Technologia bioprocesów –

procesy up-stream

1. Metody statyczne

(okresowe, ang. batch fermentation)

polegające na tym, że w czasie rozwoju

mikroorganizmów nie doprowadza się świeżych

substancji odżywczych i nie odprowadza się końcowych

produktów metabolizmu.

http://www.intechopen.com/books/biomass-now-sustainable-growth-and-use

http://www.biotek.com/resources/articles/chemical-biochemical-means-detect-alcohol.html

Wśród metod statycznych wyróżnia się

metody powierzchniowe realizowane w cienkiej

warstwie,

This image is a work of the National Institutes of Health, part of the United States Department of Health and Human Services. As a work of the U.S. federal government, the

image is in the public domain. http://www.nyu.edu/projects/xdesign/biotechhobbyist/skin.html

metody wgłębne które mogą przebiegać w warunkach tlenowych lub beztlenowych (najczęściej w obecności gazów obojętnych CO2, N2).

http://www.ibwch.lodz.pl/pliki/IBWCh_(m0e3dijltdkdwpi0).jpg

http://www.pakissan.com/english/allabout/horticulture/vegetables/mashroom/gene.transfer.technology.for.mushrooms.shtm

l http://www.fermentor.co.in/fermentor-bioreactor.html

Fazy wzrostu drobnoustrojów w hodowlach okresowych:

1 - faza inkubacyjna (przystosowawcza, lagfaza),

2 – faza zapoczątkowanego

wzrostu, 3 - faza logarytmicznego wzrostu (trofofaza), 4 - faza zahamowanego wzrostu, 5 - faza stacjonarna (idiofaza), 6 - faza letalna

2. Metody okresowe z zasilaniem

(ang. fed batch fermentation),

tzn. z okresowym lub ciągłym dozowaniem sterylnej

pożywki do fermentora, dzięki czemu uzyskuje się

zmniejszenie hamującego wpływu produktów

metabolizmu na rozwój drobnoustrojów

i zwiększony przyrost biomasy.

3. Metody okresowe z powtórnym zasilaniem

(ang. repeated-fed batch fermentation),

charakteryzujące się tym, że co pewien czas odbiera się

część pożywki wraz z nagromadzoną biomasą

drobnoustrojów i uzupełnia świeżą porcją pożywki,

utrzymując w fermentorze stałą jej objętość .

4. Półciągłe metody fermentacji

(ang. semicontinuous fermentation)

polegają na długotrwałym wykorzystaniu potencjału

biosyntetycznego drobnoustrojów przez okresowe

odbieranie części środowiska znajdującego się w

fermentorze i wprowadzenie równoważnej ilościowo

porcji świeżej pożywki

5. Metoda fermentacji ciągłej

(ang. continuous fermentation)

polegająca na stałym odbieraniu podłoża z

fermentora i stałym uzupełnianiu

(w równoważnej ilości, stała objętość) świeżą pożywką

http://people.clarkson.edu/~wwilcox/Design/reactbio.pdf

Schemat ideowy realizacji procesów fermentacyjnych:

d) układ do fermentacji półciągłej - wypływ podłoża po osiągnięciu odpowiedniego stężenia biomasy lub osiągnięcia odp. poziomu cieczy,

e) układ do fermentacji metodą ciągłą - wypływ ciągły

a) bioreaktor pracujący okresowo,

b) bioreaktor pracujący

okresowo z okresowym zasilaniem

c) bioreaktor pracujący

okresowo z okresowo

powtarzalnym zasilaniem

Zalety procesów ciągłych

• wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany warunków hodowli i fizjologię komórek,

• możliwość prowadzenia hodowli dowolnie

długo w ustalonych, najbardziej korzystnych warunkach,

• możliwość regulacji stanu fizjologicznego

komórek przez dobór szybkości zasilania i składu podłoża zasilającego hodowlę,

• stosunkowo duża jednorodność fizyczna i chemiczna hodowli,

• możliwość automatyzacji procesu,

• większa szybkość i wydajność wielu procesów,

• możliwość maksymalnego wykorzystania aparatury przy jednoczesnym równomiernym jej obciążaniu przez cały czas trwania procesu.

Wady procesów ciągłych

• degeneracja szczepów lub pojawienie się niekorzystnych mutacji i opanowanie hodowli przez populacje komórek o pogorszonych właściwościach produkcyjnych,

• trudności w utrzymaniu warunków aseptycznych procesu w bioreaktorze przez dłuższy czas,

• niekorzystny dla hodowli ciągłej sposób

rozwoju niektórych drobnoustrojów, tworzących układy wielokomórkowe, skupiska w postaci kłaczków i kuleczek, a także tendencja do obrastania przewodów i innych elementów bioreaktora,

• niekorzystna relacja pomiędzy wzrostem drobnoustrojów a tworzeniem niektórych produktów metabolizmu syntetyzowanych przez komórki nie rosnące,

• niedostateczna znajomość dynamicznych

właściwości drobnoustrojów w hodowli ciągłej.

Parametry procesu biosyntezy

i ich kontrola

Parametry procesu mikrobiologicznego

Charakterystyka materiału mikrobiologicznego 1. Ilość biomasy stężenie suchej masy, gęstość komórek (ogółem lub żywych), wilgotna biomasa lub jej objętość. gęstość optyczna: pomiar nefelometryczny 2. Morfologia komórek 3. Wiek komórek, struktura wieku komórek w

populacji 4. Potencjał metaboliczny (maksymalna aktywność

metaboliczna)

5. Stan fizjologiczny komórek: szybkość wzrostu, szybkość przyswajania substratu, szybkość tworzenia produktu, szybkość oddychania 6. Parametry molekularne komórek: - DNA/ RNA. białko ogółem, - poziom określonych enzymów, - stosunek NAD + /NADH, - potencjał energetyczny 7. Mutacje i zakażenia

Charakterystyka podłoża

(chemiczna i fizykochemiczna)

źródło węgla i energii

źródło azotu

źródło fosforu

inne związki mineralne i organiczne

prekursory

produkty

pH

potencjał redox

pO2

temperatura

ciśnienie,

lepkość,

piana,

pobór mocy,

objętość cieczy,

szybkość mieszania,

szybkość napowietrzania,

szybkość dozowania roztworów,

Warunki operacyjne (fizyczne)

Relacje pomiędzy grupami parametrów procesu biosyntezy

Parametry sterowane

Warunki procesowe

Wyniki

Relacje pomiędzy grupami parametrów procesu biosyntezy

Parametry sterowane

Warunki procesowe

Wyniki

Schemat podstawowych układów pomiarowo-regulacyjnych w bioreaktorze

Jak to wygląda w praktyce?

http://biotechnologia.pl/produkty/aparatura/bioreaktory-laboratoryjne-i-w-skali-pilotazowej-kontrola-biotechnologicznych-i-innych-procesow-przemyslowych

http://www.frings.com/PROREACT-B-Large-Scale.181+M5973b220f5b.0.html

Bioreactor line (30, 100, 1000 liters) for production of substances

Industrial process automation

Problemy do rozwiązania

• W której fazie rozwoju hodowli biosyntezowany jest idiolit?

• Czy w związku z tym opłacalne jest dodawanie do podłoża hodowlanego stymulatorów wzrostu szczepu?

• Czy opłacalne jest stosowanie prekursora biosyntezy idiolitu?

• Czy warto zmodyfikować metodę hodowli np. hodowlę okresową zastąpić hodowlą z dożywianiem lub półciągłą?

• Czy zastosowano właściwe źródło węgla?

• Jaki jest optymalny czas hodowli?

• Jaka jest szybkość (wydajność) wzrostu szczepu na zastosowanym podłożu?

Specyficzna szybkość wzrostu

N1

N2

t1 t2

lnN2/N1 K= t2-t1

Optymalizacja procesu biotechnologicznego

Optymalizacja szczepu

• mutageneza (?)

• fuzja i odnawianie

protoplastów

• metody i strategie

inżynierii genetycznej

Optymalizacja warunków procesu

•składu podłoża hodowlanego

składniki odżywcze, promotory

wzrostu, prekursory biosyntezy,

substancje pomocnicze i inne

•warunków fizycznych procesu

czas, temperatura, napowietrzanie

i inne

Optymalizacja procesu biotechnologicznego -metody

• Metoda OFAT (one factor at time)

010203040506070

Co

ba

lam

ine

in

m

yc

eli

um

(u

g g

-1)

Co2+ in medium (ug ml-1)

Wpływ stężenia kobaltu (II) na biosyntezę witaminy B12

Wpływ stężenia betainy na biosyntezę witaminy B12

0

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5

Co

ba

lam

ine in

m

yc

eli

um

(u

g g

-1)

choline in medium (mg ml-1)

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6

Co

ba

lam

ine in

m

yc

eli

um

(u

g g

-1)

betain in medium (mg ml-1)

Wpływ stężenia betainy na biosyntezę witaminy B12

Co się stanie, jeżeli do podłoża wprowadzimy 30mg Co(II), 4 mg

betainy oraz 2 mg choliny?

Czy uzyskamy lepszy efekt?

Brak odpowiedzi !!!

Metody Powierzchni Odpowiedzi (RSM - Response Surface

Methodology) – uwzględniają interakcje pomiędzy czynnikami Metoda macierzy ortogonalnej, Centralny plan kompozycyjny (CCRD)

Metoda sieci neuronowych, inne

Wykresy powierzchni odpowiedzi i odpowiadające im wykresy warstwicowe. Na każdym wykresie uwidoczniony jest łączny wpływ dwóch zmiennych niezależnych na wydajność grzybni H. erinaceum;

pozostałe dwie zmienne niezależne przyjmują wartości odpowiadające ich punktom centralnym

Dane zamieszczone w tab oraz kształt krzywych na wykresach konturowych sugerują, że zarówno na wzrost grzybni, jak i na produkcję EPS znaczący wpływ miały silne interakcje występujące pomiędzy wyciągiem słodowym i WNK. Wzrost grzybni był w znacznym stopniu uzależniony od wzajemnych interakcji pomiędzy WNK i CaCl2, natomiast dla biosyntezy IPS najbardziej znaczący był łączny efekt oddziaływania WNK i CaCl2, WNK i MgSO4·7H2O, a także CaCl2 i MgSO4·7H2O.