cznik 2 – AutoreferatZałącznik 2 – Autoreferat Krzysztof Puszyński W pracy doktorskiej...

Politechnika Śląska

Załącznik 2 – Autoreferat

Autoreferat przedstawiający opis dorobku i osiągnięć naukowych, w szczególnościokreślonych w art. 16 ust. 2 ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym

oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki

Krzysztof PuszyńskiWydział Automatyki, Elektroniki i Informatyki

Instytut AutomatykiZakład Inżynierii Systemów

18 stycznia 2017

Załącznik 2 – Autoreferat Krzysztof Puszyński

Spis treści

1 Imię i nazwisko 2

2 Posiadane dyplomy, stopnie naukowe 2

3 Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach nauko-

wych 2

4 Opis osiągnięcia naukowego 2

4.1 Tytuł osiągnięcia naukowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24.2 Omówienie celu naukowego prac i osiągniętych wyników wraz z ich

ewentualnym wykorzystaniem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44.2.1 Wprowadzenie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44.2.2 Modelowanie matematyczne [A1] . . . . . . . . . . . . . . . . 84.2.3 Analiza bifurkacyjna [A2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104.2.4 Analiza wrażliwości [A3] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144.2.5 Sterowanie pomocnicze: siRNA [A4] . . . . . . . . . . . . . . 164.2.6 Sterowanie pomocnicze: Nutlin [A5] . . . . . . . . . . . . . . . 204.2.7 Rola stochastycznego przełączania genów [A6] . . . . . . . . . 23

4.3 Podsumowanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

5 Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych 28

5.1 Omówienie dorobku naukowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285.2 Omówienie działalności dydaktycznej . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

1


1 Imię i nazwisko

Krzysztof Puszyński

2 Posiadane dyplomy, stopnie naukowe

• 2009 – Doktor nauk technicznych w dyscyplinie Biocybernetyka i In-

żynieria Biomedyczna

Wydział Automatyki, Elektroniki i Informatyki Politechniki Śląskiej.Temat pracy: Deterministyczne i stochastyczne modele ścieżek sygnałowychzwiązanych z apoptozą (promotor: Prof. dr hab. Tomasz Lipniacki, InstytutPodstawowych Problemów Techniki PAN),

• 2003 – Magister inżynier na kierunku Automatyka i Robotyka,Wydział Automatyki, Elektroniki i Informatyki Politechniki Śląskiej.

3 Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jed-

nostkach naukowych

• od 11.2009 – Adiunkt, Instytut Automatyki Politechniki Śląskiej,

• 10.2004–09.2009 – Doktorant, Instytut Automatyki Politechniki Śląskiej

4 Opis osiągnięcia naukowego

4.1 Tytuł osiągnięcia naukowego

Cykl połączonych tematycznie prac pod tytułem:

Sterowanie procesami wewnątrzkomórkowymi

2


Osiągnięcie naukowe stanowi seria sześciu połączonych tematycznie prac:

[A1] Jonak K., Kurpas M., Szoltysek K., Janus P., Abramowicz A., Puszynski

K.: A novel mathematical model of ATM/p53/NF-B pathways points to theimportance of the DDR switch-off mechanisms. BMC Systems Biology, 10(1)pp. 1-12, doi: 10.1186/s12918-016-0293-0, 2016.IF: 2.213; 35 pkt. MNiSW.

[A2] Kozłowska E., Puszynski K.: Application of bifurcation theory and siRNA-based control signal to restore the proper response of cancer cells to DNAdamage. Journal of Theoretical Biology, 408, pp. 213-221, 2016.IF: 2.049; 30 pkt. MNiSW.

[A3] Puszyński K., Lachor P., Kardyńska M., Śmieja J.: Sensitivity analysis ofdeterministic signaling pathways models. Bulletin of the Polish Academy ofSciences: Technical Sciences, 60(3), pp. 471-479, 2012.IF: 0.98; 30 pkt. MNiSW.

[A4] Puszyński K., Jaksik R., Świerniak A., Regulation of p53 by siRNA in ra-diation treated cells: simulation studies. International Journal of AppliedMathematics and Computer Science, 22(4), pp. 1011-1018, 2012.IF: 1.008; 20 pkt. MNiSW.

[A5] Puszynski K., Gandolfi A., d’Onofrio A., The Pharmacodynamics of the p53-Mdm2 Targeting Drug Nutlin: The Role of Gene-Switching Noise. PLoS Com-putational Biology, 10(12):e1003991. doi:10.1371/journal.pcbi.1003991, 2014.IF: 4.62; 45 pkt. MNiSW.

[A6] Puszynski K., Gandolfi A., d’Onofrio A., The role of stochastic gene swit-ching in determining the pharmacodynamics of certain drugs: basic mechani-sms. Journal of Pharmacokinetics and Pharmacodynamics, 43(4), pp. 395-410,2016.IF: 1.808; 20 pkt. MNiSW.

Opis mojego wkładu własnego w każdą z wymienionych publikacji znajduje się w

3


załączniku 4.

4.2 Omówienie celu naukowego prac i osiągniętych wyników

wraz z ich ewentualnym wykorzystaniem

Osiągnięcie naukowe stanowi seria sześciu tematycznie powiązanych artykułów opu-blikowanych w czasopismach znajdujących się na liście Journal Citation Reports(JRC). Zgodnie z deklaracjami moich współautorów (załącznik 7) jestem głównymautorem wszystkich artykułów z serii.

Wskaźniki liczbowe prezentowanej serii, zgodne z datą opublikowania, są następu-jące: całkowity Impact Factor wynosi 12, 678, a liczba punktów ministerialnych 180.

4.2.1 Wprowadzenie

Od początku mojej kariery naukowej moje zainteresowania skupiają się wokół za-stosowania podejścia typowego dla inżynierii systemów do zagadnień związanychz leczeniem nowotworów. Pomimo ogromnego zaangażowania naukowców z całegoświata do tej pory nie rozwiązano problemu nowotworów. Nasza wiedza o przebieguprocesów wewnątrzkomórkowych w nowotworach jest niepełna. Pomimo heteroge-niczności komórek i organizmów brak jest opracowanych terapii spersonalizowanych.Większość naukowców rozpatruje nowotwory na poziomie organizmu, tkanki lub ko-mórek, zaproponowano również markery nowotworów [1]. W swoich pracach stosujęnowe, obiecujące podejście polegające na potraktowaniu nowotworów jako dysfunkcjipowstałej w regulacji procesów wewnątrzkomórkowych. W podejściu tym komórkajest rozpatrywana jako reaktor chemiczny, w którym geny, transkrypty i białka sąsubstratami i produktami. Ich wzajemne oddziaływania i zależności tworzą zło-żony system z wieloma pętlami sprzężeń dodatnich i ujemnych zwany ścieżkamisygnałowymi. Z punktu widzenia inżynierii systemów wewnątrzkomórkowe ścieżkisygnałowe są obiektem sterowania, zaś nowotwór może być traktowany jako usterkai/lub zakłócenie w tym obiekcie.

4


W pracy doktorskiej skupiłem się na budowie modeli matematycznych procesówwewnątrzkomórkowych związanych z apoptozą, w szczególności modeli ścieżek sy-gnałowych p53 i NFkB. Kolejnym krokiem jest wykorzystanie opracowanych modeliw celu znalezienia różnic między komórkami zdrowymi i nowotworowymi, następnieustalenie, jak pokonać te różnice tak, by przywrócić prawidłowe zachowanie (np.apoptozę) komórek nowotworowych. Ważną przesłanką, by zająć się ścieżką sygna-łową p53 jako obiektem sterowania jest fakt, iż przynajmniej dla niektórych nowo-tworów jak kostniakomięsaki (np. linia komórkowa SJSA-1) czy rak piersi (MCF-7)znane są mutacje występujące w ścieżce p53, a tym samym źródło usterek.

Rysunek 1: Podejście do terapii spersonalizowanej oparte na metodach biologii sys-temów

Zaproponowane podejście, pokazane na Rys. 1 można streścić następująco:

1. identyfikacja struktury i parametrów obiektu sterowania (wewnątrzkomórko-wych ścieżek sygnałowych) oparta o eksperymenty biologiczne. W terapii sper-sonalizowanej dane pozyskiwane są od pacjenta;

5


2. budowa i symulacja komputerowa deterministycznych i stochastycznych modelibadanego obiektu;

3. analiza różnic w odpowiedziach komórek prawidłowych (zdrowych) i uszkodzo-nych (nowotworowych) traktowanych jako obiekty sterowania, w szczególnościanaliza punktów równowagi, bifurkacyjna oraz analiza wrażliwości;

4. identyfikacja potencjalnych celów dla sterowania, którego rolą będzie przywró-cenie prawidłowego działania obiektu sterowania;

5. opracowanie optymalnego protokołu sterowania minimalizującego dawki i efektyuboczne (np. liczbę martwych komórek zdrowych) przy jednoczesnej maksy-malizacji efektów terapeutycznych (np. zwiększenie apoptozy komórek nowo-tworowych);

6. weryfikacja eksperymentalna opracowanego optymalnego protokołu sterowań(na etapie eksperymentów) i jego aplikacja w terapii spersonalizowanej.

W proponowanym podejściu nowotwór jest wynikiem specyficznej zmiany parame-trów modelu. Powoduje to zmianę typów i/lub położeń punktów równowagi i/lubprzesunięcie punktów bifurkacyjnych w porównaniu do komórek zdrowych. Ponie-waż, w odróżnieniu do obiektów mechanicznych, uszkodzenie nie może być napra-wione fizycznie, proponuję wykorzystanie sygnałów sterujących, których rolą jestobejście uszkodzonych fragmentów ścieżki sygnałowej i przez to przywrócenie pożą-danego zachowania się komórek, jak na przykład przywrócenie apoptozy komóreknowotworowych. By odróżnić te dodatkowe sygnały sterujące od sterowania pod-stawowego, którym jest pojawienie się uszkodzeń DNA (spowodowane np. przezpromieniowanie jonizujące), będziemy nazywali je sterowaniem pomocniczym. Wcelu ewaluacji proponowanego podejścia uzyskałem finansowanie z Narodowego Cen-trum Nauki (NCN) - grant nr DEC-2012/05/D/ST7/02072 (Sterowanie procesamiwewnątrzkomórkowymi).

Przedstawiona seria artykułów pokrywa wszystkie aspekty prezentowanego podejściaoraz pokazuje problemy związane z zastosowaniem sterowań pomocniczych. Tworze-nie modelu matematycznego w oparciu o eksperymenty biologiczne pokazane zostało

6


w pracy [A1]. Publikacje [A2] i [A3] pokazują analizy bifurkacyjną oraz wrażli-wościową opracowanych modeli. Analizy te pozwalają na zidentyfikowanie różnicpomiędzy komórkami normalnymi i nowotworowymi oraz wyznaczenie najlepszychcelów dla terapii. Publikacje [A3], [A4] i [A5] przedstawiają dwa spośród możli-wych sterowań pomocniczych i są poświęcone analizie ich właściwości oraz wynikówotrzymanych przy ich zastosowaniu. W końcu publikacja [A6] pokazuje, że wpływstochastycznego przełączania genów nie może być pomijany przy opracowywaniuterapii minimalizujących dawki leku.

W celu pełnego zrozumienia kolejnych rozdziałów przedstawię w skrócie rozważanyobiekt sterowania. Jak widać na Rys. 2 (czarna część), białko p53 jest czynnikiemtranskrypcyjnym dla wielu białek, między innymi białek odpowiedzialnych za zatrzy-manie cyklu komórkowego (np. p21), naprawę DNA (bezpośrednio niepokazane) iinicjację apoptozy (np. Bax). Dodatkowo p53 odpowiada za produkcję białek Mdm2i PTEN które są kluczowe dla prawidłowego działania modułu regulatorowego p53.Mdm2 pełni rolę inhibitora p53, co definiuje pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego.W efekcie przy braku uszkodzenia DNA w komórkach utrzymuje się niski poziomp53. Powstanie uszkodzeń DNA prowadzi do fosforylacji p53 skutkującej jego uod-pornieniem na działanie Mdm2 oraz zwiększeniem tempa degradacji samego Mdm2.W powiązaniu z pętlą ujemnego sprzężenia zwrotnego prowadzi to do powstaniaoscylacji poziomów p53 i Mdm2. Druga pętla sprzężenia zwrotnego jest pętlą do-datnią działającą na drodze podwójnej negacji. Jest ona znacznie dłuższa od pętlisprzężenia ujemnego i działa na zasadzie zegara. Po powstaniu uszkodzenia DNA,w czasie gdy poziom p53 oscyluje, komórka ma czas na naprawienie powstałychuszkodzeń. W międzyczasie poziom białka PTEN stopniowo wzrasta co powodujepowolną dezaktywację białka PIP3, a przez to obniżenie poziomu aktywnego białkaAkt. Aktywne białko Akt jest potrzebne do fosforylacji Mdm2, by pozwolić najego translokację do jądra komórkowego. W efekcie po pewnym czasie białko Mdm2zostaje uwięzione w cytoplazmie i nie może prowadzić do degradacji białka p53umiejscowionego w jądrze komórkowym. Prowadzi to do dalszego wzrostu poziomup53 i przekroczenia progu apoptozy (więcej szczegółów w pracy [A1]).

7


4.2.2 Modelowanie matematyczne [A1]

W rozprawie doktorskiej przedstawiłem modele matematyczne ścieżek sygnałowychp53 i NFB. Obie odgrywają znaczącą rolę w kształtowaniu odpowiedzi komórekna szereg bodźców, a ich uszkodzenia mogą potencjalnie prowadzić do nowotworze-nia. NFB odpowiada głównie za wczesną odpowiedź immunologiczną, a p53 częstozwane „strażnikiem genomu” odpowiada za utrzymanie integralności genomu. Białkop53 jest aktywowane przy powstaniu uszkodzenia DNA, a jego rolą jest zatrzymaniecyklu komórkowego co zapobiega powielaniu uszkodzenia, inicjacja procesów na-prawy DNA, a finalnie, w przypadku, gdy DNA nie może zostać naprawione lubnaprawa jest mało wydajna, doprowadzenie do śmierci komórki na drodze apoptozy.Uogólniając można powiedzieć, że ścieżka sygnałowa p53 jest modułem regulatoro-wym, który otrzymuje sygnał o powstaniu uszkodzenia DNA, a następnie decyduje,która z odpowiedzi (blokada cyklu, naprawa DNA bądź apoptoza) powinna zostaćuruchomiona. Uznaje się, że około połowa nowotworów posiada zmutowane, a przezto nie działające prawidłowo białko p53, zaś pozostałe posiadają mutacje w ścieżcesygnałowej p53. Innym uszkodzeniem mechanizmów odpowiedzi na uszkodzenieDNA (eng. DNA Damage Response - DDR) jest uszkodzenie w module detekcjiuszkodzenia, co skutkuje brakiem nadania sygnału do modułu p53. Najgroźniej-szym z uszkodzeń DNA jest uszkodzenie podwójno-niciowe (eng. Double-StrandBreak - DSB). Modułem odpowiedzialnym za wykrycie tego typu uszkodzeń i prze-kazanie sygnału do modułu p53 jest ścieżka sygnałowa ATM (Ataxia telangiectasiamutated), w której jedną z kluczowych ról odgrywa fosfataza Wip1.

W celu zbadania roli różnych elementów ścieżki sygnałowej ATM, ze szczególnymuwzględnieniem Wip1, otrzymałem finansowanie z Narodowego Centrum Nauki (NCN)- grant numer N N518 287540 (Biologiczna i symulacyjna analiza ścieżki sygnałowejATM jako aktywatora modułów p53 i NFB). Publikacja [A1] opisuje rezultaty tegoprojektu.

W publikacji [A1] opisujemy kinetykę białka Wip1 po wywołaniu uszkodzeń DNAprzez promieniowanie jonizujące (IR). W odróżnieniu od prac innych grup np. [2],które sugerują, iż rolą Wip1 jest utrzymanie oscylacji w module p53, nasze wyniki

8


Rysunek 2: Szczegółowy schemat stworzonego modelu ścieżki ATM-p53-NFB.

badań in silico i in vitro sugerują, iż Wip1 pełni rolę nadzorcy w systemie ATM/p53.Fosfataza Wip1 kumuluje się w komórkach po powstaniu uszkodzeń DNA w celu wy-łączenia modułu DDR po skutecznej naprawie DNA. Jeśli poziom Wip1 pozostajewysoki, to komórka może stać się niewrażliwa na przyszłe uszkodzenia, potrzebnajest zatem odpowiednia regulacja poziomu Wip1 w celu jego obniżenia. Doniesieniapublikacyjne wskazują, że jednym z czynników regulacyjnych układu DDR mogą byćmiRNA [3]. W związku z tym zaproponowaliśmy uwzględnienie w modelu miRNA-16, które, odgrywa znaczącą rolę w ograniczeniu proliferacji komórek nowotworowych[3] dzięki inhibicji transkryptu Wip1. W oparciu o dane eksperymentalne zapropo-nowaliśmy model zawierający miRNA-16 i stymulator transkrypcji Wip1 w postacibiałka CREB. Ponadto, udało nam się pozytywnie zweryfikować za pomocą ekspery-mentów in vitro dynamikę białek i transkryptów, wielkość frakcji apoptotycznej oraz

9


żywotność komórek otrzymane ze stochastycznych symulacji opracowanego modelu.Dzięki temu wykazaliśmy, iż opracowany model matematyczny może być z powodze-niem stosowany do predykcji odpowiedzi komórek na promieniowanie jonizujące.

Najważniejsze osiągnięcia omawianej pracy to:

• pokazanie, że Wip1 wykazuje zachowanie aperiodyczne w komórkach U2-OSpobudzonych wysoką dawką IR;

• zaproponowanie nowej roli Wip1 jako nadzorcy modułu DDR;

• zaproponowanie regulacji Wip1 przez miRNA-16 oraz wyjaśnienie ścieżki tejregulacji.

4.2.3 Analiza bifurkacyjna [A2]

Kolejnym krokiem w proponowanym podejściu po opracowaniu modelu jest jegoanaliza, w szczególności analiza bifurkacyjna oraz analiza wrażliwości (opisana wnastępnym rozdziale). Rolą analizy bifurkacyjnej jest wykrycie różnic w położeniui/lub rodzaju punktów równowagi pomiędzy komórkami normalnymi (zdrowymi) anowotworowymi. Różnice te związane są ze zmianami wartości parametrów modeluodzwierciedlonymi przez zmiany wartości własnych macierzy Jacobiego. Znając teróżnice możemy sprawdzić możliwości odwrócenia zmian w wartościach własnychmacierzy przez modyfikację innych parametrów modelu matematycznego.

W pracy [A2] wykorzystaliśmy IR (sterowanie podstawowe) jako czynnik uszkadza-jący DNA. W zależności od ilości powstałych uszkodzeń DNA komórki normalne sąw stanie je naprawiać bądź umierają. Jak pokazano na Rys. 3, lewy panel, pierw-szy wiersz, kolumna A - przy niewielkiej ilości uszkodzeń spowodowanych dawką 1Gy IR komórki normalne są w stanie powrócić do punktu równowagi związanegoz proliferacją charakteryzującego się niskim poziomem białka p53. Wyższa dawkaIR (2 Gy) powoduje, że niektóre komórki naprawiają swe uszkodzenia i wracajądo punktu proliferacyjnego podczas gdy inne wybierają punkt równowagi związanyz apoptozą (kolumna B) charakteryzujący się wysokim poziomem p53. Zgodnie z

10


przewidywaniami, gdy dawka IR jest odpowiednio duża (5 Gy) wszystkie komórkiwybierają rozwiązanie apoptotyczne (kolumna C).

Mutacje w komórkach nowotworowych, odzwierciedlane w modelu poprzez zmianęparametrów, skutkują różnicami w ich odpowiedzi. Przykładowo w wielu mięsakachmamy do czynienia z mutacją w chromosomie dwunastym, kodującym m.in. Mdm2,która skutkuje amplifikacją genu Mdm2 (nawet 25-krotną w komórkach SJSA-1 [4]).Z punktu widzenia inżynierii systemów mamy do czynienia z usterką pętli sprzęże-nia ujemnego spowodowaną silnym wzmocnieniem sygnału w tej pętli. W rezultacie,nawet wysoki poziom uszkodzeń DNA nie jest w stanie spowodować przekroczeniaprzez p53 progu apoptozy, więc wszystkie komórki wybierają punkt proliferacyjny(Rys. 3, lewy panel, drugi wiersz). Innym przykładem są komórki MCF-7 [5], spre-parowane komórki PNT1a (rak prostaty) [6], czy pewne podtypy rozlanego chłoniakadużych komórek B (DLBCL) [7]. We wszystkich tych komórkach mamy do czynieniaz usterką pętli sprzężenia dodatniego spowodowaną przez mutację bądź metylacjęgenu PTEN. Jest to równoważne wyłączeniu pętli dodatniego sprzężenia zwrotnegow obiekcie sterowania. Bez PTEN białko Mdm2 nie może być zablokowane w cyto-plazmie w czasie, gdy powinna być zainicjowana apoptoza, co ponownie powoduje,iż poziom białka p53 nie może przekroczyć progu apoptozy (Rys. 3, lewy panel,trzeci wiersz).

Można zauważyć że obie usterki prowadzą do zbyt niskiego poziomu p53 w chwili,gdy powinna zostać podjęta decyzja o apoptozie, a tym samym do braku punkturównowagi związanego z apoptozą. Następnym krokiem w opisywanym podejściujest przeprowadzenie analizy wrażliwości (opisanej w następnym rozdziale), z pozio-mem p53 jako wskaźnikiem, w celu znalezienia najlepszego celu dla terapii, którejzadaniem będzie przywrócenie apoptotycznego punktu równowagi. Po zidentyfiko-waniu najlepszego możliwego celu terapii, analiza bifurkacyjna może zostać ponowniewykorzystana w celu określenia optymalnego dawkowania sterowania pomocniczego.Ponieważ wszystkie terapie związane są z istnieniem skutków ubocznych, w celu ichobniżenia warto rozważyć terapie oparte o minimalne dawkowanie. W przypadkurozpatrywanym w [A2] analiza bifurkacyjna została wykorzystana w celu uzyskania

11


A B C

Cells with functioning p53 pathway

Cells with amplified negative feedback loop

Cells with damaged positive feedback loop

A B C

Cells with functioning p53 pathway

Cells with amplified negative feedback loop + Mdm2 siRNA

Cells with damaged positive feedback loop + Mdm2 siRNA

Rysunek 3: Płaszczyzna p53-Mdm2 dla różnych typów komórek oraz dawek IR.Czarne kropki przedstawiają położenie punktów równowagi zaś szare linie przykła-dowe trajektorie. Kolumna A: dawka promieniowania 1 Gy, kolumna B: dawka 2 Gy,kolumna C: dawka 5 Gy. Lewy panel - komórki bez siRNA, prawy panel - komórkipo podaniu siRNA.

odpowiedniego typu i położenia punktu równowagi. Jak pokazano na Rys. 3 (prawypanel), po wprowadzeniu do układu odpowiedniego sterowania pomocniczego opar-tego o siRNA przywrócono prawidłowe położenie oraz typ apoptotycznego punkturównowagi w rozpatrywanych komórkach nowotworowych.

Wiadomym jest, że w czasie radioterapii napromieniowaniu ulegają nie tylko ko-mórki rakowe ale również tkanki zdrowe, znajdujące się na drodze promieniowania.Powoduje to znaczące efekty uboczne, w efekcie czego może dochodzić do niepożąda-nej apoptozy zdrowych komórek. Z tego powodu można rozważyć obniżenie poziomuefektów ubocznych poprzez uodpornienie komórek zdrowych na promieniowanie. Jak

12


Rysunek 4: Obraz bifurkacyjny komórek z prawidłowo działającą ścieżką p53 wfunkcji promieniowania oraz siRNA skierowanego na PTEN.

pokazałem poprzednio, jednym z powodów niewrażliwości komórek nowotworowychna promieniowanie może być brak funkcjonalnego białka PTEN. Dlatego zapropono-wałem wykorzystanie siRNA skierowanego na mRNA białka PTEN w celu obniżeniapoziomu PTEN w komórkach zdrowych i tym samym uodpornienia ich na promie-niowanie. Na Rys. 4 można zauważyć, że im wyższa dawka siRNA skierowanego naPTEN, tym wyższa dawka IR jest potrzebna, by przeprowadzić komórki z obszaruniskiego poziomu p53 (proliferacja) do obszaru wysokiego poziomu p53 (apoptoza).Dowodzi to, że siRNA skierowane na mRNA białka PTEN uodparnia komórki naIR.

Najważniejszymi osiągnięciami prezentowanej publikacji są:

• pokazanie w jaki sposób teoria bifurkacji może ujawnić istotne różnice pomię-dzy dynamiką komórek normalnych i nowotworowych;

• zaproponowanie, by te różnice przezwyciężyć przy pomocy sterowania pomoc-niczego opartego o siRNA;

13


• pokazanie, że siRNA skierowane na mRNA białka Mdm2 może prowadzić douwrażliwienia komórek nowotworowych na IR;

• zaproponowanie wykorzystania siRNA skierowanego na mRNA białka PTENw celu uodpornienia komórek zdrowych na IR oraz wyjaśnienie mechanizmuodpowiedzialnego za ten efekt.

4.2.4 Analiza wrażliwości [A3]

Nie wszystkie wartości parametrów mogą zostać bezpośrednio wyznaczone ekspery-mentalnie podczas opracowywania modelu. Niektóre z nich muszą zostać określonew czasie procedury dopasowania modelu do danych eksperymentalnych jak np. ob-razów western blot. Rodzi to pytania o poprawność wyznaczonych wartości orazunikalność stworzonego modelu. Ponieważ nie można wyznaczyć dokładnych warto-ści niektórych parametrów, chcemy by tworzony model był odporny na zmiany ichwartości. Gdy model jest odporny, to jego wyjście w relatywnie dużym zakresie war-tości parametrów nie powinno się różnić w znaczący sposób. Odporność modelu jestszczególnie istotna w przypadku rozpatrywania procesów wewnątrzkomórkowych ipróbie sterowania nimi z powodu heterogeniczności komórek, co ma odzwierciedle-nie w wartościach parametrów. Faktycznie dwie komórki, które sąsiadują z sobą wtkance mogą mieć trochę różne tempa pewnych procesów wynikające z różnic wielko-ści komórek, pH, stężenia enzymów itp. Opracowywane przez nas modele powinnypokazywać prawidłowe wartości wyjścia dla wszystkich rozpatrywanych komórek, aw związku z tym, powinny wykazywać odporność na zmiany wartości parametrów.Analiza wrażliwości pozwala sprawdzić tę cechę modelu. Pomimo że została opra-cowana ponad pół wieku temu jej zastosowanie w biologii systemów jest relatywnienowym pomysłem. Jak pokazujemy w [A3] interpretacja wyników analizy wraż-liwości modeli ścieżek sygnałowych wykracza daleko poza standardowy wniosek oodporności. Dostarcza ona między innymi sposobów uproszczenia wielowymiaro-wych modeli jakie powstają w biologii systemów [8] i może być wykorzystana dowyznaczania obiecujących „punktów uderzenia” czy też celów molekularnych dlaleków skierowanych w konkretną ścieżkę sygnałową. W szczególności, gdy ostatecz-

14


nym celem poszukiwań jest znalezienie najefektywniejszego sposobu wpłynięcia naścieżkę sygnałową przy pomocy sterowania pomocniczego [9].

Analiza wrażliwości dzieli się na dwa główne rodzaje: analizę lokalna i globalną.Lokalna analiza wrażliwości dostarcza informacji o wpływie niewielkich odchyłekpojedynczych parametrów od ich wartości nominalnych na wyjście modelu. Globalnaanaliza wrażliwości z kolei pokazuje, jak wyjście układu zmienia się przy jednoczesnejzmianie wielu parametrów w stosunkowo dużym zakresie.

W pracy [A3] porównujemy dwie podstawowe metody analizy wrażliwości: lokalnąopartą o standardowe funkcje wrażliwości oraz globalną opartą o wskaźniki Sobola.Rozpatrujemy dwa przypadki: prostego układu dynamicznego oraz uproszczonegomodelu ścieżki sygnałowej p53. Podsumowując, pokazujemy, iż dobór metody, którama być zastosowana, zależy od celów, jakie chcemy osiągnąć. W początkowych eta-pach budowy modelu bardziej użyteczna jest lokalna analiza wrażliwości, ponieważjest ona mniej wymagająca obliczeniowo. Z drugiej strony, gdy badania skupiająsię na wyznaczeniu zależności pomiędzy zmianami wartości parametrów (odzwier-ciedlającymi heterogeniczność komórek) a dynamiką złożonego systemu, jakim sąścieżki sygnałowe, właściwsza jest metoda oparta o wskaźniki Sobola. Gdy ich war-tości bezwzględne są niskie oznacza to stosunkowo dużą odporność modelu, co jestkluczową właściwością w większości przypadków.

Obie przedstawione metody mogą być wykorzystanie do stworzenia rankingu para-metrów, który następnie może posłużyć do redukcji złożonego modelu lub do wska-zania potencjalnych celów terapii. Z punktu widzenia zastosowania teorii systemówdo problemu leczenia nowotworów interesujące jest drugie z przedstawionych zasto-sowań. Pozwala ono zidentyfikować parametry o największym wpływie na wyjścieukładu zarówno w stanie ustalonym jak i w stanach nieustalonych. Zmierzeniewpływu pojedynczego parametru na poszczególne wyjścia modelu, czy model w ca-łości, nie jest sprawą trywialną i do jej wykonania można wykorzystać wiele różnychwskaźników. Problem staje się nawet bardziej skomplikowany, gdy rozważana jestglobalna analiza wrażliwości oparta o wskaźniki Sobola, ponieważ w analizie tejzmianie ulega jednocześnie kilka parametrów. W pracy [A3] prezentujemy sposób

15


uzyskania skumulowanych wskaźników wrażliwości lokalnej, na których oparty jestranking parametrów, a także zaproponowany przeze mnie wzór, który może zostaćwykorzystany w przypadku stosowania wskaźników Sobola.

Najważniejszymi osiągnięciami prezentowanej pracy są:

• pokazanie, w jaki sposób analiza wrażliwości może zostać wykorzystana wanalizie modeli ścieżek sygnałowych;

• wyjaśnienie, w jaki sposób różne metody mogą być wykorzystane w procesiebudowy modelu;

• zaproponowanie wzoru pozwalającego na stworzenie rankingu parametrów przywykorzystaniu analizy wrażliwości globalnej opartej o wskaźniki Sobola.

4.2.5 Sterowanie pomocnicze: siRNA [A4]

Analiza wrażliwości opisana w [A3] dostarcza ranking parametrów związanych zliczbą kopii genów, tempami transkrypcji, translacji, degradacji, tworzenia się irozpadu kompleksów, aktywacją i dezaktywacją białek. Zazwyczaj, gdy wyjściemukładu jest poziom konkretnego białka, z powodu silnego wzmocnienia sygnału wprocesie transkrypcji i translacji liczba kopii genów oraz tempa ich aktywacji i dez-aktywacji znajdują się na szczycie tego rankingu. Pomimo, że zmiana liczby kopiigenów, bądź blokada transkrypcji poprzez sztuczną zmianę obszaru promotora da-nego genu, jest możliwa in vitro w pojedynczej komórce, nie jest ona możliwa in vivoi dlatego, przynajmniej na chwilę obecną, nie może stanowić podstawy opracowywa-nej terapii antynowotworowej. Z tego powodu następnym krokiem po opracowaniurankingu parametrów jest sprawdzenie, zgodnie ze współczesną wiedzą, które z pro-cesów, związanych z parametrami na liście, mogą być regulowane przez sterowaniepomocnicze. W rezultacie pierwotny ranking powinien zostać przefiltrowany tak,by pozostały w nim jedynie parametry które mogą zostać zmienione. Innym po-dejściem jest rozpoczęcie od wyznaczenia potencjalnych celów terapii, a następniezbudowanie rankingu parametrów opartego jedynie o parametry związane z wyzna-czonymi celami. Oba z tych podejść prowadzą do uzyskania zbioru potencjalnych

16


celów dla sterowania pomocniczego, uporządkowanego według wrażliwości układuna te sterowanie.

0 10 20 30 40 50 60-1

0

1

2

3

4

5x 10

5

Time in hours

Num

ber o

f mol

ecul

es /

DSB

s

[A] Normal cells w ithout IR or siRNA stimulation

53pnMDM2n1000*DNAdam10*siRNA

0 20 40 60-1

0

1

2

3

4

5x 10

5

Time in hours

Num

ber o

f mol

ecul

es /

DSB

s

[B] Normal cells w ith 24h siRNA stimulation (300 nM)


0 10 20 30 40 50 60-1

0

1

2

3

4

5x 10

5

Time in hours

Num

ber o

f mol

ecul

es /

DSB

s

[C] Normal cells w ith IR stimulation (1 Gy)


0 10 20 30 40 50 60-1

0

1

2

3

4

5x 10

5

Time in hours

Num

ber o

f mol

ecul

es /

DSB

s

[D] Normal cells w ith IR stimulation (2 Gy)


Rysunek 5: Zachowanie się komórek normalnych przy braku wymuszeń [A], po 24hod podania siRNA w dawce 300 nM [B], po podaniu IR w dawce 1 Gy (przeżycie)[C] oraz 2 Gy (apoptoza) [D]

W przypadku ścieżki sygnałowej p53 jako obiektu sterowania i poziomu białka p53jako wyjścia układu, czołowe miejsca przefiltrowanego rankingu zajmują: tempo de-gradacji mRNA białka Mdm2, tempo degradacji białka Mdm2, tempa powstawaniai rozpadu kompleksów p53-Mdm2 oraz tempo degradacji białka p53. Zmiana tempa

17


degradacji mRNA lub blokada jego wejścia do rybosomów może być wykonana przywykorzystaniu RNA interferencyjnego (iRNA) takiego jak siRNA lub miRNA [10].

0 10 20 30 40 50 60-1

0

1

2

3

4

5x 10

5

Time in hours

Num

ber o

f mol

ecul

es /

DSB

s

[A] MCF-7 cells w ith IR stimulation (2 Gy)


0 10 20 30 40 50 60-1

0

1

2

3

4

5x 10

5

Time in hours

Num

ber o

f mol

ecul

es /

DSB

s

[B] MCF-7 cells w ith IR (2 Gy) and 2h siRNA (30 nM)


0 10 20 30 40 50 60-1

0

1

2

3

4

5x 10

5

Time in hours

Num

ber o

f mol

ecul

es /

DSB

s

[C] MCF-7 cells w ith IR (0.5 Gy) and 2h siRNA (100 nM)


0 1 2 3 40

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Time of the siRNA exposure in hours

siR

NA

dos

e in

µM

[D] Minimal siRNA dose vs exposure time required to achieve apoptosis

0.4 Gy0.5 Gy0.6 Gy2 Gy

Rysunek 6: Zachowanie się komórek MCF-7 po podaniu IR w dawce 2 Gy (przeżycie)[A], po podaniu IR w dawce 2 Gy a następnie przez 2h siRNA w dawce 30 nM(apoptoza) [B] i IR w dawce 0.5 Gy a następnie przez 2h siRNA w dawce 100 nM(apoptoza) [C]. Panel [D] - minimalna dawka siRNA vs czas ekspozycji na siRNAwymagany do uzyskania apoptozy w komórkach MCF-7.

Wywołanie degradacji gotowych białek nie jest sprawą prostą. Zazwyczaj wymagaono dołączenia co najmniej czterech cząstek ubikwityny do cząsteczki białka, które

18


chcemy zdegradować lub zakłócenia procesów deubikwitynacji tego białka. Zró-dłem problemu jest fakt, że procesy te nie są kontrolowane przez białka celowane wkonkretne molekuły, przez co prawie niemożliwym jest sterowanie procesami ubiwi-tynacji/deubikwitynacji jedynie wybranych białek. Znacznie lepszym pomysłem jestoddziaływanie na tempo tworzenia się kompleksów, jak na przykład enzym-substrat,a przez to oddziaływanie na tempo fosforylacji, acetylacji czy ubikwitynacji. Cel tenmoże być osiągnięty poprzez wykorzystanie odpowiednich cząstek chemicznych, jakna przykład Nutlin-3, który wpływa na tworzenie się kompleksów p53-Mdm2 (opi-sane w następnym rozdziale).

W pracy [A4] badamy możliwość wykorzystania siRNA skierowanego na mRNAbiałka Mdm2 jako sterowania pomocniczego uwrażliwiającego komórki nowotworowena promieniowanie jonizujące będące sterowaniem podstawowym. Było to naszepierwsze podejście do sterowania opartego na siRNA. W pracy tej udało nam sięzmodyfikować model ścieżki sygnałowej p53 poprzez dodanie części odpowiedzialnejza import i eksport komórkowy siRNA, jak również, wpływ siRNA na mRNA białkaMdm2. W trakcie symulacji udało nam się odtworzyć poziomy wyciszenia mRNAdeklarowane przez producentów siRNA.

Nasze wyniki pokazują, że nawet duże dawki siRNA nie są w stanie samotnie spo-wodować apoptozy komórek nowotworowych (Rys. 5B). Spowodowane jest to nie-możnością osiągnięcia 100% wyciszenia mRNA. W warunkach rzeczywistych poziomwyciszenia osiąga pomiędzy 75 a 90%. Komórki normalne poddane oddziaływaniuIR mogą przeżyć, gdy dawka jest niewielka (Rys. 5C) lub zginąć na drodze apoptozy,gdy dawka jest wyższa od pewnej wartości progowej (2Gy w naszych symulacjach- Rys. 5D). Z drugiej strony, komórki nowotworowe z uszkodzonymi elementamirozpatrywanej ścieżki sygnałowej, jak na przykład uszkodzeniami pętli dodatniegosprzężenia zwrotnego w komórkach MCF-7, nawet poddane działaniu wysokiej dawkiIR nie umierają (rys. 6A). Zastosowanie siRNA skierowanego na Mdm2 pozwala nazmianę odpowiedzi komórek MCF-7 na IR powodując ich apoptozę, nawet w przy-padku niższych dawek promieniowania (Rys. 6B i C). Podsumowując można powie-dzieć, że połączenie siRNA oraz IR pozwala na obniżenie dawek promieniowania,

19


a przez to efektów ubocznych przy utrzymaniu tej samej wielkości frakcji komórekapoptotycznych, jak przy zastosowaniu wyższej dawki IR bez siRNA, lub gdy dawkaIR zostanie taka sama - na otrzymanie większej liczby komórek apoptotycznych.


• stworzenie modelu matematycznego opisującego wpływ siRNA skierowanegona mRNA białka Mdm2 na moduł p53 z zachowaniem poziomów wyciszeniapodawanych przez producentów siRNA;

• pokazanie, iż sterowanie oparte o samo siRNA nie jest w stanie wywołać apop-tozy komórek zdrowych ani nowotworowych z powodu niewystarczającego po-ziomu wyciszenia mRNA;

• pokazanie, że odpowiednie siRNA wykorzystane jako sterowanie pomocniczemoże uwrażliwić komórki nowotworowe na promieniowanie jonizujące a przezto umożliwić opracowanie bardziej efektywnych terapii skutkujących obniże-niem poziomu skutków ubocznych.

4.2.6 Sterowanie pomocnicze: Nutlin [A5]

Sterowanie pomocnicze może działać nie tylko na poziomie mRNA, ale też na pozio-mie białek. Przykładem takiego sterowania działającego na ścieżkę sygnałową p53jest mała cząstka zwana Nutlinem. Jak opisano wcześniej Mdm2 jest inhibitoremp53 odpowiedzialnym za utrzymywanie jego niskiego poziomu w nieuszkodzonychkomórkach. Gdy nastąpi uszkodzenie DNA i nie może być ono naprawione, Mdm2jest blokowane w cytoplazmie co zapobiega degradacji jądrowego p53, a przez toprowadzi do wzrostu poziomu p53. Wysoki poziom p53 jest sygnałem inicjującymapoptozę [A1]. W wielu nowotworach jak na przykład mięsaki, Mdm2 ulega nade-kspresji i przez to nie może być w pełni zablokowane w cytoplazmie, co skutkujezbyt niskim poziomem p53 by wywołać apoptozę. Mechanizm molekularny inhibicjip53 przez Mdm2 wymaga powstania kompleksów p53-Mdm2 skutkujących poliubiw-kitynacją p53. Nutlin dostarczony do wnętrza komórek przyłącza się do cząsteczekMdm2 w domenie, w której łączy się z nimi też p53. Ponieważ Nutlin posiada wyższe

20


powinowactwo do Mdm2 niż p53 tworzenie kompleksów p53-Mdm2 zostaje zabloko-wane, a przez to poziom p53 może ponownie wznieść się ponad próg apoptozy. Cociekawe, Nutlin może nie tylko służyć jako sterowanie pomocnicze, ale może rów-nież odgrywać rolę sterowania podstawowego, szczególnie w komórkach, w którychnowotworzenie jest rezultatem nadekspresji Mdm2.

Rysunek 7: Procentowy udział żywotnych komórek w całej populacji po podaniuróżnych dawek Nutlinu. Symbole - dane doświadczalne z pracy Vassileva i innych[11]. Linie ciągłe i przerywane - przewidywania modelu. W symulacjach żywotnośćkomórek była wyznaczana 48h po początku ekspozycji na Nutlin. Wyniki symulacjioparte są o obliczenia z 500 komórek na każdą z dawek Nutlinu.

W pracy [A5] metodami modelowania matematycznego i symulacji opracowanegomodelu zbadaliśmy farmakodynamikę leku Nutlin. Bazując na danych Vassileva[11] i Zhanga [12] odwzorowaliśmy w modelu również farmakokinetykę Nutlinu. Wrezultacie otrzymaliśmy model, w którym wejście zdefiniowane zostało jako stężenieNutlinu w medium hodowlanym w przypadku eksperymentów in vitro lub dawkaw mg/kg w przypadku podawania leku doustnie lub dożylnie żywym organizmom.Udało nam się symulacyjnie odtworzyć krzywe przeżyciowe dla komórek RKO iSJSA-1 stworzone eksperymentalnie in vitro przez Vassileva [11] (Rys. 7). Utrudnie-

21


niem był fakt iż komórki RKO posiadają 2 kopie genu Mdm2 (jak komórki normalne)podczas gdy SJSA-1 50 kopii (25-krotna nadekspresja). Następnie zbadaliśmy, wjaki sposób uszkodzenie pętli sprzężenia dodatniego rozumiane jako metylacja genuPTEN i tym samym brak białka PTEN, wpłynie na uzyskane wyniki. Zgodnie zoczekiwaniami, z powodu silnej nadekspresji białka Mdm2, uszkodzenie pętli sprzę-żenia dodatniego nie wpływa znacząco na rezultaty uzyskane dla komórek SJSA-1,istotnie zaś zwiększa przeżywalność komórek RKO, w szczególności w środkowymzakresie rozważanych dawek Nutlinu (Fig. 7).

Rysunek 8: Przewidywalna wielkość frakcji komórek żywotnych po doustnym poda-niu Nutlinu. Symbole wypełnione odpowiadają dawce pojedynczej (na wszystkichpanelach), symbole puste odpowiadają przypadkowi gdy dawka całkowita zostałapodzielona na cztery równe dawki podawane co 24h (panel A), 12h (panel B) i 6h(panel C). Żywotność komórek była mierzona 120h po podaniu pierwszej dawki.

Kolejnym rezultatem omawianej pracy jest zaproponowanie wyjaśnienia sigmoidal-

22


nego kształtu krzywych przeżyciowych. W naszej opinii mechanizmem odpowie-dzialnym za taki kształt jest stochastyczne przełączanie genów. Hipotezę tę bardziejszczegółowo przebadaliśmy w pracy [A6].

Ostatnim zagadnieniem przebadanym w [A5] było pytanie, który z dwu sposobówdawkowania jest lepszy: dawka pojedyncza czy dawkowanie metronomiczne? Wcelu odpowiedzi na to pytanie porównaliśmy poziomy przeżycia dla komórek RKO iSJSA-1 mierzone 120h po wprowadzeniu Nutlinu. Dawki całkowite 0, 50, 100, 200,300 i 400 mg/kg zostały podane doustnie w postaci dawki pojedynczej lub podzielo-nej na 4 równe dawki podane w odstępach 6, 12 i 24h. Wyniki pokazują iż generalniedawkowanie metronomiczne może być skuteczniejsze niż dawka pojedyncza jedyniedla wysokich dawek całkowitych (>200mg/kg) i komórek bez nadekspresji Mdm2(Rys. 8).


• opracowanie modelu matematycznego uwzględniającego nie tylko farmakody-namikę ale również farmakokinetykę leku;

• zaproponowanie wyjaśnienia sigmoidalnego kształtu krzywych przeżyciowychjako wyniku stochastycznego przełączenia genów;

• weryfikacja skuteczności terapii metronomicznych.

4.2.7 Rola stochastycznego przełączania genów [A6]

Podczas prac nad [A5] zauważyliśmy silną zależność pomiędzy stochastycznym prze-łączaniem genów i sigmoidalnym kształtem krzywych przeżyciowych. Postanowili-śmy dokładniej zbadać to zjawisko, gdyż wyniki mogą znacząco wpłynąć na skutecz-ność opracowywanych sterowań rozważanego obiektu.

Rozważyliśmy dwa proste modele. W obu aktywny gen produkuje mRNA, którenastępnie służy za wzorzec do produkcji białka. W pierwszym modelu skłonności(prawdopodobieństwa na jednostkę czasu) włączenia i wyłączenia genu są niezależne,a w drugim skłonność włączenia genu jest niezależna, zaś skłonność wyłączenia genu

23


Rysunek 9: Model 1. Frakcja komórek nie odpowiadających w funkcji stężenia leku(w a.u.). Tswitch=3600s. Symulowano 1000 komórek.

zależy od ilości molekuł białka, co definiuje pętle sprzężenia ujemnego. W obu przy-padkach parametry modelu dobrane zostały w taki sposób, by wartość oczekiwanastanu genu (bez leku) była równa 1 (możliwe są stany 0, 1 lub 2 aktywne kopie).Wprowadzony lek zwiększa tempo degradacji białka, prowadząc do obniżenia jegopoziomu w komórkach. Założyliśmy prosty cel dla terapii - utrzymać poziom białkaponiżej danego progu (połowa poziomu wyjściowego) przez dany czas (12 godzin).Wyniki naszych symulacji sugerują, że stochastyczne przełączanie genów odgrywadecydującą rolę w kształtowaniu sigmoidalnej odpowiedzi na dawkę (rys. 9). Kształtkrzywej wynika z „wybuchu” poziomu mRNA i następnie białka spowodowanychprzez stochastyczną zmianę stanu genu. Gdy średni czas przełączenia (Tswitch) jestwystarczająco duży możliwą, lecz rzadką, staje się sytuacja, gdy gen przyjmie stan 0i pozostanie w nim na tyle długo by poziom białka spadł poniżej progu (Th) nawetbez, lub przy bardzo, małej dawce leku. Im wyższa jest dawka leku, tym łatwiejutrzymać poziom białka poniżej progu, lecz nawet przy wysokich dawkach leku jestmożliwa sytuacja, gdy stan genu przyjmie wartość 2 i utrzyma ją na tyle długo, żepowstały „wybuch” poziomu białka będzie w stanie przekroczyć zadany próg.

Symulacje przeprowadzone dla obu modeli pokazują ciekawą właściwość związaną z

24


Rysunek 10: Model 1. Frakcja komórek nie odpowiadających na terapię jako funkcjaTswitch dla różnych dawek leku. Symulowano 1000 komórek. Panel dla stężenia lekurównego 1 a.u. (linia niebieska) posiada inna skalę na osi poziomej w celu pokazaniakomórek nie odpowiadających dla Tswitch=0.0001s i 0.001s

wartością Tswitch i stężeniem leku (Rys. 10 i 11). W szczególności, dla wolnychprzełączeń genu znaczna ilość komórek może „odpowiedzieć” również w przypadku,gdy lek nie jest podawany lub gdy dawka leku jest niewystarczająca, by spowodo-wać odpowiedź w przypadku deterministycznym. Dla wyższych dawek leku frakcjanie odpowiadająca wykazuje maksimum w przypadku średnich czasów przełączeńgenu. W przypadku szybkich przełączeń genu przewidywania dla rozważań stocha-stycznych zgadzają się z przewidywaniami przybliżenia deterministycznego, gdziewszystkie komórki odpowiadają lub nie, w zależności od dawki leku.

Interesującym wnioskiem jest to, że dawka krytyczna (przy której model wykazujeodpowiedź na terapię) dla przybliżenia deterministycznego modelu drugiego jest niż-sza niż dawka konieczna do wywołania odpowiedzi w połowie komórek w przypadkustochastycznym (1.67 a.u vs 1.9 a.u.). Sugeruje to, że dawki terapeutyczne zdefinio-wane poprzez symulacje deterministyczne układu z ujemnym sprzężeniem zwrotnym

25


Rysunek 11: Model 2. Frakcja nie odpowiadających komórek w funkcji Tswitch dlaróżnych stężeń leku

do genów mogą być za niskie, gdy będą stosowane w układach rzeczywistych, którez natury są stochastyczne.


• wyjaśnienie mechanizmu stojącego za sigmoidalnym kształtem krzywych sku-teczności leku w pewnych układach poprzez stochastyczne przełączanie genów;

• pokazanie, że oczekiwany czas przełączenia genu może być kluczowy dla sku-teczności pewnych terapii (w szczególności terapii minimalizujących dawkę);

• pokazanie różnicy w wysokości dawki krytycznej pomiędzy podejściem deter-ministycznym i stochastycznym.

4.3 Podsumowanie

Prezentowane osiągnięcie naukowe stanowi cykl sześciu publikacji powiązanych te-matycznie zatytułowany „Sterowaniem procesami wewnątrzkomórkowymi”. Przed-

26


stawione publikacje pokrywają wszystkie aspekty proponowanego podejścia opartegoo metodologie właściwą dla inżynierii systemów. Wpierw pokazano sposób analizyrozważanej ścieżki sygnałowej i budowy jej modelu matematycznego [A1]. Następ-nie pokazano wykorzystanie analizy bifurkacyjnej i analizy wrażliwości opracowanegomodelu w celu wykrycia różnic pomiędzy komórkami normalnymi i nowotworowymi[A2], jak również wyznaczenia najlepszego celu dla terapii [A3]. Następnie zapropo-nowano i przeanalizowano sterowania pomocnicze [A4] i [A5], które mogą w pewnychsytuacjach przejąć rolę sterowania głównego [A5]. Finalnie rozważono pewne aspektysterowania procesami wewnątrzkomórkowymi związane z efektami stochastycznymiwprowadzanymi przez stochastyczne przełączanie się genów [A6].

Najważniejszymi, oryginalnymi osiągnięciami zaprezentowanymi w przedstawionymcyklu publikacji są:

1. zaproponowanie kompleksowego podejścia do problemu sterowania procesami we-wnątrzkomórkowymi w oparciu o metodologię inżynierii systemów;

2. zaproponowanie nowej roli białka Wip1 jako nadzorcy DDR;

3. pokazanie, w jaki sposób analiza bifurkacji, może zostać wykorzystana do wykry-cia różnic pomiędzy komórkami normalnymi i nowotworowymi;

4. pokazanie, w jaki sposób analiza wrażliwości, może zostać wykorzystana do wy-krycia najlepszych celów dla terapii;

5. pokazanie, w jaki sposób siRNA skierowane na mRNA białka Mdm2 może zo-stać wykorzystane w roli sterowania pomocniczego w celu uwrażliwienia komóreknowotworowych na promieniowanie jonizujące (IR - które jest sterowaniem głów-nym), a siRNA skierowane na mRNA białka PTEN jako sterowanie pomocniczeuodparniające komórki normalne na IR w celu redukcji efektów ubocznych;

6. opracowanie modelu matematycznego oddziaływania Nutlinu na ścieżkę sygna-łową p53 z odpowiednią farmakodynamiką i farmakokinetyką leku oraz weryfika-cja skuteczności terapii metronomicznych;

7. pokazanie, że stochastyczne przełączanie genów może być odpowiedzialne za sig-

27


moidalny kształt krzywych skuteczności pewnych leków oraz że oczekiwany czasprzełączenia genów może być kluczowy dla skuteczności pewnych terapii.

5 Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - ba-

dawczych

5.1 Omówienie dorobku naukowego

Jestem autorem lub współautorem 61 recenzowanych publikacji i rozdziałów w książ-kach powstałych po obronie doktoratu, w tym współautorem monografii wydanej wwydawnictwie Springer Verlag. Większość z nich związana jest z różnymi aspek-tami wykrywania powstałych uszkodzeń DNA, przekazywaniem informacji i regu-lacją w ścieżkach sygnałowych p53 i NFB oraz pewnymi aspektami prawidłowegogromadzenia i przetwarzania danych z eksperymentów biologicznych. W ostatnichlatach moje badania skupiają się na problematyce związanej ze sterowaniem pro-cesami wewnątrzkomórkowymi. Oprócz zagadnień prezentowanych w serii artyku-łów stanowiących osiągnięcie naukowe [A1]-[A6], zainicjowałem oraz brałem udziałw badaniach nad: konwersją rezultatów eksperymentalnych otrzymywanych tech-niką Western Blot do postaci numerycznej, ścieżkami detekcji pojedynczo-niciowychuszkodzeń DNA (ATR), interakcjami ścieżek ATR i ATM, rolą mechanizmu resek-cji w odpowiedzi komórek na IR, interakcjami pomiędzy ścieżką ATR-ATM-p53 acyklem komórkowym oraz nad wykorzystaniem siRNA, miRNA i oligonukleotydówjako sterowania pomocniczego lub głównego w ścieżce sygnałowej p53. Zainicjo-wałem opracowanie programu Solvary - całościowego systemu symulacji i analizyścieżek sygnałowych wykorzystującego nowe, dużo szybsze od dotychczasowego, po-dejście do symulacji deterministyczno-stochastycznych. Jestem również zaangażo-wany w badania nad zastosowaniem kawałkami liniowych modeli z przełączeniamido opisu nieliniowych układów biologicznych, co być może pozwoli na analitycznąanalizę złożonych układów. Wyniki powyższych badań zostały opublikowane bądź sąprzygotowywane do publikacji w pismach oraz były prezentowane na konferencjach

28


międzynarodowych.

Poniżej przedstawiam ważniejsze prace nieuwzględnione w cyklu prac przedstawio-nym jako osiągnięcie habilitacyjne:

1. Jonak K., Jedrasiak K., Polanski A., Puszynski K.: Application of Image Pro-cessing Algorithms in Proteomics: Automatic Analysis of 2-D Gel ElectrophoresisImages from Western Blot Assay. Computer Vision And Graphics. Lecture Notesin Computer Science. 2012, 7594, pp. 433-440

2. Kurpas M., Jonak K., Puszynski K.: Simulation Analysis of the ATR Moduleas a Detector of UV-Induced DNA Damage. In: Information Technologies inBiomedicine, Springer International Publishing. 2014, pp. 317-326

3. Kurpas M., Jonak K., Puszynski K.: The Resection Mechanism Promotes CellSurvival after Exposure to IR. Advances in Intelligent Systems and Computing.2015, 391, pp. 225-235

4. Kurpas M., Puszynski K.: A simulation study of the relationship between re-plication stress detection pathway and the cell cycle. Computational IntelligenceMethods for Bioinformatics and Biostatistics. Naples, 2015, pp. 66-71

5. Jonak K., Kurpas M., Puszynski K.: Prediction of the behavior of mammaliancells after exposure to ionizing radiation based on the new mathematical model ofATM-Mdm2-p53 regulatory pathway. Information Technologies in Biomedicine.Springer International Publishing, 2014, pp. 349-362

6. Lalik A., Jaksik R., Puszynski K.: Regulation of the p53 pathway by siRNAand antisense oligonucleotides. European Journal of Cancer. 2016, 61(Suppl. 1),pp. 178-179

7. Ochab M., Puszynski K.: Influences of the p53 abnormalities on the apoptoticdecision in the non-small cell lung cancer line: A549, H1355 and H157. Bio-algorithms and Med-systems. 2015, 11(2), pp. 30-31

8. Ochab M., Puszynski K., Swierniak A.: Reachability of the Therapeutic Targetin the Systems with Parameters Switch. Bioinformatics and Biomedical Engine-

29


ering. 2016, 9656, pp. 573-584

9. Ochab M., Puszynski K., Swierniak A.: Application of the piece-wise linear mo-dels for description of nonlinear biological systems based on p53 regulatory unit.In: Proceedings of the XXI National Conference on Applications of Mathematicsin Biology and Medicine, Wydawnictwo Uniwersytetu Jana Kochanowskiego wKielcach. Kielce, 2016, pp. 85-90

10. Bensz W., Borys D., Fujarewicz K., Herok K., Jaksik R., Krasucki M., KurczykA., Matusik K., Mrozek D., Ochab M., Pacholczyk M., Pieter J., Puszynski K.,Psiuk-Maksymowicz K., Student S., Swierniak A., Smieja J.: Integrated systemsupporting research on environment related cancers. In: Recent Developments inIntelligent Information and Database Systems. Springer, 2016, pp. 399-409, doi:10.1007/978-3-319-31277-435

11. Puszynski K., Jaksik R., Lalik A.: Controlling the Intracellular Processes. In:World Congress, Vol. 19, 1, Boje, Edward; Xia, Xiaohua (eds.), InternationalFederation of Automatic Control, 2014, pp. 11524-11529

12. Swierniak A., Kimmel M., Smieja J., Puszynski K., Psiuk-Maksymowicz K.:System Engineering Approach to Planning Anticancer Therapies. Springer In-ternational Publishing, Switzerland, 2016

Dane bibliometryczne otrzymane z baz Web of ScienceTM Core Collection, Scopus iGoogle Scholar przedstawione są w tablicy 1.

W celu sfinansowania moich badań pozyskałem dwa projekty badawcze z Narodo-wego Centrum Nauki (NCN):

• N N518 287540: Analiza biologiczna i symulacyjna ścieżki sygnałowej ATMjako aktywatora modułów p53 i NF-kappaB. 2011 - 2014 (6 wykonawców)

• DEC-2012/05/D/ST7/02072 Sterowanie procesami wewnątrzkomórkowymi.2013 - 2016 (6 wykonawców).

W obu grantach pełniłem rolę kierownika oraz głównego wykonawcy. Byłem równieżgłównym wykonawcą bądź wykonawcą w 5 grantach NCN i 1 projekcie NCBiR oraz

30


10 projektach Instytutu Automatyki Politechniki Śląskiej (BK i BKM).

Liczba cytowań Indeks Hirscha

WoS Scopus GSch WoS Scopus GSch151 159 244 5 6 6

Tablica 1: Dane bibliometryczne uzyskane z różnych baz danych. WoS – Web ofScienceTM Core Collection, GSch – Google Scholar.

Biorę aktywny udział w seminariach Instytutu Automatyki i Zakładu Inżynierii Sys-temów Politechniki Śląskiej.

Aktywnie współpracuję z 3 zagranicznymi ośrodkami naukowymi: International Pre-vention Research Institute (iPRI), Lyon, Francja (Prof. Alberto d’Onofrio); Istitutodi Analisi dei Sistemi ed Informatica „Antonio Ruberti” (IASI), Rzym, Włochy (Prof.Alberto Gandolfi) i Cross Cancer Institute University of Alberta, Edmonton, Ka-nada (Prof. Jack Tuszynski).

Recenzowałem artykuły zgłoszone do publikacji w 8 pismach z listy JCR: PLOS One,Journal of Theoretical Biology, International Journal of Biomathematics, Interna-tional Journal of Applied Mathematics and Computer Science, BioMed ResearchInternational, Current Proteomics, Mathematical Problems in Engineering i The-oretical Biology and Medical Modelling.

5.2 Omówienie działalności dydaktycznej

Przygotowałem programy nauczania i wykłady dla studentów 2 stopnia z przedmio-tów Transdukcja Sygnałów i Regulacja w Układach Biologicznych i Biologia Syste-mów. Opracowałem program ćwiczeń dla przedmiotu Biologia Systemów, programlaboratorium dla przedmiotów Transdukcja Sygnałów i Regulacja w Układach Bio-logicznych i Genomika Funkcjonalna i Proteomika. Przgotowałem program ćwi-czeń dla studentów 1 stopnia z przedmiotu Dynamika Układów oraz laboratoriumz przedmiotu Modelowanie Biosystemów oraz brałem udział w opracowaniu pro-gramu laboratorium z przedmiotów Bioinformatyka, Optymalizacja i Sterowanie w

31


Genetyce i Biologii Molekularnej oraz Optimization and Decision Making (w językuangielskim).

Byłem promotorem 8 prac magisterskich oraz 9 inżynierskich. Jestem promotorempomocniczym 1 doktoratu (w trakcie). Opiekowałem się również 6-ma projektamistudenckimi przygotowywanymi przez członków Studenckiego Koła Naukowego Bio-informatyki - BioSKN.

Szczegółowe dane odnośnie wszystkich moich osiągnięć zawarte są w załączniku 4.

Literatura

[1] Hanahan D., Weinberg R.A., The hallmarks of cancer: the next generation.Cell 144, 646–674 1686 (2011).

[2] Batchelor E., Mock C.S., Bhan I., Loewer A., Lahav G.: Recurrent initiation:a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol Cell30, 277–289 (2008).

[3] Chen X., Chen T.: Roles of MicroRNA in DNA Damage and Repair. In: Kru-man, I. (ed.) DNA Repair, pp. 341–354. InTech, (2015).

[4] Oliner J.D., Kinzler K.W., Meltzer P.S., George D.L., Vogelstein B.: Amplifi-cation of a gene encoding a p53-associated protein in human sarcomas. Nature358: 80–83. (1992).

[5] Krawczyk B., Rudnicka K., Fabianowska-Majewska K.: The effects of nu- cle-oside analogues on promoter methylation of selected tumor suppressor genesin MCF-7 and mda-mb-231 breast cancer cell lines. Nucleosides NucleotidesNucleic Acids 26 (8–9), 1043–1046. (2007).

[6] Mak P., Li J., Samanta S., Chang C., Jerry D., Davis R., Leav I., Mercurio A.:Prostate tumorigenesis induced by PTEN deletion involves estrogen receptor �repression. Cell Rep. 10 (12), 1982–1991. (2012).

32

cznik 2 – AutoreferatZałącznik 2 – Autoreferat Krzysztof Puszyński W pracy doktorskiej...

Documents

Transcript of cznik 2 – AutoreferatZałącznik 2 – Autoreferat Krzysztof Puszyński W pracy doktorskiej...