ANTYGENY ASPERGILLUS Antygeny Aspergillus 52942 Antygeny Aspergillus fumigatus 52962 Wzorcowa surowica dodatnia Aspergillus fumigatus 61681 Wzorcowa surowica dodatnia Aspergillus 61682

SERODIAGNOSTYKA ASPERGILOZY METODĄ IMMUNOPRECYPITACJI

1

1- ZASTOSOWANIE KLINICZNE

W ofercie firmy Bio-Rad znajdują się rodzaje antygenów Aspergillus służą do diagnostyki serologicznej aspergilozy metodą immunoprecypitacji. Diagnostyka aspergilozy poprzez wykrycie swoistych przeciwciał w surowicy pacjenta jest często łatwiejsza od bezpośredniej identyfikacji grzybów w hodowli.

2- ZASADA METODY

Antygeny produkowane przez Bio-Rad mają zastosowanie w różnych reakcjach immunoprecypitacji, szczególnie w metodach:

• IMMUNOELEKTROFOREZY (IEP) • IMMUNOELEKTROFOREZY PRZECIWSTAWNEJ (ES)

Metody diagnostyki aspergilozy oparte na immunoprecypitacji charakteryzują się wysoką swoistością dzięki wykrywaniu przeciwciał skierowanych przeciw dwóm enzymom, chymotrypsynie i katalazie, zawartym w ekstrakcie antygenowym. Aktywność tych enzymów można wykryć w łukach precypitacyjnych.

3- POSTAĆ TESTU

• Antygeny Aspergillus fumigatus, nr kat. 52962 2 fiolki liofilizowanych antygenów; zawartość każdej należy zrekonstytuować w 1 ml jałowej wody destylowanej (wystarcza na około 10 reakcji). - Antygen metaboliczny Aspergillus fumigatus - Antygen somatyczny Aspergillus fumigatus • Antygeny Aspergillus, nr kat. 52942 4 fiolki liofilizowanych antygenów; zawartość każdej należy zrekonstytuować w 1 ml jałowej wody destylowanej (wystarcza na około 10 reakcji). - Antygen metaboliczny Aspergillus flavus - Antygen metaboliczny Aspergillus nidulans - Antygen metaboliczny Aspergillus niger - Antygen metaboliczny Aspergillus terreus • Dodatnia surowica wzorcowa Aspergillus fumigatus, nr kat. 61681 1 fiolka liofilizowanej surowicy króliczej, zawierającej przeciwciała przeciw Aspergillus fumigatus; zawartość należy zrekonstytuować w 1 ml jałowej wody destylowanej. • Dodatnia surowica wzorcowa Aspergillus nr kat. 61682 4 fiolki liofilizowanej surowicy króliczej, zawierającej przeciwciała przeciw Aspergillus; zawartość każdej należy zrekonstytuować w 1 ml jałowej wody destylowanej (wystarcza na około 10 reakcji). - Surowica wzorcowa Aspergillus flavus - Surowica wzorcowa Aspergillus nidulans - Surowica wzorcowa Aspergillus niger - Surowica wzorcowa Aspergillus terreus

2

4- SKŁAD

2 rodzaje antygenów: • Antygen metaboliczny, będący filtratem z 10-dniowej hodowli płynnej,

wytrząsanej w temp. 30°C. • Antygen somatyczny lub komórkowy, wyekstrahowany z młodej grzybni nie

zawierającej zarodników (3-dniowa hodowla w temp. 30°C), oddzielonej od podłoża i zmiksowanej.

5- PRZECHOWYWANIE

Odczynniki liofilizowane: w temp. +2-8°C, w suchym miejscu, są trwałe zgodnie z datą ważności podaną na opakowaniu zestawu. Odczynniki zrekonstytuowane: rozporcjowane mogą być przechowywane przez kilka miesięcy zamrożone w temp. -20°C. Nie zamrażać ponownie odczynników.

6- PRÓBKI

1. Materiałem do wykonania testu jest wyłącznie surowica pobrana do suchej próbówki.

2. Zalecane postępowanie z próbkami: - Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą. - Próbki krwi przed odwirowaniem pozostawić do powstania skrzepu. - Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte. - Po odwirowaniu jak najszybciej oddzielić surowicę i przenieść do szczelnie

zamykanej próbówki. - Jeśli test będzie wykonany w ciągu 24 godzin, próbki można przechować w

temp. +2-8°C. - Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je

zamrozić w temp. -20°C lub niższej. - Próbki można zamrozić i rozmrozić najwyżej 1 raz. - Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem.

3. Nie badano wpływu na oznaczenie wysokiego poziomu albuminy ani bilirubiny. Nie używać próbek lipemicznych ani zhemolizowanych.

4. Nie ogrzewać próbek. 7- PROCEDURA

A) INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY • Barbital sodu (weronal, sól sodowa kwasu 5,5-dwuetylobarbiturowego) • Kwas solny • Woda destylowana • Barbital (kwas 5,5-dwuetylobarbiturowy) • Glicyna • Bufor TRIS 0.05 M pH 7 • Agaroza • 30% H2O2 • Ester naftylowy N-acetylo-DL-fenyloalaniny

3

• Dwumetyloformamid • Diazoblue B

B) IMMUNOELEKTROFOREZA (fot.1) Immunoelektroforezę (Grabar) przeprowadza się na mikroskopowym szkiełku podstawowym, w 1% żelu z oczyszczonego agaru lub agarozy w buforze weronalowym pH 8.2 (z dodatkiem mertiolanu 1/10 000). • W żelu wyciąć rowek o wymiarach 60 mm długość x 2 szerokość mm i przy jego

końcu wyciąć 2 dołki o średnicy 2 mm, w odległości 4 mm od siebie (patrz diagram).

• Do dołków nanieść po 20 µl nie rozcieńczonych antygenów. • Do końców szkiełka na 90 minut przyłożyć napięcie 5 V/cm. • Do centralnego rowka nanieść surowicę i przez 48 godzin pozwolić jej na dyfuzję

w żelu, umieszczając go w wilgotnej atmosferze w temp. pokojowej (+18-30°C). • Trzeciego dnia zanurzyć szkiełka na 24 godziny w roztworze do płukania. • Czwartego dnia odczytać wynik reakcji. Do odczytania delikatnie zaznaczonej

precypitacji można zabarwić żel błękitem Coomasiego.

C) IMMUNOELEKTROFOREZA PRZECIWSTAWNA (rys.1) Immunoelektroforezę przeciwstawną (Bussard) przeprowadza się w żelu agarozowym lub w octanie celulozy. Jest to prosta, czuła i szybka metoda, szczególnie przydatna do badania dużej liczby próbek. • W żelu agarozowym na szkiełku podstawowym wyciąć dołki o średnicy 2 mm w

sposób przedstawiony na diagramie. Antygeny nanieść od strony katody (-), surowice od strony anody (+). Odległość pomiędzy dołkami powinna wynosić 6 mm.

• Do odpowiednich dołków nanieść antygen nie rozcieńczony oraz rozcieńczony ½ i ¼ i po 20 µl badanych próbek surowicy.

• Przyłożyć napięcie 5 V/cm na 90 minut. • Po zakończeniu migracji od razu odczytać wynik reakcji. • Jeśli trzeba zabarwić żel błękitem Coomasiego, należy wykonać przedtem 2

kolejne płukania: w surowicy fizjologicznej (przez noc) i w wodzie destylowanej (przez 24 godziny), a następnie wysuszyć żel.

Zaleca się równoległe wykonanie testu dla kontroli dodatniej, nanosząc ją w ten sam sposób, jak antygeny.

D) IDENTYFIKACJA AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ Powstające w wyniku reakcji immunoelektroforezy łuki precypitacyjne są oznaczane jako C i J (patrz diagram) i wykazują aktywność jednego z enzymów: C – chymotrypsyny i J – katalazy. Obecność tych enzymów można potwierdzić za pomocą swoistych reakcji (Biguet i wsp.)

E) PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW

1) BUFORY - BUFOR WERONALOWY pH 8.2

Barbital sodu 15.85 g 1 N HCl 23 ml H2O do 1000 ml

4

- BARBITAL – BARBITAL SODU TRIS GLICYNA (BBNaTG) pH 8.8 A Barbital sodu 65 g Barbital 10.35 g H2O do 5000 ml

B Glicyna 281 g Tris 226 g H2O do 5000 ml

Po zmieszaniu równych objętości roztworu A i B powstaje bufor o pH 8.8 i osmolarności 0.08.

2) 1% AGAROZA (wag. / obj.)

Agaroza 10 g H2O 500 ml

Agarozę całkowicie rozpuścić w wodzie, doprowadzając do wrzenia, a następnie schłodzić do około 60°C i dodać lekko ogrzany:

Bufor weronalowy pH 8.2 500 ml lub

Bufor BBNaTG pH8.8 (rozcieńczony 1:2 wodą destylowaną)

500 ml

3) KATALAZA Do agarozy do immunoelektroforezy dodać 30% H2O2, rozcieńczony w buforze Tris 0.05 M pH 7 (0.3 ml H2O2 + 50 ml buforu). Reakcja dodatnia: wokół łuku precypitacyjnego występują pęcherzyki gazu.

4) CHYMOTRYPSYNA - ROZTWÓR A

Ester naftylowy N-acetylo-DL-fenyloalaniny 5 mg Dwumetyloformamid 2 ml

- ROZTWÓR B

Diazoblue B 10 mg Bufor Tris 0.05 M. pH 7.4 18 ml

Oba roztwory A* i B* zmieszać bezpośrednio przed użyciem i w mieszaninie inkubować membranę do immunoelektroforezy przeciwstawnej przez 30 minut w temp. 37°C. Wyjąć membranę z mieszaniny i inkubować przez noc, w temp. 37°C, 18 ml roztworu B. Przepłukać membranę wodą. Reakcja dodatnia: purpurowe zabarwienie łuku precypitacyjnego będące wynikiem aktywności chymotrypsyny.

5

F) TABELA ZBIORCZA P.J. SVENDSEN MANUEL OF QUANTITATIVE IMMUNOELECTROPHORESIS, FURLARGET UNIVERSITY, OSLO. ED.: EXELSEN KROLL-WEEXE. ASPERGILLUS ANTIGENS ANALYSIS (tabela)

Bufory Napięcie Czas Barwienie 1% agaroza w

buforze weronalowym pH

8.2

5 v/cm 90 minut

Immunoelektroforeza

Fot. 1

1% agaroza w buforze BBNaTG

pH 8.8

25 v/cm 60 minut

Coomassie Blue

1% agaroza w buforze

weronalowym pH 8.2

5 v/cm 90 minut

Immunoelektroforeza przeciwstawna

1% agaroza w

buforze BBNaTG pH 8.8

10 v/cm 60 minut

Coomassie Blue

1% agaroza w buforze

weronalowym pH 8.2

5 v/cm 90 minut

Katalaza

Fot. 2

1% agaroza w buforze BBNaTG

pH 8.8

25 v/cm 60 minut

Rozcieńczony H2O2*

Reakcja dodatnia:

pęcherzyki wokół łuku J

1% agaroza w buforze

weronalowym pH 8.2

5 v/cm 90 minut

Chymotrypsyna

Fot. 3

1% agaroza w buforze BBNaTG

pH 8.8

25 v/cm 60 minut

Roztwory A* i B*

Reakcja dodatnia:

Purpurowa barwa łuku C

1 lub 2: Antygeny S: surowica pacjenta Sr: surowica wzorcowa

Rys. 1

* patrz punkt 6: procedura (E – Przygotowanie odczynników) 8- INTERPRETACJA

Wystąpienie charakterystycznego łuku precypitacji pomiędzy dołkiem z badaną surowicą a naniesionym do dołka antygenem Aspergillus potwierdza aspergilozę. Jako metoda szybsza, immunoelektroforeza przeciwstawna jest preferowana do testów przesiewowych. Uzyskane wyniki dodatnie należy potwierdzić metodą immunoelektroforezy. Wykrycie aktywności chymotrypsyny i katalazy potwierdza swoistość metody i uzyskanego wyniku. W aspergilozie oskrzelowo-płucnej oraz aspergilozie uogólnionej, dodatnie wyniki testów immunoprecypitacji uzyskuje się w 80-90% przypadków. W grzybniaku kropidlakowym reakcje są wysoce dodatnie: występuje 5 do 10 łuków oraz łuków C. W alergicznym zapaleniu oskrzeli reakcje dodatnie występują w 50% przypadków.

6

Przeciwciała precypitujące pojawiają się na późnym etapie zakażenia: w niektórych przypadkach zostają wykryte dopiero w kolejnej próbce, pobranej po upływie miesiąca po pierwszej.

9- CHARAKTERYSTYKA TESTU / KONTROLA JAKOŚCI

A) ŁUKI PRECYPITACYJNE Właściwości antygenów Aspergillus są kontrolowane przy pomocy surowic dodatnich (surowicy króliczej anty-Aspergillus, uzyskanej w wyniku immunizacji zwierząt mieszaniną wystandaryzowanych antygenów A.fumigatus i wystandaryzowanymi antygenami metabolicznymi A.flavus, A.niger, A.nidulans i A.terreus). Wystąpienie łuków precypitacyjnych podczas immunoelektroforezy (pH = 8.2)

Dodatnia surowica wzorcowa Anty-

A.fumigatus Anty-A.flavus Anty-

A.nidulans Anty-A.niger Anty-A.terreus

Antygen somatyczny A.fumigatus

+ 4 do 8 łuków

-

-

-

-

Antygen metaboliczny A.fumigatus

+ 3 do 5 łuków

-

-

-

-

Antygen metaboliczny A.flavus

-

+

3 do 5 łuków

-

-

-

Antygen metaboliczny A.nidulans

-

-

+ 3 do 5 łuków

-

-

Antygen metaboliczny A.niger

-

-

-

+ 3 do 5 łuków

-

Antygen metaboliczny A.terreus

-

-

-

-

+ 3 do 5 łuków

B) Aktywność enzymatyczna łuków precypitacyjnych Immunoelektroforeza (pH=8.2) Immunoelektroforeza

przeciwstawna (pH=8.2) Wykrycie aktywności enzymatycznej katalazy

+ po dodaniu H2O2 pęcherzyki

gazu wokół łuku J, potwierdza aktywność katalazy

Wykrycie aktywności enzymatycznej chymotrypsyny

+ po inkubacji z roztworami A i B,

purpurowa barwa łuku C, potwierdza aktywność

chymotrypsyny 10- KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA

Odczynniki zostały przygotowane zgodnie z systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Odczynniki

7

8

każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii.

11- OGRANICZENIA METODY

Do potwierdzenia aspergilozy niezbędne są dane kliniczne oraz wyniki badań radiologicznych i laboratoryjnych (mikrobiologiczne, histologiczne i serologiczne). Dodatni wynik uzyskany bez uwzględnienia całości obrazu klinicznego należy traktować ostrożnie.

12-RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES1. BIGUET J.; TRAN VANKY P.; FRUIT J. ; ANDRIEU S. : Identification

d’une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables del’extrait antigénique d’Aspergillus fumigatus. Répercussion sur lediagnostic immunologique de l’Aspergillose. REV. IMMUNOL. (1967)31, pp. 317-328.

2. DROUHET E.; CAMEY L. ; SEGRETAIN G. : Valeur de l’immunoprécipitationet de l’immunofluorescence indirecte dans les Aspergilloses broncho-pulmonaires. ANN. INST. PASTEUR (1972) 123, pp. 379-395.

3. DROUHET E. ; DUPONT B. : Infections mycosiques et parasitaires aucours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24,pp. 99-116.

4. LONGBOTTOM J.L. : Immunological aspects of infection and allergydue to Aspergillus Species. MUKOSEN (1978), supp. 1 pp. 207-217.

5. SEGRETAIN G.; DROUHET ; MARIAT F.; Diagnostic de laboratoire enmycologie médicale (1979, 4e édition), MALOINE Edt. PARIS 150pages.

20

82

- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnosticin vitro)

- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)- EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)- Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnósticoin vitro)

- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)- CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)

- For in vitro diagnostic use - Catalogue number- Pour diagnostic in vitro - Référence catalogue- Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro-Diagnostikum - Bestellnummer- Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo- Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro diagnostik - Katalognummer- In vitro diagnose - Katalognummer

- Manufacturer - Authorised Representative- Fabricant - Représentant agréé- Fabricante - Representante autorizado- Hersteller - Bevollmächtigter- Produttore - Distributore autorizzato- Fabricante - Representante Autorizado- Tillverkad av - Auktoriserad representant- Fremstillet af - Autoriseret repræsentant

- Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD- Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ- Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD- Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT- Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG- Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD- Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag- Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD

- Storage temperature limitation - Consult Instruction for use- Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi- Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso- Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung- Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso- Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo- Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning- Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug

LOT

IVD

EC REP

REF

83

The other languages which are required in conformity to the EuropeanDirective can be obtained from your local Bio-Rad agent.

Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponiblesauprès de votre représentant Bio-Rad local.

Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la DirectivaEuropea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.

Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVDDirektive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-RadNiederlassung.

Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europeepossono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.

As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a DirectivaEuropeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próximade si.

Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från dinlokala Bio-Rad-representant.

De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås vedhenvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør.

Bio-Rad3, boulevard Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette FranceTel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 11/2003Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 880011