13–18 fileCała prawda w jednej kropli AKTUALNOŚCI Chorus Trio – nowa jakość w immunologii...

2 Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY

W NUMERZE

Cała prawda w jednej kropli

AKTUALNOŚCI

Chorus Trio – nowa jakość w immunologii

teraz dostępna również na polskim rynku

Prezes Tomasz Tuora „Dynamicznym

Przedsiębiorcą”

DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE

Wytyczne w analizie białka Bence Jonesa

Easy Interlab G26 kontra Hydrasys i Capillarys

DIAGNOSTYKA POD LUPĄ

Krioglobuliny

PRZYPADKI KLINICZNE

Krioglobulinemia

4–5

5

6–9

13–18

19

Wydawca: PZ Cormay SAul. Wiosenna 2205-092 Łomiankitel.: 22 751 79 10faks: 22 751 79 11e-mail: [email protected]

Redakcja:Redaktor naczelna – Monika Dziachan – PZ Cormay SARedakcja i korekta – Agape

Współpraca:Firma Interlab (Italy)

Przygotowanie i produkcja: Agape. Agencja doradcza i wydawniczaul. Lazurowa 183 lok. 3, 01-479 Warszawatel./faks: 22 886 62 26e-mail: [email protected], www.agape.com.plRedakcja zastrzega sobie prawo do skracania i redagowania publikowanych tekstówNumer zamknięto: 14 czerwca 2013 r.

10–12

NA WSTĘPIE

nie sprawdzi³ siê czarny scenariusz, ¿e identyfikacja bia³ek wy-

konywana metod¹ elektroforezy agarozowej zniknie z Zak³adów

Diagnostyki Laboratoryjnej.

Od trzech lat w firmie PZ CORMAY pod kierunkiem dr Be-

aty Stefañczyk trwa prawdziwy renesans linii produktów do ba-

dañ elektroforetycznych i immunofiksacji. Dziêki naszym nowym

analizatorom metoda oznaczenia jest szybka, charakteryzuje siê

wysok¹ czu³oœci¹, bardzo dobr¹ wizualizacj¹, a rozdzia³ bia³ek

jest wyraŸny. Dodatkowo, analizator Interlab Easy G26 pozwa-

la na w pe³ni automatyczny rozdzia³ materia³u.

Jesteœmy dumni, ¿e jako jedyni na rynku oferujemy pe³na ga-

mê analizatorów elektroforetycznych (w tym automatycznych)

do Laboratoriów o ró¿nym potencjale: od tych ma³ych, a¿

po specjalistyczne, które pracuj¹ na potrzeby Oddzia³ów Kli-

nicznych.

Pragnê podkreœliæ, ¿e naszym celem jest nie tylko dzia³al-

noœæ biznesowa, lecz tak¿e profesjonalna praca edukacyjna, któ-

ra spotyka siê z Pañstwa doskona³ym odbiorem. Potwierdzaj¹ to

wype³nione po brzegi sale na Konferencjach i Warsztatach Elek-

Szanowni Pañstwo,

troforetycznych, prowadzonych dla naszych obecnych, jak i pla-

nuj¹cych z nami wspó³pracê Diagnostów.

Metody elektroforetyczne to nie tylko oznaczenia rutynowe,

ale tak¿e specjalistyczne, m.in. oznaczenie krioglobulin, o któ-

rych informacje znajd¹ Pañstwo w obecnym egzemplarzu na-

szego biuletynu „Twoje Laboratorium”.

¯ycz¹c Pañstwu ciekawej lektury najnowszego magazynu,

zapraszamy do krêgu szybko rosn¹cej Rodziny PZ CORMAY,

u¿ytkuj¹cej sprzêt diagnostyczny do wykonywania badañ elek-

troforetycznych.

DDrr SS³³aawwoommiirr BBllaacchhoowwsskkii

DDyyrreekkttoorr SSpprrzzeeddaa¿¿yy KKrraajjoowweejj

Nr 1 (26), wiosna 2013 3Cała prawda w jednej kropli

Naszym celem jest nie tylko

działalność biznesowa, lecz

także profesjonalna praca

edukacyjna, która spotyka

się z Państwa doskonałym

odbiorem


AKTUALNOŚCI


Marek Witkowski ma 31 lat i jest diagnostąlaboratoryjnym. W 2006 r. ukończył CollegiumMedicum w Bydgoszczy Uniwersytetu MikołajaKopernika w Toruniu. Do tej pory zdobywałdoświadczenie w ramach pełnionych funkcji kie-rownika laboratorium szpitalnego oraz przed-stawiciela handlowego w firmach diagnostycz-nych. W PZ CORMAY S.A. jest odpowiedzialnyza wprowadzenie nowego produktu immunolo-gicznego – Chorus Trio oraz bieżące działaniaw ramach analityki ogólnej.

Wywiad z Markiem Witkowskim, Product Sales Managerem w PZ CORMAY S.A.

OObbeeccnniiee ffiirrmmaa PPZZ CCOORRMMAAYY wwpprroowwaaddzzaa

nnaa rryynneekk nnooww¹¹ lliinniiêê pprroodduukkttooww¹¹.. CCoo ssppoo--

wwooddoowwaa³³oo rroozzppoocczzêêcciiee ttzzww.. pprroojjeekkttuu iimm--

mmuunnoollooggiicczznneeggoo??

MMaarreekk WWiittkkoowwsskkii:: Badania immunologiczne

s¹ najszybciej rozwijaj¹c¹ siê dziedzin¹ dia-

gnostyki laboratoryjnej i mikrobiologicznej,

co znajduje odzwierciedlenie w liczbie wyko-

nywanych badañ. Ci¹g³y wzrost œwiadomoœci

spo³eczeñstwa w zakresie ochrony zdrowia,

a tak¿e mo¿liwoœci

technologiczne powoduj¹ zwiêk-

szone zapotrzebowanie na tego typu badania

ze strony osób prywatnych. W zwi¹zku z tym

trendem zarz¹d PZ CORMAY S.A. podj¹³

starania w sprawie poszerzenia portfolio i na-

bycia udzia³ów we w³oskiej firmie Diesse

– lidera w diagnostyce chorób infekcyjnych

oraz autoimmunoagresyjnych.

CCzzyy CChhoorruuss TTrriioo ttoo aannaalliizzaattoorr pprrzzyyggoottoowwaannyy

ddoo pprraaccyy nnaa ppoollsskkiimm rryynnkkuu??

MM..WW..: Analizator Chorus Trio to doskona³e

rozwi¹zanie dla wszystkich placówek medycz-

nych w naszym kraju. Ma³e gabaryty, szeroki

panel, mo¿liwoœæ wykonywania pojedynczych

oznaczeñ i wygoda u¿ytkowania stawiaj¹ nasz

nowy analizator w gronie najlepszych rozwi¹-

zañ na rynku. Dziêki zastosowanej technolo-

gii i miêdzynarodowemu dzia³owi badañ i roz-

woju posiadamy praktycznie nieograniczo-

ne mo¿liwoœci rozszerzania i modyfikacji

panelu badañ immunochemicznych dla

potrzeb naszych klientów.

WW jjaakkii ssppoossóóbb rroozzuummiiaannaa jjeesstt

pprroossttoottaa ii wwyyggooddaa ddllaa uu¿¿yyttkkooww--

nniikkaa??

MM..WW..: W naszym analizatorze

badania wykonywane s¹

w specjalnych kasetkach

zaopatrzonych we wszyst-

kie niezbêdne odczynniki

do wykonania oznaczenia.

Zasada – jeden test, jedna

kasetka, to doskona³e rozwi¹-

zanie dla osób ceni¹cych jasne i pro-

ste zasady kalkulacji kosztów badañ, To tak-

¿e rozwi¹zanie dla pacjentów oczekuj¹cych

niemal natychmiastowego wyniku badania.

Chcia³bym te¿ podkreœliæ, ¿e kalibratory

i kontrole znajduj¹ siê w ka¿dym zestawie.

WW jjaakkii ssppoossóóbb kkoonnffeekkccjjoonnoowwaannee ss¹¹ zzeessttaawwyy??

MM..WW..: Zestawy pakowane s¹ po 36 kasetek

jednego rodzaju, co pozwala na wykonanie

dok³adnie takiej liczby oznaczeñ. W przy-

Chorus Trio – nowa

jakość w immunologii

teraz dostępna równieżna polskim rynku

MAREK WITKOWSKI, PRODUCT SALES

MANAGER W PZ CORMAY S.A.

AKTUALNOŚCI

padku rzadkich badañ zastosowano opako-

wania po 12 kasetek. Takie frakcjonowanie

pozwala na zu¿ycie wszystkich testów

w ramach terminu wa¿noœci. Wymieniona

wy¿ej liczba oznaczeñ oraz d³ugie terminy

przydatnoœci do u¿ycia naszych zestawów,

pozwalaj¹ na ich ekonomiczne wykorzysta-

nie, nawet w ma³ych laboratoriach.

JJaakk sszzeerrookkii ppaanneell bbaaddaaññ ooffeerruujjee nnoowwyy aannaallii--

zzaattoorr??

MM..WW..: Chorus Trio oferuje badania w zakre-

sie trzech grup produktowych. Pierwsz¹ s¹

badania do identyfikacji chorób zakaŸnych

wykonywane metod¹ ELISA, drug¹ – bada-

nia chorób autoimmunologicznych (ELISA),

a trzeci¹ grupê stanowi¹ badania wykonywa-

ne za pomoc¹ odczynu wi¹zania dope³nia-

cza. Nale¿y podkreœliæ, ¿e wszystkie ozna-

czenia robione s¹ automatycznie. Jedyn¹

czynnoœci¹ ze strony u¿ytkownika jest apli-

kacja surowicy w odpowiednim do³ku kaset-

ki i umieszczenie jej w analizatorze.

CCzzyy bbaaddaanniiaa iimmmmuunnoollooggiicczznnee ss¹¹ bbaaddaanniiaammii

kkoosszzttoowwnnyymmii??

MM..WW..: Absolutnie nie. Oferowane przez

PZ CORMAY zestawy pochodz¹ z naszej

fabryki, st¹d ich cena nie jest obarczona

du¿ymi narzutami ze strony poœredników.

Naszym celem jest oferowanie szerokiego

panelu badañ immunologicznym laborato-

riom, które do tej pory tych badañ nie wy-

konywa³y lub by³y zmuszone do ich odsy-

³ania na zewn¹trz g³ównie ze wzglêdów

ekonomicznych.

MMeettooddyy EELLIISSAA kkoojjaarrzz¹¹ ssiiêê zz mmeettooddaammii mmaa--

nnuuaallnnyymmii,, jjaakk jjeesstt ww ttyymm pprrzzyyppaaddkkuu??

MM..WW..: Takie skojarzenie mo¿e dotyczyæ

innych producentów. Nasz nowy analizator

– Chorus Trio zapewnia rozwi¹zanie nowo-

czesne, ale te¿ w pe³ni automatyczne. Stan-

daryzacja i zachowanie stabilnych warunków

podczas ka¿dego badania w po³¹czeniu

z automatyzacj¹ badañ chorób zakaŸnych

oraz autoimmunologicznych wnosz¹ now¹

jakoœæ i bezpieczeñstwo pracy laboratorium

XXI wieku.

DDzziiêêkkuujjêê zzaa rroozzmmoowwêê..

Rozmawia³a: Monika Dziachan

Nagroda „Dynamicznego Przedsiêbiorcy”

jest presti¿owym wyró¿nieniem przy-

znawanym w³aœcicielom i wspó³w³aœcicie-

lom firm, którzy realizuj¹ z³o¿one projekty

rozwojowe, wymagaj¹ce odwagi, innowa-

cyjnego podejœcia i du¿ego zaanga¿owa-

nia osobistego. Kapitu³a II edycji konkursu

„Dynamiczny Przedsiêbiorca” zdecydowa³a

przyznaæ prezesowi ten zaszczytny tytu³

za bardzo dynamiczny rozwój spó³ki, jej in-

nowacyjnoœæ i udan¹ ekspansjê geograficz-

n¹. Wrêczenie nagrody odby³o siê 18 kwiet-

nia podczas uroczystej gali w warszawskim

hotelu Sheraton.

Prezes Tomasz Tuora „Dynamicznym Przedsiêbiorc¹”

Tomasz Tuora, prezes giełdowej spółki PZ CORMAY, został w tym roku uhonorowany tytułem „Dynamiczny Przedsiębiorca”.


Oferowane przez PZ CORMAY zestawy pochodzą

z naszej fabryki, stąd ich cena nie jest obarczona

dużymi narzutami ze strony pośredników

Wytyczne w analizie białkaBence JonesaWykrywanie i ilościowa ocena monoklonalnych wolnych łańcuchów lekkich w moczu(białko Bence Jonesa, BJP) to trudne zadanie dla diagnostów laboratoryjnych.




Mariastella Graziani1, Giampaolo Merlini2*i Concetta Petrini3 z Komisji IFCC ds. białekosocza oraz Grupy Badawczej SIBioC ds. białek

Oznaczenia z wykorzystaniem im-

munoelektroforezy (immunofiksa-

cji) umo¿liwiaj¹ okreœlenie dwóch

patognomonicznych cech ³añcuchów lek-

kich: monoklonalnoœci oraz braku ³añcu-

chów ciê¿kich. W celu wykluczenia obecno-

œci BJP w praktyce klinicznej czêsto wyko-

rzystuje siê metody immunochemiczne, ta-

kie jak nefelometria i turbidymetria. S¹ one

jednak ograniczone przez czynniki metabo-

liczne i analityczne. Na dok³adnoœæ iloœcio-

wych metod immunochemicznych ujemnie

wp³ywaj¹ heterogeniczne formy cz¹steczko-

we (fragmenty i polimery) BJP oraz brak ma-

teria³ów referencyjnych. Równie¿ precyzja

metod w odpowiednich obszarach zakresu

dynamicznego jest s³abo zdefiniowana. Za-

leca siê wykonywanie oznaczeñ metodami

immunoelektroforetycznymi, a w szczegól-

noœci metod¹ immunofiksacji, z uwagi na to,

¿e umo¿liwiaj¹ one wykazanie monoklonal-

noœci i braku ³añcuchów ciê¿kich. Immuno-

fiksacjê uwa¿a siê równie¿ za najlepsz¹ me-

todê udokumentowania znikniêcia bia³ek

monoklonalnych (ca³kowitej remisji). Fizjo-

logiê immunoglobulin oraz istotnoœæ kli-

niczn¹ BJP ilustruje Clin Chem Lab

Med. 2003: 41 (3): 338–346.

SSkkrróóttyy:: AL – amyloidoza powi¹zana

z monoklonalnymi ³añcuchami lekkimi; BJP

– bia³ko Bence Jonesa; FLC – wolny ³añcuch

lekki; HC – ³añcuch ciê¿ki; IF – immunofik-

sacja; Ig – immunoglobulina; LC – ³añcuch

lekki; LCDD – choroba depozytowa ³añcu-

chów lekkich; MC – komponent monoklonla-

ny; PAS – reakcja Schiffa; pi – punkt izoelek-

tryczny; SAP – osoczowe bia³ko amyloidu P.

DDEEFFIINNIICCJJAA

Bia³ko Bence-Jonesa (BJP) zosta³o opisa-

ne w roku 1962 jako „wolne monoklonalne

³añcuchy lekkie”, ulegaj¹ce syntezie poprzez

pojedynczy klon komórek B(1,2)

.

Prawid³owe komórki osocza wytwarzaj¹

nieznaczny nadmiar ³añcuchów lekkich

Nr 1 (26), wiosna 2013 7



(LC), lecz w nowotworach komórek B mo¿e

dochodziæ do wytwarzania znacznie wiêk-

szych iloœci. Po wysyceniu mechanizmu re-

absorpcji kanalikowej BJP wydalane jest

z moczem. Masa cz¹steczkowa BJP ró¿ni

siê, a BJP wystêpuje w moczu w formie mo-

nomerów (22 kDa), dimerów (44 kDa),

fragmentów o niskiej masie cz¹steczkowej

(5–18 kDa) lub wykazuje wysoki stopieñ

polimeryzacji.

CCHHOORROOBBYY PPOOWWII¥¥ZZAANNEE

Z obecnoœci¹ bia³ek Bence Jonesa naj-

czêœciej powi¹zane s¹ nastêpuj¹ce choroby:

• szpiczak mnogi,

• makroglobulinemia Waldenstroma,

• amyloidoza powi¹zana z monoklonalnymi

³añcuchami lekkimi (AL) i choroba depo-

zytowa ³añcuchów lekkich (LCDD).

Choroby te s¹ doœæ rzadkie, a ich wystêpo-

wanie w krajach zachodnich kszta³tuje siê

na poziomie 4/100000/rok w przypadku szpi-

czaka mnogiego i 0,9/100000/rok dla AL.

Obecnoœæ BJP mo¿e równie¿ wi¹zaæ siê

z wystêpowaniem ch³oniaków, przewlek³ej

bia³aczki limfocytarnej, jak równie¿ mo¿e

byæ idiopatyczna (³agodna lub o nieokreœlo-

nym znaczeniu).

PPRRZZYYDDAATTNNOOŒŒÆÆ KKLLIINNIICCZZNNAA

Oznaczenie BJP jest przydatne w nastê-

puj¹cych przypadkach(3)

:

• u chorych z komponent¹ monoklonaln¹

w surowicy (MC) – w procesie rozpoznania,

• badañ kontrolnych,

• u pacjentów z podejrzeniem gammapatii

monoklonanych, z objawami klinicznymi

lub laboratoryjnymi takimi, jak:

– bóle koœci, zmêczenie, nawracaj¹ce in-

fekcje, plamica, obrzêk,

– nieoczekiwana hipogammaglobulinemia

u doros³ych, niewyjaœniony wzrost

wskaŸnika opadania erytrocytów, nie-

dokrwistoœæ, leukopenia i trombocyto-

penia, bia³komocz.

WWYYKKRRYYWWAANNIIEE

PRÓBKA

Amerykañskie Kolegium Patologów wyda³o

wytyczne dotycz¹ce metod wykrywania i ilo-

œciowego oznaczania BJP w próbce moczu

z dobowej zbiórki(3,4)

, jednak ten sposób zbie-

rania materia³u jest uci¹¿liwy i nie w pe³ni wia-

rygodny, a BJP jest szczególnie podatne

na degradacjê z udzia³em bakterii. Element

ten mo¿na jednak zminimalizowaæ poprzez

dodanie czynnika przeciwbakteryjnego (np.

1g/l azydku sodowego). Bior¹c pod uwagê te

niedogodnoœci zalecamy wykonanie badania

w drugim porannym moczu oddanym sponta-

nicznie(5)

i wyra¿enie stê¿enia BJP w odniesie-

niu do poziomu kreatyniny w moczu.

Je¿eli zastosowana metoda jest wystarcza-

j¹co czu³a (patrz poni¿ej), oznaczenie mo¿-

na wykonaæ w niestê¿onej próbce moczu

(w formie wydalonej przez pacjenta). Je¿eli

dla celów klinicznych wymagana jest wiêksza

czu³oœæ oznaczenia BJP, mocz nale¿y zagê-

œciæ. W takim przypadku punkt odciêcia dla

membrany stosowanej w systemach do za-

gêszczania powinien wynosiæ 5 kDa,

a w ka¿dym przypadku poni¿ej 10 kDa.

METODA

Wybrana metoda powinna umo¿liwiaæ we-

ryfikacjê dwóch podstawowych cech LC, czyli

tego, ¿e s¹ one wolne i monoklonalne. Immu-

nofiksacja ³¹czy element elektroforetyczny

weryfikuj¹cy jednorodnoœæ molekularn¹ bia³ek

z typowaniem immunologicznym(3,4,6,7)

. Jest to

zalecana metoda wykrywania BJP.

Nale¿y zastosowaæ antysurowice prze-

ciwko ³añcuchom lekkim (LC) κ i λ wraz

z antysurowic¹ przeciwko ³añcuchom ciê¿-

kim (HC) immunoglobuliny monoklonalnej

w surowicy. Antysurowice przeciwko wolnym

³añcuchom lekkim (FLC) s¹ kosztowne, czê-

sto nieswoiste i miewaj¹ nisk¹ awidnoœæ

(Ryc. 1). Znajduj¹ zastosowanie wy³¹cznie

w przypadku podejrzenia wspó³migracji BJP

z nienaruszon¹ immunoglobulin¹. Podejrze-

nie zachodzi w przypadkach rozbie¿noœci

pomiêdzy sygna³em HC i LC z du¿¹ przewa-

g¹ na korzyœæ LC(8,9)

(Ryc. 2).

CZU£OŒÆ

WskaŸnik granicy wykrywalnoœci BJP mo-

¿e byæ tylko przybli¿ony, poniewa¿ nie ma

mo¿liwoœci dok³adnej oceny iloœciowej tego

bia³ka. Jednak z uwagi na fakt, ¿e wskazana

iloœæ wydalania poliklonalnych LC wynosi

oko³o 10 mg/l(10,11)

, zaleca siê wykorzystanie

metody z czu³oœci¹ na poziomie tej warto-

œci. Spoœród barwników najwiêksz¹ czu³oœæ

uzyskuje siê przy zastosowaniu z³ota kolo-

idalnego (1–2 mg/l). Koloidalny barwnik Co-

omassie umo¿liwia wykrycie BJP na pozio-

mie 10 mg/l lub ni¿szym(12)

.

INTERPRETACJA

Przy wykorzystaniu metod o wysokiej roz-

dzielczoœci i odpowiedniej czu³oœci, czêsto

pojawiaj¹ siê tak zwane wzory drabinko-

Ryc. 1 Przykład BJP powiązanych z pełną immunoglobulinąmonoklonalną. Zaznaczono każdą wykorzystaną antysurowicęmonoswoistą. Anoda u góry. Po prawej stronie obraz elektroforezybiałek w moczu (UPE). Oprócz albumin w obszarze anodywidoczne są wyraźne dwa pasma. Immunofiksacja pokazuje, że monoklonalne wolne łańcuchy lekkie λ tworzą więcej pasmanody, co potwierdza antysurowica przeciwko wolnym łańcuchomlekkim λ (F) (należy zauważyć nadmiar antygenu spowodowanyniskim mianem tej antysurowicy), podczas gdy pasmo katodytworzone jest przez pełne IgG λ, mimo że epitopy λ były dostępnedla antysurowicy tylko w bardzo niewielkim stopniu.

Ryc. 2 Przykład BJP współmigrujących z pełną immunoglobulinąmonoklonalną. Zaznaczono każdą wykorzystaną antysurowicęmonoswoistą. Anoda u góry. Po prawej stronie obraz elektroforezybiałek w moczu (UPE). Widoczne są następujące białka: albuminaw obszarze anody i ß2-mikroglobulina tworząca pasmo w obsza-rze ß oraz pasmo w obszarze katody λ. Immunofiksacja pokazuje,że ostatnie pasmo zostało stworzone przez monoklonalne białkoIgG κ z nałożonymi monoklonalnymi wolnymi łańcuchami lekki-mi κ. Należy zwrócić uwagę, że w porównaniu z pasmem immuno-precypitowanym antysurowicą anty IgG, antysurowica przeciwkołańcuchowi lekkiemu κ wytworzyła bardziej intensywne pasmoz nieznacznym nadmiarem antygenu. Efekt nadmiaru antygenujest znacznie bardziej wyraźny przy słabszej antysurowicy przeciw-ko wolnym łańcuchom lekkim κ (F).

Przy wykorzystaniu metod o wysokiej

rozdzielczości i odpowiedniej czułości, często

pojawiają się tak zwane wzory drabinkowe LC




we LC. Jest to wiele pasm rozmieszczonych

w równych odleg³oœciach. Zosta³y one do-

k³adnie opisane i stanowi¹ nastêpstwo wyda-

lania poliklonalnych LC u osób z upoœledzo-

n¹ reabsorpcj¹ kanalikow¹(13,14)

. Obraz jest ty-

powy i doœwiadczona osoba mo¿e odró¿niæ

go od BJP, jednak czasami trudnoœci mo¿e

przysparzaæ identyfikacja pasma BJP wspó³-

migruj¹cego z jednym z licznych pasm.

PODEJŒCIE ALTERNATYWNE

Metody immunochemiczne (nefelome-

tria, turbidymetria) iloœciowego oznaczenia

FLC w moczu mo¿na wykorzystywaæ jako

badanie przesiewowe w celu wwyykklluucczzeenniiaa

obecnoœci BJP, co pozwala na zmniejszenie

liczby kolejnych oznaczeñ wykonywanych

w próbkach. Jednak iloœæ BJP mo¿e wahaæ

siê od kilku miligramów do kilku gramów

na litr, wiêc w prosty sposób mo¿e wyst¹piæ

nadmiar antygenu. Dlatego obowi¹zkowe

jest kontrolowanie i unikanie nadmiaru anty-

genu oraz dokumentowanie poziomu wykry-

walnoœci poni¿ej 10 mg/l.

W przypadku uzyskania wyniku dodatnie-

go badanie nale¿y wykonaæ ponownie, me-

tod¹ immunofiksacji (IF), z nastêpuj¹cych

przyczyn:

• je¿eli antysurowice wykorzystywane w me-

todzie immunochemicznej s¹ skierowane

przeciwko ³añcuchom lekkim (wolnym

i zwi¹zanym), konieczne jest udokumen-

towanie faktu, ¿e ³añcuchy lekkie wystêpu-

j¹ w formie wolnej;

• z uwagi na fakt, ¿e antysurowica przeciw-

ko FLC nie ma zdolnoœci ró¿nicowania

monoklonalnych i poliklonalnych LC, ko-

nieczne jest definiowanie klonalnoœci.

Wprawdzie w szpiczaku mnogim LC syn-

teza poliklonalnych LC jest zazwyczaj

spowolniona, jednak w kilku innych istot-

nych klinicznie stanach (AL, LCDD) stê-

¿enie poliklonalnych FLC w moczu mo¿e

byæ znaczne i ulegaæ zmianom w miarê

przebiegu choroby;

• obecnie w celu ustalenia odpowiedzi

na wysokodawkow¹ chemioterapiê w szpi-

czaku mnogim zaleca siê wykonywanie

oznaczeñ metod¹ IF(15)

. Wykazano, ¿e

ujemny wynik IF oznacza najlepsze roko-

wania u pacjenta(16)

i w zwi¹zku z tym

opracowywane strategie leczenia maj¹

na celu uzyskanie w³aœnie takiego wyniku.

Bilans zysków i strat przesiewowego ba-

dania próbek na obecnoœæ BJP iloœciowymi

metodami immunochemicznymi nale¿y pod-

daæ szczegó³owej ocenie w zale¿noœci od ba-

danej populacji i analitycznych wyników za-

stosowanej metody immunochemicznej.

Badania, których wykonywania nale¿y za-

przestaæ:

1. Metody oznaczania bia³ka ca³kowitego

w moczu (metoda precypitacji i wi¹za-

nia z barwnikiem) charakteryzuje niska

czu³oœæ i brak dok³adnoœci dla BJP.

2. Paski testowe wykorzystywane w bada-

niach przesiewowych na obecnoœæ

bia³ka w standardowych badaniach

moczu s¹ nas¹czone buforowanym

barwnikiem, który wykazuje czu³oœæ

przede wszystkim na albuminê i mo¿e

nie wykryæ obecnoœci BJP.

3. Badanie metod¹ ciepln¹ jest niewiary-

godne i zosta³o wspomniane wy³¹cz-

nie z uwagi na swoj¹ wartoœæ histo-

ryczn¹, poniewa¿ nie ca³e BJP podle-

ga precypitacji pod wp³ywem wysokiej

temperatury.

OOZZNNAACCZZEENNIIAA IILLOOŒŒCCIIOOWWEE

Wiele systemów oceny stadium zaawan-

sowania choroby, definicji wolno postêpuj¹-

cej choroby oraz wytycznych dotycz¹cych

leczenia szpiczaka mnogiego i chorób po-

wi¹zanych, opartych jest o poziom dobowe-

go wydalania BJP(17–20)

. Jednak ¿adne z badañ

nie okreœla sposobu wykrycia i oznaczenia

„substancji zwanej BJP”.

Wartoœæ kliniczna iloœciowego oznaczenia

BJP jest ograniczona przez problemy meta-

boliczne i analityczne. Na wydalanie BJP

wp³yw ma stopieñ polimeryzacji, czynnoœæ

nerek oraz stopieñ odk³adania siê bia³ek

w ró¿nych tkankach, wiêc iloœæ BJP w moczu

nie jest bezpoœrednio powi¹zana z mas¹ no-

wotworow¹. Nale¿y ponownie podkreœliæ, ¿e

dok³adny pomiar BNP nie jest mo¿liwy

przy pomocy dostêpnych obecnie technik la-

boratoryjnych.

Wytyczne Amerykañskiego Kolegium Pa-

tologów zalecaj¹ wprowadzenie nastêpuj¹cej

procedury(4)

:

Metody immunochemiczne (nefelometria,

turbidymetria) ilościowego oznaczenia FLC

w moczu można wykorzystywać jako badanie

przesiewowe w celu wykluczenia obecności BJP

Nr 1 (26), wiosna 2013 9



• oznaczenie bia³ka ca³kowitego w próbce

z dobowej zbiórki,

• elektroforeza i IF stê¿onego moczu w celu

wykrycia BJP,

• densytometria piku BJP,

• okreœlenie stosunku odsetka piku BJP

do bia³ka ca³kowitego.

Procedura ta ma jednak pewne minusy:

• brak dok³adnoœci metod wykorzystywa-

nych w celu pomiaru bia³ka ca³kowitego

w moczu: metody te (zarówno precypita-

cja, jak i wi¹zanie z barwnikiem) wykazuj¹

siê czêsto nisk¹ czu³oœci¹ na mikroprote-

iny, a w szczególnoœci na BJP. Je¿eli jednak

elektroforeza moczu wykazuje, ¿e niemal-

¿e ca³e bia³ko wydalane z moczem to w³a-

œnie BJP, okreœlenie ca³kowitego bia³ka

w moczu wykonane w tym samym labora-

torium i t¹ sam¹ metod¹ w dwóch punk-

tach czasowych mo¿e dostarczyæ istot-

nych informacji dotycz¹cych skutecznoœci

leczenia;

• bia³ka mog¹ wykazywaæ siê ró¿nym powi-

nowactwem do barwników wykorzystywa-

nych na barwionych paskach w elektrofore-

zie i dlatego mo¿na zaobserwowaæ brak

liniowoœci odpowiedzi densytometrycznej;

• czêsto obecnych jest kilka pasm BJP

w moczu lub BJP wspó³migruje z innymi

bia³kami, wiêc prawid³owe oznaczenie pi-

ku BJP metod¹ densytometrii przysparza

trudnoœci.

Zaleca siê, aby badania kontrolne w na-

stêpstwie leczenia wykonywaæ w tym samym

laboratorium, aby zminimalizowaæ zró¿nico-

wanie analityczne. Wady metod immuno-

chemicznych (nefelometria, turbidymetria)

z wykorzystaniem antysurowicy przeciwko

FLC(7, 11, 21, 22)

opisano w ustêpie „Podejœcie al-

ternatywne”. Oprócz tego:

• antysurowice przeciwko poliklonalnej mie-

szaninie LC nie zawsze reaguj¹ w ten sam

sposób z monoklonalnymi LC w próbce;

• masa cz¹steczkowa BJP mo¿e byæ zró¿-

nicowana; w moczu bia³ko to przybiera

postaæ monomerów (22 kDa), dimerów

(44 kDa), fragmentów o niskiej masie

cz¹steczkowej lub wykazuje wysoki sto-

pieñ polimeryzacji. Stan agregacji/frag-

mentacji FCL w moczu jest bardzo zró¿-

nicowany, nieprzewidywalny i zale¿y

od wielu czynników (np. stê¿enie LC,

pH). Oprócz tego, antysurowice wyko-

rzystywane w iloœciowym oznaczeniu

FLC s¹ skierowane przeciwko epitopom

ukrytym w cz¹steczkach pe³nych immu-

noglobulin. W zaawansowanych stanach,

takich jak AL, fragmenty LC o ma-

sie 5–18 kDa zawieraj¹ce obszar amino-

koñcowy s¹ obecne w surowicy i moczu,

stanowi¹c jeden z g³ównych sk³adników

w³ókienek amyloidowych. S¹ to patogen-

ne fragmenty LC, w których mo¿e brako-

waæ niektórych lub wszystkich epitopów

i które mog¹ byæ s³abo rozpoznawalne

lub nierozpoznawalne przez antysurowi-

ce. Wszystkie te czynniki mog¹ mieæ

wp³yw na reakcjê immunologiczn¹ i po-

wodowaæ uniewa¿nienie kalibracji, przez

co iloœciowa ocena monoklonalnych LC

w moczu bêdzie niewiarygodna;

• precyzja metod iloœciowych w punktach

ekstremalnych zakresu dynamicznego

(bardzo istotna klinicznie: przy niskim po-

ziomie pozwala oceniæ remisjê, a przy wy-

sokim udokumentowaæ postêp) jest s³abo

zdefiniowana;

• brak jest materia³u referencyjnego dla mo-

noklonalnych LC i dlatego dok³adnoœæ po-

zostaje nierozwi¹zanym problemem;

• brak jest standaryzacji dostêpnych metod

iloœciowej oceny FLC w moczu. Wyniki mo-

g¹ siê znacznie ró¿niæ, w zale¿noœci

od metody wykonania oznaczenia; bior¹c

pod uwagê znaczn¹ mobilnoœæ pacjentów,

stanowi to powa¿ny problem.

Pomimo powy¿szych minusów immuno-

chemiczna ocena BJP mo¿e stanowiæ war-

toœæ kliniczn¹ w monitorowaniu klonów

w trakcie leczenia, lecz konieczne jest stoso-

wanie tych samych antysurowic i kalibrato-

rów podczas wszystkich badañ kontrolnych

i wziêcie pod uwagê wszystkich opisanych tu

zastrze¿eniach.

Niedawno stwierdzono, ¿e w szpicza-

ku LC iloœciowa ocena FLC w surowicy me-

tod¹ nefelometrii koreluje ze zmianami

w wydalaniu FLC z moczem(23)

. Autorzy su-

geruj¹, ¿e oznaczenia w surowicy mog¹ sta-

nowiæ alternatywê dla uci¹¿liwej dobowej

zbiórki moczu w monitorowaniu pacjentów

ze szpiczakiem LC, jednak przed rozpatrze-

niem tej alternatywy nale¿y zgromadziæ wiê-

cej danych.

AAuuttoorrzzyy bbaaddaaññ::

1. Laboratorium Chemii Klinicznej,

Ospedale Civile Maggiore, Werona, W³ochy.

2. Biotechnologiczne Laboratoria Ba-

dawcze, IRCCS Policlinico San Matteo, In-

stytut Biochemii, Uniwersytet Pavia, W³ochy.

* adres e-mail autora koresponduj¹cego:

[email protected].

3. Laboratorium Biochemiczne,Szpital

San Carlo Borromeo, Mediolan, W³ochy.

Piśmiennictwo:

1. Edelman GM, Gaily JA. The nature of Bence Jones protein: chemical similari-

ties to polypeptide chains of myeloma globulins and normal-)' globulins. J Exp

Med 1962; 116: 202–27.

2. Solomon A. Light chains immunoglobulin. Structure l-genetic correlates. Blo-

od 1986; 68: 603–7.

3. Kyle RA. Sequence of testing for monoclonal gammopathies. Serum and uri-

ne assays. Arch Pathol Lab Med 1999; 123: 114–8.

4. Keren DF, Alexanian R, Goeken JA, Go re vie PD, Kyle RA, Tomar RH. Guideli-

nes for clinical and laboratory evaluation of patients with monoclonal gammo-

pathies. Arch Pathol Lab Med 1999; 123: 106–7.

5. Hofmann W, Guder WG. A diagnostic programme for quantitative analysis of

proteinuria. J Clin Chem Clin Biochem 1989; 27: 589 Go re vie PD 600.

6. Merlini G, Aguzzi F, Whicher J. Monoclonal gammapathies. J Internat Fed Clin

Chem 1997; 9: 171–6.

7. Beetham R. Detection of Bence Jones protein in practice. Ann Clin Bio-

chem 2000; 37: 563–70.

8. Levinson SS, Keren DF. Free light chains of immunoglobulins: clinical labora-

tory analysis: critical review. Clin Chem 1994; 40: 1869–78.

9. Attaelmannan M, Levinson SS. Understanding and identifying monoclonal

gammopathies. Clin Chem 2000; 46: 1230–8.

10. Soiling K. Free light chains of immunoglobulins in normal urine determined

by radioimmunoassay. Scand J Clin Lab Invest 1975; 35: 407–12.

11. Brad we II AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Tang LX, S ho well PJ, Drayson MT,

et at. Highly sensitive, automated immunoassay for immunoglobulin free light

chains in serum and urine. Clin Chem 2001; 47: 673–80.

12. Aguzzi F, Bergami MR, Gasparro C, Merlini G. High sensitivity electrophore-

tic method for the detection of Bence Jones protein and for the study in uncon-

centrated urine. Ann Clin Biochem 1993; 30: 287–92.

13. Harrison HH, The "ladder light chain" or "pseudooligoclonal" pattern in urina-

ry immunofixation electrophoresis <IFE) studies: a distinctive IFE pattern and an

explanatory hypothesis relating it to free polyclonal light chains. Clin

Chem 1991; 37: 1559–64.

14. Mac Namara EM, Aguzzi F, Petrini C, Higginson J, Gasparro C, Bergami MR,

etai Restricted electrophoretic heterogeneity of immunoglobulin light chains in

urine. A cause of confusion with Bence Jones protein. Clin

Chem 1991; 37: 1570–4.

15. Blade J, Samson D, Reece D, Apperley J, Bjorkstrand B, Gahrton G, et al.

Criteria for evaluating disease response and progression in patients with multi-

ple myeloma treated by high-dose therapy and haemopoietic stem cell

transplantation. Myeloma Subcommittee of the EBMT. European Group for

Blood and Marrow Transplant. Br J Haematol 1998; 102: 1115–23.

16. Lahuerta JJ, Martinez-Lopez J, Serna JD, Blade J, Grande C, Alegre A, et al.

Remission status defined by immunofixation vs. electrophoresis after autologo-

us transplantation has a major impact on the outcome of multiple myeloma pa-

tients. Br J Haematol 2000; 109: 438–46.

17. Durie BG, Salmon SE. A clinical staging system for multiple myeloma. Corre-

lation of measured myeloma cell mass with presenting clinical features, respon-

se to treatment, and survival. Cancer 1975; 36: 842–54.

18. Alexanian R. Localized and indolent myeloma. Blood 1980; 56: 521–5.

19. Kyle RA, Greipp PR. Smoldering multiple myeloma. N Engl J Med

1980; 302: 1347–9.

20. Weber DM, Dimopoulos MA Moulopoulos LA, Delasalle KB, Smith T, Alexa-

nian R. Prognostic features of asymptomatic multiple myeloma. Br J Haema-

tol 1997; 97: 810–4.

21. Tillyer CR. The estimation of free light chains of immunoglobulins in biologi-

cal fluids. Int J Clin Lab Res 1992; 22: 152–8.

22. Boege F. Measuring Bence Jones protein with antibodies against bound im-

munoglobulin light chains: how reliable are the results? Eur J Clin Chem Clin

Biochem 1993; 31: 403–5.

23. Abraham RS, Clark RJ, Bryant SC, Lymp JF. LarsonT, Kyle RA etal. Correla-

tion of serum immunoglobulin free light chain quantification with urinary Bence

Jones protein in light chain myeloma. Clin Chem 2002; 48: 655–7.

Pomimo minusów immunochemiczna ocena BJP

może stanowić wartość kliniczną

w monitorowaniu klonów w trakcie leczenia


H. Louati1, G. Mechin2, E. Vanessche2, C. Poupon1

Jest to badanie wielooœrodkowe przepro-

wadzone przez dwa francuskie szpitale:

Gonesse i Eaubonne z wykorzystaniem

analizatora Sebia Capillarys 2 i Sebia Hydra-

sys w porównaniu z analizatorem Easy Inter-

lab G26. W badaniu porównawczym ozna-

czono bia³ka w surowicy metod¹ immunofik-

sacji/immunotypowania. Badanie wykaza³o

znaczne rozbie¿noœci w wynikach uzyska-

nych technik¹ Capillarys i technik¹ z ¿elem

agarozowym w analizatorach Easy Interlab

G26 i Hydrasys.

Dane podane w tabeli wykaza³y równie¿

niewielkie rozbie¿noœci pomiêdzy wynikami

uzyskanymi w Easy Interlab G26 i Hydrasys.

Jak widaæ, rozbie¿noœci pomiêdzy wynikami

uzyskanymi w oznaczeniach z wykorzysta-

niem ¿elu agarozowego przemawiaj¹ na ko-

rzyœæ Easy Interlab G26. Streszczenie bada-

nia zostanie równie¿ opublikowane we francu-

skim czasopiœmie naukowym „Opinion Bio”.

Easy Interlab G26kontra Hydrasys i CapillarysWyniki załączonego badania przeprowadzonego w 2011 roku, zaprezentowanopodczas Krajowej Konferencji w Tuluzie (Francja), która odbyła się 25–28 września 2012 roku.

10 Biuletyn Informacyjny PZ CORMAYCała prawda w jednej kropli

Elektroforeza białek w surowicy jest rutynowym

badaniem wykonywanym w laboratoriach

Nr 1 (26), wiosna 2013 11


Wyniki niezgodne uzyskane w analizatorze Interlab G26w porównaniu z Capillarys i Hydrasys

435354106129200244

+++++++

- ------

IgM L + (IgG K)słaba IgGIgG Kwolna L2 IgG KIgM K + słaba IgG KIgG K

Liczba niezgodnych próbek Interlab G26 Capillarys IFE Interlab G26

Numer próbki Interlab G26 Capillarys IFE Interlab G265354106200

++++

- ---

słaba IgGIgG Kwolna LIgM K + słaba IgG K

WYNIKI

Wyniki oznaczeñ trzema podanymi meto-

dami by³y porównywalne, a zgodnoœæ pomiê-

dzy analizatorem Interlab G26, a Capillarys

i Hydrasys wynosi³a 97,5 proc. Rozbie¿noœæ

pomiêdzy immunotypowaniem i immunofiksa-

cj¹ wynosi³a 60 proc. (18/30) pomiêdzy IFE

i Interlab G26 immunotypowanie Capillarys

oraz 33 proc. (12/36) pomiêdzy IFE w Hy-

drasys i IFE w Interlab G26. Immunofiksacja

w analizatorze Interlab G26 charakteryzuje

siê doskona³¹ czu³oœci¹ i ulepszon¹ wizualiza-

cj¹ pasm w ró¿nych frakcjach wyodrêbnionych

w elektroforezie bia³ek, prawdopodobnie

z powodu powinowactwa antysurowic.

WNIOSKI

System Interlab G26 to wysokiej jakoœci

innowacyjne rozwi¹zanie w zakresie ozna-

czeñ metod¹ elektroforezy/immunofiksacji.

Zapewnia wysok¹ jakoœæ oznaczeñ.

OOCCEENNAA DDZZIIAA££AANNIIAA NNOOWWEEGGOO

AANNAALLIIZZAATTOORRAA IINNTTEERRLLAABB GG2266

CEL BADANIA

Badanie mia³o na celu ocenê dzia³ania

automatycznego analizatora Interlab G26

w zakresie oznaczeñ wykonywanych w mate-

riale z probówek pierwotnych, w dwóch ru-

tynowych procedurach w szpitalach Eaubon-

ne i Gonesse.

MATERIA£Y I METODY

Badanie przeprowadzono w oparciu

o oznaczenia wykonane w 258 próbkach

metod¹ elektroforezy bia³ek w surowicy

w analizatorze Interlab G26 (zestaw referen-

cyjny SRE601K) rozprowadzanym we Francji

przez Orgentec SAS oraz w analizatorach

Hydrasys (zestaw referencyjny 4142) i Capil-

larys firmy Sebia (zestaw referencyjny 2003).

Po wykonaniu elektroforezy, 32 próbki ozna-

czono metod¹ immunotypowania w analiza-

torze Capillarys (zestaw referencyjny 2100),

a 36 próbek metod¹ immunofiksacji w anali-

zatorze Interlab G26 (zestaw referencyjny

SRE628K) i Hydrasys (zestaw referencyj-

ny 4302/4802).

WWYYNNIIKKII OOZZNNAACCZZEEÑÑ

PPRRZZEEPPRROOWWAADDZZOONNYYCCHH MMEETTOODD¥¥

EELLEEKKTTRROOFFOORREEZZYY SSPPEE

Oznaczenia metod¹ elektroforezy cha-

rakteryzowa³a doskona³a wizualizacja i roz-

dzia³ ró¿nych frakcji poprzez ulepszon¹ roz-

dzielczoœæ, prawdopodobnie dziêki zaletom

dobrego systemu analitycznego w zakresie

fiksacji z barwnikiem. Zautomatyzowany

analizator Interlab G26 jest prosty w obs³u-

dze i wyposa¿ony w intuicyjne, przyjazne dla

u¿ytkownika oprogramowanie.

W oznaczeniach powy¿szych próbek me-

tod¹ immunofiksacji stwierdzono wysok¹

czu³oœæ analizatora Interlab G26.

Capillarys

0,4% (1/258)

% niezgodnych próbek

Interlab G26

Hydrasys

0% (0/258)

Capillarys+

liczba niezgodnych próbek100

Interlab G26-*

IT Capillaryssłaba IgG K

Wyniki niezgodne uzyskane w analizatorze Capillarys i Hydrasysw porównaniu z Interlab G26

IT Capillarys – identyczne

40% (12/30)IFE G26

IT Capillarys – niezgodne

60% (18/30)

Porównanie wyników IFE w analizatorze Interlab G26i immunotypowania w analizatorze Capillarys

IFE Hydrasys – identyczne

70% (24/36)IFE G26

IFE Hydrasys – niezgodne

30% (12/36)

Porównanie wyników IFE w analizatorze Interlab G26 i IFEw analizatorze Hydrasys

Interlab G2697% (251/258)98% (254/258)

Wyniki zgodne uzyskane w analizatorze Interlab G26 w porównaniu z Capillarys i Hydrasys

% zgodnych wynikówCapillarysHydrasys

*Próbka ujemna również w oznaczeniu Hydrasys. U pacjenta nie występowały objawy kliniczne gammapatii monoklonalnej.


OOCCEENNAA EELLEEKKTTRROOFFOORREEZZYY BBIIAA££EEKK

WW SSUURROOWWIICCYY NNAA AANNAALLIIZZAATTOORRZZEE

IINNTTEERRLLAABB GG2266

Elektroforeza bia³ek w surowicy jest ru-

tynowym badaniem wykonywanym w labo-

ratoriach. Z uwagi na jego gwa³townie ro-

sn¹c¹ popularnoœæ, konieczne jest wpro-

wadzenie zautomatyzowanej techniki,

umo¿liwiaj¹cej wykrywanie dysproteinemii

przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej

rozdzielczoœci i jak najni¿szej granicy wy-

krywalnoœci. Analizator Interlab G26 roz-

prowadzany przez Orgentec France SAS

umo¿liwia pe³n¹ automatyzacjê elektrofo-

rezy ¿elowej z probówki pierwotnej. Ba-

danie przeprowadzono w oparciu o po-

równanie trzech metod elektroforezy bia-

³ek w surowicy w ¿elu agarozowym: anali-

zatory Interlab G26, Hydrasys i Capillarys

firmy Sebia, w celu oceny dzia³ania Inter-

lab G26.

MATERIA£Y I METODY

W ci¹gu trzech tygodni oznaczono 258

próbek pochodz¹cych z laboratoriów szpita-

li w Gonesse i Eaubonne. 30 próbek ozna-

czono metod¹ immunotypowania w analiza-

torze Capillarys, a 36 metod¹ immunofiksa-

cji (IFE) w analizatorach Interlab G26 i Hy-

drasys.



Niezgodne wyniki IFE w analizatorze Interlab G26 i IFE w analizatorzeHydrasys

33404754619094

104129196213

244247

IgG K + IgM LIgM L + wolna L2 IgG KIgG KIgG KIgG K + wolna LIgG K + wolna K2 IgA K + wolna K2 IgG KIgG K+ wolna L2 IgG K

IgG K2 IgG K + wolna L

IgM K + IgG L+L LIgG K + IgM Lprawidłowaprawidłowa2 IgG Kprawidłowaprawidłowa2 IgA KprawidłowaIgG K + IgG LIgG K + IgM L+ słabe pasmoK+ wolna L2 IgG K + IgA LIgG L

Numer próbki IFE Interlab G26 IFE Hydrasys

Niezgodne wyniki IFE w analizatorze Interlab G26 i immunotypowania w analizatorze Capillarys

1529404754616894

101103120121157168187196238244251

IgG K2 IgG LIgM L + wolna L 2 IgG KIgG KIgG KIgG K + wolna LIgG K + (wolna K)IgM L + IgG L3 IgA K + 2 wolna K 2 IgG K + IgG L + IgA KIgG K + IgG L + wolna K IgG LIgM L + IgM KIgG K + IgG LIgG K+ wolna L IgM LIgG KIgG K + IgA K

prawidłowyprawidłowyIgG KprawidłowyprawidłowyIgG K triklonalnaIgG Koligoklonalna z hiper IgAprawidłowaIgA KIgG KIgG K + IgG LprawidłowaIgM LIgG KIgG KprawidłowaprawidłowaIgG K

Numer próbki IFE Interlab G26 IT Capillarys

WWYYNNIIKKII OOZZNNAACCZZEEÑÑ MMEETTOODD¥¥

IIMMMMUUNNOOFFIIKKSSAACCJJII//IIMMMMUUNNOOTTYYPPOOWWAANNIIAA

Oznaczenia metod¹ immunofiksacji

w analizatorze Interlab G26 charakteryzo-

wa³a bardzo wysoka czu³oœæ i ulepszona wi-

zualizacja pasm odpowiadaj¹cych frakcjom

wyodrêbnionym w elektroforezie bia³ek,

dziêki powinowactwu antysurowic. Podobnie

stopieñ automatyzacji umo¿liwia po³¹czenie

elektroforezy i immunofiksacji, dziêki czemu

czas uzyskania wyniku oznaczenia bia³ek jest

krótszy.

WNIOSKI

Analizator Interlab G26 to innowacyjne

rozwi¹zanie w zakresie oznaczeñ metod¹

elektroforezy/immunofiksacji w ¿elu agaro-

zowym. Umo¿liwia pe³n¹ automatyzacjê

oznaczeñ materia³u z probówki pierwotnej.

Badanie wykaza³o doskona³¹ czu³oœæ i ³a-

twoœæ interpretacji wyniku. Oprogramowanie

jest proste w obs³udze, wspomaga interpre-

tacjê i umo¿liwia pe³n¹ spójnoœæ pomiarow¹

w zarz¹dzaniu danymi pacjenta. Analizator

doskonale spe³nia jakoœciowe wymagania la-

boratoriów w zakresie elektroforezy/immu-

nofiksacji bia³ek w surowicy.

AAuuttoorrzzyy bbaaddaaññ::

1. Service Biochimie, Immunologie, Pa-

rasitologie, Centre Hospitalier de Gonesse.

2. Service de Biochimie, Centre Hospita-

lier Intercommunal Eaubonne.



Krioglobuliny to bia³ka oraz komplek-

sy bia³ek, które precypituj¹ w niskiej

temperaturze i zazwyczaj rozpusz-

czaj¹ siê ponownie w temperaturze 37°C.

(211) (23) (42) (48)

Zjawisko krioprecypitacji po raz pierwszy

w 1929 roku zbadali i opisali Heidelberg

i Kendall. Ponownie, w kontekœcie klinicz-

nych objawów u kobiety – nosicielki szpicza-

ka, zbadali je w 1933 roku Wintrobe i Bull.

W roku 1947 Lerner i Watson po raz pierw-

szy u¿yli okreœlenia „krioglobuliny” w odnie-

sieniu do grupy immunoglobulin (Ig) posia-

daj¹cych w³aœciwoœci precypitacji i powrotu

do ponownej rozpuszczalnoœci, po pod-

grzaniu do temperatury 37°C.

Krioglobuliny

Nie zawsze podgrzanie powoduje po-

nown¹ rozpuszczalnoœæ ca³ego krioprecypi-

tatu:

W niektórych przypadkach interpretacjaproteinogramu, a zwłaszczaimmunofiksacji bywa problematyczna.Jednym z typowych przykładów na to jestobecność krioglobulin w surowicy.



KKLLAASSYYFFIIKKAACCJJAA KKRRIIOOGGLLOOBBUULLIINN

Nastêpnie w 1974 roku Brouet wraz

z zespo³em, wyodrêbni³ trzy typy krioglobu-

lin w oparciu o immunochemiczne w³aœciwo-

œci precypitatu(20)

.

KRIOGLOBULINEMIA TYP 1. WG BROUETA:

• Makroagregacja przy wewn¹trzcz¹stecz-

kowych interakcjach elektrostatycznych,

• Immunoglobulina monoklonalna z ten-

dencj¹ tworzenia kompleksów przy wyso-

kim PM,

• Wiêksza czêstotliwoœæ dla IgM k,

• Mniejsza czêstotliwoœæ dla IgG i podklas

IgG1-G2-G3,

• Rzadko IgA,

• Postaæ krioprecypitatu: amorficzny lub bez

okreœlonej struktury, cylindryczny i nawod-

niony, zwarte kryszta³y (postaæ najbardziej

uszkadzaj¹ca IgG3 w mikrokryszta³ach).


• Immunokompleksy,

• Pochodzenie formowania wskazuje na bio-

logiczn¹ aktywnoœæ immunoglobuliny,

• Immunoglobulina monoklonalna (IgM)

z aktywnoœci¹ FR przeciwko poliklonalnej

IgG, z rzadka przeciwko IgA,

• Tendencja do tworzenia kompleksów z im-

munoglobulin¹ poliklonaln¹ i FR,

• Czynnik reumatoidalny oddzia³uje przede

wszystkim na agregowan¹ formê immu-

noglobuliny, a w mniejszym stopniu

na natywn¹.

CCzzyynnnniikkii rreeuummaattooiiddaallnnee ppoowwssttaajj¹¹ ww wwyynnii--

kkuu ppaattoollooggiicczznneejj pprroolliiffeerraaccjjii kklloonnuu kkoommóórrkkii

oossoocczzaa::

• Pojedyncze monoklonalne pasmo w im-

munofiksacji.

KRIOGLOBULINEMIA TYP 2. „B” WG BROUETA:

• Immunokompleksy,

• Pochodzenie formowania wskazuje na bio-

logiczn¹ aktywnoœæ immunoglobuliny,

• Immunoglobulina oligoklonalna (IgM)

z aktywnoœci¹ FR przeciwko poliklonalnej

IgG (z rzadka przeciwko IgA),

• Tendencja do tworzenia kompleksów

z poliklonaln¹ IgG i FR,

• Czynnik reumatoidalny oddzia³uje przede

wszystkim na agregowan¹ formê immu-

noglobuliny, a w mniejszym stopniu

na natywn¹.

CCzzyynnnniikkii rreeuummaattooiiddaallnnee ppoowwssttaajj¹¹ ww wwyynnii--

kkuu ppaattoollooggiicczznneejj pprroolliiffeerraaccjjii kklloonnuu kkoommóórrkkii

oossoocczzaa::

• Dwa pasma monoklonalne w immunofik-

sacji.


• Immunoglobina poliklonalna,

• Sk³ada siê z jednej lub kilku immunoglo-

bulin,

• Czynniki reumatoidalne powstaj¹ w wyni-

ku zaburzeñ i nasilenia zapalnego proce-

su immunomodulacji podczas odpowiedzi

na antygen.

W wielu przypadkach wystêpuj¹ formy

obecnie uznawane przez Musseta (1992)

i Bellottiego (1991), które nie spe³niaj¹ kry-

teriów ¿adnej z powy¿szych klas, co daje

nadziejê na stworzenie uproszczonej klasy-

fikacji, sk³adaj¹cej siê z dwóch klas, gdzie

w pierwszej znajduj¹ siê bia³ka monoklinal-

ne, a w drugiej wszystkie formy mieszane.

Niedawno przeprowadzone badania Qi wykazały

istotną rolę wapnia w procesie krioprecypytacji

już przy temperaturze 37oC w interakcji

pomiędzy dwiema immunoglobulinami



„MIKROHETEROGENICZNE” GLOBULINY WG

MUSSETA:

• Obecnoœæ co najmniej dwóch lekkich

sk³adników monoklonalnych (22),

• Widoczny kontekst poliklonalny,

• Wiêksza czêstotliwoœæ IgG i IgM.

Potwierdzaj¹c to, co zosta³o zapropono-

wane i bior¹c pod uwagê zró¿nicowane pi-

œmiennictwo, stwierdza siê homogenicznoœæ

w wystêpowaniu krioglobulin typu 1. wg

Broueta oraz wed³ug tego, co inni autorzy

okreœlaj¹ mianem krioglobulinemii mono-

klonalnej. Z kolei dane dotycz¹ce innych

form s¹ bardzo zró¿nicowane, podkreœlaj¹c

heterogennoœæ w wyborze populacji krio-

globulin oraz brak standaryzacji tych sa-

mych metodologii.

OBJAWY KLINICZNE

S¹ one zró¿nicowane z uwagi na to, ¿e

oko³o 50 proc. krioglobulinemii monoklo-

nalnych oraz 15 proc. form mieszanych

przebiega bezobjawowo.

Najczêœciej wystêpuj¹ce objawy s¹ zwi¹-

zane z utrudnionym przep³ywem krwi spo-

wodowanym przez krioprecypitacjê w naczy-

niach w³osowatych (objaw Raynauda, mar-

twica koñczyn, sinica koñczyn, plamica na-

czyniowa itp.)

W tabeli pokazaliœmy zale¿noœci pomiê-

dzy objawami i krioglobulinemiami (tabela 1)

oraz ich wystêpowanie w ró¿nych formach

choroby (tabela 2).

MMEECCHHAANNIIZZMMYY KKRRIIOOPPRREECCYYPPIITTAACCJJII

Wiêkszoœæ czynników wp³ywaj¹cych

na krioprecypitacjê immunoglobulin mono-

klonalnych wystêpuje równie¿ w przypadku

krioglobulinemii mieszanych. Oprócz fazy

zastoju (Lawson 1987), wystêpuje faza spo-

wolniona z powstawaniem niewielkich agre-

gatów immunoglobulin, a nastêpnie gwa³-

towna i rozleg³a agregacja zwieñczona pre-

cypitacj¹.

Precypitacja mieszanych krioglobulin jest

nastêpstwem gwa³townego i postêpuj¹cego

wzrostu rozmiarów immunokompleksów

(I.C.) IgG-IgM powstaj¹cych w niskich tem-

peraturach (Brandau 1986).

Czynniki maj¹ce wp³yw na powstawanie

krioprecypitatów s¹ nastêpuj¹ce:

1. stê¿enie immunoglobulin, liczba koli-

zji, liczba spotkañ, liczba skutecznych

zderzeñ,

2. temperatura,

3. wartoœæ pH, je¿eli<7,0,

4. sta³y dielektryk rozpuszczalnika,

5. sytuacja hemodynamiczna.

Krioglobuliny s¹ wiêc zjawiskiem fizycz-

nym, wyró¿niaj¹cym siê i sztucznie stwo-

rzonym.

Dane zawarte w piœmiennictwie, na które

powo³uj¹ siê autorzy zainteresowani wyja-

œnieniem tego zjawiska, s¹ sprzeczne i nie-

rozstrzygaj¹ce.

W niniejszych bia³kach Levo stwierdzi³

redukcjê glukozamin i kwasu sialowego, co

zinterpretowa³ jako nieod³¹czne cechy cha-

rakterystyczne krioprecypitacji immunoglo-

bulin.

Inni autorzy skoncentrowali wysi³ki

na zmodyfikowanej rozpuszczalnoœci jako

funkcji odpowiedzi na czynniki zewnêtrzne,

takie jak temperatura, pH lub si³a jonowa

rozpuszczalnika. Na przyk³ad, niska tempe-

ratura mo¿e powodowaæ zmianê struktury

bia³ek, zmniejszaj¹c biegunowoœæ i rozpusz-

czalnoœæ. Bia³ka zazwyczaj precypituj¹

do swojego punktu izoelektrycznego,

przy optymalnym pH w zakresie 5,5 do 8,0.

Wp³yw si³y jonowej zjawisk precypitacji jest

ró¿ny (0,09–0,3 u). Spójnoœæ immunoglo-

bulin jest zazwyczaj niezbêdna dla celów

precypitacji i tylko w szczególnych przypad-

kach Fab i Fab2 zachowuj¹ w³aœciwoœci

umo¿liwiaj¹ce precypitacjê w niskich tempe-

raturach.

Z tego powodu krioprecypitacja mono-

klonalnych krioglobulin typu 1. wydaje siê

zale¿eæ od czwartorzêdowej struktury wê-

glowodanów i aminokwasów. Je¿eli rola wê-

glowodanów jest trudna do oceny w zjawi-

sku precypitacji, widzieliœmy w zamian

szczególne sekwencje aminokwasów, które

zaobserwowano w zró¿nicowanym obsza-

rze ³añcuchów ciê¿kich krioglobulin IgM

na zewnêtrznej czêœci cz¹steczki. W pew-

nych typach krioglobulinemii wykryto nie-

dobór tyrozyny i seryny lub obecnoœæ leu-

cyny zamiast proliny w pozycji 44. w ³añcu-

chach lekkiego ³añcucha krioglobulinemii.

Równie¿ obecnoœæ pewnych komponentów

lipidowych mo¿e stanowiæ element promu-

j¹cy brak rozpuszczalnoœci i krioprecypita-

cjê. Szczególnie interesuj¹ce s¹ niektóre

mieszane krioglobuliny monoklonalne

z izotypem IgG3, wykazuj¹ce sk³onnoœæ

do autoagregacji. Cz¹steczki te posiada-

j¹ dodatkowy aminokwasowy segment

11,000 MW w regionie zawiasowym

z czternastoma resztami cysteinowymi, sta-

nowi¹cymi element mostków dwusiarczko-

wych wewn¹trz i pomiêdzy ³añcuchami

ciê¿kimi. Nie wyjaœniono czy dodatkowy

³añcuch w ³añcuchach ciê¿kich oraz liczba

mostków dwusiarczkowych wspomagaj¹ au-

Ogólne występowanie

PlamicaMartwica kończynPokrzywkaSiność siatkowataObjaw RaynaudaSinica kończynArtralgiaObjawy nerkoweObjawy neurologiczne

5514108

509

352117

Objawy

Typ I Typ II Typ III

1540151

40155

2515

6020

00

40152035

5

700

101460

2581225

% występowania w odniesieniu do typu krioglobulinemii według Broueta

Tabela nr 1

Szpiczak mnogiMakroglobulinemia WaldenstroemaLLCLESARZespół SjogrenaChoroby wątrobyBrak istotnych w krioglobulinemii

Powiązane choroby

Typ I Typ II Typ III

4836160000

11

10133743

2052

000

1154

2937

% występowania w odniesieniu do typu krioglobulinemii według Broueta

Tabela nr 2



toagregacjê, która jest typowa dla tego izo-

topu (po³¹czenie s³abych niejonowych i hy-

drofobowych interakcji).

Molekularna podstawa krioprecypytacji

w mieszanych krioglobulinemiach jest mniej

okreœlona, poniewa¿ zjawisko to pojawia

siê przede wszystkim w zale¿noœci od po-

wstawania I.C. W przesz³oœci du¿¹ wagê

przypisywano do IgG jako antygenu stymu-

luj¹cego powstawanie czynnika reumato-

idalnego IgM. Wed³ug niektórych autorów

krioprecypitat czynnika reumatoidalnego

ró¿ni siê od przeciwcia³ przeciwko IgG

w zakresie niewielkiej reaktywnoœci z króli-

czym IgG, zwyczajowo wykorzystywanym

w oznaczaniu czynników reumatoidalnych.

Zale¿noœæ pomiêdzy krioprecypitowanym

czynnikiem reumatoidalnym i IgG badano

równie¿ pod k¹tem monomerycznych pod-

jednostek oraz fragmentów Fab pentame-

rycznych przeciwcia³ klasy IgM.

Uzyskano wartoœæ 1 w przeciwieñstwie

do obecnoœci dwóch typów przeciwcia³,

prawdopodobnie dla ograniczenia sterycz-

nego, z uwagi na niewielk¹ mo¿liwoœæ do-

stêpu do antygenu w niektórych miejscach

wi¹zania. Kompleksy czynnik reumatoidal-

ny IgM – IgG s¹ obecne w temperatu-

rze 37o

C, a zmniejszenie temperatury po-

woduje wzrost liczby miejsc wi¹zania do-

stêpnych na kompleksie czynnika reumato-

idalnego.

Niedawno przeprowadzone badania Qi

wykaza³y istotn¹ rolê wapnia w procesie

krioprecypytacji ju¿ przy temperatu-

rze 37o

C w interakcji pomiêdzy dwiema

immunoglobulinami. Zjawisko to jeszcze

œciœlej zachodzi w temperaturze 4o

C, kiedy

utworzona w ten sposób I.C., zostaje pod-

dana precypitacji tylko, je¿eli zachodz¹

szczególne warunki fizyczne i chemiczne

takie jak, obecnoœæ wapnia lub innych ka-

tionów, jak bar lub mangan. Jednym

z czynników uwa¿anych za wspomagaj¹cy

krioprecypitacjê s¹ niektóre elementy

ostrej fazy stanów zapalnych, a uwagê ba-

daczy zwróci³a szczególnie fibronektyna.

Fibronektyna jest integralnym sk³adnikiem

kriofibrynogenu oraz krioprecypitatów po-

heparynowych, gdzie przyjmuje siê teoriê

dzia³ania cz¹steczek bia³ka na wzmaganie

i objawy krioprecypitacji. W szczególnoœci

we wtórnych formach autoimmunologicz-

nych procesów zapalnych, z obecnoœci¹

krioglobulin g³ównie 3. typu, wykryto jej

obecnoœæ, lecz interakcje i ³¹czenie z krio-

precypitatem nie zosta³y jeszcze w pe³ni

zdefiniowane.

FFAAZZAA PPRRZZEEDDAANNAALLIITTYYCCZZNNAA

PPrrooppoonnoowwaannee rroozzwwii¹¹zzaanniiee pprroobblleemmuu

ttrraannssppoorrttuu pprróóbbeekk bbiioollooggiicczznnyycchh

Z uwagi na brak zaleceñ dotycz¹cych

konserwacji próbek, które musz¹ byæ spe³-

20 minut 30 minut 40 minut

37°C36°C

32,5°C32,5°C

Temperatura oznaczona w surowicy, upływ czasu

50 minut 60 minut

Termos z piaskiem 37°CTermos z wodą 37° CPojemnik z piaskiem 37°CPojemnik z wodą 37°C

36,9°C35,2C30°C30°C

36,5°C34,5°C28,5°C

28°C

36,4°C34°C27°C

26,5°C

36,3°C32°C26°C25°C

Warunki zewnętrzne: t = 25°C

nione w procedurze wykrywania krioglobu-

lin, laboratoria przyjmuj¹ procedury, które

uznaj¹ za najodpowiedniejsze. Dlatego we-

ryfikacji poddaje siê seriê niejednorodnych

i niepowtarzalnych sytuacji mog¹cych mieæ

wp³yw na procedurê wykrywania obecnoœci

krioglobulin.

Proponujemy nastêpuj¹c¹ procedurê

umo¿liwiaj¹c¹ praktyczne rozwi¹zanie tego

problemu:

PPrroocceedduurraa uussuunniiêêcciiaa kkrriioogglloobbuulliinn ww kkoonn--

ttrroolloowwaanneejj tteemmppeerraattuurrzzee

W otwartym termosie powinien znajdo-

waæ siê piasek oraz probówka o odpowied-

niej objêtoœci (powinna pomieœciæ 20/30 ml

wody i nastêpnie probówkê z próbk¹) w ter-

mostacie o temperaturze 37o

C. Czas ocze-

kiwania, aby temperatura piasku wzros³a

do po¿¹danej temperatury 37o

C, wynosi 24

godziny.

Pobraæ próbkê krwi ¿ylnej przy pomocy

strzykawki ogrzanej do temperatury 37o

C.

Otworzyæ termos i umieœciæ probówkê

z próbk¹ w wiêkszej probówce. Zatkaæ wiêk-

sz¹ probówkê, zamkn¹æ termos i przes³aæ go

do laboratorium.

Sposób utrzymania temperatury w pro-

bówce z próbk¹ opisano w tabeli nr 3,

w której podane s¹ równie¿ inne procedury

dotycz¹ce postêpowania z próbk¹.

W tabeli nr 3 podano wartoœci temperatu-

ry w próbkach, które przed przekazaniem

do laboratorium przechowywano na dwa ró¿-

ne sposoby.

W tabeli nr 4 znajduj¹ siê wyniki typo-

wania przeprowadzonego na trzech se-

riach próbek surowicy, w trzech ró¿nych

stadiach konserwacji podczas fazy pobie-

rania próbek.

Propozycja przedstawiona w tabeli nr 5

umo¿liwia zwiêkszenie odsetka próbek na-

daj¹cych siê do typowania, w kontekœcie

ukierunkowanych badañ nad krioglobuli-

nami.

FFaazzaa pprrzzeeddaannaalliittyycczznnaa:: MMaatteerriiaa³³yy ii mmeettoo--

ddyy ttyyppoowwaanniiaa kkrriioogglloobbuulliinn

Metoda: Ditiotreitol > 98 proc. (Sigma-

-Aldrich)

DDaannee ddoottyycczz¹¹ccee DDTTTT::

Ditiotreitol: doskona³y do utrzymania

grup SH w stanie redukcji, a dodany do bu-

foru próbkowego redukuje wi¹zania dwu-

siarczkowe bia³ek przed SDS PAGE.

DTT mo¿na równie¿ wykorzystaæ w celu

redukcji mostków dwusiarczkowych N, N’-bis

(akryloil) cystaminy w ¿elu poliakrylamido-

wym. DTT jest mniej toksyczny ni¿ 2-mer-

kaptoetanol. Zazwyczaj, aby uzyskaæ efekt

podobny do 2-merkaptoetanolu DTT wyko-

rzystuje siê w stê¿eniu siedmiokrotnie mniej-

szym: 100 mM DTT = 5 proc. 2-merkap-

toetanolu (5 proc. v/v, 700 mM). Odczynnik

Clelanda DTT. C4H10O2S2 FW 15425.

Mp 41 przy 44o

C.

11..11 PPrróóbbkkaa

Objêtoœæ próbki krwi niezbêdna do wy-

krycia krioglobulinemii wynosi 10 ml.

Tabela nr 3

NIEZBÊDNE MATERIA£Y:

1. Termos z zakręcaną nakrętką lub pojemniko kontrolowanej temperaturze (patrz rysunek).

2. Szklana probówka z korkiem, 40 ml (możezawierać probówkę do pobrania próbki i wody).

3. Piasek.4. Termostat o temperaturze 37oC.

Próbkê nale¿y pobraæ do probówki

przy pomocy strzykawki podgrzanej do tem-

peratury 37o

C. Dziêki takiej temperaturze

jest pewnoœæ, ¿e w ¿adnej z faz pobierania

ani transportu próbki temperatura nie spad-

nie poni¿ej wartoœci 36o

C.

11..22.. KKooaagguullaaccjjaa

Pojemnik nale¿y przetransportowaæ do la-

boratorium, z uwzglêdnieniem termostatu

ustawionego na temperaturê 37o

C, dla fazy

koagulacji próbki krwi.

Utrzymywaæ pracê termostatu przez 2/3

godz. Po koagulacji odwirowaæ probówkê

w temperaturze 37o

C w celu uzyskania czy-

stej surowicy wolnej od œladów krwinek czer-

wonych i/lub fibryny.

11..33 UUwwaaggaa:: nniiee oozznnaacczzaaææ ssuurroowwiiccyy zzee

œœllaaddaammii hheemmoolliizzyy//lliippeemmiiii


11..44 LLaabboorraattoorriiuumm

W laboratorium powinny znajdowaæ siê

probówki podgrzane do temperatury 37o

C

oraz probówki o temperaturze 4o

C, które po-

s³u¿¹ do rozdzia³u surowicy na dwie porcje.

11..55 PPoossttêêppoowwaanniiee zz ssuurroowwiicc¹¹

1) probówka nr 1 podgrzana do tempe-

ratury 37o

C.

Oznaczyæ probówkê nazwiskiem i okre-

œleniem 37o

C. Nastêpnie odpipetowaæ 500

mikrolitrów surowicy i zamkn¹æ probówkê

korkiem.

Umieœciæ w termostacie w temperatu-

rze 37o

C.

2) probówka nr 2 sch³odzona do tempe-

ratury 4o

C.

Oznaczyæ probówkê nazwiskiem i okre-

œleniem 4o

C. Nastêpnie odpipetowaæ pozo-

sta³¹ surowicê i zamkn¹æ probówkê korkiem.

Umieœciæ w lodówce w temperatu-

rze 2–6o

C.

Za zakoñczenie procesu inkubacji mo¿-

na uznaæ ca³kowite utworzenie siê krio¿elu.

Zazwyczaj czas precypitacji krio¿elu wy-

nosi 3 do 7 dni. Próbki pochodz¹ce od pa-

cjentów z HCV nale¿y przechowywaæ w lo-

dówce przez 10 dni.

11..77 BBrraakk kkrriioopprreeccyyppiittaattuu

Próbki bez obecnoœci krioglobulin.

11..88 OObbeeccnnooœœææ kkrriioopprreeccyyppiittaattuu

Wzrokowo oceniæ obecnoœæ krioprecypi-

tatu w probówce umieszczonej w lodówce.

Je¿eli krioprecypitat jest obecny w probów-

ce, nale¿y przejœæ do wykonania kolejnej

czynnoœci.

11..99 OOddwwiirroowwaanniiee nnaa zziimmnnoo

Odwirowaæ probówkê z krioprecypita-

tem, przy zachowaniu nastêpuj¹cych wa-

runków:

• temperatura 4o

C,

• 1600 obrotów na minutê,

• czas wirowania 10 minut.

Odczytanie kriokrytu.

Po zakoñczeniu wirowania sprawdziæ

wartoœæ procentow¹ krioprecypitatu w od-

niesieniu do ca³oœci, je¿eli do pomiaru u¿y-

to probówki z podzia³k¹.


7343

4

Warunki transportu

Termos z piaskiem i probówką 37°CPojemnik z wodą 37°CW dłoni około 35°C

11% 0% 5%

Liczba Odsetek dodatniego typowania

Tabela nr 5

Średnia Odchyleniestandardowe

Zakrestemperatur

36,1°C30,7°C

Temperatura próbek po dostarczeniu do laboratorium

Termos z piaskiem i wewnętrzna probówka 37°CPojemnik z wodą 37°C

2,5°C2,7°C

31,5°C\41°C25°C\35°C

Statystyki

Tabela nr 4

Zamiast probówki nr 2 do odczytu krio-

krytu mo¿na wykorzystaæ probówkê z po-

dzia³k¹.

11..66 IInnkkuubbaaccjjaa pprroobbóówweekk

Czas inkubacji wynosi nie mniej ni¿ 3 dni

i rozpoczyna siê od momentu umieszczenia

probówki w lodówce.

Krioprecypitacja monoklonalnych krioglobulin

typu 1. wydaje się zależeć od czwartorzędowej

struktury węglowodanów i aminokwasów




11..1100 IIllooœœææ bbiiaa³³kkaa ccaa³³kkoowwiitteeggoo ii//lluubb iimm--

mmuunnoogglloobbuulliinn oorraazz ((ooppccjjoonnaallnnee))

pprrzzyyggoottoowwaanniiee pprroobbóówweekk 33 ii 44

Oznaczyæ iloœæ w surowicy z probówki

nr 1 znajduj¹cej siê w termostacie i w super-

natancie z probówki nr 2 znajduj¹cej siê

w lodówce, a nastêpnie odwirowanej.

Ró¿nica pomiêdzy uzyskanymi wynikami

wskazuje na zawartoœæ i stê¿enie krioglobu-

linemii i obecne klasy immunoglobulin.

11..1111 PPrrzzyyggoottoowwaanniiee bbuuffoorruu ffoossffoorraannoo--

wweeggoo ddoo pp³³uukkaanniiaa kkrriioopprreeccyyppiittaattóóww

Roztwór 1: rozpuœciæ w 500 ml wody

destylowanej 3,4 g KH2PO4 (PM 136).

Roztwór 2: rozpuœciæ w 500 ml wody

destylowanej 4,45 g Na2HPO4.2H2O

(PM 178).

Aby uzyskaæ ostateczny roztwór roboczy

nale¿y zmieszaæ 185 ml Roztworu 1 i 315

ml Roztworu 2.

Nastêpnie dodaæ PEG 600 (v/v), aby

uzyskaæ 3 proc. roztwór PEG.

Roztwór ten nale¿y przechowywaæ

w temperaturze 2–6o

C.

11..1122 PPrrzzyyggoottoowwaanniiee rroozzttwwoorruu ddiittiioottrree--

iittoolluu ww bbuuffoorrzzee

Odwa¿yæ 0,5 g ditiotreitolu i rozpuœciæ go

w 100 ml buforu fosforanowego (pH 7,2) lub

buforu u¿ywanego w procesie elektroforezy.

Roztwór przechowywany w lodówce

i bez dostêpu œwiat³a zachowuje stabilnoœæ

przez 1 rok.

11..1133 PP³³uukkaanniiee kkrriioo¿¿eelluu

Proces p³ukania odbywa siê w probówce

nr 2 przechowywanej w lodówce.

Ostro¿nie usun¹æ supernatant, uwa¿aj¹c

aby nie usun¹æ jednoczeœnie czêœci kriopre-

cypitatu.

Dodaæ bufor fosforanowy z lodówki,

pH = 7,2, w nastêpuj¹cy sposób:

• umieœciæ w probówce niewielk¹ iloœæ bufo-

ru, ponownie zawiesiæ krioprecypitat, za-

chowuj¹c przy tym szczególn¹ ostro¿noœæ,

• odwirowaæ na zimno (4o

C) probówkê,

w taki sam sposób jak opisano w punk-

cie 1.9,

• usun¹æ supernatant z krio¿elu,

• powtórzyæ operacjê w 3/4 cyklach.

Po zakoñczeniu ostatniego p³ukania usu-

n¹æ bufor.

Próbka zosta³a przygotowana do dysa-

gregacji.

11..1144 PPoossttêêppoowwaanniiee zz pprróóbbkk¹¹ ii rroozzttwwoo--

rreemm ddiittiioottrreeiittoolluu pprrzzeedd ttyyppoowwaanniieemm

Umieœciæ szczelnie zamkniêt¹ probówkê

z wyp³ukanym precypitatem na godzinê

w k¹pieli wodnej w temperaturze 37o

C.

Umieœciæ probówkê z ditiotreitolem

w buforze na godzinê w k¹pieli wodnej

o temperaturze 37o

C.

11..1155 RRoozzcciieeññcczzeenniiee kkrriioopprreeccyyppiittaattuu rroozz--

ttwwoorreemm ddiittiioottrreeiittoolluu.. MMeettooddaa wwzzrroo--

kkoowwaa

Oparta o zmêtnienie zawiesiny.

Powtarzane rozcieñczenia:

• bardzo mêtna próbka = 1 czêœæ + 3

czêœci ditiotreitolu,

• mêtna próbka = 1 czêœæ + 2 czêœci di-

tiotreitolu,

• przejrzysta próbka = 1 czêœæ + 1 czêœæ

ditiotreitolu.

MMeettooddaa eekkssppeerryymmeennttaallnnaa

W oparciu o ró¿nicê stê¿eñ pomiêdzy

probówk¹ nr 1 i supernatantem w probówce

nr 2 oceniliœmy nastêpuj¹ce rozcieñczenia:

1) ró¿nica pomiêdzy IgG oko³o 200 mg/dl,

rozcieñczenie 1:2.

2) ró¿nica pomiêdzy IgM oko³o 150 mg/dl,

rozcieñczenie 1:2.

3) ró¿nica pomiêdzy IgA oko³o 150 mg/dl,

rozcieñczenie 1:2.

4) ró¿nica pomiêdzy IgG/IgA/IgM równa lub

mniejsza ni¿ 100 mg/dl, rozcieñcze-

nie 1:1.

11..1166 TTeemmppeerraattuurraa rroozzcciieeññcczzoonneejj pprróóbbkkii

Rozcieñczone próbki nale¿y przechowy-

waæ w k¹pieli wodnej przez godzinê.

11..1177 TTeemmppeerraattuurraa pprrzzyyrrzz¹¹ddóóww ((kkooññccóówwkkii

mmiikkrrooppiippeett,, ppoojjeemmnniikkii,, iittpp..))

Przyrz¹dy przechowywaæ w termostacie

w temperaturze 37o

C.

11..1188 PPoossttêêppoowwaanniiee zz pprróóbbkk¹¹ pprrzzeezznnaa--

cczzoonn¹¹ ddoo ttyyppoowwaanniiaa

Wyj¹æ probówki zawieraj¹ce materia³

do oznaczeñ z k¹pieli wodnej i umieœciæ

w pojemniku z wod¹ o temperatu-

rze 38–40o

C.

Pozwoli to unikn¹æ nara¿enia probówek

na nag³e zmiany temperatury.

Przenieœæ pojemnik na blat roboczy. Nie

wyjmuj¹c probówek z wody, szybko prze-

nieœæ materia³ do studzienek jednorazowego

pojemnika na próbki.

11..1199 UUssttaawwiiææ pprrooggrraamm „„kkrriioogglloobbuulliinnyy””

ww aannaalliizzaattoorrzzee IInntteerrllaabb

Program pozwala wykonaæ immunofiksa-

cjê krioglobulin, posiada nastêpuj¹c¹ cha-

rakterystykê:

ZZaapprrooggrraammoowwaanniiee ppooddggrrzzaanniiaa ¿¿eelluu

Umo¿liwia podgrzanie ¿elu agarozowego

do temperatury 37o

C.

Dziêki temu próbka zawieraj¹ca krioglo-

buliny nie zostaje poddana gwa³townym

zmianom temperatury podczas nanoszenia

próbki.

ZZaapprrooggrraammoowwaanniiee iimmmmuunnooffiikkssaaccjjii kkrriioo--

gglloobbuulliinn

Temperatura naniesienia materia³u biolo-

gicznego = 37o

C.

Umo¿liwia naniesienie próbki w kontrolo-

wanej temperaturze, dziêki czemu nie roz-

pocznie siê proces precypitacji krio¿elu.

Temperatura 37o

C podczas fazy migracji.

Umo¿liwia migracjê krio¿elu bez nara¿e-

nia na gwa³towne zmiany temperatury.

Nr 1 (26), wiosna 2013 19

PRZYPADKI KLINICZNE


We Włoszech, Hiszpanii i Francji, jak również prawdopodobnie w innych krajach śródziemnomorskich, występowaniekrioglobulinemii jest dosyć powszechne (od 30 do 50 proc. pacjentów jest zakażonych HCV). Z kolei w krajach anglosaskich(UK, USA) występuje ona stosunkowo rzadko (u około 2 proc.).

AtlasKrioglobuliny poddane immunofiksacji

Typ 1 krioglobulin wg BrouetaIgGK i brak form poliklonalnych

Typ 2 krioglobulin wg BrouetaIgM RF i poliklonalna IgG

KrioglobulinemiaKażdy z Państwa może zaangażować się w tworzenietego działu. Jeżeli spotkali się Państwo z interesującym,nietypowym przypadkiem, chętnie go opublikujemy.Mamy nadzieję, że te przypadki będą edukacyjnymnarzędziem w doskonaleniu Państwa umiejętnościdiagnostycznych.

Typ 3 krioglobulin wg Brouetapoliklonalna IgG

Mikroheterogenność krioglobulin wg MussetaIgGK i poliklonalna IgMK + wolne κ + poliklonalne λ

13–18 fileCała prawda w jednej kropli AKTUALNOŚCI Chorus Trio – nowa jakość w immunologii...

Documents

Transcript of 13–18 fileCała prawda w jednej kropli AKTUALNOŚCI Chorus Trio – nowa jakość w immunologii...