MECHANIZMY STABILNEGO DZIEDZICZENIA PLAZMIDÓW NA
PRZYKŁADZIE PLAZMIDU pSM19035
Natalia Mieczysławska
plazmidy - samodzielne pozachromosomowe replikony losowy rozdział plazmidów do komórek potomnych systemy wspomagania stabilnego dziedziczenia
plazmidów systemy post-segregacyjnego zabijania (PSK) charakterystyka plazmidu pSM19035
PLAZMIDY
Samodzielne pozachromosomowe replikony występują u bardzo wielu organizmów
prokariotycznych oraz u niektórych eukariontów
cechuje je zdolność do trwałego utrzymywania się (stable maintenance) w komórce i replikowania się w niej w kontrolowany sposób
bardzo różnorodne pod względem rozmiarów, struktury i funkcji
odgrywają znacząca rolę w zdolnościach adaptacyjnych prokariontów i w konsekwencji w ich ewolucji
Plazmidy bakteryjne zdolne są do autonomicznej replikacji, za którą odpowiedzialne są regiony (zwykle 1-3kb) zawierające geny kodujące białka replikacyjne, sekwencje regulatorowe oraz miejsce startu replikacji.
wielkość plazmidu i liczba jego kopii w komórce odgrywa bardzo ważną rolę w stabilnym dziedziczeniu
LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH
Jeżeli założymy, że podczas losowego rozdziału każda z cząsteczek plazmidu ma takie same szanse dostania się do jednej z dwóch komórek potomnych, wówczas komórki bezplazmidowe będą pojawiać się w populacji z częstością zależną od liczby kopii plazmidu zgodnie ze wzorem (Nordström i Austin 1989r.) :
)1(2 nP P - prawdopodobieństwo powstania komórki bezplazmidowej (tzw. czystość segregacji plazmidu)
n - liczba kopii plazmidu
jeżeli n =2 komórki bezplazmidowe powinny pojawić się już po 2 podziałach, jeżeli n =20 częstość segregacji wynosi mniej niż 10 -6
PLAZMIDY:(1kb-1,7Mb)
małeśredniedużemegaplazmidy
jednokopioweniskokopiowe
(2-8 kopii na komórkę)
wysokokopiowe
od częstości segregacji zależy segregacyjna stabilność plazmidów
jest to wystarczające dla stabilnego dziedziczenia w przypadku plazmidów wysokokopiowych
LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH
LEPSZY NIŻ LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH
Istnieją specyficzne mechanizmy stabilnego dziedziczenia plazmidów:
A System miejscowo specyficznej rekombinacji (wspomaga jedynie rozdział losowy plazmidów)
B System aktywnego rozdziału (partycji) C Systemy post-segregacyjnego zabijania (addykcyjne)
W rzeczywistości nawet plazmidy o niskiej liczbie kopii są niezwykle trwale utrzymywane w populacjach bakteryjnych, niezależnie od braku presji selekcyjnej
SITE-SPECIFIC RECOMBINATION SYSTEMS
plazmidy kodują tzw. mrs (multimer resolution system) przeciwdziałający utrzymywaniu się form oligomerycznych w komórce
system ten tworzy miejscowo-specyficzna rekombinaza (resolwaza), która rozpoznaje tzw.sekwencje res
KATASTROFA DIMEROWAPowstawanie dimerów lub form oligomerycznych wyższego rzędu wśród identycznych kopii plazmidówproblem z miejscami oriczęstsze niż oczekiwane powstawanie komórek bezplazmidowych
ACTIVE PARTITION
Wspomagają fizyczny rozdział kopii plazmidów do komórek potomnych
konieczne jest: miejsce centromerowe gen kodującego białko
wiążące się do DNA rejonu centromerowego
gen o właściwościach ATP-azy oba geny, kodujące
odpowiednie białka (tworzące kompleks nukleoproteinowy) wchodzą w skład operonu, którego transkrypcja jest przez nie regulowana
PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PSK)
Działają po podziale komórki, uzależniają komórkę gospodarza od występujących w niej plazmidów (addykcja)
nazywane systemami post- segregacyjnego zabijania (PSK), systemami trucizna - odtrutka, toksyna - antidotum (TA)
ideę addykcji zaproponował Koyama w 1975r. zauważając, ze jeśli komórka tracąca plazmid ginie, to w populacji nigdy nie znajdzie się
pozbawionych plazmidów komórek potomnych
system ten tworzą przynajmniej dwa geny plazmidowe, warunkujące powstawanie:
stabilnej trucizny
( dłuższy okres półtrwania) nietrwałego antidotum
(krótki czasie półtrwania)
SYSTEMY ADDYKCYJNE (PSK)
Trucizna jest białkiem, antidotum antysensownym RNA
Trucizna i antidotum są białkami
SYSTEMY PSK REGULOWANE PRZEZ ANTYSENSOWNY RNA
zbadane i opisane na przykładzie systemu hok-sok (host killing, supression of killing) znajdującego się na plazmidzie R1 E. coli
zawiera on trzy nakładające się geny : hok - kodujący toksynę
mok - regulujący translację trwałego mRNA trucizny
sok - kodujący nietrwały antysensowny RNA, komplementarny do obszaru 5’ mRNA mok-hok.
wysoką trwałość mRNA trucizny powoduje występująca na jego 3’ końcu strukturze fbi (fold back inhibition)
PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS)
PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS)
dwa (lub trzy) geny stanowią operon autoregulacja transkrypcji:
antidotum samo lub w kompleksie z trucizna działa jako represor promotora
PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS)
• podobieństwa strukturalne i funkcjonalne systemów
• nie ma znaczących podobieństw sekwencji ich genów
• małe białka (70-130aa)
•białko trucizny na ogół większe od antidotum
PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS)
Pomimo intensywnych badań prowadzonych przez ostatnie lata nad różnymi systemami trucizna - antidotum tylko dla nielicznych
z nich udało się ustalić molekularny mechanizm działania trucizny
PLAZMID pSM19035
plazmid niskokopiowy (ok. 2-5 cząsteczek plazmidu na chromosom bakteryjny)
plazmid o szerokim zakresie gospodarzy
replikuje (według schematu theta) w bakteriach Gram-dodatnich, w których zawartość par G+C w DNA chromosomalnym jest niska
koduje oporność na erytromycynę
wyizolowany z patogennych komórek klinicznego szczepu Streptococcus pyogenes
prawie 80% cząsteczki stanowią powtórzone sekwencje w komórkach Bacillus subtilis plazmid wykazuje 1000 razy większą stabilność niż wynikałoby to z losowego rozdziału
28975bps
PLASMID pSM19035
Seg A, gen system miejscowo specyficznej rekombinacji.
wymaga chromosomalnego histono - podobnego białka komórkowego Hbsu (w Bacillus subtilis)
Seg B oraz -- . lepszy niż losowy rozdział plazmidów genu aktywny rozdział plazmidów operon -- proces post-segregacyjnego zabijania
na plazmidzie tym zidentyfikowano dwa
rejony zaangażowane w trzy różne procesy
stabilnego dziedziczenia:
SYSTEM -- PLAZMIDU pSM19035
gen antidotum Epsilon (90aa)
proteaza degradująca ClpXP gen trucizna Zeta
(287aa) gen białko Omega
(71aa)
Białko omega jest globalnym regulatorem funkcjonowania genów plazmidu pSM19035:• reguluje liczbę kopii plazmidu, działając na gen CopS • reguluje ekspresję genu i wpływa na aktywną partycję• jest represorem transkrypcji operonu --
OMEGA JAKO GLOBALNE BIAŁKO REGULATOROWE
SYSTEM PSKAKTYWNA PARTYCJA
KONTROLA LICZBY KOPII
SYSTEM -- PLAZMIDU pSM19035
brak znaczącego podobieństwa do znanych sekwencji wśród sekwencji kodujących białka Zeta, Epsilon i Omega
jedyny dobrze rozpoznawalny motyw jest obecny w N-końcowym rejonie Zety i jest nim ATP/GTP wiążący motyw Walkera (P- loop)
wykorzystując drożdżowy system dwuhybrydowy wykazano wzajemne oddziaływanie Zety i białka Epsilon
analizując mutanty delecyjne powstałe wskutek ukierunkowanej mutagenezy genów i wykazano wzajemne oddziaływanie N- końca białka Epsilon i N-końca białka Zeta
udało się również wykrystalizować (Meinhart 2003r.) kompleks białek trucizny i odtrutki (Epsilon2Zeta2)
STRUKTURA BIAŁKA OMEGA
PRZYSZŁOŚĆ
Identyfikacja rejonu trucizny Zety odpowiedzialnego za toksyczne działanie
znalezienie celu dla działania trucizny
WNIOSKI KOŃCOWE
Niskokopiowe plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy stanowią bardzo interesujący obiekt badawczy:
wektory, również jako wektory miedzy komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi
konstrukcje nowych leków antybakteryjnych wykorzystanie plazmidowych systemów post segregacyjnego zabijania w
walce z patogennymi drobnoustrojami (środki farmakologiczne nowej
generacji)
Top Related