Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/2 73

Adres do korespodencji: dr med. Mariola Pawlaczyk, Katedra i Klinika Dermatologii AM, ul. Przybyszewskiego 49, 60-355 Poznañ,e-mail: m_p@go2.pl

ZZaassttoossoowwaanniiee bbaaddaańń iimmmmuunnoohhiissttoocchheemmiicczznnyycchh ii tteecchhnniikk bbiioollooggiiii mmoolleekkuullaarrnneejj ww ddiiaaggnnoossttyyccee zziiaarrnniinniiaakkaa ggrrzzyybbiiaasstteeggooTThhee uussee ooff iimmmmuunnoohhiissttoocchheemmiissttrryy aanndd mmoolleeccuullaarrbbiioollooggyy tteecchhnniiqquueess iinn tthhee ddiiaaggnnoossiiss ooff mmyyccoossiiss ffuunnggooiiddeess

MARIOLA PAWLACZYK1, ELŻBIETA PORĘBA2, VIOLETTA FILAS3, TAMARA BANASIAK3,LUCYNA KRAMER4, JAN BRĘBOROWICZ3, ANNA GOŹDZICKA-JÓZEFIAK2

1 Katedra i Klinika Dermatologii AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry i Kliniki prof. dr hab. med.Wojciech Silny; 2 Zakład Wirusologii Molekularnej Instytutu Biotechnologii UAM, kierownik Zakładu prof. dr hab. AnnaGoździcka-Józefiak; 3 Katedra Onkologii AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry prof. dr hab. med.Jan Bręborowicz; 4 Katedra i Zakład Informatyki i Statystyki AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry i Zakładu prof. dr hab. Jerzy Moczko

AbstractMycosis fungoides (MF) is the most common primary

cutaneous T-cell lymphoma which may be difficult to dia-gnose at the early stage. The aim of the study was to evalu-ate the usefulness of immunohistochemical examinations andT-cell receptor γ gene (TCRγ) rearrangement analysis in thediagnosis of MF. Immunohistochemical reactions were per-formed with antibodies to CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8and CD20 cell markers of skin infiltrates. TCRγ rearrange-ments were detected using the method of polymerase chainreaction with the subsequent separation of products by tem-perature gradient gel electrophoresis. The studied groupconsisted of 49 patients with MF and 25 patients with in-flammatory dermatoses. In the majority of MF skin infiltra-tes cells expressed the immunophenotype: CD2+, CD3+,CD4+, CD5+, CD7-, CD8- and CD20- did not vary signi-ficantly from phenotypes observed in chronic inflammatorydermatoses. Dominant clones with TCRγ rearrangement we-re detected in 85% of MF skin biopsies and in 63% of MFperipheral blood cells whereas in the control group in 11%and 14% of cases, respectively. Statistically significant dif-ferences were found in the occurrence of clonal T-cells inskin infiltrates between patients with MF and the controlgroup. A statistical analysis of TCRγ rearrangement in pe-

StreszczenieZiarniniak grzybiasty (MF) jest najczêœciej wystêpuj¹cym

pierwotnym ch³oniakiem skóry T-komórkowym, który w po-cz¹tkowym okresie choroby czêsto sprawia trudnoœci diagno-styczne. Celem pracy by³a ocena przydatnoœci badañ immu-nohistochemicznych oraz rearan¿acji genu γ receptora limfo-cytów T (TCRγ) w diagnostyce ziarniniaka grzybiastego (MF).Reakcje immunohistochemiczne prowadzono z przeciwcia³a-mi przeciw markerom CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8,CD20 komórek nacieków skórnych. Do analizy rearan¿acjiTCRγ zastosowano metodê PCR z elektroforetycznym rozdzia-³em heterodupleksów w ¿elu, w gradiencie temperaturowym.Badaniami objêto 49 chorych na MF w ró¿nych stadiach oraz25 chorych z dermatozami zapalnymi. W wiêkszoœci naciekówskórnych MF na komórkach stwierdzano immunofenotypCD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7-, CD8-, CD20-, podobnydo wystêpuj¹cego w przewlek³ych zapalnych chorobach skó-ry. Dominuj¹ce klony z rearan¿acj¹ TCRγ wykryto w wycin-kach skórnych u 85%, a w komórkach krwi obwodowej u 63%ogó³u chorych z MF, podczas gdy w grupie kontrolnej odpo-wiednio u 11 i 14% chorych. Stwierdzono statystycznie istot-ne ró¿nice w porównaniu wystêpowania klonów limfocytówT w naciekach skórnych u chorych z MF w stosunku do cho-rych z grupy kontrolnej. Analiza statystyczna wyników rearan-

Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/274

Mariola Pawlaczyk, El¿bieta Porêba, Violetta Filas, Tamara Banasiak, Lucyna Kramer, Jan Brêborowicz,Anna GoŸdzicka-Józefiak

WstępW przebiegu klinicznym ziarniniaka grzybiastego (myco-

sis fungoides, MF), najczêœciej wystêpuj¹cego nowotworu

z grupy pierwotnych ch³oniaków skórnych T-komórkowych,

wyró¿nia siê 3 nastêpuj¹ce kolejno po sobie stadia rozwojo-

we: rumieniowe, naciekowe i guzowate [1, 2]. W ka¿dym okre-

sie MF dojœæ mo¿e do erytrodermii, co pogarsza rokowanie

[2, 3]. Prawid³owe rozpoznanie wczesnego stadium choroby

sprawia trudnoœci diagnostyczne klinicystom i histopatologom

ze wzglêdu na podobieñstwo obrazu klinicznego oraz histopa-

tologicznego zmian skórnych do dermatoz zapalnych o prze-

wlek³ym przebiegu, takich jak wyprysk, ³uszczyca, przy³usz-

czyca plackowata [2, 4, 5]. Erytrodermiê w przebiegu MF trud-

no jest zró¿nicowaæ z erytrodermi¹ innego pochodzenia [3, 6,

7], dlatego chorym podejrzanym o MF czêsto wielokrotnie po-

biera siê wycinki skórne do badañ [2, 7].

W diagnostyce pierwotnych ch³oniaków skóry obok ba-

dañ histopatologicznych zmian skórnych, wykorzystuje siê ba-

dania immunohistochemiczne, wykrywaj¹ce markery po-

wierzchniowe komórek nacieków [8, 9], a w ostatnich latach

coraz szerzej stosuje siê techniki biologii molekularnej [10–12].

W procesie dojrzewania prawid³owe limfocyty T przecho-

dz¹ rearan¿acje regionów zmiennych, ³¹cz¹cych i sta³ych w ob-

rêbie genów receptora limfocytów T (T cell receptor, TCR),

w wyniku czego ka¿d¹ komórkê charakteryzuj¹ okreœlone

cz¹stki powierzchniowe, a wszystkie komórki siostrzane wy-

wodz¹ce siê z dojrza³ych limfocytów T wykazuj¹ ekspresjê

tych samych TCR. W procesach nowotworzenia zwi¹zanych

z monoklonaln¹ proliferacj¹ limfocytów T, do których zalicza

siê MF, liczba jednakowych komórek bêdzie wiêc wzrastaæ do

poziomu daj¹cego siê wykryæ technikami molekularnymi

[11–15].

Celem pracy by³a ocena przydatnoœci badañ immunohi-

stochemicznych markerów powierzchniowych komórek na-

cieków skórnych oraz analizy rearan¿acji genu γ TCR w dia-

gnostyce ziarniniaka grzybiastego.

Materiał i metodyBadaniami objêto materia³ pochodz¹cy od 49 chorych na

MF, w wieku od 34 do 82 lat, leczonych w Klinice Dermatolo-

gii AM w Poznaniu, b¹dŸ diagnozowanych w Katedrze Onko-

ripheral blood cells did not reveal any differences only inpatients with the MF in the early stage (IA) when comparedwith inflammatory dermatoses. Detection of TCRγ rearran-gement is a valid supplement to histopathologic and immu-nohistochemical examination in cases of suspected MF ho-wever the diagnosis should always be based on the analysisof examinations and clinical status of patients.

Key words: mycosis fungoides, immunonohistochemicaldiagnosis, monoclonality.

¿acji TCRγ w komórkach krwi obwodowej nie wykaza³a istot-nych ró¿nic tylko w stadium pocz¹tkowym (IA) MF w porów-naniu z dermatozami ³agodnymi. W przypadkach podejrzeniaMF, wykrycie rearan¿acji genu TCRγ stanowi cenne uzupe³-nienie diagnostyki histopatologicznej i immunohistochemicz-nej, jednak rozpoznanie powinno byæ zawsze stawiane na pod-stawie ca³oœciowej oceny badañ i stanu klinicznego chorych.

S³owa kluczowe: ziarniniak grzybiasty, diagnostyka im-munohistochemiczna, monoklonalnoœæ.

(PDiA 2003; XX, 2: 73–79)

Tab. 1. Stadium zaawansowania ziarniniaka grzybiastego wg klasyfikacji TNM*

Stadium T (tumor) N (lymph node) M (metastasis)

IA rumienie i nacieki <10% brak lymphadenopatii brakpowierzchni skóry (T1) lub zmiany odczynowe w wêz³ach

IB rumienie i nacieki >10% brak lymphadenopatii brakpowierzchni skóry (T 2) lub zmiany odczynowe w wêz³ach

IIA rumienie i nacieki lymphadenopatia ze zmianami brak

odczynowymi w wêz³ach ch³onnych

IIB guzy >1 (T3) brak lymphadenopatii lub zmiany brakodczynowe w wêz³ach

III erytrodermia (T4) lymphadenopatia ze zmianami brakodczynowymi w wêz³ach ch³onnych

IVA T1, T2, T3 lub T4 nacieki nowotworowe brakw wêz³ach ch³onnych

IVB T1, T2, T3 lub T4 zmiany odczynowe zajêcie narz¹dówlub nowotworowe w wêz³ach ch³onnych wewnêtrznych

*Podzia³ przyjêty przez Miêdzynarodow¹ Konferencjê okreœlaj¹c¹ zasady leczenia ch³oniaków skóry [16]

Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/2 75

Zastosowanie badañ immunohistochemicznych i technik biologii molekularnej w diagnostyce ziarniniaka grzybiastego

logii AM w Poznaniu, w latach 1994–2002. Stadium MF ocenia-no wg klasyfikacji TNM, przedstawionej w tab. 1. [16]. Do grupkontrolnych w³¹czono 15 chorych na przewlek³y, rozsiany wy-prysk kontaktowy niealergiczny, 10 chorych na ³uszczycê oraz10 chorych na przy³uszczycê plackowat¹ drobnoogniskow¹. Ma-teria³ pobierany by³ przed wdro¿eniem leczenia i obejmowa³ wy-cinki skórne oraz u czêœci chorych krew obwodow¹. We wszyst-kich przypadkach rozpoznania potwierdzane by³y rutynowymibadaniami laboratoryjnymi z uwzglêdnieniem szczegó³owej oce-ny rozmazu krwi obwodowej, badaniem radiologicznym klatkipiersiowej oraz ultrasonograficznym jamy brzusznej, ocen¹ hi-stopatologiczn¹ i immunohistochemiczn¹ wycinków skórnychoraz wêz³ów ch³onnych w przypadku ich powiêkszenia. Bada-nia immunohistochemiczne markerów powierzchniowych CD2,CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD20 na komórkach naciekówskórnych wykonywano w skrawkach parafinowych i kriostato-wych, z zastosowaniem przeciwcia³ monoklonalnych firmy Da-ko i Novocastra oraz metody immnuohistochemicznej z kom-pleksem EnVision + HPR. Reakcje immunohistochemiczne uzna-wano za dodatnie, je¿eli barwi³o siê co najmniej 50% komórekjednoj¹drzastych nacieku. Oceny histopatologicznej i immuno-histochemicznej dokonywa³y niezale¿nie, dwie ró¿ne osoby.

Analizê rearan¿acji genu γ TCR przeprowadzono w wycin-kach skórnych i krwi obwodowej, stosuj¹c metodê PCR (poly-merase chain reaction, PCR), z elektroforetycznym rozdzia³emheterodupleksów w ¿elu, w gradiencie temperaturowym (HD-TGGE, heteroduplex temperature gradient gel electropho-resis). Do izolacji genomowego DNA z wycinków skórnychskrawano 10 skrawków po 10 µm ka¿dy. W celu odparafino-wania materia³ poddawano dzia³aniu ksylenu, a po odwirowaniui przep³ukaniu etanolem trawiono proteinaz¹ K [17]. Do izolacjigenomowego DNA z komórek nacieków skórnych i krwi obwo-dowej wykorzystano zestawy firmy QIAGEN; odpowiednio QIAamp DNA Mini Kit oraz QIAamp DNA Blood Kit. JakoœæDNA w próbkach sprawdzano technik¹ PCR z u¿yciem starte-rów specyficznych dla fragmentu genu ludzkiej β-globiny. Re-akcje amplifikacji fragmentów TCRγ prowadzono ze starteramikomplementarnymi do regionów V1-8 lub V9 oraz J1-2 TCRγzestawionymi w tab. 2. [18]. Mieszaniny reakcyjne o objêtoœcikoñcowej 20 µl zawiera³y: 50 ng DNA genomowego, 1 x stê¿o-ny bufor PCR, 200 µM ka¿dego dNTP, 1 µM ka¿dego z dwócholigonukleotydów, 1U/25 µl Taq DNA polimerazy. Reakcjê pro-wadzono, stosuj¹c nastêpuj¹ce profile termiczne: denaturacja

w 94oC przez min, przy³¹czanie starterów w 55oC przez 1,5 min,polimeryzacjê w 70oC przez 1,5 min. W pierwszej rundzie am-plifikacji stosowano pary starterów zewnêtrznych V1-8γ i Jγ1/2 albo Vγ 9 i Jγ 1/2. Nastêpnie otrzymane produkty u¿ywa-no jako matrycê w kolejnej rundzie amplifikacji, w której wy-korzystywano odpowiednio startery komplementarne do we-wnêtrznych sekwencji genów Vγ 1-8 i Jγ 1/2 albo Vγ 9 i Jγ 1/2.Po pierwszej rundzie amplifikacji rejonu Vγ 1-8 i Jγ 1/2 otrzy-mywano produkty o wielkoœci ok. 480 par zasad, a po drugiej420 par zasad. Amplifikowane fragmenty rejonu Vγ 9 i Jγ 1/2wynosi³y odpowiednio 400 i 380 par zasad. Do oceny rearan-¿acji jako kontrolê negatywn¹ stosowano DNA wyizolowanyz krwi osób zdrowych, a jako kontrole pozytywne DNA wyizo-lowany z komórek Jurkat (rearan¿acje w rejonie V1-8γ) orazDNA wyizolowany z krwi obwodowej chorego na ostr¹ bia-³aczkê limfatyczn¹ T-komórkow¹ γδ+ (rearan¿acje w rejonieVγ9). Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono w aparacie UNOII firmy Biometra. Otrzymane produkty rozdzielano w 2% ¿e-lu agarozowym, zawieraj¹cym bromek etydyny, w celu spraw-dzenia efektu amplifikacji. Produkty otrzymane w reakcji am-plifikacji denaturowano w 95oC przez 5 min, a nastêpnie rena-turowano w 55oC przez 20 min w celu uzyskaniaheterodupleksów. Rozdzia³ elektroforetyczny prób prowadzo-no w 8% ¿elu poliakryloamidowym zawieraj¹cym 7M mocz-nik, w gradiencie temperatury (35–55oC) przez 3 godz. przy na-piêciu 450 V, z u¿yciem aparatu TGGE Maxi firmy Biometra.Po zakoñczeniu elektroforezy ¿ele barwiono srebrem, stosuj¹czestaw Silver Stain, firmy Kucharczyk i fotografowano.

Analizê statystyczn¹ wyników przeprowadzono przy po-mocy testu dok³adnego Fishera (p=0,05). Dla porównanina wy-ników monoklonalnoœci w poszczególnych grupach zastoso-wano test Manna-Whitthney’a, przyjmuj¹c dla wycinków skór-nych p=0,0027, a dla krwi obwodowej p=0,0216.

WynikiW badaniach przeanalizowano 53 wycinki skórne pocho-

dz¹ce od chorych na MF w ró¿nych stadiach choroby i wycin-ki od wszystkich chorych z grupy kontrolnej oraz krew obwo-dow¹ od 40 chorych na MF i wszystkich z grupy kontrolnej.

Wiêkszoœæ limfocytów w naciekach skórnych MF wyka-

zywa³a fenotyp CD2+ CD3+ CD4+ CD8- (fot. 1. i 2.), za wy-

j¹tkiem 4 przypadków w stadium IIB i 2 w stadium IVA MF,

Tab. 2. Startery stosowane do amplifikacji fragmentów receptora γγ limfocytów T

Runda PCR Starter Vγγ (5'-3') Starter Jγγ (5'-3')

I Vγ 1-8 zewnêtrzny GGAGCTTCTAGCTTTCCTGTCTC lub Jγ zewnêtrznyVγ 9 zewnêtrzny CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC

GGAATTCCAAATTCTTGGTTTA

II Vγ 1-8 wewnêtrzny CTCGAGTGCGCTGCCTACAGAGAGGlub Jγ wewnêtrznyVγ 9 wewnêtrzny GGATCCACTGCCAAAGAGTTTCTTCTCGAGTGCGCTGCCTACAGAGAG

Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/276

Mariola Pawlaczyk, El¿bieta Porêba, Violetta Filas, Tamara Banasiak, Lucyna Kramer, Jan Brêborowicz,Anna GoŸdzicka-Józefiak

z ekspresj¹ CD8+ CD4-. Os³abion¹ ekspresjê CD5 obserwo-wano u 7 chorych (stadia IIA, IIB, III, IVA), a CD3 u 4 cho-rych w stadium IIB, III, IVA. W nielicznych przypadkach(dwóch w stadium IA, dwóch w stadium IB i jednym w sta-dium IIA) w naciekach MF stwierdzono ekspresjê CD7+. Tyl-ko pojedyncze komórki nacieków nowotworowych MF wyka-zywa³y reakcjê z przeciwcia³em CD 20. W grupie kontrolnejw wiêkszoœci stwierdzano immunofenotyp komórek naciekówskórnych: CD2+ CD3+ CD4+ CD5+ CD7- CD8-, z wyj¹tkiem3 przypadków przewlek³ego wyprysku i 3 przypadków przy-³uszczycy plackowatej, w których wystêpowa³a ekspresjaCD7+. Analiza statystyczna ekspresji CD7+ nie wykaza³a istot-

nych ró¿nic miêdzy grup¹ MF a grup¹kontroln¹.

Wyniki analizy rearan¿acji genu γ TCRzestawiono w tab. 3. Próby uznawano zamonoklonalne, jeœli w smudze DNA na ¿e-lu widoczny by³ pojedynczy pr¹¿ek (fot.3.). Dominuj¹ce klony z rearan¿acj¹ TCRγstwierdzono w naciekach skórnych u 79%,a w komórkach krwi obwodowej u 63%ogó³u chorych z MF. Monoklonalnoœæ wy-stêpowa³a we wszystkich próbkach cho-rych w stadium IVA. W stadium IIB re-aran¿acje wystêpowa³y u 90% chorychw limfocytach nacieków skórnych orazu 78% we krwi obwodowej. Porównywal-ny odsetek rearan¿acji stwierdzono w sta-diach IIA i III, zarówno w wycinkach, jaki komórkach krwi obwodowej. W pocz¹t-kowym stadium IA MF rearan¿acje stwier-dzono u 75% chorych w wycinkach skór-nych, ale tylko w 37,5% w komórkachkrwi obwodowej. W trzech przypadkachprzewlek³ego wyprysku i u jednego cho-rego z przy³uszczyc¹ plackowat¹ wykrytodominuj¹ce klony w wycinkach skórnych.Analiza rearan¿acji TCRγ we krwi obwo-dowej u chorych z grupy kontrolnej da³adodatnie wyniki u 2 chorych na wypryskoraz u 3 z 10 chorych na przy³uszczycêplackowat¹.

Stwierdzono statystycznie istotne ró¿-nice w porównaniu wystêpowania klo-nów limfocytów T w naciekach skórnychu chorych z MF w stosunku do chorychz grup kontrolnych. Analiza statystycznawyników rearan¿acji TCRγ w komórkachkrwi obwodowej nie wykaza³a istotnychró¿nic tylko w stadium IA.

OmówieniePoszukiwania nowych metod diagno-

stycznych gwarantuj¹cych prawid³owerozpoznanie pierwotnych ch³oniaków skó-ry w pocz¹tkowym okresie choroby, kon-centrowa³y siê przez wiele lat na bada-

niach immunohistochemicznych i genetycznych. Oznaczanieimmunofenotypów komórek nowotworowych nacieków skór-nych stanowi podstawy obowi¹zuj¹cych aktualnie klasyfikacjipierwotnych ch³oniaków skóry [7]. Przedstawione przez nas ba-dania immunohistochemiczne wykaza³y utratê niektórych mar-kerów powierzchniowych na limfocytach T w naciekach skór-nych w stadiach zaawansowanych MF, co przemawia za proce-sem z³oœliwym, jednak w pocz¹tkowym okresie chorobyantygeny powierzchniowe wykazywa³y podobn¹ ekspresjê w MFi przewlek³ych, zapalnych chorobach skóry, co potwierdzaj¹ tak-¿e liczne doniesienia innych autorów [5, 7–9, 20–22]. W wiêk-szoœci przypadków na komórkach nacieków MF nie stwierdza-

Fot. 1. Dodatnia reakcja z przeciwcia³em anty-CD4 w nacieku skórnym u cho-rego w stadium IIA ziarniniaka grzybiastego (pow. 400 razy)

Fot. 2. Ujemna reakcja z przeciwcia³em anty-CD8 w nacieku skórnym u chore-go w stadium IIA ziarniniaka grzybiastego (pow. 400 razy)

Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/2 77

Zastosowanie badañ immunohistochemicznych i technik biologii molekularnej w diagnostyce ziarniniaka grzybiastego

no dodatnich reakcji z przeciwcia³em an-ty-CD7, ale podobny immunofenotyp cha-rakteryzowa³ grupê kontroln¹. Zwiêksze-nie liczby pacjentów grupy kontrolnej mo-g³oby wp³yn¹æ na wykazanie istotnychró¿nic dyskryminuj¹cych nacieki MF oddermatoz zapalnych, jak przedstawi³ toBergman i wsp. [23]. W swojej pracyobejmuj¹cej wiêksz¹ liczbê chorych auto-rzy wykazali istotne ró¿nice w ekspresjiCD7, pozwalaj¹ce na ró¿nicowanie przy-padków MF od zapalnych chorób skóry[23]. Obserwacji Bergmana i wsp. nie po-twierdzaj¹ jednak inne badania. Wydajesiê, ¿e ujemna reakcja z przeciwcia³em an-ty-CD7 w sytuacjach w¹tpliwych nie prze-s¹dza o nowotworowym charakterze na-cieku skórnego [5, 9, 12, 19, 20].

Od momentu wprowadzenia do dia-gnostyki pierwotnych ch³oniaków skórytechnik biologii molekularnej, monoklo-nalnoœæ wykrywano pocz¹tkowo opiera-j¹c siê na technice Southern blot, jednakliczba komórek T w naciekach we wcze-snych okresach MF mo¿e okazaæ siê nie-wystarczaj¹ca do wykazania dominuj¹ce-go klonu t¹ metod¹ [18]. Czu³oœæ badañ wzros³a po wprowa-dzeniu do analizy monoklonalnoœci techniki PCR. LimfocytyT mog¹ prezentowaæ 2 rodzaje ³añcuchów αβ i γδ, co sprawia,¿e w badaniach diagnostycznych wykorzystywaæ mo¿na rearan-

¿acje w obrêbie czterech genów. Wiêkszoœæ skórnych limfocy-tów T wykazuje ekspresjê αβ TCR. Amplifikacja tych ³añcu-chów jest jednak doœæ trudna z uwagi na du¿¹ liczbê segmen-tów zmiennych, st¹d w celu wykrycia klonalnoœci wykorzystu-

Fot 3. Produkty amplifikacji TCRγγ 1-8 rozdzielone metod¹ elektroforezy w ¿e-lu w gradiencie temperatury. Linie 7, 14, 15, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 –produkty poliklonalne; linie – 5, 6, 8, 10, 11 produkty monoklonalne; linie – 1,9, 12, 13 produkty biklonalne; linia – 2, 3, 4 produkty oligoklonalne. 17 markermasy pUC19/MspI. Linia 18 – kontrola dodatnia (DNA izolowany z komórekJurkat)

Tab. 3. Wyniki analizy rearan¿acji genu γγ receptora limfocytów T w wycinkach skórnych i krwi obwodowej u chorychna ziarniniaka grzybiastego i w grupach kontrolnych

Rozpoznanie Wycinki skórne Krew obwodowaN/nPCR+ (%) N/nPCR+ (%)

stadium MF

IA 8/6 75% 8/3 37,5%

IB 12/8 67% 9/5 55,5%

IIA 10/8 89% 10/7 70%

IIB 10/9 90% 9/7 78%

III 10/8 80% 5/3 60%

IVA 3/3 100% 2/2 100%

razem 53/42 79% 43/27 63%

grupa kontrolna

wyprysk 15/3 20% 5/2 13%

³uszczyca 10/0 0% 110/0 0 %

przy³uszczyca 10/1 10% 10/3 30%

razem 35/4 11% 35 /5 14%

N: liczba chorych

N PCR+: liczba chorych ze stwierdzon¹ monoklonalnoœci¹

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/278

Mariola Pawlaczyk, El¿bieta Porêba, Violetta Filas, Tamara Banasiak, Lucyna Kramer, Jan Brêborowicz,Anna GoŸdzicka-Józefiak

je siê czêœciej amplifikacjê ³añcucha γTCR. W prezentowanejpracy zastosowano technikê PCR opracowan¹ przez Woodai wsp. [18], skojarzon¹ z czu³¹ metod¹ elektroforetycznego roz-dzia³u uzyskanych produktów amplifikacji w ¿elu w gradien-cie temperatury [24–26]. Uzyskane przez nas wyniki wykry-wania monoklonalnoœci w naciekach skórnych s¹ podobne doprzedstawionych przez innych autorów [18, 27–29]. Bergmani wsp. wykazali rearan¿acje klonalne TCRγ w naciekach skór-nych u 69% chorych z klasycznym MF [23], a Dadej w 88%[30]. Nieznacznie ni¿szy odsetek rearan¿cji stwierdzono w sta-dium IA MF (37,5%) w komórkach krwi obwodowej w porów-naniu z doniesieniami Muche i wsp. [24], którzy w tym stadiumMF wykryli rearan¿acje u 46,2% chorych. Z punktu widzeniaklinicznego i patologicznego MF, zgodnie z definicj¹ pierwot-nych ch³oniaków skórnych T-komórkowych, rozwija siê w skó-rze i przez 6 mies. od pocz¹tku choroby nie powinien dawaæprzerzutów do wêz³ów ch³onnych czy narz¹dów wewnêtrznych[6, 7]. Badania z wykorzystaniem technik biologii molekular-nej wskazuj¹ na mo¿liwoœæ pozaskórnego rozsiewu nowotwo-rowych limfocytów T ju¿ we wczesnym okresie choroby,o czym œwiadczy wystêpowanie klonów komórek T we krwiobwodowej w stadiach IA i IB MF.

Ciekawe wydaje siê wykrycie rearan¿acji w komórkachkrwi obwodowej chorych z przy³uszczyc¹ plackowat¹ drobno-ogniskow¹. Dermatoza ta od kilku lat stanowi przedmiot kon-trowersji wœród dermatologów; przez jednych uwa¿ana jest zaprekursora MF, inni zaœ traktuj¹ przy³uszczycê plackowat¹w odmianie wieloogniskowej jako stadium rumieniowe MF[31]. Muche i wsp. wykazali wysoki odsetek klonów limfocy-tów T we krwi obwodowej chorych na przy³uszczycê placko-wat¹ drobnoogniskow¹, przy braku tych klonów w naciekachskórnych. Autorzy t³umacz¹ ten fakt mo¿liwoœci¹ wystêpowa-nia miejscowej odpowiedzi immunologicznej skutecznie redu-kuj¹cej nacieki klonalne w skórze [25].

Czêstoœæ wykrywania klonów komórkowych w badanymmateriale zale¿y od kilku czynników: warunków technicznych,w tym sposobu ekstrakcji DNA, rodzaju zastosowanych star-terów i techniki rozdzia³u produktów amplifikacji, badanegomateria³u oraz interpretacja wyników [11, 15, 18, 24, 26, 27,30]. Rearan¿acje wykrywa siê czêœciej w œwie¿ych mro¿onychwycinkach ni¿ w skrawkach parafinowych [18, 22, 30]. Z dru-giej strony stosowanie materia³u zatopionego w parafinieupraszcza procedury diagnostyczne i pozwala na retrospektyw-n¹ ocenê materia³u. Zwiêkszanie czu³oœci stosowanych tech-nik mo¿e jednak doprowadziæ do wykrywania pojedynczychklonów reaktywnych limfocytów w zmianach skórnych w prze-biegu zmian zapalnych skóry [11, 30, 32]. Potwierdzaj¹ to wy-kryte przez nas rearan¿acje w komórkach nacieków u chorychna wyprysk.

Monoklonalnoœæ nie zawsze musi byæ jednoznaczna z roz-rostem z³oœliwym. Z drugiej strony, badania prowadzone przezAsthony-Key’a i wsp. [22] i Bergmana i wsp. [23] udowodni-³y, ¿e dermatozy z pogranicza MF, w których wystêpowa³y klo-nalne rearan¿acje komórek T mimo braku w momencie usta-lania rozpoznania kryteriów klinicznych i histopatologicznychodpowiadaj¹cych MF, po pewnym czasie uleg³y transformacjiw MF. Chorzy z tzw. klonalnym zapaleniem skóry (clonal der-matitis) powinni wiêc byæ objêci obserwacjami klinicznymi

i histopatologicznym z uwagi na mo¿liwoœæ rozwoju CTCL[22, 23, 30, 33].

W œwietle prezentowanych wyników w³asnych oraz licz-nych doniesieñ innych autorów okazuje siê, i¿ analiza klonalno-œci dostarcza cennych dodatkowych informacji potwierdzaj¹-cych rozrost nowotworowy [10, 12, 18, 23, 24, 27, 30]. Nie mo¿-na jednak wyników tego badania traktowaæ jako odrêbnegokryterium diagnostycznego, a jedynie jako badanie uzupe³nia-j¹ce diagnostykê histopatologiczn¹, immunohistochemiczn¹ i ca-³oœciow¹ analizê stanu klinicznego pacjenta [6, 7, 30, 32–34).

Wnioski1. Badania immunohistochemiczne z u¿yciem przeciwcia³

przeciw antygenom powierzchniowym: CD2, CD3, CD4,CD5, CD7, CD8, CD20 komórek nacieków skórnych niepozwalaj¹ na ró¿nicowanie pocz¹tkowego okresu ziarni-niaka grzybiastego z przewlek³ymi, zapalnymi choroba-mi skóry.

2. Analiza monoklonalnoœci na podstawie badania rearan¿a-cji genu γTCR dostarcza istotnych danych potwierdzaj¹-cych nowotworowy charakter dermatoz.

3. Rozpoznanie ziarniniaka grzybiastego powinno byæ zawszestawiane na podstawie ca³oœciowej oceny badañ histopa-tologicznych, immnunohistochemicznych, analizy mono-klonalnoœci oraz stanu klinicznego chorych.

Piœmiennictwo

1. Diamandidou E, Cohen PR, Kurzrock M: Mycosis fungoidesand Sezary syndrome. Blood, 1996, 88, 2385-409.

2. Fung MA, Murphy MJ, Hoss DM, et al.: Practical evaluationand management of cutaneous lymphoma. J Am Acad Derma-tol, 2002, 46, 325-57.

3. Bernengo MG, Burg G, Duvic M, et al.: Update on erythroder-mic cutaneous T-cell lymphoma: report of the international so-ciety for cutaneous lymphomas. J Am Acad Dermatol, 2002,46, 95-106.

4. Yeh A, Hudson A, Prieto V, et al.: Reassessment of lympho-cytic atypia in the diagnosis of mycosis fungoides. Mod Pa-thol, 2001,14, 285-88.

5. Kempf W, Dummer R, Burg G: Approach to lymphoprolifera-tive infiltrates of the skin. The difficult lesions. Am J Clin Pa-thol, 1999, 111 (suppl. 1), S84-S93.

6. Willemze R: Primary cutaneous lymphomas. Curr Opin On-col, 2000,12, 419-25.

7. Willemze R, Kerl H, Sterry W, et al.: EORTC classificationfor primary cutaneous lymphomas. A proposal from the Cu-taneous Lymphoma Study Group of the European Organiza-tion for Research and Treatment of Cancer (EORTC). Blo-od, 1997, 90, 354-71.

8. Ralfkiaer E, Wollf-Sneedorff A, Thomsen K, et al.: Immuno-phenotypic studies in cutaneous T-cell lymphomas: clinical im-plications. Br J Dermatol, 1993, 129, 655-59.

9. Preesman AH, Toonstra J, van der Putte SCJ, et al.: Immuno-phenotyping on simultaneously occuring plaques and tumoursin mycosis fungoides and Sezary syndrome. Br J Dermatol,1993, 129, 660-66.

10. Kohler S, Zehnder JL: Use of the polymerase chain reactionin the evaluation of the cutaneous T-cell infiltrates. DermatolClin, 1999, 17: 657-66.

Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/2 79

Zastosowanie badañ immunohistochemicznych i technik biologii molekularnej w diagnostyce ziarniniaka grzybiastego

11. Wood GS: T-cell receptor and immunoglobulin gene rearran-gements in diagnosing skin disease. Arch Dermatol, 2001, 137:1503-506.

12. Bakels V, Oostveen J, Preesman A, et al.: Differentiation be-tween actinic reticuloid and cutaneous T cell lymphoma by Tcell receptor γ gene rearrangements analysis and immunophe-notyping. J Clin Pathol 1998,51,154-158.

13. Terhune MH, Cooper KD: Gene rearrangements and T-celllymphomas. Arch Dermatol, 1993, 129, 1484-490.

14. Li N, Bhawan J: New insight into the applicability of T-cell re-ceptor γ gene rearrangement analysis in cutaneous T-cell lym-phoma. J Clin Pathol, 2001, 28, 412-8.

15. Mieleke V, Staib G, Boehncke WH, et al.: Clonal disease in ear-ly cutaneous T-cell lymphoma. Dermatol Clin, 1994, 12, 351-60.

16. Proceeding of the International Concensus Conference onCTCL Treatment and Recommendations Boston. J Am AcadDermatol, 1997, 36, 949-54.

17. Wright DK, Manos MM: Sample preparation from paraffinembedded tissues. W: PCR protocols: a guide to methods andapplications. Academic Press, New York, 1990, 153-58.

18. Wood G, Tung R, Haeffner A, et al.: Detection of clonal T-cellreceptor γ gene rearrangements in early mycosis fungoides/Se-zary syndrome by polymerase chaine reaction and denaturinggradient gel electrophoresis (PCR/DGGE). J Invest Dermatol,1994, 103, 34-41.

19. Ralfkiaer E.: Controversies and discussion on early diagnosisof cutaneous T-cell lymphoma. Phenotyping. Dermatol Clin,1994, 12, 329-34.

20. Smoller BR, Bishop K, Glusac EJ, et al.: Lymphocyt antigenabnormalities in inflammatory dermatoses. Appl Immunohi-stochem, 1995, 3, 127-31.

21. Pawlaczyk M, Filas V, Brêborowicz J, Silny W: Badania im-munohistochemiczne nacieków skórnych u chorych z ziarni-niakiem grzybiastym. Doniesienie wstêpne. Przegl Dermatol,1997, 84, 19-26.

22. Asthon-Key M, Diss TC, Du MQ, et al.: The value of polyme-rase chain reaction in the diagnosis of cutaneous T-cell infil-trates. Am J Surg Pathol, 1997, 21, 743-47.

23. Bergman R, Faclieru D, Sahar D, et al.: Immunophenotypingand T-cell receptor γ gene rearrangement analysis as an adjunctto the histopathologic diagnosis of mycosis fungoides. J AmAcad Dermatol, 1998, 39, 554-59.

24. Muche M, Lukowsky A, Asadullah K, et al.: Demonstrationof frequent occurrence of clonal T cells in peripheral blood ofpatients with primary cutaneous T-cell lymphoma. Blood, 1997,4, 1636-42.

25. Muche M, Lukowsky A, Heim J, et al.: Demonstration of fre-quent occurrence of clonal T cells in peripheral blood but notin the skin of patients with small plaque parapsoriasis. Blood,1999, 94, 1409-1417.

26. Scheller U, Muche M, Sterry W, et al.: Detection of clonal T cells in cytaneous T cell lymphoma by polymerase chainereaction: comparison of mutation detection enhancement-po-lyacrylamide gel electrophoresis, temperature gradient gel elec-trophoresis and fragment analysis of sequencing gels. Electro-phoresis, 1998, 19, 653-58.

27. Bachelez H, Bioul L, Flageul B, et al.: Detection of clonal T-cell receptor γ gene rearrangements with the use of polyme-rase chain reaction in cutaneous lesions of mycosis fungoidesand Sezary syndrome. Arch Dermatol, 1995, 131, 1027-31.

28. Bottaro M, Berti E, Biondi A, et al.: Heteroduplex analysis of T-cell receptor γ gene rearrangements for diagnosis and monitoringof cutaneous T-cell lymphomas. Blood, 1994, 83, 3271-78.

29. Theodorou I, Bigorgane C, Delfau MH, et al.: VJ rearange-ments of the TCRγ locus in peripheral T-cell lymphomas: ana-lysis by polymerase chain reaction and denaturating gradientgel electrophoresis. J Pathol, 1996, 178, 303-10.

30. Dadej K, Gaboury L, Lamare L, et al.: The value of clonalityin the diagnosis and follow-up of patients with cutaneous T-cell infiltrates. Diagn Mol Pathol, 2001, 10, 78-88.

31. Burg G, Dummer R: Small plaque (digitate) parapsoriasis isan abortive cutaneous T-cell lymphoma and is not mycosis fun-goides. Arch Dermatol, 1995, 131, 336-8.

32. Wood G: Analysis of clonality in cutaneous T cell lymphomaand associated diseases. Ann New York Acad Sciences, 2001,941, 26-30.

33. Delfau-Larue MH, Laroche L, Wechsler J, et al.: Diagnosticvalue of dominant T-cell clones in peripheral blood in 363 pa-tients presenting consecutively with a clinical suspicion of cu-taneous, lymphoma. Blood, 2000, 96, 2987-92.

34. Dippel E, Assaf C, Hummel M, et al.: Clonal T-cell receptorg-chain gene rearrangement by PCR-based genescan analysisin advanced cutaneous T-cell lymphoma: a critical evaluation.J Pathol, 1999, 188, 146-54.

Praca wykonana zosta³a dziêki programowi badañ w³a-snych nr 501-2-12-03 AM im. Karola Marcinkowskiegow Poznaniu.

Podziêkowania: Autorzy pragn¹ podziêkowaæ Panu doc.Ansgarowi Lukowsky z Kliniki Dermatologii Uniwersyteckie-go Szpitala Charite, Uniwersytetu Humboldta w Berlinie, zanieocenion¹ pomoc w opracowaniu metody analizy rearan¿a-cji genu γ receptora TCR i interpretacji uzyskanych wyników.