce w czasie pierwszych etapów formowania się zarodka zygotycznego.

Czynnikami decydujące o zajściu i częstotliwości SE

• skład pożywki, • warunki kultury • rodzaj eksplantatu.

SE – rodzaj eksplantatu• Informacja potrzebna do odtworzenia

kompletnego organizmu znajduje się w każdej komórce roślinnej – embriogenna może stać się każda żywa komórka

• Najlepsze do uzyskiwania embriogenezy: eksplantaty izolowane z młodych liści, hipokotyli i liścieni siewek, nierozwiniętych pąków kwiatowych, fragmenty korzeni przybyszowych, fragmenty pędów;także: mikrospory, zalążki

SE – rodzaj pożywki• indukcja embriogeniczności: obecność auksyn w

pożywce: NAA, IAA, Picloram, 2,4 –D lub obniżenie pH pożywki

• dalszy rozwój zarodków: pożywki wolne od auksyn• cytokininy: stymulacja proliferacji tkanki

embriogenicznej i regeneracji, hamowanie potencjału embriogenicznego w komórkach

• auksyna z cytokininą: możliwe wytworzenie zarodkow bezpośrednio na eksplantatach

SE – rodzaj pożywki

• Pożywki płynne: rozwój wszystkich zarodków przebiega w podobnym tempie

• Pożywki stałe: agregatom embriogenicznym towarzyszą zarodki we wczesnych stadiach rozwoju oraz tkanka macierzysta tworząc razem kalus embriogeniczny

• W praktyce często indukcja embriogenezy na pożywkach stałych i późniejsze przenoszenie tkanek embriogennych do pożywek płynnych

SE – rodzaj pożywki

Somatyczna embriogeneza u winorośli na pożywkach płynnych i zestalonychhttp://www.amjbot.org/cgi/content/full/90/7/973/F8

U winorośli -różnice w budowie zarodków dotyczące m in.:wielkości liścieni,kształtu liścieni,proporcji długości hypokotylu i liścieni

SE – warunki kultury

• Indukcja embriogenezy somatycznej – ciemność, pozytywny wpływ naświetlania światłem czerwonym

• Kiełkowanie zarodków w rośliny (konwersja) – na świetle

SE – geny zaangażowane w proces

• Kilkanaście genów• W większości czynniki transkrypcyjne

(wpływają na kontrolę ekspresji genów): BBM, LEC1, LEC2, L1L, VP1

• SERK – produktem białko o właściwościach enzymatycznych - kinaza

BBM – BABY BOOM• Koduje regulator transkrypcji• Jego ekspresja zachodzi w wczesnych i na

późnych etapach embriogenezy somatycznej i zygotycznej

• Dodatkowa ekspresja BBM prowadzi u rzodkiewnika i rzepaku do :– formowania struktur podobnych do zarodków

somatycznych i liścieni na końcach liścieni i liści– zmiany fenotypowe regenerowanych roślin– zaburzenia w budowie morfologicznej liści

i kwiatów

Efekty fenotypowe nadekspresji BBM u rzodkiewnika

a. Liścienie i liścieb. Struktury podobne do

zarodków na brzegach liści

c. Fenotyp dziki siewkid. Karłowatość u

heterozygotye. Liście powcinanef. Liście zdeformowaneg. Fenotyp dzikih. Zmiany długości organów

w kwieciei. kwiat, fenotyp dziki

Boutilier i wsp. 2002

SE - zastosowania

• Rozmnażanie wegetatywne roślin• Model do badań nad embriogenezą

zygotyczną• Uzyskiwanie roślin transgenicznych• Badanie funkcji genów

SE - zastosowania• Rozmnażanie wegetatywne roślin

– b. wysoki współczynnik rozmnażania– wydajniejsza i tańsza metoda od rozmnażania

poprzez pąki kątowe lub przybyszowe– niskie koszty robocizny– możliwość automatyzacji– Wymagany specjalistyczny sprzęt (np. bioreaktory)

i protokoły zaawansowanych technologii kultury– Problemy związane z zaburzeniami wzrostu i

rozwoju zarodków (wieloliścieniowość, niewykształcony dostatecznie korzonek zarodkowy, brak epikotylu

SE - zastosowania

http://www.ipst.gatech.edu/faculty_new/faculty_bios/pullman/bio_pullman_gerald.html

SE - zastosowania

http://www.icgeb.org/plant-biology-plant-transformation.html