558

Marta NAPIERAŁAEwa FLOREK

Laboratorium Badań Środowiskowych, Katedra i Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w PoznaniuKierownik: prof. dr hab. Ewa Florek

Dodatkowe słowa kluczowe: materiały alternatywneślinawłosypaznokciediagnostykatoksykologia

Additional key words:alternative materials saliva hair nails diagnostics toxicology

Adres do korespondencji:dr n. farm. Marta NapierałaLaboratorium Badań Środowiskowych Katedra i Zakład Toksykologii Uniwersytetu Medycznego im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu ul. Dojazd 30, 60-631 Poznań tel. +48 61 847 20 81 e-mail: martan@ump.edu.pl

prAce pogląDowe

Wybrane materiały alternatywne w diagnostyce i toksykologii

Selected alternative materials in diagnostics and toxicology

Autorzy nie deklarują konfliktu interesów

Otrzymano: 02.09.2017Zaakceptowano: 19.10.2017

Niniejsza praca przedstawia moż-liwości zastosowania materiałów alternatywnych: śliny, włosów i pa-znokci, w diagnostyce laboratoryjnej i analizie toksykologicznej. Materiały te, choć niewykorzystywane obec-nie, jako rutynowe narzędzia diagno-styczne, wraz z rozwojem technik analitycznych dają nadzieję na niein-wazyjne, bezbolesne i dokładniejsze przeprowadzanie badań biochemicz-nych oraz toksykologicznych, co za-pewni częstsze monitorowanie stanu zdrowia oraz szybkie diagnozowanie chorób.

This paper presents the possi-bilities of using alternative materials: saliva, hair and nails, in laboratory diagnostics and toxicological analy-sis. These materials, though not cur-rently used as routine diagnostic tools, along with the development of analytical techniques, provide hope for non-invasive, painless and more accurate biochemical and toxicologi-cal investigations, which will ensure more frequent health monitoring and rapid disease diagnosis.

Wstęp W obecnych czasach rośnie zainte-

resowanie wykorzystaniem w badaniach diagnostycznych oraz toksykologicznych alternatywnych materiałów biologicznych, pobieranych w sposób nieinwazyjny, bez specjalistycznego sprzętu oraz nadzoru personelu medycznego. Przyczynić się to może do zmniejszenia lęku pacjenta, co spowoduje częstsze monitorowanie stanu zdrowia oraz diagnozowanie chorób na wczesnym etapie.

Celem niniejszej pracy było omówie-nie możliwości wykorzystania wybranych materiałów alternatywnych pozyskiwanych w sposób nieinwazyjny: śliny, włosów i pa-znokci.

Ślina:wydzielanie, skład i funkcje fizjolo-

giczneŚlina produkowana jest przez gruczo-

ły ślinowe: podjęzykowe, przyuszne, pod-żuchwowe oraz liczne mniejsze ślinianki rozprzestrzenione w całej jamie ustnej [1]. Wydzielanie śliny zachodzi w sposób cią-gły pod kontrolą autonomicznego układu nerwowego. Pod wpływem bodźca (po-karmu), wzrasta aktywność włókien układu przywspółczulnego i następuje produkcja śliny surowiczej, podczas gdy w wyniku ak-tywności układu współczulnego więcej pro-dukowanej jest śliny śluzowej [1]. Średnio powstaje około 0,3 do 0,5 mL śliny w ciągu minuty, co może wzrosnąć na skutek pobu-dzenia pokarmem, bodźcem zmysłowym (zapach, widok), bądź przez zastosowanie właściwej farmakoterapii (metacholina, pi-lokarpina) [1,2]. Dobowa objętość wydzie-lanej śliny oraz jej skład zależy od wielu czynników: częstości i rodzaju posiłku, wieku, płci, ilości snu, działania bodźców

emocjonalnych. Najwięcej śliny produkują gruczoły ślinowe podżuchwowe – około 70% całej objętości śliny (ślina surowiczo--śluzowa). Około 25% śliny produkowanej jest przez ślinianki przyuszne (ślina suro-wicza). Ślina śluzowa stanowi pozostałą część śliny i produkowana jest przez śli-nianki podjęzykowe [1,2]. Płyn ten w ponad 95% składa się z wody. Pozostałe składniki to związki organiczne (enzymy, mucyny, immunoglobuliny, hormony) oraz nieorga-niczne (amoniak, magnez, sód, potas, wapń, jony chlorkowe, węglanowe, fosfo-ranowe, niektóre metale) [1,3,4]. Do funkcji fizjologicznych śliny należą: trawienie, uła-twianie przełykania, odbierania bodźców smaku, rozpuszczanie leków, wydalanie (istotne z punktu diagnostycznego), ochro-na przed patogenami. Ponadto ślina bierze udział w remineralizacji szkliwa oraz pełni funkcję osmotyczną [4]. Za funkcję tra-wienną śliny odpowiadają enzymy takie jak amylaza ślinowa, glukozydaza, maltaza, lipaza językowa, rybonukleaza. Lepkość ślinie zapewnia obecność mucyny. W ślinie znajdują się molekuły odpowiedzialne za walkę z drobnoustrojami: immunoglobu-liny – głównie IgA oraz w ilościach ślado-wych IgG, IgM; lizozym; aniony rodanko-we; interferon i enzymy antyoksydacyjne [4]. Właściwości przeciwutleniające pełnią obecne w ślinie enzymy antyoksydacyjne, takie jak katalaza, peroksydaza glutationo-wa i dysmutaza ponadtlenkowa oraz wita-mina E i kwas moczowy. Ich ilość w ślinie zależy od wielu czynników m.in. obserwuje się zmiany ich stężenia towarzyszące nie-którym chorobom [5,6].

Sposób pobraniaZe względu na wzrost popularności śli-

ny w diagnozowaniu chorób, wzrasta liczba

M. Napierała i E. Florek

Przegląd Lekarski 2017 / 74 / 10 559

technik jej pobierania, ułatwiających anali-zę. Znane są techniki pobierania opierające się na pasywnym ślinieniu, absorbowaniu śliny na jałowym waciku, czy żuciu gumy parafinowej. Pierwsza z technik polega na pobraniu próbki śliny do jałowej probówki bez stymulowania jej wydzielania, w okre-ślonym czasie np. 60 sekund. W ten sposób można uzyskać niewielkie (do 1 mL) ilości materiału. Metoda z użyciem jałowego wa-cika, który absorbuje ślinę po umieszczeniu w jamie ustnej, i przeniesieniu go do spe-cjalnie zaprojektowanych probówek, służą-cych do zabezpieczenia i wirowania próbki, pozwala na uzyskanie ok. 2 mL oczyszczo-nego materiału badawczego. Pobieranie śliny przy pomocy żucia gumy parafinowej przez określony czas i umieszczaniu jej w jałowym pojemniku prowadzi do wydzie-lenia nawet do 4 mL próbki [7-9].

Wybierając jedną z technik pobierania należy pamiętać, aby pobierać próbki śliny do jednego badania przy pomocy jednej metody. Wskazane jest nie jeść przynaj-mniej 90 min i przepłukać jamę ustną zde-jonizowaną wodą przed pobraniem oraz pobierać próbki zawsze o tej samej porze. W celu spowolnienia aktywności hydroli-tycznej enzymów, probówki z materiałem schładza się lub stosuje się dodatek inhi-bitorów proteaz, biorąc pod uwagę czy nie wpłyną one na markery poddawane ana-lizie. Pobrane i zabezpieczone próbki śli-ny, które nie są bezpośrednio poddawane analizom, powinny być przechowywane w temperaturze -80°C do momentu ozna-czeń [7,9].

Zastosowanie w badaniach diagno-stycznych

Coraz częściej ślina wykorzystywana jest w badaniach laboratoryjnych i klinicz-nych, jako alternatywa dla krwi. Zastosowa-nie śliny w ocenie stanu zdrowia niesie wie-le pozytywnych aspektów. Ślina jest łatwo dostępnym materiałem, którego pobranie nie wymaga specjalistycznego sprzętu oraz angażowania wykwalifikowanego persone-lu medycznego. Ślina może zostać pobra-na samodzielnie przez chorego w sposób nieinwazyjny i bezbolesny, co nie wywołuje stresu u pacjenta. Jest to szczególnie istot-ne w przypadku pozyskiwania materiału badawczego od małych dzieci czy osób, u których pobieranie krwi jest przeciwska-zane np. chorzy na hemofilię. Ponadto jest to metoda korzystna również dla personelu medycznego m.in. przez zmniejszenie ry-zyka zakażenia wirusem HIV czy wirusem zapalenia wątroby [1,6,10].

Stężenie substancji biologicznie czyn-nych, markerów nowotworowych, wskaź-ników stanu zapalnego zawartych w ślinie podlega zmianom wraz ze zmianami za-chodzącymi w organizmie. Poza zmianami w obrębie jamy ustnej, materiał ten można wykorzystać do diagnozowania oraz moni-torowania chorób ogólnoustrojowych [1,11].

Choroby przyzębiaŚlina, stanowi płynne medium jamy ust-

nej, stąd często wykorzystywana jest, jako wskaźnik zdrowia przyzębia np. zapalenie dziąseł lub tkanek okołowierzchołkowych

[6,11]. Biomarkery chorób przyzębia moż-na podzielić na trzy grupy: enzymy oraz ich inhibitory; substancje odpowiedzi immuno-logicznej; produkty rozpadu komórek [12]. Zmienione chorobowo miejsca wykazują wyższą aktywność fosfatazy alkalicznej, co skutkuje nasileniem procesu utraty łączno-ści tkankowej. Ponadto wśród pacjentów cierpiących na schorzenia przyzębia obser-wuje się podwyższone ilości enzymów jak β-glukuronidaza i elastaza [12]. Ważnym biomarkerem jest 1-CTP (ang. Pyridinoline Cross-Linked Carboxyterminal Telopeptide of Type I Collagen), który może wskazywać na zaawansowane stadium choroby, prowa-dzące do utraty łączności tkankowej i dege-neracji kości wyrostków zębodołowych [12]. Ponadto badany jest wpływ chorób przyzę-bia na stężenie metali w płynie ustnym [13]. Innym typem biomarkerów są wskaźniki stanu zapalnego i markery stresu oksyda-cyjnego. Badanie parametrów stresu oksy-dacyjnego w ślinie jest przydatne w ocenie narażenia na chorobę oraz w monitorowa-niu stanu zdrowia i skuteczności terapii [6].

Choroby nowotworoweBadanie śliny ze względu na obecność

specyficznych dla danej choroby biomarke-rów, może stanowić dobre narzędzie profi-laktyczne w onkologii [11]. Zawarte w ślinie biomarkery mogą być pomocne w wykry-waniu zmian nowotworowych w obrębie głowy i szyi [11]. Do potencjalnych marke-rów rozwoju raka w obrębie jamy ustnej, obecnych w ślinie zalicza się: peptyd ET-1, defensyny, cytkinę IL-6 i IL-8 oraz lektynę [1,11]. W ślinie pacjentów wykryć można DNA wirusa brodawczaka ludzkiego (ang. Human Papilloma Virus, HPV), stanowią-cego czynnik rozwoju nowotworu jamy ust-nej. Mutacje w genie p-53 obserwowane są u pacjentów z kolczysto komórkowymi nowotworami błony śluzowej jamy ustnej. Ponadto obserwuje się zmiany stężenia markerów stresu oksydacyjnego [1,4,11].

Ślina może stanowić materiał do badań przesiewowych w kierunku innych nowo-tworów. Przeciwciała anty-53 można ob-serwować u pacjentów z rakiem przełyku, żołądka czy jelita grubego. Obserwuje się podwyższone stężenie białka antygeno-wego: CA15-3 w przypadku raka sutka, CA-125 w przypadku raka jajnika, a nade-kspresję receptorów nabłonkowego czynni-ka wzrostu (EGFR) w raku trzustki [11,14].

Zaburzenia hormonalneStężenie hormonów w ślinie wykazu-

je dużą korelację z ich stężeniem we krwi. Głównie dotyczy to hormonów steroido-wych, ich prekursorów oraz metabolitów (androstedion, dehydroepiandrosteron, estradiol, estriol, progesteron, 17-OH pro-gesteron, testosteron). Na podstawie stęże-nia kortyzolu w ślinie można ocenić funkcję nadnerczy, a także monitorować reakcję organizmu na stres czy ćwiczenia fizyczne. Ponadto ślinę wykorzystuje się w badaniach diagnostycznych zespołu Cushinga [11,15].

Choroby układu pokarmowegoAnaliza śliny może być przydatna

w diagnostyce chorób układu pokarmo-

wego. Obserwuje się zmniejszone pH śli-ny osób z refluksem żołądkowym, a także obniżony poziom jonów sodowych, wzrost fosforanów i pojemności buforowej. Bada-nie śliny na obecność zakażenia Helico-bacter pylori metodą PCR może zastąpić kosztowaną i inwazyjną biopsję błony ślu-zowej żołądka przy rozpoznawaniu choro-by wrzodowej [1].

Choroby zakaźneŚlina jest materiałem pomocnym przy

diagnozowaniu wirusowego zapalenia wątroby typu A, B, C oraz wirusa HIV, nie stanowiąc przy tym źródła potencjalnego zakażenia. Oznaczalność przeciwciał an-ty-HAV, HBV, HCV w ślinie, podobnie jak w surowicy, charakteryzuje się dużą spe-cyficznością [11]. Przy zakażeniu wirusem HIV obserwuje się obecność wirusowego RNA, wzrost stężenia IgG, IgA oraz an-tygenu P24. Opracowywane są zestawy do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko wirusowi HIV. Ponadto w ślinie wykryć można wirus: opryszczki, odry, świnki, różyczki [1,11,14].

Choroby metaboliczneBadając ślinę można rozpoznać zmia-

ny cukrzycowe na wczesnym etapie roz-woju. Jednym z symptomów zaostrzenia choroby jest wzrost poziomu stresu oksy-dacyjnego w jamie ustnej. Obserwuje się wówczas zmniejszone wydzielanie śliny, a także zwiększone stężenie enzymów antyoksydacyjnych: peroksydazy oraz dys-mutazy ponadtlenkowej [16]. Badanie śliny pod kątem parametrów stresu oksydacyj-nego stanowi prosty i skuteczny sposób na monitorowanie przebiegu choroby i ocenę stanu zdrowia pacjenta [17].

Choroby sercowo-naczynioweAnaliza stężenia białka C-reaktywne-

go w ślinie może być pomocna w ocenie ryzyka występowania chorób sercowo-na-czyniowych [16]. Markery ślinowe jak: NT--proBNP, CK-MB, czy hs-cTnT, stanowią potencjalne markery diagnozowania cho-rób serca, które mogłyby ułatwić procedurę pobierania materiału oraz obniżyć koszty badań [18].

Choroby autoimmunologiczneMarkery obecne w ślinie mogą wspie-

rać monitorowanie przebiegu chorób au-toimmunologicznych (celiakii, choroby Sjögrena, mukowiscydozy). W chorobie Sjögrena związanej z uszkodzeniem śli-nianek i gruczołów łzowych, obserwuje się: ograniczone wydzielanie śliny, wzrost jonów chlorkowych i sodowych, obniżenie fosforanów, wzrost cytokin zapalnych, IgA, laktoferyny oraz wyższe stężenie białka całkowitego [15,18]. W ślinie osób z mu-kowiscydozą wykazano podwyższony po-ziom chloru, sodu, potasu, wapnia, fosforu, białka całkowitego, kwasu moczowego i li-pidów [16].

Zastosowanie w badaniach toksyko-

logicznychBadania śliny pozwalają na monitoro-

wanie narażenia na substancje toksyczne.

560

Poziom wielu substancji w ślinie odpowia-da poziomowi ich frakcji niezwiązanych w osoczu [19].

Leki Oznaczanie stężenia leków może mieć

szczególne znaczenie w przypadku zatruć, przedawkowania czy monitorowania stę-żenia terapeutycznego leku. Niektóre leki, niezwiązane z białkami, są transportowane do śliny na drodze dyfuzji biernej. Trans-port ten zależy od właściwości związku: wielkości cząsteczki, pH, rozpuszczalności w tłuszczach, czy szybkości przepływu śli-ny [18]. Obecnie można oznaczać w ślinie farmaceutyki z wielu grup, m.in. antybiotyki (gentamycyna), leki przeciwastmatyczne (teofilina), przeciwpadaczkowe (np. karba-mazepina), anty-arytmiczne i przeciwnad-ciśnieniowe (metoprolol, digoksyna), prze-ciwbólowe (paracetamol), psychotropowe (diazepam, sole litu) [18].

UżywkiW dobie, kiedy kofeina stanowi po-

wszechny i łatwo dostępny składnik wielu produktów, może stanowić zagrożenie dla zdrowia. Uzasadnione wydaje się, więc dążenie do opracowywania prostych, a za-razem precyzyjnych metod oznaczania poziomu kofeiny w celu dokładnej oceny narażenia, do których należy pomiar stęże-nia tego alkaloidu w ślinie [10]. Określenie stężenia kotyniny jest przydatnym biomar-kerem ekspozycji organizmu na dym tyto-niowy w ślinie. Wykazano to w licznych ba-daniach, gdzie określano poziom narażenia na dym tytoniowy zarówno u osób palących, jak i narażonych na bierne palenie [7,18,20].

Alkohol Do pomiaru zawartości alkoholu w or-

ganizmie, w warunkach domowych może posłużyć prosty test przesiewowy ze śliny. Jest to szybki i niezwykle czuły test. Meto-da ta pozwala wykryć alkohol od 20 min do 12h po spożyciu [18].

Narkotyki Ślina może być wykorzystana do wy-

krywania narkotyków w organizmie czło-wieka: amfetaminy, fencyklidyny, kokainy, metadonu, marihuany i opiatów [21]. Te-trahydrokanabinoidy (THC) w ślinie moż-na wykryć, w kilka minut po użyciu do 24h [18]. Ponadto analiza śliny daje możliwość wykrywania niedozwolonych substancji do-pingowych [8,11].

DopalaczeWykazano, że ślina może zostać wyko-

rzystana, jako materiał w ocenie narażenia młodzieży na środki psychoaktywne-dopa-lacze. Jest to szczególnie przydatne w miej-scach takich jak szkoły gimnazjalne, licea, gdzie ważne jest szybkie i nieinwazyjne pobranie materiału. Często oceny naraże-nia na substancje psychoaktywne dokonuje się na podstawie badań ankietowych, które stanowią stosunkowo szybką i łatwą formę oceny, jednakże wymagają one weryfikacji poprzez analizę toksykologiczną materiału biologicznego w celu ich uwiarygodnienia co zapewnia badanie śliny [8].

Zanieczyszczenie środowiskaŚlina może posłużyć w badaniach na-

rażenia na pestycydy i środowiskowego narażenia na dym tytoniowy [20]. Metale ciężkie takie jak ołów i kadm są ważnymi toksynami zawodowymi i mogą znajdować się w ślinie [22].

Włosy:Budowa Włosy są zbudowane ze zrogowacia-

łych komórek naskórka. W skład włosa wchodzi tzw. łodyga położona powyżej skóry, a także korzeń włosa położony pod skórą, otoczony pochewką, którą nazywa się mieszkiem włosowym i zakończony cebulką. Do mieszka włosa przyczepio-ny jest mięsień przywłosowy, do którego uchodzi gruczoł łojowy [23]. W 60-95% włos zbudowany jest z białek, głównie ke-ratyny bogatej w aminokwasy siarkowe, 1-9% z tłuszczy, a w 0,1-5% z pigmentów (melaniny). Kolor włosów rożni się w za-leżności od ilości, rozmieszczenia i ro-dzaju obecnego w nim pigmentu. W skład włosa wchodzą również woda, pierwiastki śladowe oraz polisacharydy [24]. Wzrost włosów zależy od wielu czynników m.in. wieku, stanu odżywienia, poziomu wita-min i substancji mineralnych, temperatu-ry otoczenia, zaburzeń metabolicznych, okresu ciąży. Włosy średnio wrastają o ok. 1 cm w ciągu miesiąca (0,6-1,4 cm). Badając fragmenty włosa o długości 1 cm, odpowiadające kolejnym miesiącom, można wykryć substancje zażywane przez pacjenta [25-27]. Na proces odkła-dania się substancji we włosach wpływa: zawartość melaniny, polarność oraz cha-rakter zasadowy lub kwasowy związku. Zawartość ksenobiotyków we włosach zależy od ich barwy. Prawdopodobnie melanina jest jednym z miejsc wiązania ksenobiotyków we włosach, do którego dochodzi na drodze odziaływań van der Waalsa pomiędzy pierścieniami aroma-tycznymi melaniny i wbudowywanego związku [28]. Włosy afrykoidalne czy mongoidalne wiążą większe ilości związ-ków niż włosy kaukazoidalne. Zarówno melanina jak i kreatyna mają większe powinowactwo do związków zasadowych np. kokainy, morfiny i nikotyny, a mniej-sze do związków o charakterze kwaśnym jak kwas acetylosalicylowy i THC [28,29]. Substancje mogą przedostawać się do włosów: z krwi poprzez sieć naczyń wło-sowatych, z wydzieliny gruczołów łojo-wych i potowych, ze środowiska. Związki lipofilne (kokaina, metamfetamina) są lepiej wbudowywane w strukturę włosa niż związki bardziej polarne (amfetami-na, morfina) [29]. We włosach częściej obserwuje się obecność prekursorów niż metabolitów, co wyróżnia ten materiał biologiczny od innych [28,29].

Sposób pobrania i przygotowania próbek do analizy

Pasmo włosów o grubości ołów-ka (średnicy ok. 0,5 cm) należy odciąć za pomocą nożyczek ceramicznych tuż przy skórze z tylnej części głowy i za-bezpieczyć np. w kopercie. Dla ułatwie-

nia pasmo do pobrania można zawiązać przy nasadzie głowy nicią. Próbki można przechowywać w temperaturze pokojo-wej. Dla uzyskania właściwych wyników próbki włosów powinny zostać pobrane pomiędzy 4-5 tygodniem od wprowadze-nia substancji do organizmu. W porówna-niu z krwią, włosy są pobierane w prosty, niedrogi i nieinwazyjny sposób, mogą być łatwo przechowywane i transporto-wane do laboratorium w celu przeprowa-dzenie ich analizy [29,30]. Zastosowanie włosów, jako materiału badawczego ma pewne ograniczenia, takie jak występo-wanie trudnych do usunięcia, egzogen-nych zanieczyszczeń, których źródłem mogą być np. zabiegi kosmetyczne [30]. Dlatego włosy przed rozpoczęciem analiz wymagają odpowiedniego przygotowania w celu dekontaminacji próbki [30].

Zastosowanie w badaniach diagno-stycznych

Włosy stanowią dobry materiał badaw-czy w analizie kortyzolu. Analiza biomar-kera narażenia na chroniczny stres może przyczynić się do zrozumienia przebiegu wielu chorób (np. zawału mięśnia serco-wego) [29,30]. We włosach można, także oznaczać inne hormony steroidowe (estra-diol, progesteron, testosteron) oraz lipidy, których profil we włosach odzwierciedla ich zawartość we krwi. Na podstawie ich analizy można ocenić stan zdrowia i odży-wienia organizmu [30,31]. Ponadto często z udziałem włosów dokonuje się analizy pierwiastków, stosując różne techniki ana-lityczne, takie jak atomowa spektrometria absorpcyjna, spektrometria mas z joniza-cją w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ang. Inductively Coupled Plasma Mass Spektro-metry, ICP-MS) [33].

Zastosowanie w badaniach toksyko-logicznych

W ekspertyzie toksykologicznej spo-śród materiałów alternatywnych najwięk-sze znaczenie mają włosy, których analiza stwarza możliwość śledzenia historii zaży-wania ksenobiotyków w okresie określo-nym długością włosa. W przypadku włosów czas detekcji ksenobiotyków jest znacznie dłuższy niż w przypadku analiz w próbce krwi lub moczu. Analiza włosów ma szcze-gólne zastosowanie w medycynie sądowej do celów opiniowania sądowo-lekarskiego odnośnie zatruć śmiertelnych substancja-mi chemicznymi [27,29].

Leki Obecność leków we włosach informuje

o stosowanej terapii farmakologicznej na przestrzeni ostatnich miesięcy. Za pomocą analizy włosów można z łatwością wykryć substancje psychotropowe jak benzodia-zepiny i opiaty [29].

Narkotyki Badanie włosów w postaci testów

skriningowych na zawartość substancji zakazanych znalazło zastosowanie w wię-zieniach, szkołach, a także w badaniach przedstawicieli zawodów bezpieczeństwa publicznego (np. wojskowy, policjant) [34].

M. Napierała i E. Florek

Przegląd Lekarski 2017 / 74 / 10 561

Podczas analiz włosów na obecność nar-kotyków należy wziąć pod uwagę fakt, że u osób niezażywających narkotyków, ale narażonych np. na dym marihuany bądź pyłki kokainy, może dojść do kontaminacji. W celu wykluczenia dodatnich wyników zafałszowanych czynnikami zewnętrzny-mi, przed ekstrakcją próbki włosów należy dokładnie przemyć [34]. Włosy stanowią również materiał pomocny przy kontroli na-rażenia na narkotyki dzieci rodziców uza-leżnionych [27,28,34].

Substancje dopingoweWłosy mogą stanowić przydatny ma-

teriał biologiczny w badaniach antydopin-gowych. Lista niedozwolonych substancji w okresie zawodów jest ściśle określona i zawiera limity ich zawartości. Ponadto wszystkie substancje niebędące na liście i niezarejestrowane, jako leki dla ludzi, są także niedozwolone. Analiza włosów po-zwala na wykazanie zażywania substancji o działaniu długotrwałym jak sterydy ana-boliczne, które wpływają na przyrost masy mięśniowej, a w momencie pobierania ma-teriału do analizy nie ma ich w organizmie. Testy substancji dopingujących we wło-sach są jednak wciąż poddawane ocenie przez właściwe agencje [35].

UżywkiPierwsze oznaczenia dotyczące za-

wartości nikotyny we włosach pojawiły się ponad 30 lat temu. Z biegiem lat opracowy-wano znacznie czulsze metody oznacza-nia tego ksenobiotyku we włosach osób narażonych (technika spektroskopii maso-wej połączona z chromatografią gazową lub cieczową) [36].

Alkohol Badania z udziałem włosów mogą być

użyteczne w celu detekcji nadmiernego bądź chronicznego zażywania alkoholu, poprzez detekcję markerów alkoholowych jak etyloglukuronid (EtG). Maksymalny okres detekcji zażywanych alkoholi to trzy miesiące ze względu na hydrofilowe wła-ściwości EtG, które sprawiają, że zwią-zek ten jest łatwo wypłukiwany z włosów. W konsekwencji można otrzymać wyniki fałszywie ujemne [37].

Zanieczyszczenie środowiskaW badaniach epidemiologicznych mo-

nitorujących skażenie środowiska i nara-żenie pracowników, włosy mogą stanowić materiał dzięki, któremu można wykazać przebieg narażenia na przestrzeni lat np. na arsen, pestycydy (1,1,1-trichloro-2,2-bi-s(p-chlorofenylo)etan, DDT); heksachloro-benzen, HCB), heptachlor, dioksyny, poli-chlorowane bifenyle (PCB)) [37].

Paznokcie:Budowa i funkcjePaznokieć to przydatek naskórka

zbudowany z blaszki grzbietowej i po-deszwowej. Blaszka grzbietowa składa się z zagłębionego w skórze korzenia i paznokcia właściwego, wyrastającego na zewnątrz. Paznokcie powstają z ma-cierzy, a rosnąc przylegają do łożyska.

Ludzki paznokieć stanowi giętką, zro-gowaciałą blaszkę, odporną na czynniki mechaniczne, zbudowaną z wysokosiar-kowych, twardych keratyn [39]. Wzrost paznokcia jest procesem ciągłym, trwa-jącym od 5 miesiąca życia płodowego do śmierci. Paznokcie u rąk rosną ok. 3 mm/miesiąc, a wzrost paznokci u stóp jest dwukrotnie wolniejszy [40,41]. Różnice w szybkości wzrostu paznokcia wynika-ją ze zmienności osobniczych, wieku, płci, stanu zdrowia, czynników zakaź-nych, hormonalnych i stanu odżywienia [39]. Zarówno paznokcie jak i włosy są próbkami keratynizowanymi i mogą gro-madzić leki podczas długotrwałego na-rażenia. Istnieją jednak pewne różnice pomiędzy tymi materiałami, wpływający-mi na użyteczność w analizie zawartości ksenobiotyków. Paznokcie nie zawierają melaniny. Badania dowodzą, że zawar-tość ksenobiotyków we włosach, zależy także od zawartości w nich barwników. Ponieważ pH mealnocytów wynosi 3-5, melanina sprzyja wiązaniu związków o charakterze zasadowym [42]. W miarę wzrostu paznokcia, substancje chemicz-ne (nielegalne substancje, leki, biomar-kery alkoholowe itd.) Wnikają do włókien keratynowych, gdzie mogą pozostawać przez dłuższy czas (3-5 miesięcy w pa-znokciach dłoni i 8-14 miesięcy w pa-znokciach stóp). Zaletami wykorzystania paznokci, jako materiału biologicznego jest bezbolesny sposób ich pobrania oraz związane ze sposobem transportu i przechowywania, zmniejszenie kosztów analiz [43].

Sposób pobieraniaDo kontaminacji paznokci może dojść

w trakcie ich obcinania przyrządami, dla-tego ważne jest prawidłowe pobranie pró-bek. Pacjenci nie powinni obcinać paznok-ci przed użyciem ich do analizy przez okres kilku tygodni. Paznokcie powinny zostać obcięte w możliwie jak największej ilości, najlepiej zarówno u obu stóp i rąk. Wycinki paznokci powinny być umieszczone w ko-percie i przechowywane w temperaturze pokojowej, w suchym miejscu. Przed do-konaniem właściwych analiz pobrany ma-teriał powinien zostać przemyty np. aceto-nem [43].

Zastosowanie w diagnostycePaznokcie to materiał biologiczny,

który może posłużyć przy monitorowaniu stanu odżywienia organizmu oraz w oce-nie narażenia na działanie metali toksycz-nych (Cd, Pb, As). Niedobór lub nadmiar pierwiastków niezbędnych, takich jak Zn, Cu, Fe może świadczyć o rozwoju wielu stanów chorobowych w organizmie. Na-ukowcy udowodnili związek pomiędzy niewłaściwym stężeniem pierwiastków niezbędnych a stanami chorobowymi (nie-dokrwistość, drgawki, drżenie mięśnio-we) i zaburzeniami metabolicznymi [44]. Zawartość pierwiastków w paznokciach może być nawet pięćdziesięciokrotnie wyższa niż we krwi czy moczu [45]. Do oznaczania metali w paznokciach lub wło-sach stosuje się między innymi spektro-

metrię mas z jonizacją w plazmie sprzężo-nej indukcyjnie (ang. Inductively Coupled Plasma Mass Spektrometry, ICP-MS) [43]. Poza oceną zawartości pierwiastków w ludzkim organizmie, paznokcie są także materiałem alternatywnym w monitoro-waniu niektórych stanów chorobowych, takich jak nowotwory, czy choroby serco-wo-naczyniowe [43].

Zastosowanie w badaniach toksyko-logicznych

Paznokcie mają zdolność kumulowa-nia ksenobiotyków przez dłuższy okres czasu. Materiał ten wykorzystuje się w celu zbadania narażenia zawodowego na metale (np. na Pb wśród pracowników hut), oceny narażenia środowiskowego (monitorowanie narażenia na: Cd, Zn, Cu, Fe) czy w analizach z zakresu medycyny sądowej [46-48].

LekiMechanizmy depozycji leków w pa-

znokciach nie zostały w pełni poznane. W jednym z badań dokonano obserwa-cji na podstawie włączenia zolpidemu po podaniu pojedynczej dawki doustnej. Wyniki analizy wykazały trzy potencjal-nie drogi pojawienia się leku w próbkach paznokci: zanieczyszczenie przez pot możliwe do wykrycia przez 24 godziny po spożyciu leku (najniższe stężenie); osa-dzanie się w korzeniu poprzez krew pły-nącą w macierzy po dwóch tygodniach; oraz na skutek wzrostu paznokcia od rąbka do wolnej części paznokcia po 3 miesiącach od podania leku (najwyższe stężenie) [49]. Leki w większości wbu-dowują się w strukturę paznokci w więk-szym stężeniu niż ich metabolity. NALT jest wyjątkowym przypadkiem, w którym metabolit 6-BNAL, a nie lek macierzysty, jest przeważającą formą obecną w pa-znokciach [50].

NarkotykiNiedawno opublikowano obszerny

przegląd stosowania testów paznokci w programach leczenia uzależnień od narkotyków, identyfikacji narkotyków, mo-nitorowania leków, w toksykologii sądo-wej, obejmującej analizy post mortem [46, 50]. Stężenie niektórych narkotyków np. kwasu 11-nor-Δ9-THC-9-karboksylowego (THCA) w paznokciach jest niemal pię-ciokrotnie wyższe niż w próbkach włosów [46]. Analizy z udziałem paznokci stały się niezawodnym sposobem obrazowa-nia długoterminowego stosowania i nad-używania narkotyków. Techniki ekstrakcji są proste, a wrażliwe oprzyrządowanie analityczne (głównie LC-MS, GC-MS) umożliwia uzyskanie dokładnych wyników [46,50].

AlkoholW paznokciach, tak jak i we włosach

możliwa jest detekcja EtG, biomarkera stosowanego do wykrywania spożycia al-koholu. Zgodnie z wynikami badań, EtG w paznokciach jest jakościowym wskaź-nikiem spożycia alkoholu nawet w ciągu ostatnich 12 tygodni [37].

562

Zanieczyszczenie środowiskaPaznokcie stały się użytecznym na-

rzędziem do wykrywania narażenia na ksenobiotyki np. metale ciężkie. Ludzkie paznokcie są szeroko stosowane do mo-nitorowania narażenia na nadmierne stę-żenie substancji chemicznych. Paznok-cie można badać łatwo i ekonomicznie w obiektach mieszkalnych i przemysło-wych. Wysokie stężenia niektórych pier-wiastków obserwowane w paznokciach mogą być przyczyną wielu chorób [48].

PodsumowanieIstotną rolę w procesie leczenia odgry-

wa diagnostyka pozwalająca na wczesne rozpoznanie choroby, a w konsekwencji zastosowanie odpowiedniej terapii. Po-branie materiału biologicznego w sposób nieinwazyjny ogranicza lęk pacjenta i za-chęca go do częstszej kontroli stanu zdro-wia. Rozwój metod analitycznych i technik laboratoryjnych umożliwia wykorzystanie nowych materiałów w diagnostyce i w ba-daniach toksykologicznych. Alternatywą dla stosowanych powszechnie w labora-toriach: krwi, moczu i kału stanowią ma-tryce jak ślina, włosy, paznokcie. Zaleta-mi wyżej opisanych materiałów do badań jest nieinwazyjny i bezbolesny sposób ich pozyskania, co jest szczególnie pomocne w przypadku dzieci czy osób starszych, u których pobranie tradycyjnych mate-riałów do analiz może być trudne. Ślina, włosy oraz paznokcie minimalizują ryzyko przeniesienia infekcji na personel me-dyczny. Ponadto materiały te nie wyma-gają szczególnych warunków przechowy-wanie, a analizy przydatków skóry nie są obciążone błędem związanym z krótko-terminowymi zmianami stężeń substancji oznaczanych [18].

Z powodu na niskie stężenie kseno-biotyków w tych materiałach konieczne jest stosowanie czułych i kosztownych metod pomiarowych. Ponadto wciąż brak poprawnie sprecyzowanych wartości re-ferencyjnych dla wielu substancji, których ustalenie poza czynnikami osobniczymi utrudniają m.in. stosowanie zabiegów pie-lęgnacyjnych włosów i paznokci. Dlatego interpretacja wyników badań z udziałem alternatywnych materiałów biologicznych może być trudna. Niezbędne są, więc dal-sze badania w celu optymalizacji i walidacji właściwych metod oznaczania związków w tych materiałach.

piśmiennictwo1. Farnaud SJ, Kosti o, getting SJ, renshaw

D: Saliva-physiology and diagnostic potential in health and disease. Sci World J. 2010; 10: 434-456.

2. Nieuw Amerongen AV, Veerman ecI, Vissink A: Saliva-properties and functions. Salivary Diagnostics. Red. Wong TD, Wiley-Blackwell. 2008, 27-26.

3. Neyraud e, palicki o, Schwartz c, Nicklaus S, Feron g: Variability of human saliva composition: Possible relationships with fat perception and lik-ing. Arch Oral Biol. 2012; 57: 556-566.

4. cyprysiak g, Tadeusiak w: Zastosowanie śliny w diagnostyce medycznej. Nowa Stomatologia 2001; 2: 33-36.

5. Ahmadi-Motamayel F, goodarzi MT, Hendi SS, Kasraei S, Moghimbeigi A: Total antioxidant ca-pacity of saliva and dental caries. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2013.

6. golusińska-Kardach e, Napierała M, Sokalski J, Kardach H, Florek e: Choroby przyzębia u pa-laczy tytoniu a parametry stresu oksydacyjnego. Przegl Lek. 2015; 72: 584-587.

7. Drummer oH: Drug testing in oral fluid. Clin Bio-chem Rev. 2006; 27: 147-159.

8. Napierała M, Tezyk A, piznal M, Bogusiewicz J, Florek e: Wykorzystanie śliny do oceny narażenia młodzieży na dopalacze. Przegl Lek. 2015; 72: 531-535.

9. Veerman ecI, Vissink A, wong DT, Niuw Am-erongen AV: Processing and storage of saliva samples. Salivary Diagnostic. Willey-Blackwell, 2008.

10. Napierała M, Florek e: Analiza jakościowa i ilo-ściowa kofeiny w ślinie z wykorzystaniem wyso-kosprawnej chromatografii cieczowej. Przegl Lek. 2016; 73: 777-780.

11. greabu M, Battino M, Mohora M, Totan A, Di-dilescu A. et al: Saliva-a diagnostic window to the body, both in health and in disease. Journal of Medicine and Life 2009; 2: 124-132.

12. cafiero c, Matarasso S: Predictive, preven-tive, personalised and participatory periodontol-ogy: ‘the 5Ps age’ has already started. EPMA J. 2013; 4: 16.

13. Herman M, golasik M, piekoszewski w, walas S, Napierala M. et al: Essential and toxic metals in oral fluid-a potential role in the diagnosis of peri-odontal diseases. Biol Trace Elem Res. 2016; 173: 275-282.

14. Szydlarska D, grzesiuk w, Kupstas A, Bar-An-dziak e: Ślina jako materiał diagnostyczny. Forum Med. Rodz. 2008; 6: 454-464.

15. Klichowska-palonka M1, Bachanek T: Możliwo-ści wykorzystania śliny w diagnostyce i leczeniu wybranych stanów patologicznych-przegląd pi-śmiennictwa. Przegl Lek. 2011; 68: 114-117.

16. Javaid MA, Ahmed AS, Durand r, Tran SD: Saliva as a diagnostic tool for oral and systemic diseases. J Oral Biol Craniofac Res. 2016; 6: 66-75.

17. Al-rawi NH: Oxidative stress, antioxidant status and lipid profile in the saliva of type 2 diabetics. Diab Vasc Dis Res. 2011; 8: 22-28.

18. Kowalczyk p, Manda A, Kościelniak B, Tomasik p, Sztefko K: Nietypowe materiały biologiczne pobierane w sposób nieinwazyjny w diagnostyce laboratoryjnej. Diagn Lab. 2014; 50: 255-262.

19. Heltsley r, Depriest A, Black Dl, robert T, Marshall l. et al: Oral Fluid Drug Testing of Chronic Pain Patients. I Positive Prevalence Rates of Licit and Illicit Drugs. J Anal Toxicol. 2011; 35: 529-540.

20. Kulza M, woźniak A, Seńczuk-przybyłowska M, czarnywojtek A, Kurhańska-Flisykowska A, Florek e: Oznaczanie kotyniny w ślinie me-todą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją diodową. Przegl Lek. 2012; 69: 837-840.

21. cone eJ, clarke J, Tsanaclis l: Prevalence and disposition of drugs of abuse and opioid treatment drugs in oral fluid. J Anal Toxicol. 2007; 31: 424-433.

22. Koh DS, Koh gc: The use of salivary biomarkers in occupational and environmental medicine. J Occup Environ Med. 2007; 64: 202-210.

23. Koszowski B, czogała J, goniewicz MŁ, Sob-czak A, Kolasińska e. et al: Zastosowanie ozna-czeń nikotyny we włosach jako narzędzia do oceny

narażenia na dym tytoniowy. Przegl Lek. 2008; 10: 696-699.

24. cooper g: Hair testing is taking root. Annals of Clinical Biochemistry 2011; 48: 516-530.

25. wozniak A, Napierala M, golasik M, Herman M, walas S. et al: Metal concentrations in hair of patients with various head and neck cancers as a diagnostic aid. Biometals 2016; 29: 81-93.

26. pérez-ortuño r, Martínez-Sánchez JM, Fu M, Fernández e, pascual JA: Evaluation of tobacco specific nitrosamines exposure by quantification of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) in human hair of non-smokers. Sci Rep. 2016; 6: 25043.

27. Kintz p: Value of hair analysis in postmortem toxi-cology. Forensic Sci Int. 2004; 142: 127-134.

28. chojnacka K, górecka H, górecki H: The effect of age, sex, smoking habit and hair color on the composition of hair. Environ Toxicol Pharmacol. 2006; 22: 52-57.

29. cooper g, Kronstrand r, Kintz p: Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci Int. 2012; 218: 20-24.

30. rodrigues J, Batista B, Nunes J, passos c, Bar-bosa JrF: Evaluation of the use of human hair for biomonitoring the deficiency of essential and ex-posure to toxic elements. ‎Sci Total Environ. 2008; 405: 370-376.

31. Yang HZ, lan J, Meng YJ, wa XJ, Han Dw: A preliminary study of steroid reproductive hor-mones in human hair. J Steroid Biochem. Molec Biol. 1998; 67: 447-450.

32. Masukawa Y, Tsujimura H, Imokawa g: A sys-tematic method for the sensitive and specific deter-mination of hair lipids in combination with chroma-tography. J Chrom B. 2005; 823: 131-142.

33. Abdulrahman F, Akan J, chellube Z, waziri M: Levels of heavy metals in human hair and nail samples from Maiduguri Metropolis, Borno State, Nigeria. Word Environment 2012; 2; 81-89.

34. Di corcia D, D’Urso F, gerace e, Salomone A, Vin-centi M: Simultaneous determination in hair of mul-ticlass drugs of abuse (including THC) by ultra-high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry. J Chromatogr B. 2012; 899: 154-159.

35. Thieme D, grosse J, Sachs H, Mueller rK: Ana-lytical strategy for detecting doping agents in hair. Forensic Sci Int. 2000; 107: 335-345.

36. Seńczuk M, Florek e, piekoszewski w, Stana-szek r, Bręborowicz gH. i wsp: Nikotyna we włosach noworodków jako wskaźnik palenia tyto-niu przez kobiety w czasie ciąży-badania wstępne. Przegl Lek. 2007; 64: 729-868.

37. Berger l, Fendrich M, Jones J, Fuhrmann D, plate c, lewis D: Ethyl glucuronide in hair and fingernails as a long-term alcohol biomarker. Ad-diction (Abingdon, England) 2014; 109: 425-431.

38. Apenzeller BMr, Tsatsakis AM: Hair analysis for biomonitoring of environmental and occupational exposure to organic pollutants: State of the art, critical review and future needs. Toxicol Lett. 2012; 210: 119-140.

39. Slotnick M, Nriagu J: Validity of human nails as a biomarker of arsenic and selenium exposure: A review. Environ Res. 2006; 102: 125-139.

40. lai-cheong J, Mcgrath J: Structure and function of skin, hair and nails. Medicine 2009; 37: 223-226.

41. Yaemsiri S, Hou N, Slining M, He K: Growth rate of human fingernails and toenails in healthy Ameri-can young adults. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2009; 24: 420-423.

42. Łuczak-Zielkiewicz I, Szutowski MM: Wartość diagnostyczna włosów. Biuletyn Wydziału Farma-ceutycznego. WUM 2013; 8: 56-64.

M. Napierała i E. Florek

Przegląd Lekarski 2017 / 74 / 10 563

43. He K: Trace Elements in Nails as Biomarkers in Clinical Research. Eur J Clin Invest. 2011; 41: 98-102.

44. Koranteng-Addo J, owusu-Ansah e, Boam-ponsem l, Koka J, Agjei r: Analyses of lead and zinc levels in human scalp hair in occupationally exposed workers in Cape Coast, Ghana. J Chem Pharm Res. 2010; 2: 384-391.

45. wołowiec p, Michalak I, chojnacka K, Mikule-wicz M: Hair analysis in health assessment. Clini-ca Chimica Acta 2013; 419: 139-171.

46. palmeri A, pichini S, pacifici r, Zuccaro p, lo-pez A: Drugs in Nails. Physiology, Pharmacokine-tics and Forensic Toxicology. Clin Pharmacokinet. 2000; 38: 95-110.

47. Barbosa F, Tanus-Santos J, gerlach r, parsons P: A critical review of biomarkers used for monitor-ing human exposure to lead: advantages, limita-tions, and future needs. Environ Health Perspect. 2005; 113: 1669-1674.

48. carneiro M, grotto D, Batista B, rhoden c, Bar-bosa Jr F: Background Values for Essential and

Toxic Elements in Children’s Nails and Correlation with Hair Levels. Biol Trace Elem Res. 2011; 144: 339-350.

49. Madry MM, Steuer Ae, Binz TM, Baumgartner Mr, Kraemer T: Systematic investigation of the in-corporation mechanisms of zolpidem in fingernails. Drug Test Anal. 2014; 6: 533-541.

50. Shu I, Jones J, Jones M, lewis D, Negrusz A: Detection of Drugs in Nails: Three Year Experi-ence. J Anal Toxicol. 2015; 39: 624-628.