BIOSYNTEZA I

NADPRODUKCJA

AMINOKWASÓW Nadprodukcja podstawowych

produktów metabolizmu (kwas

cytrynowy, enzymy aminokwasy)

KTÓRE AMINOKWASY

OTRZYMYWANE SĄ METODAMI

BIOTECHNOLOGICZNYMI?

Liczba aminokwasów znanych – ponad 200

Liczba aminokwasów białkowych – ponad 20

Liczba aminokwasów egzogennych dla człowieka

– 8 (a-aminokwasy o konfiguracji L: Phe, Ile, Leu,

Lys, Met, Thr, Try, Val)

Aminokwasy względnie egzogenne – 2: His, Asn

Metody otrzymywania aminokwasów:

•Biosynteza

•Wydzielanie z hydrolizatów białkowych

•Synteza chemiczna

Umożliwiają selektywne otrzymanie

aminokwasów L

Powstaje mieszanina D/L aminokwasów

W produkcji dominują:

Kwas L-glutaminowy: 50% produkcji, > 400 000

ton/rok stosowany w postaci soli sodowej jako

przyprawa smakowo zapachowa,

L-lizyna: 40 000 ton/rok, aminokwas egzogenny,

dodawany do produktów spożywczych

Zastosowanie aminokwasów:

• Składnik żywności

• Dodatki do pasz

• Składniki leków

• Składniki kosmetyków

NEGATYWNA KONTROLA

METABOLICZNA BIOSYNTEZY

AMINOKWASÓW

Stężenie aminokwasu potrzebne dla normalnego

rozwoju organizmu blokuje syntezę enzymów

uczestniczących w wytwarzaniu

Okresowy nadmiar aminokwasu hamuje

aktywność wszystkich kluczowych enzymów

szlaku, względnie pierwszego enzymu w jego

odgałęzieniu

MIKROORGANIZMY WYKORZYSTYWANE W

OTRZYMYWANIU AMINOKWASÓW

Powinny cechować się nadprodukcją

aminokwasów, czyli:

Powinny nie mieć sprawnie działających

mechanizmów kontrolnych

Powinny mieć możliwość (zdolność) transportu

aminokwasów na zewnątrz komórki

Grzyby – nie - sprawnie działające

mechanizmy kontrolne

Bakterie – tak, ale istnieją duże

różnice między gatunkami, np. E. coli

–precyzyjna regulacja

Które organizmy spełniają te warunki?

METODY STOSOWANE DLA UZYSKANIA

NADPRODUKCJI AMINOKWASÓW

Zmiana preferencji metabolicznych – przez

zmianę preferencyjnego kierunku syntezy w

punkcie rozgałęzienia szlaku, przez hamowanie

jednego z z nich nadmiarem produktu

Dodatek prekursorów

Zmiana (zwiększenie) aktywności enzymów

limitujących proces biosyntezy

Uzyskanie wzrostu przepuszczalności przez błonę

cytoplazmatyczną

Modyfikacja szczepów – zakłócenie lub

wyeliminowanie kontroli metabolicznej:

Mutanty auksotroficzne (żywieniowe)

– auksotrofia- blokada enzymatyczna szlaku metabolicznego

– wytworzone białko pozbawione jest aktywności katalitycznej

– wymagają uzupełnienia podłoża brakującym metabolitem

– przy jego ograniczonej ilości mogą wytwarzać duże ilości

metabolitów pośrednich lub produktów odgałęzień szlaku

Mutanty regulatorowe – mutacja genu regulatorowego lub

operatorowego - mutanty niewrażliwe na nadmiar

odpowiednich metabolitów

Szczepy uzyskane metodami inżynierii genetycznej

KWAS L-GLUTAMINOWY

Jakie mikroorganizmy stosowane są w produkcji

kwasu glutaminowego?

Batrerie z rodzajów Corynebacterium, Brevibacterium,

Microbacterium, Arthrobacter

Głównie C. glutamicum i B. flavum

Dlaczego te rodzaje bakterii?

Mają zdolność wydajnej biosyntezy kwasu L-glutaminowego

(nadprodukcji) – specyfika metabolizmu

Mają zdolność wydzielania produktu do podłoża – efekt

niepełnosprawnej błony cytoplazmatycznej, jeżeli są

hodowane w podłożu deficytowym w stosunku do biotyny

TECHNOLOGIA Podłoże zawiera:

Źródło węgla: glukoza, sacharoza, octan, etanol,

n-alkany

Źródło azotu: mocznik, amoniak

Składniki są dozowane!!

pH podłoża 7-8

Temperatura 30-35 oC

Wysokie natlenianie, 3-5 mmoli O2/ml.min !!!

Zbyt słabe natlenianie- produkt kwas bursztynowy

Zbyt silne natlenianie – produkt kwas 2-oksoglutarowy

Dla uzyskania wydzielania kwasu

glutaminowego do podłoża:

Biotyna w stężeniu 2,5 ug/ml – niskie stężenie

kluczowe dla wydzielania produktu do podłoża. Przy

stężeniu optymalnym dla szczepu (25ug/ml) 1/3

kwasu glutaminowego pozostaje w komórce

hamując dalszą syntezę.

20 mg/1gs.m. 2300 mg/1g s.m.

Detergenty – również ułatwiają uwalnianie produktu

Dodatek penicylin i cefalosporyn(antybiotyki

hamujące syntezę peptydoglikanu)

Dodatek nasyconych kwasów tłuszczowych –

hamuje syntezą kwasu oleinowego ( i znosi barierę

przepuszczalności błony

BIOSYNTEZA SCP

(BIAŁKA MIKROBIOLOGICZNEGO)

mikroorganizmy w optymalnych warunkach wykazują bardzo szybki wzrost, a niektóre z nich podwajają swoją masę co 0,5-1 godz;

efektywność biosyntezy białka przez zwierzęta (bydło), rośliny (soja) i drobnoustroje (drożdże) wyraża się stosunkiem 1:81:100 000;

mikroorganizmy można namnażać w sposób ciągły, co zapewnia dużą wydajność biosyntezy niezależnie od warunków klimatycznych

Korzyści wynikające z zastosowania mikroorganizmów do syntezy białka

OPTYMALIZACJA PROCESU

mikroorganizmy łatwiej podlegają modyfikacji genetycznej dla nadania ich biomasie cech wymaganych przez człowieka (np. szybkości wzrostu, poprawy składu aminokwasowego) aniżeli rośliny i zwierzęta;

mikroorganizmy mogą przetwarzać produkty uboczne, surowce odpadowe i ścieki;

poprzez zmianę składu pożywki i parametrów hodowli można zmieniać skład aminokwasowy białka.

mikroorganizmy zawierają dużą ilość białka

odpowiedniej jakości;

mogą zawierać również dużą ilość tłuszczów,

węglowodanów i witamin

Wada

często wysoka zawartość kwasów nukleinowych

Jakość produktu

Wysoka zawartość kwasów nukleinowych w SCP: (bakterie –

głównie DNA; grzyby –głównie RNA

Zasady purynowe są metabolizowane do kwasu moczowego,

którego nagromadzenie w organizmie jest szkodliwe.

Eliminacja RNA i DNA z komórek grzybowych:

Autoliza komórek w temperaturze 50 – 60C.

Enzymy proteolityczne są inaktywowane, a nukleazy i

rybonukleazy trawią kwasy nukleinowe do zasad azotowych,

które można łatwo oddzielić od SCP.

INNE WADY:

Niekorzystne właściwości organoleptyczne – głównie bakterie

Obecność substancji toksycznych – głównie grzyby

(mykotoksyny)

JAKIE MIKROORGANIZMY MOŻNA WYKORZYSTAĆ DO BIOSYNTEZY SCP?

Grzyby (głównie pleśniowe)

Drożdże

Bakterie

Ze względu na wartości odżywcze i bezpieczeństwo

stosowania:

odpowiednim składem chemicznym biomasy,

odpowiadającym wysokoodżywczym produktom

spożywczym i paszowym (wysoką zawartością białka,

tłuszczu, węglowodanów i witamin, brakiem substancji

antyżywieniowych, niską zawartością kwasów nukleinowych);

Drobnoustroje używane do biosyntezy białka powinny odznaczać się:

właściwościami syntetyzowania korzystnych i

wymaganych w środkach odżywczych, substancji

o działaniu oligodynamicznym (witamin i

specyficznych organicznych połączeń związków

mineralnych);

brakiem zdolności syntezy substancji

toksycznych;

brakiem zdolności adsorpcji substancji

toksycznych lub rakotwórczych z pożywki

Ze względów technologicznych

zdolnością do wszechstronnego i maksymalnego

wykorzystania odżywczych składników podłoża

(węglowodanów, związków azotowych, kwasów

organicznych, alkoholi, aldehydów, substancji

mineralnych);

dobrze rozbudowanym kompleksem enzymów

oddechowych, warunkujących szybki wzrost

biomasy

odpornością na niekorzystne zmiany składu

podłoża i warunków hodowli;

korzystnymi cechami technologicznymi,

ułatwiającymi dalszą obróbkę technologiczną

biomasy (wydzielanie, dezintegrację itp.);

DROBNOUSTROJE WYKORZYSTYWANE DO OTRZYMYWANIA SCP:

Drożdże: Saccharomyces cerevisiae,

Saccharomyces carlsbergensis, Candida utilis,

Candida tropicalis, Candida lipolytica,

Kluyveromuces marxianus

Grzyby: Fusarium gravinearum, Paecilomyces

varioti

Bakterie: Methylomonas, Methylococcus,

Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas,

Micrococcus

Zestawienie substratów i mikroorganizmów w procesie produkcji białka mikrobiologicznego

PRZYKŁADY INNYCH NIŻ BIOTECHNOLOGIA FARMACEUTYCZNA I ŻYWNOŚCI

ZASTOSOWAŃ METOD BIOTECHNOLOGICZNYCH

Enzymatyczna synteza tlenków alkenów

Wg S. Russel Biotechnologia

ZARYS BEZTLENOWEGO ROZKŁADU ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH W PROCESIE FERMENTACJI METANOWEJ

Wg S. Russel

Biotechnologia