Biokatalizatory - Politechnika Gdańska · 2014-12-02 · Przedmiot: Podstawy Biotechnologii...

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Wykład 4 – Biokataliza. Zastosowanie enzymów w procesach przemysłowych

Biokatalizatory:

Enzymy – zbudowane z aminokwasów (białka)

Rybozymy – zbudowane z rybonukletydów (RNA)



Enzymy są „superkatalizatorami”

• niezwykle duża efektywność katalizy

• wysoka aktywność katalityczna w umiarkowanych warunkach

• swoistość reakcji

• specyficzność substratowa

• stereospecyficzność

• praktycznie 100% wydajność; brak produktów ubocznych



Siła katalityczna enzymów jest zdumiewająca



SWOISTOŚĆ SUBSTRATOWAL-asparaginaza EC 3.3.1.1

Substrat

Aktywność względna

KM × 105 (M)

V

L-asparagina

100

1

0.965

D-asparagina

5

6200

0.177

Amid kwasu bursztynowego

20

1500

0.240

Diamid kwasu bursztynowego

0

-

-



Stereospecyficzność działania enzymów



Dlaczego enzymy są tak efektywnymi katalizatorami?

-grupy funkcyjne w centrum aktywnym

-hydrofobowy charakter centrum aktywnego

-współdziałanie koenzymów

-kataliza kwasowo-zasadowa

-maksymalne zbliżenie i optymalne ustawienie substratu(ów)

-wzbudzone dopasowane enzymu



Centrum aktywne

Struktura kompleksu enzym-substrat

Centrum aktywne może obejmowaćreszty aminokwasowe odlegle od siebiew sekwencji aminokwasowej enzymu

Centrum aktywne

Centrum aktywne może obejmować resztyodległe od siebie w sekwencji aminokwasowejłańcucha polipeptydowego

W centrum aktywnym znajdują się reszty wiążącesubstrat (ew, także koenzym) oraz reszty katalityczne

Kompleksenzym:substrat



Niektóre enzymy potrzebują pomocników...

Koenzym – niewielka cząsteczka organiczna współpracującaz cząsteczką enzymu podczas aktu katalitycznego,której obecność jest niezbędna dla katalizy.Koenzym wiąże się z enzymem tylko w trakcieaktu katalitycznego

Grupa prostetyczna – cząsteczka organiczna lub jon metaluniezbędna dla działania enzymu,połączona trwale z cząsteczka enzymu



Szybkość reakcji enzymatycznejEnzym, podobnie jak każdy inny katalizator, przyśpiesza reakcję,ale nie zmienia jej stanu równowagi.

Enzymy katalizują jedynie reakcje termodynamicznie możliwe, czyli takie, dla których ∆G≤0.Uwaga: enzymy w komórkach mogą katalizować reakcje, dla których

∆G°>0. Warunek: sprzężenie z reakcją, dla której ∆G°<0.

Warunkiem zajścia reakcji jest efektywne zderzenie cząsteczek(cząsteczki muszą posiadać odpowiednią energię oraz być odpowiednio ustawione względem siebie)

Najmniejsza energia, którą należy dostarczyć molowi substratów,aby każda z cząsteczek stała się reaktywna – energia aktywacji

Szybkość reakcji zależy od energii aktywacji układu.v = f (∆G*)



Enzymy obniżają energię aktywacji układu



Enzym wiążąc substrat przyjmuje konformację komplementarną do stanu przejściowego



Indukowane dopasowanie enzymu

Konformacja heksokinazy zmienia się w wyniku związania substratuIndukowane dopasowanie substratu



Enzym przyciąga substrat do centrum aktywnego

Rozkład potencjału elektrostatycznego wokółenzymu – dysmutazy nadtlenkowejPokazano obszary potencjału dodatniego i ujemnego.Substrat: O2

-. jest naładowany ujemnie

Sposoby oddziaływań elektrostatycznychenzymu z substratem

Efekt Kirke



Wykres zależności szybkości reakcji katalizowanej przez enzym od stężenia substratu ma kształt hiperboliczny

][][SK

SVvM +

=



Czynniki wpływające na aktywność enzymu

• temperatura•odczyn środowiska•potencjał redoks

T

v

∆ [P]

50 Co

70 Co

80 Co

tt 1 2t

v

T

t 1

2t

Zależność aktywności enzymuod temperatury

Zależność aktywnościenzymu od pH

Kształt wykresu v = f(T) może się zmieniać w zależności od momentu pomiaru



Wytwarzanie enzymów

Dwa rodzaje procesów technologicznych, zasadniczo różniące sięwarunkami:

1. Enzymy wytwarzane w dużych ilościach, głównie dla celówprzemysłowych, tylko częściowo oczyszczone (bulk enzymes)

2. Enzymy wytwarzane w niewielkich ilościach, dla celów terapeutycznych i naukowych, o wysokim stopniu czystości

Obecne tendencje w produkcji enzymów:

1. Zastępowanie enzymów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego przezenzymy rekombinowane, wytwarzane przez drobnoustroje w warunkachnadprodukcji

2. Wprowadzanie enzymów pochodzących z komórek drobnoustrojówekstremofilnych

3. Zastosowanie inżynierii białka – enzymy o zmienionych właściwościach



Schemat technologiczny wytwarzania enzymutypu „bulk”



Enzymy proteolityczne w przemyśle

Usuwanie zmętnienia piwa, kruszenie mięsa

Wytwarzanie serów

Kruszenie mięsa, zastosowania medyczne

Kruszenie mięsa, piekarnictwo, piwowarstwoSerowarstwo

Środki piorące, usuwanie żelatyny

Papaya latex

Żołądki cielęce, białko rekombinowane

Jelita zwierzęce

Aspergillus oryzaeAspergillus niger

Mucor pusillusRhizomucor mieheiCryptonectria parasitica

Bacillus subtilis

Hydroliza białek

Ścinanie mleka

Hydroliza białek

Hydroliza białek

Hydroliza białek

Papaina

Renina

Trypsyna, chymotrypsyna

Proteazy grzybowe

Proteazy bakteryjne

ZastosowanieŹródło enzymuReakcja lub substrat

Enzym



Hydroliza skrobi

Hydroliza celulozydo celobiozy

Otrzymywanie cukrów prostych z disacharydów

Analityka medycznaUsuwanie cukru z produktów jajecznychUsuwanie O2 z majonezu i sokówOtrzymywanie słodkichsyropów

Bacillus subtilisAspergillus oryzae

Trichoderma virideAspergillus niger

Aspergillus spp.Sacharomyces

Aspergillus niger

Streptomyces spp.Lactobacillus brevis

Hydroliza wiązańα(1→4) glikozydowych

Hydroliza wiązańβ(1→4) glikozydowych

laktozasacharoza

Glukoza + O2 →Glukonolakton + H2O2

Glukoza → Fruktoza

Amylaza

Celulaza

β-galaktozydaza;sacharaza;β-glukoozydaza

Oksydaza glukozowa

Izomeraza ksylozowa

ZastosowanieŹródło enzymu

Reakcja lub substrat

EnzymEnzymy metabolizujące węglowodany w przemyśle



Inne enzymy znajdujące zastosowanie w przemyśle

Enzym Zastosowanie

Izomeraza 11βsterydowa Biotransformacja sterydów

Aminoacylaza Otrzymywanie optycznie czynnych aminokwasów

Penicylinaza Otrzymywanie kwasu 6AP

Hydrataza nitrylowa Synteza aminokwasów

Lipaza Hydroliza triacyloglicerydów

Pektynaza Klarowanie soków



Immobilizacja enzymów

Metody immobilizacji a) Adsorpcja na powierzchni nośnika (alumina, hydroksyapatyt, kaolinit

szkło, matryce jonowymienne);b) Wiązanie kowalencyjne z nośnikiem (poliakrylamid, nylon, celuloza,

dekstran, Sephadex, Sepharose, Agarose, żel krzemionkowy, kulki szklane). Konieczna aktywacja nośnika;

c) Uwięzienie w matrycy- akrylamid polimeryzowany w roztworze enzymu- żele tworzone in situ w roztworze enzymu;

d) Kapsułkowanie w membranie półprzepuszczalnejliposomy, kapsułki nylonowe,

celofanowe, celuloidowe, poliuretanowe

e) Sieciowanie międzycząsteczkoweCzynniki sieciujące:

aldehyd glutarowy, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen;.




Metody kowalencyjnejimmobilizacji enzymów




Immobilizacja enzymu z zastosowaniem molekularnego wysięgnika

1 – immobilizacja bez wysięgnika; 2 - immobilizacja z użyciem krótkiego wysięgnika;3 – immoblizacja z użyciem długiego wysięgnika; 4 – wysięgnik zbyt długi;5 – immobilizacja wielopunktowa; 6, 7, 8 – relacja wysięgnik:centrum aktywne Immobilizowanego enzymu




Otrzymywanie sol-żeli z zastosowaniem różnych dodatków oraz metod suszenia

Sol-żele: żele nieorganiczneOtrzymywane głównie z tlenków krzemu, tytanu, cyrkonu, glinui glinokrzemianów

Większe możliwości – alkoksydySi(OR)4 i alkoksysilanyXSi(OR)3 oraz XX’Si(OR)2

Aerożele – wysuszane przez usunięcie płynu w stanie nadkrytycznym (CO2 – Tk = 31°C)Ambiżele – z materiałów zawierających dużą liczbę grup hydrofobowych




Schemat immobilizacji enzymów w hydrożelach: a) alginianie wapnia; b) karagenianie




Schemat silanizacji szkła oraz immobilizacji enzymów po uprzedniej funkcjonalizacjipodstawników silanowych



Immobilizacja enzymówPrzykłady procesów przemysłowych prowadzonych

z użyciem immobilizowanych enzymów

Otrzymywanie 6-APA

Uwięzienie w matrycy

Poloakrylamid, celuloza

Amidaza penicylanowa

Oznaczanie glukozyKapsułkowanieOksydaza glukozowaPeroksydaza

Otrzymywanie mleka wolnego od laktozy

AdsorpcjaKrzemionkaβ-galaktozydaza

Otrzymywanie aspartamu

Układ dwufazowyTermolizyna

Otrzymywanie syropu fruktozo-glukozowego

AdsorpcjaAmberlit IRA904Izomerazaglukozowa

Otrzymywanie L-aminokwasów

AdsorpcjaDEAE-SephadexAminoacylaza

ZastosowanieMetoda immobilizacji

Matryca Enzym



Biokataliza w rozpuszczalnikach organicznych

Charakterystyka biokatalizy dwufazowej w układzie woda/rozpuszczalnik organiczny

Potencjalne zalety:-wysoka rozpuszczalność substratu i produktu-zmniejszenie możliwości inhibicji przez produkt lub nadmiar substratu-ułatwione wyodrębnienie produktu i odzysk biokatalizatora-wysoka rozpuszczalność gazów w rozpuszczalnikach organicznych-korzystne przesunięcie równowagi reakcji

Potencjalne wady:-możliwa denaturacja i.lub inhibicja biokatalizatora przez rozpuszczalnik organiczny-zwiększona złożoność reakcji




prof. Ernest Sym

zapoczątkował na PG badania w dziedzinie biotechnologii; światowy pionier badańnad katalizą enzymatycznąw układach niewodnych.




Biokompatybilne rozpuszczalniki organiczne

Kryterium – wartość parametru Hanscha - log Poct - współczynnik podziałuw układzie n-oktanol/woda

Rozpuszczalniki charakteryzujące się log Poct <2 są uważane za nieprzydatne dobiokatalizy; log Poct = 2 ÷ 4 – biokompatybilność pośrednia i zmienna; log Poct > 4 rozpuszczalniki biokompatybilne

Przykłady: n-dekanol 4,0 n-heptan 4,0n-dodekanol 5,0 n-nonan 5,1eter difenylowy 4,3 n- undekan 6,1benzoesan pentylu 4,2oleinian butylu 9,8ftalan dibutylu 5,4




(a) dwufazowa emulsja wodyw oleju

(b) dwufazowa emulsja olejuw wodzie

(c) enzym immobilizowany na porowatym nośniku w układzie dwufazowym

(d) enzym w odwróconej miceli(e) kowalencyjnie zmodyfikowany

enzym (np. glikolem polietylenowym) w rozp. org.

(f) immobilizowany enzym rozpuszczony w rozp. org.

(g) sproszkowany enzym rozpuszczony w rozp. org.



Biokataliza w innych układach

Układ faza stała/faza gazowaBrak problemów z przenikaniem masyKataliza z udziałem enzymów takich jak: dehydrogenaza alkoholowa, oksydaza alkoholowa, lipazy. Reakcje – synteza związków lotnych, jak aldehydy, estry, ketony

Reakcje w cieczach nadkrytycznychDuże szybkości przenikania masy i łatwe wyodrębnianie produktów. Aparatura wysokociśnieniowa

Stosuje się głównie ditlenek węgla (Tk = 31°C). Reakcje dotyczące związków hydrofobowych, m.in. utlenianie cholesterolu przez oksydazę cholesterolową, stereoselektywne hydrolizy estrów przez immobilizowane lipazy, syntezy dipeptydówz użyciem enzymów proteolitycznych

Biokataliza w cieczach jonowychSole nie krystalizujące w temperaturze pokojowej (kation 1,3-dialkiloimidazoliowy lub N-alkilopirydyniowy i anion BF4

-, BF6- lub NO3

-. Wiele enzymów wykazuje trwałośćw cieczach jonowych, a nawet korzystniejsze właściwości (dotyczy to m.in. lipaz)



Działanie fosfolipaz na fosfatydylocholinę

Przykłady zastosowań

Schemat procesu usuwania fosfolipidów z olejów (odśluzowywanie)




Schemat produkcji syropu glukozowegoE1 – alfa amylaza, E2 - glukoamylaza




Reakcje katalizowane przez monooksygenazy wykorzystywanedo biotransformacji w praktyce przemysłowej

(a) hydroksylowanie alkanów

(b) hydroksylowane arenów

(c) epoksydacja alkenów

(d) utlenianie heteroatomów

(e) utlenianie ketonów do estrów




Biokatalityczna synteza optycznie czynnych aminokwasów

NHC(O)R1

R

O

OHNH2

R

O

NH2

NHR1

R

O

OR2

CO2H

NH2RH

R OH

O ROH

O

O

Acylaza Amidaza Esterazalub proteaza

liaza dehydrogenaza

addycja amoniaku do podwójnego wiązania

redukcyjne aminowanie




ZASTOSOWANIE ENZYMÓW DO OTRZYMYWANIAOPTYCZNIE CZYNNYCH AMINOKWASÓW

C CCOOHH

HHOOCNH3

H2N

COOH

CH2COOHH

L

LH2N

COOH

CH2H

NH3 C CCOOHH

H

+

+

aspartaza

amoniako-liazafenyloalaninowa

synteza chemiczna

NAc-DL-aminokwas

aminoacylazaz Aspergillus oryzae

NAc-D-aminokwas

L-aminokwas + CH3COO-

racemizacja

Biosynteza optycznie czynnych aminokwasów białkowych




ZASTOSOWANIE ENZYMÓW DO OTRZYMYWANIAOPTYCZNIE CZYNNYCH AMINOKWASÓW

H

hydantoinazaNH

N

O

OH

DL

racemizacja, pH 8

N

OOH

ONH2

D

NH

N

O

OH

L

amidohydrolaza D

NH2

OOH

Synteza/biosynteza optycznie czynnych pochodnych glicyny – substratów dla otrzymywania penicylin półsyntetycznych


Wykład 3 – Procesy biotechnologiczneWykład 4 – Biokataliza. Zastosowanie enzymów w procesach przemysłowych


Alternatywne możliwości otrzymywania 6APA z penicyliny G




Wytwarzanie kwasu 6-aminopenicylanowego (6APA)

Warunki hydrolizy enzymatycznejBiotransformacja 12-15% (w/v) roztworu soli penicyliny G lub V przez immobilizowaną amidazę penicylinową. Podczas reakcji utrzymuje się pHna poziomie 7 – 8 poprzez dodawanie KOH, NaOH lub wody aminiakalnej. Produkty: 6APA oraz odpowiedni kwas (fenylooctowy lub fenoksyoctowy). 6APA izoluje się poprzez zakwaszenie mieszaniny poreakcyjnej do pH = 4.0 w obecności rozpuszczalnika organicznego nie mieszającego się z wodą. W tych warunkach 6APA wytrąca się,a kwas prekursorowy przechodzi do fazy organicznej i jest zwykle zawracanyjako dodatek do nowej fermentacji

Korzyści z zastąpienia chemicznej hydrolizy penicyliny G do 6APA przez hydrolizę enzymatyczną

Eliminacja chlorowcowanych rozpuszczalników organicznych, toksycznych odczynników i odpadów oraz potrzeby stosowania ciekłego azotu do chłodzenia;prowadzenie reakcji w umiarkowanych warunkach; łatwa kontrola pH, temperatury;zwiększenie wydajności, brak produktów ubocznych;




Synteza aspartamu z zastosowaniem biotransformacji enzymatycznej




Biotransformacje sterydów

Biokatalizatory - Politechnika Gdańska · 2014-12-02 · Przedmiot: Podstawy Biotechnologii...

Documents

Transcript of Biokatalizatory - Politechnika Gdańska · 2014-12-02 · Przedmiot: Podstawy Biotechnologii...