MECHANIZMY STABILNEGO DZIEDZICZENIA PLAZMIDÓW NA

PRZYKŁADZIE PLAZMIDU pSM19035

Natalia Mieczysławska

plazmidy - samodzielne pozachromosomowe replikony losowy rozdział plazmidów do komórek potomnych systemy wspomagania stabilnego dziedziczenia

plazmidów systemy post-segregacyjnego zabijania (PSK) charakterystyka plazmidu pSM19035

PLAZMIDY

Samodzielne pozachromosomowe replikony występują u bardzo wielu organizmów

prokariotycznych oraz u niektórych eukariontów

cechuje je zdolność do trwałego utrzymywania się (stable maintenance) w komórce i replikowania się w niej w kontrolowany sposób

bardzo różnorodne pod względem rozmiarów, struktury i funkcji

odgrywają znacząca rolę w zdolnościach adaptacyjnych prokariontów i w konsekwencji w ich ewolucji

Plazmidy bakteryjne zdolne są do autonomicznej replikacji, za którą odpowiedzialne są regiony (zwykle 1-3kb) zawierające geny kodujące białka replikacyjne, sekwencje regulatorowe oraz miejsce startu replikacji.

wielkość plazmidu i liczba jego kopii w komórce odgrywa bardzo ważną rolę w stabilnym dziedziczeniu

LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH

Jeżeli założymy, że podczas losowego rozdziału każda z cząsteczek plazmidu ma takie same szanse dostania się do jednej z dwóch komórek potomnych, wówczas komórki bezplazmidowe będą pojawiać się w populacji z częstością zależną od liczby kopii plazmidu zgodnie ze wzorem (Nordström i Austin 1989r.) :

)1(2 nP P - prawdopodobieństwo powstania komórki bezplazmidowej (tzw. czystość segregacji plazmidu)

n - liczba kopii plazmidu

jeżeli n =2 komórki bezplazmidowe powinny pojawić się już po 2 podziałach, jeżeli n =20 częstość segregacji wynosi mniej niż 10 -6

PLAZMIDY:(1kb-1,7Mb)

małeśredniedużemegaplazmidy

jednokopioweniskokopiowe

(2-8 kopii na komórkę)

wysokokopiowe

od częstości segregacji zależy segregacyjna stabilność plazmidów

jest to wystarczające dla stabilnego dziedziczenia w przypadku plazmidów wysokokopiowych

LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH

LEPSZY NIŻ LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH

Istnieją specyficzne mechanizmy stabilnego dziedziczenia plazmidów:

A System miejscowo specyficznej rekombinacji (wspomaga jedynie rozdział losowy plazmidów)

B System aktywnego rozdziału (partycji) C Systemy post-segregacyjnego zabijania (addykcyjne)

W rzeczywistości nawet plazmidy o niskiej liczbie kopii są niezwykle trwale utrzymywane w populacjach bakteryjnych, niezależnie od braku presji selekcyjnej

SITE-SPECIFIC RECOMBINATION SYSTEMS

plazmidy kodują tzw. mrs (multimer resolution system) przeciwdziałający utrzymywaniu się form oligomerycznych w komórce

system ten tworzy miejscowo-specyficzna rekombinaza (resolwaza), która rozpoznaje tzw.sekwencje res

KATASTROFA DIMEROWAPowstawanie dimerów lub form oligomerycznych wyższego rzędu wśród identycznych kopii plazmidówproblem z miejscami oriczęstsze niż oczekiwane powstawanie komórek bezplazmidowych

ACTIVE PARTITION

Wspomagają fizyczny rozdział kopii plazmidów do komórek potomnych

konieczne jest: miejsce centromerowe gen kodującego białko

wiążące się do DNA rejonu centromerowego

gen o właściwościach ATP-azy oba geny, kodujące

odpowiednie białka (tworzące kompleks nukleoproteinowy) wchodzą w skład operonu, którego transkrypcja jest przez nie regulowana

PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PSK)

Działają po podziale komórki, uzależniają komórkę gospodarza od występujących w niej plazmidów (addykcja)

nazywane systemami post- segregacyjnego zabijania (PSK), systemami trucizna - odtrutka, toksyna - antidotum (TA)

ideę addykcji zaproponował Koyama w 1975r. zauważając, ze jeśli komórka tracąca plazmid ginie, to w populacji nigdy nie znajdzie się

pozbawionych plazmidów komórek potomnych

system ten tworzą przynajmniej dwa geny plazmidowe, warunkujące powstawanie:

stabilnej trucizny

( dłuższy okres półtrwania) nietrwałego antidotum

(krótki czasie półtrwania)

SYSTEMY ADDYKCYJNE (PSK)

Trucizna jest białkiem, antidotum antysensownym RNA

Trucizna i antidotum są białkami

SYSTEMY PSK REGULOWANE PRZEZ ANTYSENSOWNY RNA

zbadane i opisane na przykładzie systemu hok-sok (host killing, supression of killing) znajdującego się na plazmidzie R1 E. coli

zawiera on trzy nakładające się geny : hok - kodujący toksynę

mok - regulujący translację trwałego mRNA trucizny

sok - kodujący nietrwały antysensowny RNA, komplementarny do obszaru 5’ mRNA mok-hok.

wysoką trwałość mRNA trucizny powoduje występująca na jego 3’ końcu strukturze fbi (fold back inhibition)

PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS)

PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS)

dwa (lub trzy) geny stanowią operon autoregulacja transkrypcji:

antidotum samo lub w kompleksie z trucizna działa jako represor promotora

PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS)

• podobieństwa strukturalne i funkcjonalne systemów

• nie ma znaczących podobieństw sekwencji ich genów

• małe białka (70-130aa)

•białko trucizny na ogół większe od antidotum

PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS)

Pomimo intensywnych badań prowadzonych przez ostatnie lata nad różnymi systemami trucizna - antidotum tylko dla nielicznych

z nich udało się ustalić molekularny mechanizm działania trucizny

PLAZMID pSM19035

plazmid niskokopiowy (ok. 2-5 cząsteczek plazmidu na chromosom bakteryjny)

plazmid o szerokim zakresie gospodarzy

replikuje (według schematu theta) w bakteriach Gram-dodatnich, w których zawartość par G+C w DNA chromosomalnym jest niska

koduje oporność na erytromycynę

wyizolowany z patogennych komórek klinicznego szczepu Streptococcus pyogenes

prawie 80% cząsteczki stanowią powtórzone sekwencje w komórkach Bacillus subtilis plazmid wykazuje 1000 razy większą stabilność niż wynikałoby to z losowego rozdziału

28975bps

PLASMID pSM19035

Seg A, gen system miejscowo specyficznej rekombinacji.

wymaga chromosomalnego histono - podobnego białka komórkowego Hbsu (w Bacillus subtilis)

Seg B oraz -- . lepszy niż losowy rozdział plazmidów genu aktywny rozdział plazmidów operon -- proces post-segregacyjnego zabijania

na plazmidzie tym zidentyfikowano dwa

rejony zaangażowane w trzy różne procesy

stabilnego dziedziczenia:

SYSTEM -- PLAZMIDU pSM19035

gen antidotum Epsilon (90aa)

proteaza degradująca ClpXP gen trucizna Zeta

(287aa) gen białko Omega

(71aa)

Białko omega jest globalnym regulatorem funkcjonowania genów plazmidu pSM19035:• reguluje liczbę kopii plazmidu, działając na gen CopS • reguluje ekspresję genu i wpływa na aktywną partycję• jest represorem transkrypcji operonu --

OMEGA JAKO GLOBALNE BIAŁKO REGULATOROWE

SYSTEM PSKAKTYWNA PARTYCJA

KONTROLA LICZBY KOPII

SYSTEM -- PLAZMIDU pSM19035

brak znaczącego podobieństwa do znanych sekwencji wśród sekwencji kodujących białka Zeta, Epsilon i Omega

jedyny dobrze rozpoznawalny motyw jest obecny w N-końcowym rejonie Zety i jest nim ATP/GTP wiążący motyw Walkera (P- loop)

wykorzystując drożdżowy system dwuhybrydowy wykazano wzajemne oddziaływanie Zety i białka Epsilon

analizując mutanty delecyjne powstałe wskutek ukierunkowanej mutagenezy genów i wykazano wzajemne oddziaływanie N- końca białka Epsilon i N-końca białka Zeta

udało się również wykrystalizować (Meinhart 2003r.) kompleks białek trucizny i odtrutki (Epsilon2Zeta2)

STRUKTURA BIAŁKA OMEGA

PRZYSZŁOŚĆ

Identyfikacja rejonu trucizny Zety odpowiedzialnego za toksyczne działanie

znalezienie celu dla działania trucizny

WNIOSKI KOŃCOWE

Niskokopiowe plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy stanowią bardzo interesujący obiekt badawczy:

wektory, również jako wektory miedzy komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi

konstrukcje nowych leków antybakteryjnych wykorzystanie plazmidowych systemów post segregacyjnego zabijania w

walce z patogennymi drobnoustrojami (środki farmakologiczne nowej

generacji)