Nieinwazyjne badania genówpłodu w osoczu kobiet ciężarnych ... · Konflikt RhD przed...
Transcript of Nieinwazyjne badania genówpłodu w osoczu kobiet ciężarnych ... · Konflikt RhD przed...
Katarzyna Guz
Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Nieinwazyjne badania molekularne
antygenów komórek krwi
Dlaczego są ważne?
Dzięki czemu są możliwe?
Jakimi metodami prowadzimy je w Polsce i na świecie?
Dlaczego nie są proste?
Jakie są nasze wyniki i wyniki innych laboratoriów?
Co wymaga ulepszenia?
Dlaczego są ważne?
Antygeny komórek krwi mogą być immunogenne:
erytrocyty: najważniejsze RhD, ale też K, Rhc, RhE i inne
płytki: najważniejsze HPA-1a, ale też HPA-5b i inne HPA
Matczyne alloprzeciwciała
mogą powodować chorobę hemolityczną (ChHPN) lub
alloimmunologiczną małopłytkowość (AIMP/N) płodu/noworodka, gdy
dany antygen jest obecny na komórkach płodu
nie są groźne, gdy płód nie ma antygenu do którego są przeciwciała
nie trzeba monitorować ciąży metodami inwazyjnymi (kordocenteza,
amniopunkacja - ryzyko utraty płodu 1%, pogłębienia alloimmunizacji
Immunoprofilaktyka konfliktu RhD – nie potrzebna jak płód Rh-
Konflikt RhD
przed immunoprofilaktyką
~20% immunizacja
immunoprofilaktyka po porodzie, poronieniu
1,6% immunizacja (Lenkiewicz 2000), 0,49% w latach 2006-2007
(Żupańska 2009) ~1000 rocznie w Polsce
90% skuteczność (zaniedbania podania immunoglobuliny anty-D, za mała dawka, przeciek i alloimmunizacja już w trakcie ciąży, u 1% ciężarnych w pierwszej ciąży, błędy w oznaczeniu RhD dziecka)
immunoprofilaktyka w 28 lub 34 tyg ciąży (rutynowo
stosowana w wielu krajach)
Obniżenie ryzyka immunizacji do 0,3% (van der Schoot 2009)
wysokie koszty, a nie jest potrzebna gdy płód RhD ujemny (40%)
w Wielkiej Brytanii 40 000 kobiet na 700 000 porodów rocznie
niepotrzebnie dostanie immunoglobulinę anty-D (Wright 2009)
Konflikty inne niż RhD
brak immunoprofilaktyki
obowiązek skriningu przeciwciał czerwonokrwinkowych u
wszystkich ciężarnych w 12 i 28 tyg ciąży od roku 1996
zagwarantowany ustawowo:
ocena stosowania tego prawa w latach 2006-2007 (Żupańska
2009):
niespełna 48% ciężarnych objęto badaniami skriningowymi
(prawie 100% w Holandii)
jedynie 50% z nich to ciężarne RhD dodatnie (ich liczba powinna
być 5-krotnie wyższa)
przeciwciała nie anty-D u 0,37% ciężarnych RhD+ (anty-E, -K, -
c, -Jka,-Jkb, -Fya, -C, MNS, anty-Coa)
szacunkowo ~2000 przypadków rocznie w Polsce – aż 4/5
niedodiagnozowane
Klinicznie istotne przeciwciała nie
anty-D Anty-K:
ciężka ChHP/N
Anty-c:
ciężka ChHPN nawet przy niskim mianie przeciwciał
przeciwciała mogą wytworzyć się w późniejszym etapie ciąży
Anty-E:
często wykrywane u ciężarnych
na ogół nie reagują one w pośrednim teście antyglobulinowym (PTA)
albo miano ich jest bardzo niskie
rzadko są przyczyną choroby hemolitycznej płodów/noworodków
(ChHP/N)
zdarzają się przypadki ChHP/N o bardzo ciężkim przebiegu
Dzięki czemu są możliwe?
Inwazyjna
badania
antygenów
na komórkach pobranych w trakcie kordocentezy
DNA
z amniocytów
zbyt mało materiału u około 2% kobiet; ryzyko utraty płodu 1% (Mujezinovic, 2007)
z kosmków łożyska
zbyt mało materiału u około 8%;
ryzyko utraty płodu u około 1% (Mujezinovic, 2007)
W Wielkiej Brytanii rocznie ~20 000 amniocentez i 5 000 CVS - około przypadków 250 utraty płodu
Nieinwazyjna
badania
komórek płodu we krwi matki
zarzucona bo komórki te mogą przetrwać >20 lat
wolnokrążącego DNA płodu (cell free fetal - cff-DNA) w osoczu kobiety ciężarnej
Diagnostyka prenatalna
Izolacja
DNA
cff-DNA w osoczu ciężarnych (Lo 1997)
cff-DNA
DNA matki
Z wykładu „ Non – invasive Prenatal Diagnosis
Technical Challenges and Advances, Helen White, PhD, 2009
Charakterystyka cff-DNA możliwe do wykrycia już w 5/7 tygodniu ciąży
stężenie początkowo bardzo niskie, wzrasta z wiekiem
ciąży, ale zawsze konieczne czułe metody by je
wykryć
stanowi tylko 3-6% DNA w osoczu – reszta to DNA
matki
ulega degradacji w kilka godzin po porodzie (źródłem
cff-DNA komórki trofoblastu)
Kierunki intensywnych badań
cff-DNA w osoczu
Choroby uwarunkowane genetycznie
sprzężone z płcią
jednogenowe
aneuploidia
Konflikty serologiczne (od 10 lat w IHiT):
RhD, Rhc, RhE
K w standaryzacji
Jakimi metodami badamy cff-DNA?
Efektywna metoda izolowania DNA:
z dużych objętości (1 ml)
odczynnikami dedykowanymi do izolowania kwasów
nukleinowych wirusów
Bardzo czuła i specyficzna detekcja DNA:
real-time PCR
spektrometria mas MALDI-TOF
digital PCR
Ograniczenie ryzyka kontaminacji na etapie
przedanalitycznym i analitycznym
Dlaczego nie jest to proste?
śladowa ilość cff-DNA w osoczu wobec wysokiej proporcji
DNA matki
tylko połowa genów w cff-DNA pochodzi od ojca
różna skala trudności badania w zależności jakie jest podłoże
genetyczne determinujące antygen, którego szukamy u płodu
ryzyko kontaminacji próbki DNA w fazie przedanalitycznej
genem powszechnym w populacji
konieczność udowodnienia, że badamy DNA płodu, a nie tylko
DNA matki - trudności w opracowaniu taniej, uniwersalnej
kontroli cff-DNA > niedopuszczalny wynik fałszywie ujemny!
Skale trudności nieinwazyjnych
badań prenatalnych Najłatwiej szukać genu, którego nie ma u matki
SRY - nie ma go u kobiet
RHD – nie ma go u kobiet RhD-, a jest u osób
RhD+
ale skomplikowane i różnorodne podłoże fenotypów RhD+ i
RhD– stwarza dodatkowe trudności
Podłoża genetyczne fenotypu RhD(-)
Delecja (brak) genu RHD (99% w rasie białej*)
pseudogen RHD ψ (67% w rasie negroidalnej)
RHD-CE(3-9)-D (4-6% w rasie żółtej)
RHDel (20-30% w rasie żółtej)
inne nieznane dotąd mutacje
* u 1% osób RhD- rasy kaukaskiej gen RHD jest obecny,
różne warianty RHD niemego
Warianty białka RhD o zmienionej
ekspresji lub/i zmienionych epitopach Słabe D - mała ilość antygenu D na krwinkach
mutacje punktowe w regionach przezbłonowych lub
wewnątrzkomórkowych białka RhD i niektóre hybrydy
RHD-CE-D
Częściowy D - utrata jakiegoś epitopu D
hybrydy RHD-CE-D lub mutacje punktowe w
zewnątrzkomórkowych fragmentach białka RhD
DEL - szczególnie słaby D możliwe do wykrycia
serologicznie tylko techniką adsorpcji elucji
mutacje nonsensowne lub delecja eksonu 9 lub 8 RHD
Konsekwencje skomplikowanego podłoża
genetycznego antygenu RhD dla
nieinwazyjnej diagnostyki
Niektóre osoby RhD-mają gen RHD lub jego
fragmenty
Jeśli kobieta Rh ujemna ma niemy gen RHD nie można u niej wykonać nieinwazyjnej diagnostyki RHD płodu
Analiza poziomu genu RHD względem genu kontrolnego na poziomie ilości DNA matczynego a nie cff-DNA
Niektóre osoby RhD+ mogą
nie mieć pewnych
fragmentów genu RHD
RhD dodatni płód może nie mieć
wszystkich eksonów/intronów genu
RHD
Konieczne badanie więcej niż jednego
fragmentu RHD
Ilościowe wyniki wykrywania RHD pozwalają
odróżnić czy to gen płodu czy matki
flu
ore
scen
cja
Sygnał tła (fluorescencja z pierwszych 15 cykli)
RhD dodatnia
kobieta
Ct=28
Osoba
RhD
ujemna
Ct=40
RhD ujemna kobieta
z RhD dodatnim
płodem
Ct=35
Przypadki w których niemożliwe było
nieinwazyjne ustalenie czy płód jest RhD+
4 matki z RHD słabe
1 matka z wariantem RHDel (IVS3 +1G>A)
6 RHD 1 RHDel (IVS3 + 1 G>A)
RHD częściowe (3 DVI typ 2, 1 DVI typ 1; 1 DV typ 4)
3 RHD słabe (typ 1, 11, 17)
IHiT,
Warszawa
5/353
Amsterdam
16/2380
Jeśli w osoczu kobiety ciężarnej Rh-
nie wykryto genu RHDnajprawdopodobniej płód jest RHD ujemny
lecz
trzeba potwierdzić, że w próbce było:
wystarczająco dużo DNA płodu
„dobra” jakość DNA płodu
Badamy geny kontrolne odziedziczone po ojcu, a nie obecne u matki dla chłopców : gen SRY
dla dziewczynek: polimorfizmy typu delecja genu: GSTM1, GSTT1, S03, S06 , S 15 lub bialleliczne polimorfizmy typu insercja/delecja w obrębie genu: S01a/b, S04a/b, S05a/b, S07a/b, S08a/b, S09a/b, S10a/b, S11a/b, S14a/b, S 18a/b RHCE, ACEdel/ins
Transfusion, 2005, 45, 9
Gin.Pol, 2004, 75, 12
Gin.Pol, 2004, 75, 1
TRUDNE, ŻMUDNE, DROGIE…
Wykrywanie genu kodującego RhD
w osoczu RhD ujemnej ciężarnej
Gen RHD-
Gen SRY+
RhD (-)chłopiec
GEN RHD+/-
POWTÓRZYĆ
BADANIE
Gen RHD-
Gen SRY-
prawdopodobnieRHD (-)
dziewczynka
ALE trzeba potwierdzić obecność DNA płodu
wykryciem polimorfizmu ins/del odziedziczonego
po ojcu
WYNIKI POWTARZALNE > dla 3 reakcji real-
time PCR (3 fragmentów genu RHD) WYNIKI ROZBIEŻNE
Gen RHD +
RhD (+) dziecko z drugiej
probówki
Przykład wyniku
Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej
Instytut Hematologii i Transfuzjologii
00-957 Warszawa, ul. Chocimska 5 Warszawa dn. 17.02.2005
Wynik
Metodą real-time PCR w osoczu pani XY (RhD-) z 16 tygodnia
ciąży nie wykryto genu RHD pochodzącego od płodu. Osocze
zawierało DNA płodu, co potwierdzono wykrywając w nim
polimorfizmy S08a i ACEdel, nieobecne u matki, a obecne u ojca
(pana Z Y).
Komentarz: Wyniki badania wskazują, że płód jest Rh ujemny.
Konsekwencje kliniczne fałszywych
wyników Fałszywie dodatni =
wykrywamy antygen,
którego płód nie ma
Płód jest traktowany jako mogący zimmunizować matkę i zagrożony ChHPN niepotrzebnie
zastosowana immunoprofilaktyka anty-D (dotyczy tylko konfliktu Rh)
monitorowanie hemolizy u płodu
co byłoby i tak stosowane gdyby badania cff-DNA nie wykonać
Fałszywie ujemny =nie wykrywamy antygenu,
który jest „groźny”
Płód jest traktowany jako
nie zagrożony, a:
matka powinna dostać immunoglobuliną anty-D (dotyczy
tylko konfliktu Rh)
płód powinien być monitorowany i ewentualnie leczony
Potencjalne źródła wyniku fałszywie
dodatniego, sposoby przeciwdziałania
Kontaminacja próbki materiałem zawierającym DNA od osoby RhD dodatniej >> odpowiedni sposób pobierania, przesyłania
materiału, izolacji DNA, wykonania badania
Obecność „niemego genu RHD u płodu” w populacji kaukaskiej ryzyko około 0,2-1%
jeśli ojciec innej rasy niż kaukaska ryzyko większe konieczność analizy wykrywania różnych fragmentów RHD należy podać na skierowaniu pochodzenie etniczne (rasa
czarna, żółta)
Potencjalne źródła wyniku fałszywie
ujemnego, sposoby przeciwdziałania
Brak lub zbyt mała koncentracja DNA płodowego w próbce
Konieczne udowodnienie obecności cff-DNA:
dla płodów płci męskiej – wykrycie genów z chromosomu Y
dla płodów płci żeńskiej – wykrycie genu/polimorfizmu ins/del odziedziczonego po ojcu, a nie obecnego u matki (wieloetapowe i skomplikowane badania)
Powtórzenie badania w późniejszym etapie ciąży
Dalsze badania nad sposobami udowodnienia „dobrej jakości” cff-DNA w próbce
badanej analiza metylacji DNA
Skala trudności diagnostyki nieinwazyjnej
w konfliktach innych niż RhD
znacznie trudniejsza, bo podłożem różnicy
antygenów u matki i płodu są tzw. SNP
wysoki poziom niespecyficznej amplifikacji, powstający z
przeważającej ilości DNA matczynego
zadawalające wyniki jedynie dla badania:
alleli RHCE*c, RHCE*E genu RHCE ze względu na to że,
użyte startery zawierają dodatkowe polimorfizmy SNP,
prócz tych warunkujących antygeny Rhc czy RhE
allelu KEL*1 ze względu na modyfikację startera -
wstawienie tzw. LNA (z ang. locked nucleic acids) przed
specyficznym nukleotydem na końcu 3
Czułość i swoistość kliniczna wykrywania genów płodu
w cff-DNA według publikowanych danychWykry
wany
gen
Publikacja/ Liczba
przypadków
Czułość %
(przedział
ufności dla 95%)
Swoistość
(przedział
ufności 95%)
SRY Metaanaliza 57 publikacji
/ 7 000
99.9
(99.7 – 100%)
94.9%
(93.5 – 96.4)
RHD Wielka Brytania/ 1997 99.8 99.2
Francja / 300+ 283 100 97.5 - 100
Belgia / 563 100 99.5
Polska / 230 100 99.6*
* u jednej ciężarnej z płodem RhD- nie wykryliśmy genu RHD, ale nie potwierdziliśmy
obecności cff-DNA, gdyż nie znaleźliśmy markera obecnego u ojca, a nieobecnego u matki
Jakie są wyniki nasze i innych laboratoriów?
Rutynowo przeprowadzana diagnostyka
nieinwazyjna w konfliktach serologicznych w IHiTRhD
u 348/348 kobiet prawidłowo oznaczono RhD płodu:
– u 260 płód RHD(+)
– u 88 płód RHD(-): u 51 gen SRY (chłopcy), u 36 marker ins/del po
ojcu, w 1 przypadku brak markera od ojca (87/88 wydano wynik)
Rhc
u 22/22 kobiet prawidłowo oznaczono Rhc płodu:
– u 16 płód RHCE*c (+)
– u 6 płód RHCE*c (-)
RhE
u 21/21 kobiet prawidłowo oznaczono RhE płodu:
– u 14 płód RHCE*E (+)
– u 7 płód RHCE*E (-)
Badania nieinwazyjne allelu KEL*1
minimalizacja ryzyka fałszywej amplifikacji przez stosowanie zmodyfikowanych starterów o podwyższonej swoistości, tzw. LNA (locked nucleic acids)
Finning i wsp. 2008: prawidłowe wyniki u 43 kobiet, które urodziły dzieci K-
1/27 wynik fałszywie ujemny u kobiet z przeciwciałami anty-K, które urodziły dziecko K+
IHiT pilotażowe badania DNA z osocza 11ciężarnych K-
u 5 potwierdzone prawidłowe wyniki: u 3 urodziły się K+ dzieci, u 2 K-
poziom wykrywanego allelu KEL*1 o 3-4- krotnie niższy od genu RHD
Projekt masowych badań RHD płodu
do kwalifikacji do podania anty-D
Przy masowych badaniach
automatyzacja
zmniejszenie kosztów
Koszty immunoprofilaktyki w czasie ciąży i ich
organiczenie po wprowadzeniu oznaczania RHD
płodu w Holandii
Obecnie stosowany schemat:
Ig dla kobiet Rh ujemnych,
które nie maja dzieci(14 000 )
koszt 3.1mln Euro
Wprowadzenie badań RHD w
ciąży i podawanie Ig
tylko gdy płód jest Rh+
koszt razem z badaniami
3 mln Euro
Objęcie wszystkich kobiet
podawaniem Ig w ciąży
(34 000)
koszt 6.6 mln Euro
Po włączeniu
nieinwazyjnych badań
RHD płodu
3.9 mln Euro
Van der Schoot, 2009
Co wymaga ulepszenia?Potencjalne metody udoskonalenia nieinwazyjnych
badań prenatalnych
Rozdzielenie cff-DNA od DNA matki na podstawie:
wielkości
cff-DNA <300bp
DNA matczyne >500bp
różnic w budowie białek histonowych (cff-DNA z H3.1,
DNA matczyne z H3.3)
Opracowanie uniwersalnej kontroli cff-DNA
różnice w metyzacji cff-DNA
PodziękowaniaWszystkim lekarzom i diagnostom laboratoryjnym, którzy
współpracują z IHiT dla udoskonalania nieinwazyjnej diagnostyki płodu
i
kobietom ciężarnym, które wyrażają zgodę na pobranie krwi i udostępniają dane o grupie krwi urodzonego noworodka
składa
zespół Pracowni Biologii Molekularnej Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej w składzie:
dr Katarzyna Guz, dr Agnieszka Orzińska, mgr Justyna Smolarczyk-Wodzyńska, mgr Magdalena Łakomy,
prof. Ewa Brojer, prof. Barbara Żupańska
Tylko z Państwa pomocą możemy kontynuować badania!
Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej IHiT
Kierownik: Prof. dr hab. Ewa [email protected] tel. (22)34 96 611
Pracownia Biologii Molekularnej:
dr Katarzyna Guz [email protected]
dr Agnieszka Orzińska orziń[email protected]
tel. 022 34 96 600 wew. 144, 154