UNIWERSYTET RZESZOWSKI

AUTOREFERAT PRACY DOKTORSKIEJ

Roman Maślanka

Wpływ glukozy i jej metabolizmu na stan fizjologiczny,

potencjał reprodukcyjny i długość życia komórek

drożdży Saccharomyces cerevisiae

Promotor: dr hab. Renata Zadrąg-Tęcza, prof. UR

Promotor pomocniczy: dr Magdalena Kwolek-Mirek

Recenzenci:

Prof. dr hab. Janusz Maszewski, Uniwersytet Łódzki

Dr hab. Marek Skoneczny, IBB PAN

Dziedzina nauk ścisłych i przyrodniczych

Dyscyplina: nauki biologiczne

RZESZÓW 2019

2

Spis treści

1. Wprowadzenie .................................................................................................................... 3

2. Cel i zakres pracy ............................................................................................................... 5

3. Materiały i metody ............................................................................................................. 5

4. Struktura rozprawy doktorskiej .......................................................................................... 7

5. Wyniki badań ...................................................................................................................... 9

6. Podsumowanie .................................................................................................................... 18

Bibliografia ............................................................................................................................. 18

3

1. Wprowadzenie

Glukoza jest cząsteczką o niezwykle istotnym znaczeniu dla prawidłowej aktywności

komórek większości organizmów. Powszechnie uważa się ją za podstawowy substrat

energetyczny, bowiem wewnątrzkomórkowe procesy metaboliczne bazują na związkach

będących pochodnymi tej cząsteczki. Glukoza zapewnia także szkielet węglowy

wykorzystywany do biosyntezy makromolekuł komórki. Powoduje to konieczność ścisłego

wykrywania jej poziomu w otoczeniu komórki, o czym świadczy obecność szeregu

komórkowych białek spełniających m.in. rolę błonowych transporterów czy sensorów

glukozy (Magier i Jarzyna, 2013; Rødkaer i Faergeman, 2014). Jest to szczególnie widoczne

w przypadku organizmów jednokomórkowych, w tym drożdży Saccharomyces cerevisiae,

u których zmiana dostępności glukozy w środowisku determinuje sposób pozyskiwania

energii. Przy czym komórki drożdży preferencyjnie uzyskują energię na drodze fermentacji

alkoholowej, nawet w sytuacji pełnej dostępności tlenu w środowisku, co zwane jest efektem

Crabtree (Rodrigues i in., 2006). Ten swoisty paradoks energetyczny (preferencyjne

uzyskiwanie energii na drodze glikolizy w warunkach tlenowych) poza komórkami drożdży

obserwowany jest także w przypadku innych intensywnie proliferujących komórek w tym

komórek nowotworowych (Vander Heiden i in., 2009; Diaz-Ruiz i in., 2011) oraz komórek

macierzystych (Rafalski i in., 2012; Hu i in., 2016).

Glukoza jest przedmiotem wielu badań m.in. pod kątem jej wpływu na sprawność

fizjologiczną i długość życia szeregu organizmów (Lee i in., 2017). Prowadzone w tym

zakresie badania koncentrują się głównie wokół zagadnień związanych z ograniczeniem

podaży glukozy czyli z tzw. restrykcją kaloryczną (CR – ang. calorie restriction) (Roth

i Polotsky, 2012; Fontana i Partridge, 2015). Choć pozytywny wpływ CR na poprawę

sprawności fizjologicznej organizmów wydaje się być niekwestionowany (Fontana

i Partridge, 2015; Mattison i in., 2017), to jej wpływ na długość życia organizmów wydaje się

być sprawą mniej oczywistą i wciąż stanowiącą przedmiot dyskusji naukowej (Colman i in.,

2009; Austad, 2012; Mattison i in., 2012; Biliński i in., 2015). Szczególnie istotnych

obserwacji dotyczących CR dostarczyły badania prowadzone na małpach z rodzaju Rhesus

(Colman i in., 2009; Mattison i in., 2012). Okazało się w nich, że dostarczanie składników

odżywczych na zasadzie ad libitum, czyli nieograniczonego dostępu do pokarmu, może być

rozpatrywane jako stan nadmiaru kalorii (Colman i in., 2009; Austad, 2012; Mattison i in.,

2012). Nadmiar kalorii (CE – ang. calorie excess) oznacza stan, w którym ilość dostarczanych

4

składników odżywczych jest wyższa niż wynika to z rzeczywistego zapotrzebowania

energetycznego organizmu (Biliński i in., 2015). Kwestie nadmiaru kalorii nie są w pełni

poznane, w tym znacząco mało danych można znaleźć w odniesieniu do konsekwencji

nadmiaru kalorii obserwowanych na poziomie komórkowym. Analiza tego typu wydaje się

być szczególnie istotna ze względu na coraz częściej pojawiające się problemy związane

z nadmiarem glukozy dostarczanej organizmowi i zaburzeniami jej metabolizmu, zwłaszcza

w kontekście negatywnych zmian wywołanych otyłością czy cukrzycą typu 2.

W badaniach analizujących wpływ restrykcji kalorycznej na funkcjonowanie komórki

jako jeden z modeli badawczych wykorzystuje się komórki drożdży S. cerevisiae. Badania te

dotyczą głównie wpływu warunków CR na sprawność fizjologiczną i replikacyjną długość

życia komórek drożdży (Lin i in., 2002; Sharma i in., 2011; Schleit i in., 2013). Niemniej

jednak niewiele jest danych dotyczących zmian wywołanych działaniem nadmiaru kalorii,

wynikającym z wysokich stężeń glukozy w podłożu hodowlanym. Obecnie istnieją tylko

ograniczone dane pokazujące wpływ wysokiego stężenia glukozy na wybrane aspekty

fizjologii komórek drożdży (Weinberger i in., 2010; Zuin i in., 2010).

Przyjmuje się, że wyrazem sprawności fizjologicznej komórki są jej możliwości

proliferacyjne, bowiem proliferacja wymaga pełnej synchronizacji procesów metabolicznych

i znacznych nakładów inwestycyjnych. Zjawisko ograniczonej zdolności proliferacyjnej poza

komórkami ssaczymi (Tschen i in., 2009; Gunin i in., 2011), notowane jest także dla

pojedynczych komórek drożdży S. cerevisiae. Ich ograniczone możliwości reprodukcyjne

tłumaczy się biorąc pod uwagę różnorodne czynniki, w tym gromadzenie agregatów

białkowych, wzrost liczby pozachromosomalnych kółek rDNA czy akumulację uszkodzonych

mitochondriów (Smith i in., 2015). Alternatywnym wyjaśnieniem tej kwestii jest hipoteza

hipertrofii odnosząca się do relatywnie dużych rozmiarów uzyskiwanych przez komórki,

które zakończyły proliferację (Zadrag-Tecza i in., 2009; Biliński i in., 2012). Wskazuje ona

na istnienie ścisłego związku pomiędzy tempem wzrostu wielkości komórek a ich

możliwościami reprodukcyjnymi (Zadrag-Tecza i in., 2009; Biliński i in., 2012; Bilinski

i Zadrag-Tecza, 2017). Tempo przyrostu wielkości komórki a co za tym idzie szybkość

osiągania postulowanego stanu hipertrofii zależy od przebiegu procesów metabolicznych,

w tym procesów warunkujących możliwości biosyntetyczne komórki. Te z kolei mogą być

modyfikowane zarówno przez czynniki genetyczne jak też warunki środowiskowe, spośród

których szczególnie istotna wydaje się być dostępność składników odżywczych.

5

2. Cel i zakres pracy

Głównym celem badań było określenie wpływu glukozy i zmian jej stężenia na szeroko

pojęty stan fizjologiczny, metabolizm, potencjał reprodukcyjny i długość życia komórek

drożdży S. cerevisieae.

Postawiono hipotezę, zgodnie z którą różne stężenia glukozy, poprzez modyfikację

procesów metabolicznych, zmieniają potencjał reprodukcyjny komórek drożdży i regulują

długość ich życia. Dodatkową hipotezą było założenie, że wysoki poziom glukozy, będący

odpowiednikiem warunków nadmiaru kalorii, jest czynnikiem zaburzającym funkcjonowanie

komórek drożdży S. cerevisieae.

Dla realizacji wyznaczonych celów sformułowano określone zadania:

przedstawienie dotychczasowego stanu wiedzy na temat roli glukozy w odniesieniu do

metabolizmu komórki jak i funkcjonowania organizmu człowieka

opracowanie warunków eksperymentalnych umożliwiające porównanie komórek

drożdży wykazujących podobny typ metabolizmu niezależnie od stężenia glukozy

określenie konsekwencji wynikających z wpływu różnych stężeń glukozy na parametry

morfologiczne, stan fizjologiczny oraz możliwości biosyntetyczne komórek drożdży

analiza zdolności reprodukcyjnej i długości życia komórek drożdży w warunkach

różnego stężenia glukozy

zaproponowanie koncepcji wyjaśnienia związku między zależnymi od stężenia glukozy

zmianami metabolicznymi, możliwościami biosyntetycznymi a potencjałem

reprodukcyjnym komórki

3. Materiały i metody

W celu wieloaspektowej analizy wpływu glukozy na komórkę w badaniach

zastosowano układ eksperymentalny konfrontujący dwa czynniki tj. zarówno zmienne

genetyczne (zastosowanie szczepów drożdży pozbawionych wybranych genów biorących

udział w wykrywaniu i sygnalizacji zależnej od glukozy) jak i zmienne środowiskowe (różne

stężenia glukozy w podłożu hodowlanym). Materiał badawczy stanowiły komórki drożdży

Saccharomyces cerevisieae reprezentujące głównie tło genetyczne BY4741 (szczep dziki; WT

ang. wild type) oraz izogeniczne względem niego szczepy pozbawione wybranych genów

związanych z metabolizmem glukozy (Δgpa2; Δgpr1 oraz Δhxk2).

6

Jako podłoże hodowlane wykorzystywano podłoże YPD ze zmiennymi stężeniami

glukozy (0,5% - warunki restrykcji kalorycznej; 2% - warunki optymalne; 4% - warunki

nadmiaru kalorii).

Właściwą fazę badań poprzedziły analizy wstępne, dotyczące m.in. czasu prowadzenia

hodowli na poszczególnych podłożach, których celem było wykluczenie porównywania

komórek wyjściowo różniących się typem metabolizmu, bądź też znajdujących się

w warunkach, które mogłyby zainicjować odpowiedź na stres. Czas prowadzenia hodowli

został wybrany m.in. na podstawie analizy szybkości zużywania glukozy i produkcji etanolu.

Analizy rozpoczęto od określenia tempa pobierania glukozy, w tym celu zastosowano

(po raz pierwszy w przypadku określenia tempa pobierania glukozy w komórkach drożdży)

fluorescencyjny analog glukozy 6-NBDG. Użycie analogu glukozy 6-NBDG pozwoliło

dodatkowo na zobrazowanie i dokładne scharakteryzowanie zjawiska autofluorescencji

w komórkach drożdży, która ma znaczenie dla interpretacji wyników uzyskanych za pomocą

barwników fluorescencyjnych.

Stan fizjologiczny oraz parametry morfologiczne komórek drożdży hodowanych na

podłożach zawierających różne stężenia glukozy, oznaczono przy pomocy: testów

wzrostowych (wzrost komórek drożdży na podłożu stałym i płynnym); fluorymetrycznych

i fluorescencyjnych analiz żywotności i witalności komórek drożdży z wykorzystaniem

barwienia różnicującego z dioctanem fluoresceiny i jodkiem propidyny oraz przy użyciu

sondy fluorescencyjnej FUN-1; fluorescencyjnej wizualizacji struktury sieci mitochondrialnej

z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Rodamina B oraz fluorymetrycznej analizy

potencjału błonowego mitochondriów przy zastosowaniu barwnika Rodamina 123; pomiarów

morfometrycznych komórek na podstawie zdjęć mikroskopowych, dzięki którym określono

wielkość komórek drożdży w populacji; analizie zawartości suchej masy, pozwalającej na

oznaczenie biomasy komórki.

Zmiany biochemiczne i metaboliczne, wynikające z różnego stężenia glukozy

w podłożu hodowlanym, oceniane były na podstawie: analiz poziomu generacji reaktywnych

form tlenu (RFT) (generację RFT określono mierząc kinetykę przyrostu fluorescencji

z wykorzystaniem sond fluorescencyjnych: dihydroetydyny (DHET) i dioctanu 2',7'-

dichlorodihydrofluoresceiny (H2DCF-DA) a poziom generacji RFT oznaczono zarówno dla

komórek kompletnych (rho+) jak i niekompletnych oddechowo (rho

0)); analiz poziomu ATP;

aktywności enzymów szlaku pentozofosforanowego oraz oznaczeń całkowitej, zredukowanej

oraz utlenionej puli NADP(H).

7

W ostatnim etapie dokonano analizy potencjału reprodukcyjnego oraz całkowitej

długości życia komórek drożdży. Potencjał reprodukcyjny określono przy użyciu

mikromanipulatora analizując liczbę wytworzonych pączków przez pojedyncze komórki

„matki”. Natomiast czas życia komórek drożdży został oznaczony dzięki wprowadzeniu do

podłoża przyżyciowego barwnika – floksyny B, zgodnie z metodyką opisaną przez (Minois

i in., 2005) z późniejszymi modyfikacjami (Zadrag i in., 2008). Wszystkie eksperymenty,

wykonano w co najmniej trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych.

Analizy statystyczne wykonano z wykorzystaniem programu STATISTICA 10.0.

Istotność statystyczną obserwowanych różnic oceniono przy zastosowaniu jednoczynnikowej

analizy wariancji (one-way ANOVA) i testów post-hoc (testu Dunnetta oraz testu Tukeya).

Korelację między wynikami wybranych parametrów określono poprzez obliczenie

współczynnika korelacji Pearsona, a w przypadku wielkości komórek skorzystano również

z hierarchicznej analizy skupień. Ponadto względem potencjału reprodukcyjnego i wielkości

komórek w populacji wykorzystano metodę histogramu w celu prezentacji rozkładu wartości

uzyskanych wyników. Dla uzyskanych wyników przyjęto poziom istotności p < 0,05.

4. Struktura rozprawy doktorskiej

Rozprawa doktorska obejmuje cykl 4 publikacji naukowych, których sumaryczny IF

(wg roku opublikowania) jest równy 8,233, natomiast liczba punktów MNiSW (zgodnie

z danymi podanymi w PBN) wynosi 95.

1. Maślanka R., Zadrąg-Tęcza R. (2017) Glukoza - substancja o istotnym znaczeniu dla

prawidłowego funkcjonowania komórki i organizmu. [W]: Wybrane substancje

o znaczeniu biologicznym. Spojrzenie młodych naukowców. Monografia 2017, red.

Magdalena Kwolek-Mirek, Mateusz Mołoń, Kraków: Creativetime, 108-115. ISBN 978-

83-63058-78-4.

liczba punktów MNiSW2017 – 5

2. Maslanka R., Kwolek-Mirek M., Zadrag-Tecza R. (2017) Consequences of calorie

restriction and calorie excess for the physiological parameters of the yeast Saccharomyces

cerevisiae cells. FEMS Yeast Research. 17(8):fox087. IF2017 – 2,609; IF5-letni – 3,022; liczba punktów MNiSW2017 – 30

3. Maslanka R., Kwolek-Mirek M., Zadrag-Tecza R. (2018) Autofluorescence of yeast

Saccharomyces cerevisiae cells caused by glucose metabolism products and its

methodological implications. Journal of Microbiological Methods. 146: 55-60. IF2017 – 1,701; IF5-letni – 1,961; liczba punktów MNiSW2017 – 25

8

4. Maslanka R., Zadrag-Tecza R. (2019) Less is more or more is less: implications of

glucose metabolism in the regulation of the reproductive potential and total lifespan of the

Saccharomyces cerevisiae yeast. Journal of Cellular Physiology. doi: 10.1002/jcp.28386;

dostępny on-line: 25 luty 2019.

IF2017 – 3,923; IF5-letni – 3,830; liczba punktów MNiSW2017 – 35

W pierwszej pracy z zaprezentowanego cyklu (Maślanka i Zadrąg-Tęcza, 2017)

przedstawiono przegląd aktualnej wiedzy na temat wieloaspektowej roli glukozy w regulacji

parametrów fizjologicznych na poziomie komórki i organizmu, ze szczególnym

uwzględnieniem konsekwencji zaburzenia homeostazy glukozy, będących podłożem rozwoju

chorób metabolicznych. Praca ta napisana w języku polskim, ma charakter przeglądowy,

przez co w szerokim kontekście opisuje istotę badań dotyczących metabolizmu glukozy.

W drugiej pracy (Maslanka i in., 2017) scharakteryzowano metodyczne i techniczne

aspekty warunków eksperymentalnych, umożliwiających porównywanie zmian zachodzących

w komórkach drożdży hodowanych na podłożach zawierających różne stężenia glukozy.

W pracy ujęto wyniki charakteryzujące stan fizjologiczny i parametry morfologiczne

analizowanych komórek drożdży hodowanych na podłożach zawierających różne stężania

glukozy. Ponadto zaprezentowano wyniki dotyczące generacji reaktywnych form tlenu (RFT).

Ocenę zależności między poziomem generowania przez komórki RFT a stężeniem glukozy

w podłożu, uzupełniono o analizy poziomu generacji RFT dla komórek niekompletnych

oddechowo (rho0). Zastosowanie tego dodatkowego układu eksperymentalnego, dało

podstawę do wnioskowania, że w komórkach drożdży istnieją poza-mitochonrialne źródła

generacji RFT. W opisywanej pracy zaprezentowano również wyniki dotyczące tempa

pobierania glukozy uzyskane dzięki zastosowaniu fluorescencyjnego analogu glukozy 6-

NBDG.

Analizy sprawdzające poprawność uzyskiwanych wyników związanych z pierwszym

zastosowaniem analogu 6-NBDG w przypadku określenia tempa pobierania glukozy przez

komórki drożdży, pozwoliły na zobrazowanie i dokładne scharakteryzowanie zjawiska

autofluorescencji, co zostało przedstawione w 3 pracy wchodzącej w skład cyklu (Maslanka

i in., 2018). Poza identyfikacją tryptofanu, ryboflawiny i pirydoksyny jako głównych

fluoroforów odpowiedzialnych za zjawisko autofluorescencji w komórkach drożdży, praca

obejmuje również wyniki prezentujące znaczenie wpływu zjawiska autofluorescencji na

wartości i problemy interpretacyjne wyników uzyskiwanych za pomocą metod opartych na

barwnikach fluorescencyjnych.

9

W ostatniej pracy z cyklu (Maslanka i Zadrag-Tecza, 2019) przedstawiono wyniki

parametrów biochemicznych związanych z metabolizmem komórki i jego zmianami

wynikającymi z różnego stężenia glukozy w podłożu hodowlanym. Jednakże, istotną część

wyników zaprezentowanych w tej pracy były dane dotyczące wpływu różnych stężeń glukozy

na potencjał reprodukcyjny oraz długość życia komórek drożdży. Przy czym prezentowane

analizy długości życia, obejmowały całkowity czas trwania życia komórki drożdży wraz

z jego podziałem na czas trwania fazy reprodukcyjnej i post-reprodukcyjnej. Na podstawie

szczegółowych analiz uzyskanych wyników i szerokiego przeglądu literatury w ostatniej

pracy z cyklu zaprezentowano również modele prezentujące zmiany metabolizmu komórki

w zależności od stężenia glukozy oraz ich wpływ na wielkość i potencjał reprodukcyjny

komórek drożdży, przez co praca ta stanowi pewnego rodzaju syntetyczne podsumowaniem

prowadzonych analiz.

5. Wyniki badań

Analizując tempo pobierania glukozy wykazano, że było ono znaczono niższe

w komórkach szczepów pozbawionych genów związanych z metabolizmem glukozy

(tj. Δgpa2; Δgpr1 i Δhxk2) niż w komórkach szczepu dzikiego (Ryc. 1). Dało do podstawę do

wnioskowania, iż wewnątrzkomórkowe

stężenie glukozy w komórkach szczepów

delecyjnych musi być niższe niż w szczepie

typu dzikiego. Wewnątrzkomórkowe

stężenie glukozy, będące zależne zarówno

od zewnątrzkomórkowego stężenia glukozy

jak i zdolności komórki do jej pobierania,

okazało się kluczowym determinantem

wpływającym na szereg parametrów

analizowanych komórek drożdży.

Jakkolwiek analizując wzrost komórek

wybranych szczepów drożdży hodowanych

na podłożach płynnych zawierających

różne stężenie glukozy, poza odmiennym czasem osiągania poziomu plateau krzywych

wzrostu dla komórek rosnących na podłożach zawierających glukozę w stężeniu 0,5; 2 i 4%,

RRyycciinnaa 11.. TTeemmppoo ppoobbiieerraanniiaa gglluukkoozzyy pprrzzeezz

kkoommóórrkkii aannaalliizzoowwaannyycchh sszzcczzeeppóóww ddrroożżddżżyy..

Oznaczanie tempa pobierania glukozy

przeprowadzono mierząc sygnał

fluorescencyjny po 1,5 h inkubacji z analogiem

glukozy 6-NBDG. *** p <0,001 w porównaniu

do szczepu dzikiego (WT).

10

nie zaobserwowano większych różnic. Nie odnotowano również różnic w tempie wzrostu

pomiędzy szczepem dzikim (WT) a szczepami Δgpa2; Δgpr1 i Δhxk2. Podobne zależności

zaobserwowano również we wzroście komórek na podłożu stałym. Komórki analizowanych

szczepów nie różniły się również znacząco pod względem witalności i żywotności. Wszystkie

analizowane komórki bez względu na stężenie glukozy w podłożu wykazały wysoki poziom

witalności w pomiarach fluorymetrycznych z wykorzystaniem sondy fluorescencyjnej FUN-1.

Aczkolwiek komórki szczepu Δhxk2 charakteryzowały się niższymi wartościami tego

parametru w porównaniu do komórek szczepu dzikiego oraz szczepów Δgpa2 i Δgpr1.

W mikroskopowej ocenie żywotności komórek, stwierdzono iż w populacji komórek

analizowanych szczepów, śmiertelność była na bardzo niskim poziomie. Na tym tle

wyróżniała się jedynie populacja komórek szczepu dzikiego hodowanych na podłożu

zawierającym 4% glukozy, gdzie odsetek martwych komórek sięgał 8%. Ewidentne różnice

odnotowano natomiast w przypadku pomiarów morfometrycznych komórek drożdży. Wraz ze

wzrostem stężenia glukozy wzrastała

średnia wielkość komórki w populacji,

a trend taki był najbardziej widoczny

dla komórek szczepu dzikiego. Średnia

wielkość komórek szczepów

delecyjnych była istotnie niższa od

średniej wielkości komórek szczepu

dzikiego (Ryc. 2A). Dodatkowo

przeprowadzona hierarchiczna analizę

skupień wykazała silne podobieństwo

(biorąc pod uwagę parametr wielkości)

między komórkami szczepów Δgpa2

i Δgpr1, z kolei najniższy poziom

podobieństwa i największa odległość

w dendrogramie wystąpiła między

komórkami WT a komórkami szczepu

Δhxk2 (Ryc. 2B).

RRyycciinnaa 22.. WWiieellkkoośśćć kkoommóórreekk ddrroożżddżżyy aannaalliizzoowwaannyycchh sszzcczzeeppóóww hhooddoowwaannyycchh nnaa ppooddłłoożżuu zz rróóżżnnyymm

ssttęężżeenniieemm gglluukkoozzyy ((AA)).. DDeennddrrooggrraamm ggrruuppuujjąąccyy sszzcczzeeppyy ddrroożżddżżyy wweeddłłuugg ppooddoobbiieeńńssttwwaa ww wwiieellkkoośśccii

kkoommóórrkkii ((BB)).. *** p <0,001 w porównaniu do szczepu dzikiego (WT) na tym samym typie podłoża.

Litery a, b, c wskazują różnice między wartościami obserwowanymi na różnych podłożach

w obrębie tego samego szczepu drożdży.

11

Analizowane zmiany stężenia glukozy w podłożu hodowlanym bardzo silnie wpłynęły

na szereg parametrów fizjologicznych komórek drożdży. Zaobserwowano zwiększoną

generację RFT wraz ze wzrostem stężenia glukozy w podłożu hodowlanym, a trend taki był

najbardziej widoczny dla komórek szczepu dzikiego. Największy poziom generacji RFT

odnotowywano dla komórek hodowanych na podłożu zawierającym 4% glukozy (warunki

nadmiaru kalorii) (Ryc. 3A i 3B).

Wynik ten w kontekście

obecnie przyjmowanej wiedzy,

postulującej z jednej strony represję

glukozową oddychania tlenowego

w komórkach drożdży hodowanych

na podłożach z wysoką zawartością

glukozy, a z drugiej strony uznającej

aktywność mitochondriów za

główne źródło RFT w komórce, był

nieco zaskakujący. Wobec tego oznaczono status funkcjonalny i strukturę sieci

mitochondrialnej w komórkach drożdży a ponadto sprawdzono poziom generacji RFT

z wykorzystaniem komórek drożdży niekompletnych oddechowo (rho0) tj. mogących

przeprowadzać tylko proces fermentacji. Nie odnotowano większych różnic w stanie

funkcjonalnym oraz strukturze sieci mitochondrialnej dla komórek drożdży hodowanych na

podłożach z różnym stężeniem glukozy (Ryc. 4). Z kolei w analizach wykorzystujących

komórki rho0

odnotowano, iż poziom generacji RFT jest w nich identyczny do tego

notowanego dla komórek mających zdolność prowadzenia oddychania tlenowego. Dało to

RRyycciinnaa 33.. PPoozziioomm ggeenneerraaccjjii RRFFTT

ww kkoommóórrkkaacchh ddrroożżddżżyy kkoommpplleettnnyycchh

ooddddeecchhoowwoo hhooddoowwaannyycchh nnaa ppooddłłoożżuu

zz rróóżżnnyymm ssttęężżeenniieemm gglluukkoozzyy.. GGeenneerraaccjjaa

RRFFTT oozznnaacczzoonnaa zz wwyykkoorrzzyyssttaanniieemm ssoonnddyy

fflluuoorreesscceennccyyjjnneejj DDHHEETT ((AA)) ii HH22DDCCFF--

DDAA ((BB)).. ** p <0,01; *** p <0,001

w porównaniu do szczepu dzikiego (WT)

na tym samym typie podłoża. Litery a, b,

c wskazują różnice między wartościami

obserwowanymi na różnych podłożach

w obrębie tego samego szczepu drożdży.

12

podstawę do wnioskowania, że na terenie komórki drożdży istnieją poza-mitochondrialne

źródła generacji RFT, co sugeruje potrzebę zmiany poglądu o mitochondriach jako o jedynym

źródle RFT w komórkach drożdży. Dodatkowo dzięki zastosowaniu sond fluorescencyjnych

reagujących specyficznie z określonymi rodzajami RFT oraz szczepów pozbawionych genów

kodujących dysmutazy ponadtlenkowe ustalono, iż prawdopodobnie główną RFT generowaną

poza-mitochondrialnie jest anionorodnik ponadtlenkowy.

Glukoza pobrana do wnętrza komórki, może być wykorzystana na drodze kilku

wzajemnie powiązanych szlaków metabolicznych, a jak pokazały analizy wybranych

parametrów biochemicznych istnieje między nimi „specyficzny kompromis metaboliczny”

(ang. metabolic trade-off). Stopień wykorzystania glukozy w różnych szlakach

metabolicznych jest modyfikowany w zależności od stężenia glukozy w podłożu hodowlanym

oraz tempa jej pobierania. Stwierdzono, iż wraz ze wzrostem stężenia glukozy w podłożu

spadał poziom ATP w komórkach, a tendencja ta była najbardziej widoczna dla komórek

szczepu dzikiego. Tendencja ta widoczna była również w dodatkowych testach dla komórek

rosnących na podłożach zawierających 8% i 10% glukozy. Zaobserwowane zmiany

RRyycciinnaa 44.. SSttrruukkttuurraa ssiieeccii

mmiittoocchhoonnddrriiaallnneejj.. SSieć

mitochondrialna była

oznaczana za pomocą

mikroskopii fluorescencyjnej

przy zastosowaniu barwnika

fluorescencyjnego Rodaminy

B. Parametry wzbudzenia

i emisji fluorescencji: λex =

555 nm i λem = 579 nm.

Zdjęcia zostały

zarejestrowane za pomocą

mikroskopu Olympus BX-51

wyposażonego w aparat

cyfrowy DP-72

i oprogramowanie CellSens

Dimension. Zdjęcia

przedstawiają typowe wyniki

z kolejnych powtórzeń

eksperymentu. Powiększenie

1000 ×

13

energetyczne wydają się być skutkiem przesunięcia równowagi metabolicznej od oddychania

tlenowego do fermentacji oraz jednoczesnego zwiększenia udziału szlaku

pentozofosforanowego (szlak PPP) w metabolizmie glukozy, zwłaszcza przy wyższych

stężeniach glukozy w podłożu hodowlanym. Taką możliwość pośrednio potwierdzono dzięki

analizie aktywności enzymów szlaku pentozofosforanowego (dokładnie dehydrogenazy

glukozo-6-fosforanowej - G6PD oraz dehydrogenazy 6-fosfoglukonianowej - 6-PGD).

Wykazano w ten sposób m.in., że komórki szczepu dzikiego, u których tempo pobierania

glukozy było najwyższe a spadek poziomu ATP wraz ze wzrostem stężenia glukozy

w podłożu hodowlanym najbardziej widoczny, charakteryzowały się wyższą aktywnością

szlaku PPP w porównaniu do komórek szczepu Δgpa2 i Δgpr1. Komórki szczepu dzikiego

miały przede wszystkim wyższą aktywność G6PD, co jest zgodne z danymi literaturowymi

wskazującymi na kluczową rolę aktywności tego enzymu dla działania szlaku PPP. Szlak PPP

stanowi źródło prekursorów węglowych wykorzystywanych do biosyntezy makromolekuł

komórki ale także prowadzi do wytworzenia NADPH. Poza funkcjami związanymi

z utrzymaniem wewnątrzkomórkowego poziomu zredukowanego glutationu i odpowiedniego

statusu redoks, NADPH jest kluczowym wewnątrzkomórkowym reduktantem

wykorzystywanym w szeregu reakcji metabolicznych, w tym w procesach biosyntetycznych.

Wyniki przeprowadzonych badań wykazały wyższy poziom zarówno NADPH jak i całej

komórkowej puli NADP+/NADPH w komórkach hodowanych na podłożu zawierającym 4%

glukozy względem komórek hodowanych na podłożu zawierającym 2% glukozy. Istotne

zależności wykazała także analiza udziału NADPH i NADP+ w całkowitej puli NADP(H).

Stwierdzono, wyższy udział NADP+ w całkowitej puli NADP(H) w komórkach hodowanych

na podłożu zawierającym 2 i 4% stężenie glukozy. Taka sytuacja może być konsekwencją

zwiększonego utleniania NADPH, co sugeruje większe wykorzystanie NADPH w procesach

biosyntetycznych dostosowanych do aktualnych potrzeb komórki. Biorąc pod uwagę

uzyskane wyniki dotyczące wpływu stężenia glukozy na tempo wzrostu populacji, wielkość

komórek, zmiany poziomu ATP, aktywność szlaku PPP oraz zmiany w wykorzystaniu

NADPH, istotnym stało się oznaczenie możliwości biosyntetycznych analizowanych

komórek drożdży, które określono za pomocą pomiaru suchej masy komórki obrazującej

ogólną wydajność procesów biosyntetycznych komórki. Zawartość suchej masy komórek

była istotnie wyższa dla komórek szczepu dzikiego względem komórek szczepów Δgpa2

i Δgpr1. Co więcej w przypadku komórek szczepu dzikiego zawartość suchej masy wzrastała

wraz ze wzrostem stężenia glukozy w podłożu hodowlanym i była najwyższa w warunkach

14

CE. Takiego wzrostu w zawartości suchej masy komórek nie obserwowano natomiast dla

komórek szczepów Δgpa2 i Δgpr1 (Ryc. 5).

Mając na względzie, założenie iż zdolność reprodukcyjna jest istotną miarą sprawności

fizjologicznej komórki w ostatnim zadaniu badawczym przeprowadzono analizę wpływu

różnych stężeń glukozy na zdolność reprodukcyjną i długość życia komórek drożdży.

Zaobserwowano znaczny spadek potencjału reprodukcyjnego komórek szczepu dzikiego

(zarówno wartości maksymalnych, średnich jak i występujących najczęściej) wraz ze

wzrostem stężenia glukozy w podłożu hodowlanym. Zależności takiej nie zaobserwowano dla

komórek szczepów Δgpa2 i Δgpr1, których potencjał reprodukcyjny nie ulegał zmianie

niezależnie od stężenia glukozy a obydwa szczepy wytwarzały więcej komórek potomnych

niż szczep dziki. Wartą podkreślenia jest niemal dwukrotna różnica wartości potencjału

reprodukcyjnego pomiędzy szczepem dzikim a szczepami Δgpa2 i Δgpr1 w warunkach

nadmiaru kalorii

(Ryc. 6).

RRyycciinnaa 55.. SSuucchhaa mmaassaa kkoommóórreekk

ddrroożżddżżyy hhooddoowwaannyycchh nnaa ppooddłłoożżuu

zz rróóżżnnyymm ssttęężżeenniieemm gglluukkoozzyy..

Dane wyrażono w przeliczeniu

na pojedynczą komórkę. ** p

<0,01; *** p <0,001

w porównaniu do szczepu

dzikiego (WT) na tym samym

typie podłoża. Litery a, b, c

wskazują różnice między

wartościami obserwowanymi na

różnych podłożach w obrębie

tego samego szczepu drożdży.

RRyycciinnaa 66..

PPootteennccjjaałł

rreepprroodduukkccyyjjnnyy

kkoommóórreekk

ddrroożżddżżyy

hhooddoowwaannyycchh

ww wwaarruunnkkaacchh

rróóżżnneeggoo ssttęężżeenniiaa

gglluukkoozzyy..

15

RRyycciinnaa 77.. RRoozzkkłłaadd wwaarrttoośśccii ppootteennccjjaałłuu rreepprroodduukkccyyjjnneeggoo kkoommóórreekk ddrroożżddżżyy hhooddoowwaannyycchh

ww wwaarruunnkkaacchh rróóżżnnyycchh ssttęężżeeńń gglluukkoozzyy.. κκ-- kkuurrttoozzaa;; γγ‐‐ sskkoośśnnoośśćć..

RRyycciinnaa 88.. RRoozzkkłłaadd wwaarrttoośśccii wwiieellkkoośśccii kkoommóórrkkii ww ppooppuullaaccjjii kkoommóórreekk ddrroożżddżżyy hhooddoowwaannyycchh

ww wwaarruunnkkaacchh rróóżżnnyycchh ssttęężżeeńń gglluukkoozzyy..

zzyy.. κκ-- kkuurrttoozzaa;; γγ‐‐ sskkoośśnnoośśćć..

16

Zestawiając ze sobą rozkład wartości potencjału reprodukcyjnego oraz rozkład

wielkości komórek badanych szczepów w warunkach różnego stężenia glukozy wykazano

istnienie związku między rozmiarem komórki a jej zdolnością do reprodukcji. Wzrostowi

wielkości komórki towarzyszyło zmniejszenie potencjału reprodukcyjnego i odwrotnie (Ryc.

7 i 8). Analiza korelacji potwierdziła istnienie negatywnej zależności między wielkością

komórki a potencjałem reprodukcyjnym (r = -0,82). Bardzo istotny (r = -0,96) okazał się

również poziom korelacji między możliwościami biosyntetycznymi komórki wyrażanymi

wartością suchej masy a potencjałem reprodukcyjnym komórki.

Analizując długość życia komórek drożdży wykazano, że post-reprodukcyjny czas życia

komórek drożdży jest ujemnie skorelowany z potencjałem reprodukcyjnym i reprodukcyjnym

czasem życia. Z kolei całkowita długość życia komórek drożdży okazała się być

porównywalna zarówno pomiędzy szczepami drożdży a także w warunkach optymalnych jak

i restrykcji kalorycznej. Ponadto wykazano, że całkowita długość życia ulega wyraźnemu

skróceniu w warunkach nadmiaru kalorii, co było najbardziej widoczne dla komórek szczepu

dzikiego (Ryc. 9). Na podstawie uzyskanych wyników i danych literaturowych, stworzono

modele prezentujące zmiany metabolizmu komórki w zależności od stężenia glukozy oraz ich

wpływ na wielkość i potencjał reprodukcyjny komórek drożdży (Ryc. 10).

RRyycciinnaa 99.. PPoorróówwnnaanniiee ccaałłkkoowwiitteejj ddłłuuggoośśccii żżyycciiaa kkoommóórreekk ddrroożżddżżyy hhooddoowwaannyycchh ww wwaarruunnkkaacchh

rróóżżnnyycchh ssttęężżeeńń gglluukkoozzyy.. Całkowitą długość życia komórek drożdży określono przy użyciu

mikromanipulatora analizując komórki hodowane na stałym podłożu zawierającym przyżyciowy

barwnik – floksynę B.

17

RRyycciinnaa 1100.. PPrraawwddooppooddoobbnnee rrooddzzaajjee „„mmeettaabboolliicczznneeggoo kkoommpprroommiissuu”” ww zzaalleeżżnnoośśccii oodd wwaarruunnkkóóww

ddoossttęęppnnoośśccii sskkłłaaddnniikkóóww ooddżżyywwcczzyycchh oorraazz iicchh wwppłłyyww nnaa wwiieellkkoośśćć ii ppootteennccjjaałł rreepprroodduukkccyyjjnnyy

kkoommóórreekk ddrroożżddżżyy.. Zastosowane skróty: ATP: trifosforan adenozyny; cAMP: cykliczny

monofosforan adenozyny; GPCR: receptor sprzężony z białkiem G; HXT: transporter heksozy;

PPP: szlak pentozofosforanowy; PKA: kinaza białkowa A.

18

6. Podsumowanie

Wyniki uzyskane w toku realizacji pracy doktorskiej pozwoliły na kompleksową analizę

konsekwencji nadmiaru i restrykcji kalorycznej dla komórek drożdży S. cerevisiae. W pracy

podjęto próbę wyjaśniania skomplikowanych zależności występujących między

wewnątrzkomórkowymi szlakami metabolizmu glukozy. Wnioski płynące z pracy pozwalają

na pełniejsze zrozumienie regulacji metabolizmu glukozy na poziomie komórkowym, przez

co mogą być pomocne w analizach dotyczących funkcjonowania komórek narażonych na

wysokie stężenia glukozy, co ma miejsce m.in. w przypadku osób chorych na cukrzycę.

Badania przeprowadzone w ramach niniejszej pracy doktorskiej pozwoliły sformułować

następujące wnioski:

(i) w komórce istnieje „specyficzny kompromis metaboliczny” pomiędzy różnymi

sposobami wykorzystania glukozy,

(ii) wewnątrzkomórkowe wykorzystanie glukozy jest zależne od jej stężeniem w otoczeniu

oraz tempa jej pobierania,

(iii) stężenie glukozy w podłożu hodowlanym ma wpływ na poziom generowanych

reaktywnych form tlenu, przy czym istotna część RFT w komórkach drożdży jest

generowana w sposób poza-mitochondrialny,

(iv) istnieje silna zależność między stężeniem glukozy, stanem fizjologicznym komórek

drożdży, ich wielkością i możliwościami biosyntetycznymi a potencjałem

reprodukcyjnym,

(v) warunki nadmiaru kalorii negatywnie wpływają na sprawność fizjologiczną, potencjał

reprodukcyjny a także całkowitą długość życia komórki.

Bibliografia

Austad SN (2012) Ageing: Mixed results for dieting monkeys. Nature 489: 210-11.

Biliński T, Paszkiewicz T, Zadrag-Tecza R (2015) Energy excess is the main cause of accelerated aging of

mammals. Oncotarget 6: 12909-19.

Bilinski T, Zadrag-Tecza R (2017) Yeast aging: Reproduction Strategies Determine the Longevity of

Buding and Fission Yeasts In Shefferson R, Owen J and R, S.-G. (Eds), The Evolution of Senescence in the Tree of Life, Cambridge University Press

Biliński T, Zadrąg-Tęcza R, Bartosz G (2012) Hypertrophy hypothesis as an alternative explanation of the

phenomenon of replicative aging of yeast. FEMS Yeast Res 12: 97-101.

Colman RJ, Anderson RM, Johnson SC, Kastman EK, Kosmatka KJ, i in. (2009) Caloric restriction delays

disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science 325: 201-4.

Diaz-Ruiz R, Rigoulet M, Devin A (2011) The Warburg and Crabtree effects: On the origin of cancer cell

energy metabolism and of yeast glucose repression. Biochim Biophys Acta 1807: 568-76.

Fontana L, Partridge L (2015) Promoting health and longevity through diet: from model organisms to humans. Cell 161: 106-18.

19

Gunin AG, Kornilova NK, Petrov VV, Vasil'eva OV (2011) [Age-related changes in the number and

proliferation of fibroblasts in the human skin]. Adv Gerontol 24: 43-7.

Hu C, Fan L, Cen P, Chen E, Jiang Z, i in. (2016) Energy Metabolism Plays a Critical Role in Stem Cell

Maintenance and Differentiation. Int J Mol Sci 17: 253.

Lee D, Son HG, Jung Y, Lee SV (2017) The role of dietary carbohydrates in organismal aging. Cell Mol

Life Sci 74: 1793-1803.

Lin SJ, Kaeberlein M, Andalis AA, Sturtz LA, Defossez PA, i in. (2002) Calorie restriction extends

Saccharomyces cerevisiae lifespan by increasing respiration. Nature 418: 344-8.

Magier Z, Jarzyna R (2013) [The role of glucose transporters in human metabolic regulation]. Postepy Biochem 59: 70-82.

Maslanka R, Kwolek-Mirek M, Zadrag-Tecza R (2017) Consequences of calorie restriction and calorie

excess for the physiological parameters of the yeast Saccharomyces cerevisiae cells. FEMS Yeast Res

17.

Maslanka R, Kwolek-Mirek M, Zadrag-Tecza R (2018) Autofluorescence of yeast Saccharomyces cerevisiae cells caused by glucose metabolism products and its methodological implications.

J Microbiol Methods 146: 55-60.

Maslanka R, Zadrag-Tecza R (2019) Less is more or more is less: Implications of glucose metabolism in

the regulation of the reproductive potential and total lifespan of the Saccharomyces cerevisiae yeast.

J Cell Physiol.

Mattison JA, Colman RJ, Beasley TM, Allison DB, Kemnitz JW, i in. (2017) Caloric restriction improves

health and survival of rhesus monkeys. Nat Commun 8: 14063.

Mattison JA, Roth GS, Beasley TM, Tilmont EM, Handy AM, i in. (2012) Impact of caloric restriction on

health and survival in rhesus monkeys from the NIA study. Nature 489: 318-21.

Minois N, Frajnt M, Wilson C, Vaupel JW (2005) Advances in measuring lifespan in the yeast

Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 402-6.

Rafalski VA, Mancini E, Brunet A (2012) Energy metabolism and energy-sensing pathways in mammalian

embryonic and adult stem cell fate. J Cell Sci 125: 5597-608.

Rødkaer SV, Faergeman NJ (2014) Glucose- and nitrogen sensing and regulatory mechanisms in

Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res 14: 683-96.

Rodrigues F, Ludovico P, Leão C (2006) Sugar Metabolism in Yeasts: an Overview of Aerobic and

Anaerobic Glucose Catabolism, Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts. The Yeast Handbook.,

Springer: Berlin, pp. 101-121.

Roth LW, Polotsky AJ (2012) Can we live longer by eating less? A review of caloric restriction and

longevity. Maturitas 71: 315-9.

Schleit J, Johnson SC, Bennett CF, Simko M, Trongtham N, i in. (2013) Molecular mechanisms underlying

genotype-dependent responses to dietary restriction. Aging Cell 12: 1050-61.

Sharma PK, Agrawal V, Roy N (2011) Mitochondria-mediated hormetic response in life span extension of

calorie-restricted Saccharomyces cerevisiae. Age (Dordr) 33: 143-54.

Smith J, Wright J, Schneider BL (2015) A budding yeast's perspective on aging: the shape I'm in. Exp Biol

Med (Maywood) 240: 701-10.

Tschen SI, Dhawan S, Gurlo T, Bhushan A (2009) Age-dependent decline in beta-cell proliferation restricts

the capacity of beta-cell regeneration in mice. Diabetes 58: 1312-20.

Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB (2009) Understanding the Warburg effect: the metabolic

requirements of cell proliferation. Science 324: 1029-33.

Weinberger M, Mesquita A, Caroll T, Marks L, Yang H, i in. (2010) Growth signaling promotes

chronological aging in budding yeast by inducing superoxide anions that inhibit quiescence. Aging (Albany NY) 2: 709-26.

Zadrag-Tecza R, Kwolek-Mirek M, Bartosz G, Bilinski T (2009) Cell volume as a factor limiting the

replicative lifespan of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biogerontology 10: 481-8.

Zadrag R, Bartosz G, Bilinski T (2008) Is the yeast a relevant model for aging of multicellular organisms?

An insight from the total lifespan of Saccharomyces cerevisiae. Curr Aging Sci 1: 159-65.

Zuin A, Carmona M, Morales-Ivorra I, Gabrielli N, Vivancos AP, i in. (2010) Lifespan extension by calorie

restriction relies on the Sty1 MAP kinase stress pathway. EMBO J 29: 981-91.