Zastosowania mikroskopii fluorescencyjnejkurzynowski/Studenckie/Mikroskopia...Mikroskop...
Transcript of Zastosowania mikroskopii fluorescencyjnejkurzynowski/Studenckie/Mikroskopia...Mikroskop...
Mikroskopia fluorescencyjna
Mikroskop fluorescencyjny
to mikroskop świetlny, wykorzystujący zjawisko fluorescencji
większość z nich to mikroskopy tzw. epi-fluorescencyjne
zjawisko fotoluminescencji: fluorescencja i fosforescencja
BARWNIKI
Struktura, którą chcemy uwidocznić
Źródło wzbudzające
Emitują głównie światło widzialne
Barwa emitowanego światła zależy od substancji fluoryzującej
Fluoresceina
Rodamina
DAPI (4’,6- diamydino-2-fenyloindol)
Oranż akrydynowy
+ przeciwciała fluoryzujące
Budowa mikroskopu fluorescencyjnego
Rys. 1. Schemat mikroskopu fluorescencyjnego źródło: http://bioinfo.mol.uj.edu.pl/articles/Kaluzny05
Rys. 2. Mikroskop fluorescencyjny Źródło: http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Fluorescencyjna-hybrydyzacja-in-situ/
Źródło: http://www2.chemia.uj.edu.pl/chemia_konserwatorska/materialy/Techniki%20mikroskopowe1.pdf
Elementy mikroskopu fluorescencyjnego • Źródło światła – żarówka emitująca promieniowanie UV
• Zestaw filtrów:
o Filtr wzbudzenia – przepuszcza światło o pożądanej długości fali
o Filtr barierowy (supresyjny) – przepuszcza jedynie widzialną część widma, pochłania ultrafiolet
• Lusterko dichroiczne – rozdziela ścieżki wzbudzenia i emisji
• Obiektyw – skupia światło wzbudzające na preparacie, wysoka apertura numeryczna
Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego
• Zjawisko fluorescencji – powstawanie światła widzialnego w wyniku naświetlania obiektu promieniami ultrafioletowymi, niebieskimi lub zielonymi
• Próbka może wykazywać zdolność do naturalnej fluorescencji lub może być wyznakowana barwnikami fluorescencyjnymi
• Uzyskiwany obraz jest negatywem obrazu z typowego mikroskopu świetlnego: na ciemnym tle uwidaczniają się świecące struktury.
Źródło: http://pl.wikipedia.org/w/index.php?title=Plik:Yeast_membrane_proteins.jpg&filetimestamp=20090113144047
Źródło: http://micro.magnet.fsu.edu/primer/lightandcolor/fluorointroduction.html
Oświetlenie w mikroskopii fluorescencyjnej
W mikroskopach fluorescencyjnych można stosować dwa sposoby oświetlania preparatu: • system diailuminacji - odpowiada przebiegowi wiązki oświetlającej w normalnym mikroskopie optycznym, • system epiiluminacji - standardowy w nowoczesnych mikroskopach, w których promienie przechodzą przez obiektyw i padają na preparat z góry, światło emitowane przez preparat przechodzi z powrotem przez ten sam obiektyw. W tym przypadku wiązka wzbudzająca po przejściu przez preparat ulega rozproszeniu i poza nielicznymi promieniami odbitymi nie wpada do obiektywu, a obraz tworzony jest wyłącznie przez promienie widzialnego zakresu widma emitowane na drodze fluorescencji. Taki sposób oświetlenia preparatu polepsza jakość obrazu i zmniejsza narażenie żywych komórek na kontakt ze szkodliwym ultrafioletem.
Stosując odpowiedni zestaw filtrów można uzyskać efekt ciemnego pola. We współczesnych mikroskopach fluorescencyjnych najczęściej światło wzbudzające kierowane jest na preparat poprzez obiektyw. Światło emitowane z preparatu zbierane jest przez obiektyw i po przejściu przez zestaw filtrów kierowane jest do okularu. W starszych konstrukcjach stosowano układ optyczny podobny do układu wywołującego efekt ciemnego pola w mikroskopach świetlnych. Obecnie stosowany system wzbudzenia (obiektyw skupia światło wzbudzające na preparacie) pozwala uzyskać duże lokalne natężenia światła wzbudzającego przy niewielkiej mocy źródła.
Źródło: http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Leki_Biochemia/dydaktyka/biofizyka/cz4.pdf
Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia
Powstała jako modyfikacja klasycznej mikroskopii fluorescencyjnej i stała się szczególnie użyteczna w badaniu zjawisk zachodzących bezpośrednio pod i na powierzchni komórek.
Polega ona na oświetleniu próbki światłem wzbudzającym, jednak pod takim kątem (kąt graniczny), aby padające światło uległo całkowitemu wewnętrznemu odbiciu przed wejściem do próbki: • w szkiełku nakrywającym próbkę (typu epi-), • w kwarcowym pryzmacie (typu trans-).
Zjawisku całkowitego wewnętrznego odbicia towarzyszy powstanie fali zanikającej (wiąże się to z różnicą między współczynnikiem załamania światła szkła, czyli kwarcu i wody, czyli próbki – współczynnik ten dla szkła (kwarcu) jest większy), która nie ulega odbiciu, ale penetruje środowisko (próbkę) po drugiej stronie szkiełka lub pryzmatu. Czyni to jednak tylko na pewną określoną głębokość (fala ta zanika wykładniczo wraz z odległością), co w praktyce oznacza zwykle około 100-250 nm. W tym obszarze głębokości próbki, fala ta może wzbudzić obecne w próbce fluorofory, a one zaczną emitować światło (co ważne, fala zanikająca ma tę samą długość co fala która uległa odbiciu). To emitowane światło jest następnie odbierane przez obiektyw, przepuszczane przez odpowiednie filtry i przetwarzane jak w klasycznym mikroskopie fluorescencyjnym. W ten sposób w TIRFM następuje bardzo selektywna wizualizacja obszarów położonych zaraz pod szkiełkiem lub pryzmatem, ponieważ obszar wzbudzenia powstaje tylko w zasięgu fali zanikającej, co znacznie ogranicza wpływ tła (wnętrza komórki), zwiększając rozdzielczość uzyskanych obrazów.
Rys. 2. Schemat zasady TIRFM w systemie epi- (światło pada i odbierane jest z tej samej strony próbki). Źródło:http://encyklopedia.eduteka.pl/wiki/Mikroskopia_fluorescencyjna_ca%C5%82kowitego_wewn%C4%99trznego_odbicia
1. Próbka 2. Zasięg fali zanikającej 3. Szkiełko nakrywkowe 4. Olejek immersyjny 5. Obiektyw 6. Promień emitowany (sygnał) 7. Promień wzbudzający
1. Obiektyw 2. Promień emitowany 3. Olejek immersyjny 4. Szkiełko nakrywkowe 5. Próbka 6. Zasięg fali zanikającej 7. Promień wzbudzający 8. Pryzmat kwarcowy
Rys. 3. Schemat zasady TIRFM w systemie trans- (światło pada i odbierane jest z różnych stron próbki). Źródło:http://encyklopedia.eduteka.pl/wiki/Mikroskopia_fluorescencyjna_ca%C5%82kowitego_wewn%C4%99trznego_odbicia
Zastosowania mikroskopii
fluorescencyjnej
Rys.3. Fibroblasty komórek naskórka jelenia
Nauki biologiczne
Rys.1. Trzy markery fluorescencyjne
Rys.2. Odmienne stężenie jonów wapnia w komórce Purkynie’go w móżdżku świnki morskiej
Rys.5. Oddziaływanie białko –białko ulegające apoptozie, badanie metodą FRET
Rys.4. Immunofluorescencja. Mikrotubule w komórkach nerki myszy
Diagnostyka chorób • Choroby genetyczne
• Diagnozowanie nowotworów
• Obrazowanie i identyfikacja komórek rakowych w badanym preparacie
Rys.6 i 7. Dyspersja światła przechodzącego przez zarażone tkanki. Rys.8. Potrójne barwienie w komórkach ludzkich.
Komórki nowotworu czerniaka
Kryształy antybiotyku ciprofloksacyny Mikrokapsułki alginianowe zawierające liposomy z ciprofloksacyną
Streptomyces coelicolor produkujący podjednostkę polimerazy DNA
Rys. Komórki śródbłonka tętnicy
Rys.6. Autofluorescencja chlorofilu
Rys.5. Móżdżek transgenicznej myszy
Rys.7. Neurony
Mikroskopy fluorescencyjne stały się ważnym narzędziem w biologii, stając się podstawą do rozwoju bardziej zaawansowanych technik mikroskopii fluorescencyjnej, takich jak: • TIRFM, • mikroskopia konfokalna, • mikroskopia dwufotonowa, • FLIC (Mikroskopia fluorescencyjna kontrastu interferencyjnego).
Dziękujemy za uwagę