Analiza specjacyjna platyny w próbkach roślinnychAnaliza specjacyjna platyny w próbkach roślinnychJakub Ignatowski

Pracownia Chemii Analitycznej StosowanejKierujący pracą: dr Joanna Kowalska Opiekun: dr Monika Asztemborska

WSTĘP

Z uwagi na szerokie zastosowanie platyny obserwuje się wzrost zawartości tego pierwiastka w środowisku naturalnym. Dlatego też podejmuje się badania mające na celu poznanie jej cykli biogeochemicznych, określenie możliwości zatężania platyny w różnych ogniwach łańcucha pokarmowego oraz identyfikację związków, w jakich występuje ona w organizmach. Mimo niewielkiej biodostępności, platyna pobierana jest przez rośliny. Wysokie współczynniki zatężania platyny zaobserwowano dla roślin uprawianych hydroponicznie na pożywkach wzbogaconych solą tego metalu. Przy podwyższonej zawartości metali ciężkich, takich jak Cd, Zn lub Pb w podłożu, w komórkach roślinnych dochodzi do syntezy fitochelatyn (PCn). Są to związki organiczne, składające się z dwóch do jedenastu grup -glutamylocysteinowych oraz zamykającej cząsteczkę glicyny (-Glu-Cys)nGly.

PRZYGOTOWANIE ROŚLIN

Wykorzystaną do badań gorczycę białą (Sinapis alba L.) uprawiano hydroponicznie przez okres trzech tygodni na pożywce zawierającej azotan tetraaminaplatyny (II) - stężenie metalu w pożywce wynosiło 500μg/L.

Związki te syntetyzowane są w komórkach roślin z glutationu w wyniku reakcji enzymatycznej. Ich rolą jest kompleksowanie jonów metali i transport do wakuoli.. W przypadku platyny mechanizm ten jest w literaturze jedynie postulowany i jak sugerują autorzy nielicznych publikacji na ten temat wymaga weryfikacji.

OPTYMALIZACJA WARUNKÓW ROZDZIELANIA

Przed przystąpieniem do analizy związków tiolowych w ekstraktach badanych roślin zoptymalizowano warunki rozdzielania chromatograficznego w odwróconym układzie faz, stosując jako modelowe związki tiolowe cysteinę (Cys), glutation zredukowany (GSH), glutation utleniony (GSSG) oraz ditiotreitol (DTT).

PORÓWNANIE MOŻLIWOŚCI OZNACZANIA ZWIĄZKÓW TIOLOWYCH METODAMI RP-HPLC-PAD i RP-HPLC-UV

Sprawdzono możliwość zastosowania amperometrii pulsowej i spektrofotometrii jako metod detekcji w wysokosprawnej chromatografii cieczowej do analizy związków tiolowych.

Detekcja UV : = 220 nm

Detekcja elektrochemiczna: Edet = 1,4 V; tdet = 240 ms (tdel = 140 ms) Eoxd = 1,6 V; toxd = 180 ms;Ered = -0,8 V; tred = 500 ms.Elektrody: Au (pracująca), Ag/AgCl/KCl (odniesienia) i Pt (pomocnicza).

CEL PRACY

Celem podjętych w ramach pracy badań było potwierdzenie syntezy fitochelatyn w roślinach narażonych na stres, wywołany podwyższoną zawartością platyny w podłożu. Do badań wykorzystano wysokosprawną chromatografię cieczową z detekcją spektrofotometryczną (HPLC –UV) i elektrochemiczną (HPLC –PAD).

Po zakończeniu uprawy prowadzono ekstrakcję platyny ze świeżego materiału roślinnego. Około 2 g próbki - świeżo ściętych liści, łodyg lub korzeni zamrażano w ciekłym azocie, rozdrabniano i ujednorodniano. Następnie dodawano ekstrahenta (30 mmol/L TRIS – HCl, pH 8) i wytrząsano przez jedną godzinę). Otrzymane ekstrakty odwirowywano 30 min z prędkością 3000 obr/min i liofilizowano.

ACN : woda (1:99)

ACN : 0,05% TFA (1:99)

0,05% TFA

Chromatogramy mieszaniny związków tiolowych otrzymane przy zastosowaniu różnych faz ruchomych (kolumna: ZORBAX Eclipse XDB-C18 4,6x250mm, przepływ 1ml/min, objętość próbki 20 uL , detektor UV : 220 nm).

W dalszej pracy jako fazę ruchomą stosowano: ACN : 0,05% TFA (1:99)

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10

C [mmol/L]

pow

ierz

chn

ia p

iku

[uA

]

Cys

GSH

GSSG

PC2

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 2 4 6 8 10

C [mmol/L]

pow

ierz

chni

a pi

ku [m

AU

]

Cys

GSH

GSSG

PC2

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 100 200 300 400 500

C [umol/L]

pow

ierz

chni

a pi

ku [m

AU

]

Cys

GSH

GSSG

PC2

detekcja elektrochemiczna

detekcja spektrofotometryczna

80

85

90

95

100

105

110

115

120

125

130

0 5 10 15 20 25 30 35min

uA

Chromatogramy mieszanin związków tiolowych ( stężenia tioli: 0,05; 0,5; 2,5 mmol/L)

detekcja elektrochemiczna

detekcja spektrofotometryczn

a

Zależności powierzchni pików od stężenia poszczególnych związków tiolowych otrzymane metodami: HPLC – PAD oraz HPLC - UV.

PODSUMOWANIE

• Zastosowana metoda chromatograficzna umożliwia rozdzielenie analizowanych związków tiolowych;

• Zarówno amperometria pulsowa jak i spektrofotometria przy długości fali 220 nm umożliwiają detekcję badanych tioli;

• Spektrofotometria, jako stosowana metoda detekcji, charakteryzuje się niższą granicą wykrywalności (0,01mmol/L) w porównaniu z amperometrią pulsową na elektrodzie złotej (0,5 mmol/L);

• Opracowane metody zostaną zastosowane do analizy związków tiolowych w ekstraktach gorczycy białej, uprawianej hydroponicznie z dodatkiem soli platyny (II).

ACN : bufor fosforanowy (0,2mol/L; pH 4,6) (2:98)

ACN : bufor fosforanowy (0,2mol/L; pH 3) (2:98)

Cys

GSH

GSSG

DTT PC2

CysGSH

GSSG DTT PC2