UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ WYDZIAŁ BIOLOGII I NAUK O ZIEMI

Joanna Wrona

Kierunek BIOLOGIA

Specjalność Biochemia

Udział bakteryjnych homologów dioksygenazy

AlkB w naprawie egzocyklicznych uszkodzeń

zasad DNA

(The role bacterial homologues of AlkB dioxygenase in repair of

exocyclic DNA bases damage)

Promotor: prof. dr hab. Jarosław Kuśmierek

Część doświadczalna pracy wykonana pod opieką

dr Agnieszki Maciejewskiej

w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN

LUBLIN 2010

2

3

Streszczenie

Gen alkB jest częścią systemu odpowiedzi adaptacyjnej na środki alkilujące bakterii

Escherichia coli. Sam gen znany jest od wielu lat, jednak biochemiczna funkcja

białka AlkB została odkryta dopiero w 2002 roku. Białko AlkB to zależna od

2-oksoglutaranu i jonów Fe(II) dioksygenaza, która usuwa grupy metylowe

z 3-metylocytozyny i 1-metyloadeniny przez utlenienie ich do formaldehydu i tym

samym odtwarza nieuszkodzoną cytozynę i adeninę w DNA. Homologi alkB

znaleziono u wielu innych bakterii i organizmów wyższych, także u człowieka.

Dodatkowo odkryto, że białka typu AlkB usuwają mostki etenowe z cytozyny

i adeniny przez utlenienie ich do glioksalu. Addukty tego typu generowane są

w DNA przez metabolity chlorku winylu, znanego kancerogenu przemysłowego,

a także endogennie pod wpływem produktów peroksydacji lipidów (LPO). LPO jest

procesem związanym ze stresem oksydacyjnym prowadzącym do powstania całej

gamy wysoce reaktywnych związków (m. in.: akroleina, aldehyd krotonowy,

dialdehyd malonowy, 4-hydroksynonenal) uszkadzających różne komponenty

komórki, w tym DNA.

Badano rekombinowane homologi białka AlkB z E. coli u następujących bakterii:

Streptomyces coelicolor – białka SC-1A i SC-2B oraz Xanthomonas campestris –

XC-1B i XC-2B. Białko SC-1A, w przeciwieństwie do SC-2B, XC-1B i XC-2B,

wyraźnie naprawia uszkodzenia zasad DNA spowodowane związkami

modyfikującymi, takimi jak aldehyd chlorooctowy (CAA) i akroleina (ACR). Przy

pomocy opracowanej metody ustalone zostały optymalne warunki aktywności

SC-1A w naprawie różnych adduktów w zależności od pH buforu, stężenia

-ketoglutaranu i jonów żelaza. Optymalne warunki dla naprawy poszczególnych

uszkodzeń przez białko SC-1A były zbliżone do wyników z udziałem EcAlkB, co

świadczy o pokrewieństwie (homologii) tychże białek. Jak wynika

z przeprowadzonych doświadczeń, białko AlkB jest w stanie naprawiać

egzocykliczne addukty zasad, jak nienasycone etenoaddukty: etenoadeninę (εA)

i etenocytozynę (εC), ale także nasycone hydroksyalkanopochodne:

hydroksyetanocytozynę (HEC) i hydroksypropanocytozynę (HPC). Zatem

specyficzność substratowa białek typu AlkB może być szeroka i białka te mogą

odgrywać istotną rolę w naprawie różnego typu modyfikacji, również w komórkach

ssaków.

4

Pragnę serdecznie podziękować

prof. dr hab. Jarosławowi Kuśmierkowi

za promotorską opiekę i cenne wskazówki udzielone w czasie pisania niniejszej pracy

dr Agnieszce Maciejewskiej

za opiekę naukową, teoretyczne i praktyczne zapoznanie mnie z tematem, życzliwość,

cierpliwość, wyrozumiałość oraz wsparcie na jakie zawsze mogłam liczyć

5

Praca została zrealizowana w ramach polsko-norweskiego grantu nr PNRF-143-AI-1/07.

The AlkB protein and its eukaryotic homologues – the role in DNA repair and the possible

role in cancer etiology and target in cancer therapy (Białko AlkB i jego eukariotyczne

homologi – rola w naprawie DNA i potencjalny udział w etiologii nowotworów oraz jako cel

w terapii przeciwnowotworowej)

6

Spis treści

I. Wstęp ........................................................................................................................ 9

I.1. Czynniki uszkadzające DNA ........................................................................... 10

I.1.1. Czynniki fizyczne ..................................................................................... 11

I.1.2. Czynniki biologiczne ................................................................................ 13

I.1.3. Czynniki chemiczne .................................................................................. 14

I.1.4. Chlorek winylu .......................................................................................... 18

I.1.5. Peroksydacja lipidów ................................................................................ 19

I.1.5.1. Egzocykliczne uszkodzenia DNA ...................................................... 21

I.2. Sposoby naprawy DNA ................................................................................... 26

I.2.1. AlkB .......................................................................................................... 28

I.2.1.1. Mechanizm działania ......................................................................... 28

I.2.1.2. Struktura przestrzenna AlkB .............................................................. 30

I.2.1.3. Rodzina bakteryjnych białek AlkB .................................................... 31

I.2.1.4. Homologi AlkB .................................................................................. 33

I.2.1.5. Znaczenie badań nad białkami AlkB ................................................. 37

II. Cel pracy ................................................................................................................ 39

III. Materiały i metody ............................................................................................... 40

III.1. Materiały ....................................................................................................... 40

III.1.1. Odczynniki ............................................................................................. 40

III.1.2. Bufory ..................................................................................................... 41

III.1.2.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka ...................................... 41

III.1.2.2. Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich

naprawy przez badane białka ......................................................................... 42

III.1.3. Pentamery ............................................................................................... 42

III.1.4. Enzymy ................................................................................................... 42

III.1.5. Antybiotyki ............................................................................................. 42

III.1.6. Pożywki .................................................................................................. 43

III.1.7. Aparatura ................................................................................................ 43

III.1.7.1. Aparatura do oczyszczania białek ................................................... 43

III.1.7.2. Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez

badane białka .................................................................................................. 43

III.1.8. Inne materiały ......................................................................................... 44

III.2. Metody .......................................................................................................... 44

III.2.1. Sporządzanie buforów ............................................................................ 44

III.2.2. Elektroforeza białkowa .......................................................................... 45

III.2.3. Przygotowanie komórek kompetentnych i transformacja bakterii ......... 45

III.2.3.1. Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem

pET28a/alkB ................................................................................................... 45

III.2.3.2. Ekspresja białka SC-1A w szczepie E. coli BL21 (DE3) ............... 46

III.2.3.3. Dysrupcja komórek ......................................................................... 46

III.2.2. Oczyszczanie białka SC-1A ................................................................... 47

III.2.3. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford ........................................ 47

III.2.4. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka ..... 47

III.2.4.1. Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksyetanocytozynę

TT(HEC)TT i TT(εC)TT w reakcji pentameru TTCTT z aldehydem

chlorooctowym (CAA) ................................................................................... 47

7

III.2.4.2. Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksypropanocytozynę

TT(HPC)TT w reakcji pentameru TTCTT z akroleiną (ACR) ...................... 48

III.2.4.3. Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT w

reakcji pentameru TTATT z aldehydem chlorooctowym (CAA) .................. 48

III.2.5. Badanie aktywności białek i wykonanie zależności .............................. 49

III.2.5.1. Zależność od pH .............................................................................. 50

III.2.5.2. Zależność od stężenia jonów Fe(II) ................................................ 51

III.2.5.3. Zależność od stężenia αKG ............................................................. 53

IV. Wyniki ................................................................................................................. 54

IV.1. Oczyszczanie białka SC-1A .......................................................................... 54

IV.2. Modyfikacja pentametrów zwierających cytozynę ....................................... 55

IV.2.1. Uzyskanie pentameru zawierającego hydroksypropanocytozynę ........ 55

IV.2.2. Uzyskanie pentamerów zawierających hydroksyetanocytozynę i

etenocytozynę ..................................................................................................... 57

IV.3. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-1A ................ 59

IV.3.1. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od pH reakcji........................ 61

IV.3.2. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia jonów Fe(II) w

reakcji ................................................................................................................. 63

IV.3.3. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia αKG w reakcji ... 67

IV.4. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-2B ................ 68

IV.4.1. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od pH reakcji........................ 69

IV.4.2. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia jonów Fe(II) w

reakcji ................................................................................................................. 71

IV.5. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białka XC-1B i XC-2B . 71

V. Wnioski ................................................................................................................. 73

VI. Dyskusja ............................................................................................................... 74

Literatura .................................................................................................................... 84

8

Spis używanych skrótów

dR – deoksyryboza

VC (ang. vinyl chloride) – chlorek winylu

CEO (ang. chloroethylene oxide) – tlenek chloroetylenu

CAA (ang. chloroacetaldehyde) – aldehyd chlorooctowy

CRA (ang. crotonaldehyde) – aldehyd krotonowy

ACR (ang. acrolein) – akroleina

HNE (ang. trans-4-hydroxy-2-nonenal) – 4-hydroksynonenal

MDA, MA (ang. malondialdehyde) – dialdehyd malonowy

ROS (ang. reactive oxygen species) – reaktywne formy tlenu (RFT), wolne rodniki

tlenowe (WRT)

TT(HEC)TT, THEC – 3,N4-α-hydroksyetanocytozyna (HEC)

TT(HPC)TT, THPC – 3,N4-α-hydroksypropanocytozyna (HPC)

TT(εC)TT, TεC, εC – 3,N4-etenocytozyna (3,N

4-εC)

TT(εA)TT, TεA, εA – 1,N6-etenoadenina (1,N

6-εA)

EcAlkB – białko pochodzące od E. coli, podstawowe dla rodziny białek AlkB

SC-1A – homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces coelicolor

SC-2B – homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces coelicolor

XC-1B – homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Xanthomonas campestris

XC-2B – homolog biłka EcAlkB pochodzący od bakterii Xanthomonas campestris

SA-1A – homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces avermitilis

SA-2B – homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces avermitilis

HPLC (ang. high performance / high pressure liquid chromatography) –

wysokosprawna / wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa

MeOH – metanol

TEAA – trójetyloamina

IPTG – izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd

SDS – dodecylosiarczan sodu

TEMED – N,N,N’,N’- tetrametylenodiamina

DTT – ditiotreitol

9

I. Wstęp

Kwas deoksyrybonukleinowy (deoxyribonucleic acid, DNA) jest podstawowym

nośnikiem informacji genetycznej, która determinuje budowę, metabolizm, a także

behawioral organizmów żywych. DNA narażone jest nieustannie na działanie

czynników zaburzających, mających tym samym wpływ na jego strukturę. Jeżeli

nastąpi zmiana w budowie chemicznej DNA wzrasta prawdopodobieństwo błędnego

parowania się zasad lub braku zdolności do tworzenia par komplementarnych. Takie

nieprawidłowości mogą uniemożliwić replikację i/lub transkrypcję powodując skutek

mutagenny, a nawet letalny. Dlatego też tak ważnym jest aby wszystkie uszkodzenia

DNA komórkowego zostały jak najszybciej usunięte w celu zapobieżenia utrwaleniu

się danej mutacji w przyszłych pokoleniach.

„DNA ani o niczym nie wie, ani o nic nie dba,

DNA po prostu jest, a my tańczymy tak jak nam zagra."

Richard Dawkins

Budowa DNA

DNA ma postać heliksu („podwójnej helisy”) i zbudowany jest

z deoksyrybonukleotydów. Na deoksyrybonukleotyd składa się zasada azotowa:

adenina lub guanina (dwupierścieniowa puryna), cytozyna lub tymina

(jednopierścieniowa pirymidyna), 2-deoksyryboza (pentoza), a także reszta kwasu

ortofosforowego. Zasada azotowa łączy się z pierścieniem pentozowym cukru

wiązaniem N-glikozydowym, deoksyrybonukletydy zaś połączone są ze sobą

wiązaniami fosfodiestrowymi, między pozycjami 3’ i 5’. Deoksyryboza jest

pochodną rybozy, w której grupa hydroksylowa, połączona z węglem 2' zastąpiona

jest grupą wodorową. Z atomem 5' reszty cukrowej związana jest grupa fosforanowa.

Deoksyryboza dobrze rozpuszcza się w wodzie o pH obojętnym, w przeciwieństwie

do zasad azotowych, które nie są rozpuszczalne. Z tego też powodu cząsteczki DNA

tworzą taką strukturę, gdzie na zewnątrz obecne są elementy rozpuszczalne (cukier

i reszta fosforanowa), natomiast wewnątrz nierozpuszczalne w wodzie.

W warunkach fizjologicznych kwas deoksyrybonukleinowy ma postać regularnego

10

heliksu, który składa się z dwóch „antyparalelnie” ułożonych łańcuchów

polinukleotydowych, zwiniętych wokół wspólnej osi. W obrębie heliksu dochodzi do

oddziaływań hydrofobowych między zasadami, ponadto w każdej parze cytozyna -

guanina tworzą się trzy wiązania wodorowe, zasady w parze adenina - tymina są

związane dwoma wiązaniami wodorowymi. W helisie B wyróżnia się rowek

mniejszy i większy. Na dnie rowka białka wiążące DNA rozpoznają sekwencję

nukleotydową, gdyż tam "wystają" grupy chemiczne zasad azotowych. Zatem

zmiany konformacji w obrębie DNA mogą być mechanizmem regulującym ekspresję

genów.

I.1. Czynniki uszkadzające DNA

Możliwe są przynajmniej dwa podziały czynników modyfikujących kwasy

nukleinowe. Ze względu na pochodzenie wyodrębnić można czynniki egzogenne

i endogenne.

Czynniki egzogenne

Do czynników egzogennych zaliczamy promieniowanie UV, promieniowanie

jonizujące, substancje wywołane działalnością człowieka (chlorek winylu), związki

alkilujące (np. etanosulfonian metylu – EMS, etylonitrozomocznik – ENU,

metanosulfonian metylu – MMS) czy substancje naturalnie występujące

w środowisku (np. aflatoksyna B1). Wiele związków ulega w organizmie

przemianom prowadzącym do ich detoksykacji lub wręcz przeciwnie, do aktywacji.

Np. przemiany, jakim przy udziale cytochromów P450 podlega aflatoksyna AFB1,

prowadzą do jej detoksykacji, albo do powstania wysoce reaktywnej formy

epoksydowej, która tworząc addukty w DNA zapoczątkowuje proces mutagenezy

i kancerogenezy.

Najczęściej występującymi zmianami w DNA są chemiczne modyfikacje zasad

purynowych i pirymidynowych, w których wyróżnić można dwie podgrupy:

cytotoksyczne i mutagenne. Uszkodzenia cytotoksyczne prowadzą do opóźnienia

bądź zatrzymania widełek replikacyjnych blokując polimerazy DNA. Mutagenne

uszkodzenia zaś są nieprawidłowo odczytywane w czasie replikacji, generując tym

samym powstawanie mutacji w nowopowstałej nici DNA.

11

Czynniki endogenne

Poza czynnikami środowiskowymi na zmianę struktury DNA wpływają procesy

metaboliczne przebiegające we wszystkich żywych komórkach.

Do czynników endogennych możemy zaliczyć naturalną reaktywność DNA

(spontaniczna deaminacja hydrolityczna cytozyny prowadząca do powstania

uracylu), jak również związki naturalnie powstające w komórkach (reaktywne formy

tlenu). Przykładem innej spontanicznej reakcji hydrolitycznej, polegającej na

zerwaniu wiązania N-glikozydowego między C-1’ deoksyrybozy a N-9 zasady

purynowej, jest depurynacja, która prowadzi do utraty zasady purynowej z cząsteczki

DNA. Do depirymidynacji może także dochodzić, lecz z mniejszą częstotliwością.

Najczęściej obserwowanymi endogennymi modyfikacjami DNA są miejsca

apurynowe, produkty dezaminacji, uszkodzenia oksydacyjne i alkilacja zasad, jak też

różne aldehydopochodne addukty egzocykliczne (np. produkty peroksydacji

lipidów). Addukty takie prowadzą do zniekształceń DNA, dających w rezultacie

spowolnienie albo blokowanie replikacji. Wzrasta wówczas prawdopodobieństwo

zatrzymania podziałów komórkowych lub pojawienia się aberracji

chromosomowych.

Bardziej precyzyjnym kryterium podziału jest rodzaj modyfikacji, który pozwala

wyróżnić czynniki fizyczne, chemiczne i biologiczne.

I.1.1. Czynniki fizyczne

Spośród czynników fizycznych uszkadzających DNA znaczną rolę odgrywają

promieniowania - jonizujące i ultrafioletowe.

Promieniowanie jonizujące charakteryzuje się znaczną przenikliwością i jest

powodem wybijania elektronów z zajmowanych przez nie orbitali. Działanie

promieniowaniem o wysokiej energii prowadzi do jonizacji nie tylko kwasów

nukleinowych, ale również innych składników komórki i może przyczyniać się do

powstawania form wolnorodnikowych, które utleniają zasady azotowe kwasu

deoksyrybonukleinowego oraz inicjują powstawanie wiązań krzyżowych pomiędzy

dwoma nićmi DNA, jak też pomiędzy DNA a białkami. Wybicie elektronów

zmniejsza także siłę wiązania między atomami i jest przyczyną pęknięć w cząsteczce

DNA i jego fragmentacji (Schemat 1.).

12

Schemat 1. Wpływ promieniowania jonizującego na funkcjonowanie komórek

Źródło: Kaczmarska Z, 2008, praca licencjacka

Promieniowanie ultrafioletowe wykazuje mniejszą przenikliwość w porównaniu

z promieniowaniem jonizującym ze względu na większą długość fali (200-300 nm)

i mniejszą energię. Wprowadza w strukturę DNA dimery pirymidynowe z udziałem

cytozyny i tyminy, głównie dimery tyminowe, pomiędzy C5 i C6. Tworzy się wtedy

pierścień cyklobutanowy między pirymidynami, który powoduje odkształcenie

cząsteczki i zbliżenie nukleotydów.

Rysunek 1. Struktura dimeru tyminowego

Źródło: Opracowanie własne na podstawie Kaczmarska Z, 2008, praca licencjacka

PROMIENIOWANIE JONIZUJĄCE

jonizacja składników komórki

(DNA, RNA, białek)

pękanie nici DNA (niszczenie cukrów i wiązań fosfodiestrowych)

wiązania krzyżowe

DNA-DNA i DNA-białko

uszkodzenia

oksydacyjne

radioliza wody i powstawanie

reaktywnych form tlenu

(RFT) i azotu (RFA)

13

Pod wpływem promieniowania UV powstają także fotoprodukty pirymidyno (6-4)

pirymidynowe.

Rysunek 2. Struktura fotoproduktu pirymidyno (6-4) pirymidynowego

Źródło: Opracowanie własne na podstawie Kaczmarska Z, 2008, praca licencjacka

I.1.2. Czynniki biologiczne

Do tej grupy czynników należą patogeny - wirusy i grzyby.

Wirus HIV

Jeden z retrowirusów, wirus HIV (ang. human immunodeficiency virus), będący

przyczyną zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS) potrafi specyficznie

wintegrowywać w genom komórki gospodarza przez pośrednią formę, jaką jest

DNA.

Aflatoksyna B1

Aflatoksyna B1 (AFB1) jest naturalnym produktem (mikotoksyną) wytwarzanym

przez grzyby Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus.

Mutagenność i kancerogenność AFB1 jest wynikiem powstawania AFB1-8,9-

epoksydu, reagującego bezpośrednio z DNA. Wiązanie z DNA zachodzi gwałtownie

i powstaje trwały addukt 8,9-dihydro-8-(N7-guanyl)-9-hydroksy AFB1 (AFB1-

guanina) (Pierzynowska J, Grzesiuk E, 1999).

14

Rysunek 3. Struktura trwałego adduktu aflatoksyny B1

Źródło: Opracowanie własne na podstawie Smart RC, Hodgson E, 2008

Enzymami odpowiedzialnymi za metabolizm fazy II AFB-8,9-epoksydu są:

mikrosomalna hydrolaza epoksydowa (mEH) i S-transferaza glutationu (GST),

prowadzące do detoksyfikacji (Plant N, 2003).

I.1.3. Czynniki chemiczne

Związki chemiczne stanowią niewątpliwie najobszerniejszą grupę czynników

uszkadzających DNA. Zaliczamy tutaj nie tylko czynniki chemiczne prowadzące do

oksydacji, alkilacji i hydrolizy zasad (deaminacja, depurynacja, depirymidynacja),

ale także produkty peroksydacji lipidów oraz działanie chlorku winylu i jego

pochodnych.

Czynniki oksydacyjne

Uszkodzenia oksydacyjne DNA odgrywają istotną rolę w mutagenezie,

kancerogenezie i w procesie starzenia (Ames BN i in., 1995). Nadtlenek wodoru, tlen

atomowy czy rodnik hydroksylowy są produktami ubocznymi wielu procesów

metabolicznych, takich jak utlenianie w peroksyzomach, oddychanie tkankowe

w mitochondriach czy metabolizm substancji egzo- i endogennych w retikulum

endoplazmatycznym przy udziale cytochromu P450. Reaktywne formy tlenu są także

bronią stosowaną przez makrofagi w obronie przed inwazją patogenów. W procesach

zapalnych powstają również aktywne formy azotu. Tlenek azotu pełni w komórce

15

funkcję przekaźnika sygnałów, ale też może poprzez interakcję z lipidami uszkadzać

DNA (Burcham PC, 1998).

Najgroźniejsze implikacje dla organizmów niosą ze sobą reakcje wolnych rodników

tlenowych z DNA. Interakcje takie mogą prowadzić do utworzenia pojedynczych

i podwójnych pęknięć DNA, wiązań poprzecznych i modyfikacji zasad azotowych.

Oksydacyjne modyfikacje zasad azotowych można podzielić na dwie grupy ze

względu na ich biologiczne właściwości: a) potencjalnie mutagenne oraz

b) blokujące proces replikacji DNA. Typowym przykładem oksydacyjnego

uszkodzenia DNA prowadzącego do bloku replikacyjnego jest glikol tyminy.

Prawdopodobnie również obecność w cząsteczce DNA produktów częściowego

rozpadu pierścienia purynowego, to znaczy – FapyA i FapyG, może prowadzić do

zahamowania procesu replikacji (Wallace SS, 1994).

Pośród reaktywnych form tlenu zdolnych do uszkadzania DNA występują:

anionorodnik ponadtlenkowy O2•

¯, nadtlenek wodoru H2O2, rodnik hydroksylowy

OH• i tlen singletowy

1O2. Formy te łatwo utleniają zarówno cząsteczki zasad jak

i cukrów budujących DNA (glikol tyminy, 8-oksyG, FapyG), a często prowadzą też

do jednoniciowych i dwuniciowych pęknięć DNA. Modyfikacje w obrębie zasad

obejmują wprowadzenie do cząsteczki grupy OH, co zmienia właściwości kodujące

danego nukleotydu (np. 8-oksyG może tworzyć parę z A co wywołuje substytucję G

do T, jak i z C co nie skutkuje mutacją), ułatwia pękanie pierścieni pirymidyn

(mocznik) i puryn (Fapy), które są nie tylko mutagenne, lecz również blokują

polimerazy DNA i RNA, prowadząc w efekcie do śmierci komórki.

16

NH

N

O

O

deoksyryboza

H

HO

H3C

HO

deoksyryboza

H

NH2

O

NH

N

O

NH2

HN

H

HN

deoksyryboza

O

NH

NN

HN

O

NH2

O

deoksyryboza

Rysunek 4. Wybrane uszkodzenia oksydacyjne

Źródło: Kaczmarska Z, 2009, praca magisterska

Jeżeli w procesie replikacji DNA naprzeciwko 8-oksyG włączona zostanie adenina,

to po dwóch rundach replikacyjnych pojawi się transwersja G → T. Z wolnymi

rodnikami reagują nie tylko zasady wchodzące w skład DNA, ale również obecne

w trójfosfodeoksynukleotydach. 8-oksodGTP jest dobrym substratem dla polimeraz

DNA, a możliwość błędnego parowania zmodyfikowanej oksydacyjnie guaniny

może doprowadzić do jej inkorporacji naprzeciwko adeniny i do substytucji A → C

po trzech rundach replikacyjnych (Oliński R, Jurgowiak M, 1999).

Czynniki alkilacyjne

Do czynników alkilujących zaliczamy mutageny i kancerogeny, które modyfikują

DNA i RNA poprzez alkilację (van den Born E i in., 2009), potrafią wprowadzać

różne szkodliwe uszkodzenia do kwasów nukleinowych, a także produkowane są

endogennie, jako produkt uboczny metabolizmu komórkowego (Falnes PØ, Rognes

T, 2003). Uszkodzenia alkilacyjne zasad mogą zatrzymywać replikację, przerywać

transkrypcję czy sygnalizować aktywację apoptozy. W komórkach ssaków mogą być

zaangażowane w kancerogenezę, schorzenia neurodegeneracyjne czy procesy

starzenia (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Obecne w tych związkach reaktywne

grupy metylowe i etylowe wywołują alkilację zasad azotowych i grup fosforanowych

8-oksyG

inicjuje błędy

w kodowaniu

G T

glikol tyminy

blokuje

replikację i

transkrypcję

mocznik

blokuje

replikację

i transkrypcję

FapyG

blokuje

replikację

17

nukleotydów. Rodzaj wywoływanych przez nie zmian zależy od ich właściwości

chemicznych i struktury przestrzennej DNA (Sedgwick B, Lindahl T, 2002). Główne

modyfikacje zasad wprowadzane do dwuniciowego DNA (dsDNA) przez czynniki

alkilujące to: 7-metyloguanina (7-meG), 3-metyloadenina (3-meA)

i O6-metyloguanina (O

6-meG), natomiast w znacznie mniejszym stopniu:

1-metyloadenina (1-meA), 7-metyloadenina (7-meA), 3-metylocytozyna (3-meC),

3-metyloguanina (3-meG) i O4-metylotymina (O

4-meT). Przy czym,

w jednoniciowym DNA (ssDNA) 1-meA oraz 3-meC,występują częściej niż

w dsDNA (Falnes PØ, Rognes T, 2003).

7-metyloguanina O6-metyloguanina 3-metyloadenina

Rysunek 5. Przykłady uszkodzeń alkilacyjnych

Źródło: Opracowanie własne

Pozycja N7 guaniny jest najbardziej podatna na alkilację i stanowi od 65 do 80%

wszystkich alkilowanych zasad. Modyfikacja ta nie blokuje replikacji, ani

transkrypcji, nie wpływa również na parowanie zasad, wydaje się więc być

nieszkodliwa. Jednak 7-meG może stanowić źródło wtórnych uszkodzeń DNA

o silnych właściwościach toksycznych, takich jak: miejsca apurynowe czy puryny

z otwartym pierścieniem imidazolowym, tzn. Fapy. Z kolei 3-meA blokuje

większość polimeraz DNA, a ponadto jest źródłem miejsc apurynowych

(Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007).

Donorem grup metylowych dla rozmaitych metylotransferaz jest

S-adenozylometionina (SAM), która może nieenzymatycznie metylować DNA, ale

w innych pozycjach niż w reakcjach enzymatycznych. Ponieważ metylacja odgrywa

ważną rolę w procesach komórkowych, takich jak ekspresja informacji genetycznej,

18

zmiana poziomu SAM w komórce może wpływać na jej funkcjonowanie,

a nieprawidłowości związane z metabolizmem SAM mogą być przyczyną chorób

wątroby, schorzeń neurologicznych czy kancerogenezy (Lutz WK, 1990). SAM

może również uczestniczyć w spontanicznej metylacji DNA generując powstawanie

głównie 7-meG i 3-meA, a w mniejszym stopniu także O6-meG. Metylosulfonian

metylu (MMS) jest czynnikiem metylującym DNA, używanym w eksperymentach

związanych z mutagenezą i rekombinacją (Beranek DT, 1990). MMS wywołuje

zmiany w budowie zasad w postaci 1meA, 3meC i O6meG, które pojawiają się

preferencyjnie w RNA i jednoniciowych cząsteczkach DNA, gdyż w przypadku

dwuniciowego DNA metylowane atomy są zaangażowane w tworzenie wiązań

pomiędzy zasadami, ich dostępność dla czynnika alkilującego jest zmniejszona.

Zmiany takie mogą prowadzić do błędnego parowania zasad i zatrzymania replikacji

(Duncan T i in., 2002). MMS czy jodek metylu (MeI) wprowadzają grupy alkilowe

wyłącznie do atomów azotu oraz mają silne właściwości toksyczne (Nieminuszczy J,

Grzesiuk E, 2007). Reaktywność SAM jest znacznie słabsza niż MMS (Rydberg B,

Lindahl T, 1982).

Do czynników metylujących należą również związki przyłączające grupy alkilowe

zarówno do tlenu i azotu w cząsteczkach zasad oraz tlenu grupy fosforanowej

(N-metylo-N-nitrozomocznik (MNU) i N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyna

(MNNG). Wykazują one silne właściwości mutagenne.

I.1.4. Chlorek winylu

Chlorek winylu używany jest do produkcji polimerów (polichlorek winylu, PCW)

i kopolimerów (z octanem winylu, chlorkiem winylidenu, estrami kwasu akrylowego

i maleinowego) wykorzystywanych w przemyśle tworzyw sztucznych. Należy do

rodziny halogenowych pochodnych etylenowych. Ten prosty gaz o zapachu

chloroformu po dostaniu się do organizmu jest przetwarzany w wątrobie przez

cytochrom P450 II E 1 (Mroczkowska-Słupska MM, Kuśmierek JT, 1994).

Pierwotnym produktem utleniania chlorku winylu (VC) jest tlenek chloroetylenu

(Barbin A i in., 1975; Gothe R i in., 1974). Tlenek chloroetylenu (CEO) jest

związkiem nietrwałym i w roztworach wodnych ulega przegrupowaniu do aldehydu

chlorooctowego (CAA) oraz hydrolizie do aldehydu glikolowego. Zarówno aldehyd

19

chlorooctowy jak i aldehyd glikolowy są związkami względnie trwałymi (Barbin A

i in., 1990).

C C

H

Cl

H

H

HOCH2

C

O

H

ClCH2

C

O

H

C C

H

Cl

H

H

O

chlorek winylu (VC)

[O]

cytochrom P-450 2E1

aldehyd glikolowy tlenek chloroetylenu

( CEO)

aldehyd chlorooctowy

( CAA)

hydroliza przegrupowanie

Schemat 2. Aktywacja metaboliczna chlorku winylu

Źródło: Mroczkowska-Słupska MM, Kuśmierek JT, 1994

CEO i CAA oddziałują z białkami oraz z DNA (reakcje z adeniną i cytozyną)

w jądrach komórek (Osterman - Golkar S i in., 1977). Obecność w tych metabolitach

dwóch aktywnych grup funkcyjnych (w CEO chlor i grupa epoksydowa, w CAA

chlor i grupa formylowa) umożliwia tworzenie cyklicznych adduktów zasad

(etenopochodne) i wiązań krzyżowych. Wykazano także tworzenie wiązań

międzyniciowych w reakcji CAA z DNA (Spengler SJ, Singer B, 1988).

I.1.5. Peroksydacja lipidów

Peroksydacja lipidów jest ciągiem reakcji, które mogą wzmagać stres oksydacyjny

rozpoczęty przez wolne rodniki i reaktywne formy tlenu (Blair IA, 2001). Jest to

proces fizjologiczny obejmujący utlenianie wielonienasyconych kwasów

tłuszczowych (PUFA), stanowiących podstawowy składnik błon biologicznych.

Aktywne chemicznie elektrofilowe związki, zawierające przeważnie α,β-nienasycone

aldehydy, powstałe w rezultacie tych procesów, mogą przemieszczać się do jądra

20

komórkowego i reagować z DNA, jak również powstawać in situ w wyniku

peroksydacji lipidów chromatynowych, tj. fosfolipidów (Matulewicz Ł,

Przybyszewski WM, 2004).

Schemat 3. Powstawanie propano- i etenoadduktów pod wpływem produktów peroksydacji

lipidów

Źródło: Przybyszewski WM i in., 2005 (zmodyfikowano)

Peroksydacja lipidów przebiega z utworzeniem wielu reaktywnych produktów,

zarówno na drodze nieenzymatycznej jak i w wyniku reakcji enzymatycznych

(Porter NA, 1986). Substancjami powstałymi w różnych ilościach w zależności od

budowy kwasów oraz warunków utleniania są związki epoksydowe (np. 2,3-

epoksybutanal czy 2,3-epoksy-4-hydroksynonanal) oraz aldehydy nasycone

(np. heksanal, pentanal) i α,β-nienasycone (np. akroleina, aldehyd krotonowy, 4-

hydroksynonenal, 2-heksenal, 2-heptenal, 2-oktenal, 2-nonenal, 2,4-nonadienal, 2,4-

dekadienal) (Dotan Y i in., 2004). Końcowymi produktami peroksydacji lipidów

powstającymi w największych ilościach są α,β-nienasycone aldehydy o niskich

masach cząsteczkowych, charakteryzujące się dłuższym czasem półtrwania niż

reaktywne formy tlenu i zdolnością do dyfuzji do odległych nawet obszarów

komórki względem miejsc ich powstawania. Przemieszczając się na swej drodze

powodują uszkodzenie komórki, dzięki czemu można je traktować jako wtórne

21

przekaźniki peroksydacji lipidów (Dotan Y i in., 2004). Aldehydy te mogą reagować

z grupami aminowymi i tiolowymi wielu innych związków ważnych biologicznie,

takich jak białka i DNA. W reakcje z resztami aminokwasowymi białek łatwo

wchodzi dialdehyd malonowy (MDA) oraz 4-hydroksy-2-nonenal (HNE), w wyniku

czego wytwarzane są pochodne karbonylowe białek (Dotan Y i in., 2004).

α,β-nienasycone aldehydy, jako związki karbonylowe dwufunkcyjne, są istotnymi

czynnikami chemicznymi zanieczyszczającymi środowisko, jak również produktami

metabolizmu człowieka. Należne ich dwufunkcyjnemu charakterowi (podwójne

wiązanie skoniugowane z grupą formylową) zdolności chemiczne wykazują obfite

modyfikacje DNA. Jedną z istotnych konsekwencji wysokiej reaktywność

α,β-nienasyconych aldehydów w stosunku do zasad azotowych jest ich zdolność do

tworzenia egzocyklicznych adduktów DNA (Pluskota-Karwatka D, 2008).

W wyniku tych reakcji powstaje szereg połączeń prowadzących m.in. do hamowania

replikacji i transkrypcji DNA (Dotan Y i in., 2004; Hemminki K i in., 1994). Należy

też podkreślić, że aldehydy powstające w wyniku peroksydacji lipidów, wchodząc

w reakcje z DNA i białkami, wykazują przy tym właściwości zarówno toksyczne jak

i mutagenne (Dotan Y i in., 2004; Benamira M i in., 1995; Bartsch H i in., 2002).

Stwierdzono, że najbardziej toksycznym produktem peroksydacji lipidów jest

4-hydroksy-2-nonenal (Esterbauer H i in., 1990). Właściwości mutagenne zarówno

w stosunku do komórek bakteryjnych jak i zwierzęcych wykazuje akroleina (ACR),

aldehyd krotonowy (CRA) jak też dialdehyd malonowy (MDA) (Eckl P, Esterbauer

H, 1989), przy czym związkiem najbardziej mutagennym jest MDA (Esterbauer H

i in., 1990).

I.1.5.1. Egzocykliczne uszkodzenia DNA

Akroleina (ACR), aldehyd krotonowy (CRA) i 4-hydroksynonenal (HNE)

przekształcają się oksydacyjnie do epoksyaldehydów. Epoksyaldehydy mają

zdolność modyfikacji zasad DNA dając w rezultacie etenoaddukty. Jak wykazały

badania, w wyniku oddziaływania epoksyaldehydów na DNA powstaje

etenoguanina, etenoadenina i etenocytozyna, a epoksyd akroleiny powoduje

powstanie 1,N2-etenoguaniny (Golding BT i in., 1996). Aldehyd krotonowy

przekształca się w 2,3-epoksybutanal, który powoduje powstawanie podstawionych

grupami alkilowymi zasad: 1,N6-etenoadenozyny, 3,N

4-etenocytydyny,

22

1,N2-etenoadenozyny (Nair V, Offerman RJ, 1985). Pochodna HNE - 2,3-epoksy-4-

hydroksynonenal (EH) powoduje podstawienie grup hydroksyheptanowych do

guaniny i adeniny; powstają w ten sposób 1,N2- i N

2,3-etenoguanina oraz

1,N6-etenoadenina (Sodum RS, Chung FL, 1989 i 1991). Addukty tego rodzaju

przyczyniają się do niestabilności genetycznej, odgrywając tym samym znaczącą

rolę w procesach mutagenezy i kancerogenezy (Kowalczyk P i in., 2004).

Produkty peroksydacji lipidów tworzą w reakcji z kwasem

dezoksyrybonukleinowym dwa rodzaje egzocyklicznych adduktów: epoksydy dają

pięcioczłonowe etenoaddukty, natomiast nie-epoksydowane α,β-nienasycone

aldehydy dają sześcioczłonowe propanoaddukty.

Propanoaddukty zasad DNA

Scharakteryzowano i opisano propanoaddukty powstałe m.in. w reakcji akroleiny z

deoksycytozyną. Jednym z nich jest hydroksyalkanoaddukt 3,N4-α-

hydroksypropanocytozyna.

Rysunek 6. Wzór hydroksypropanocytozyny

Źródło: Opracowanie własne

Addukt ten jest alkalilabilny co powoduje, że oligonukleotyd pęka w miejscu

modyfikacji w środowisku zasadowym. HPC jest efektywnie usuwana przez Mug

w zakresie pH 7.2-8.0. Uważa się, że słabe wycinanie HPC w warunkach niskiego

pH związane jest z faktem, że HPC jest czwartorzędową zasadą i przy niskim pH

przechodzi w formę uprotonowaną, co skutkuje zmniejszonym powinowactwem do

enzymu (Borys-Brzywczy E i in., 2005).

23

Propanoaddukty powstają również pod wpływem aldehydu krotonowego i

4-hydroksynonenalu (HNE). Przeważającym ilościowo produktem bezpośredniej

reakcji HNE z DNA jest propanowy addukt guaniny podstawiony łańcuchem

alifatycznym (Douki T i in., 2004).

Rysunek 7. Struktura adduktu HNE do guanozyny

Źródło: Opracowanie własne

Wyniki badań in vitro wykazały, że HNE oddziałuje z deoksynukleozydami, co

prowadzi do powstania propano- i etenocyklicznych adduktów z bocznym

łańcuchem hydroksyalkilowym, które powodują wzrost częstości mutacji oraz

hamują syntezę DNA in vitro u E. coli (Kowalczyk P i in., 2004).

Etenoaddukty zasad DNA

Etenoaddukty są egzocyklicznymi związkami powstałymi poprzez uformowanie się

dodatkowego pierścienia imidazolowego w cząsteczce zasady DNA. Możemy

wyróżnić cztery etenoaddukty: 1,N6-etenoadenina (εA), 3,N

4-etenocytozyna (εC),

N2,3-etenoguanina (N

2,3εG), 1,N

2-etenoguanina (1,N

2,εG) (Kochetkov NK i in.,

1971).

24

N

N

NO

OH

N

N

NO

3,N4-etenocytozyna 3,N

4- hydroksy-etano

(3,N4- C) cytozyna (HEC)

1,N2-etenoguanina N

2,3-etenoguanina 1,N

6-etenoadenina

(1,N2- G) (N

2,3- G) (1,N

6- A)

Rysunek 8. Wzory chemiczne etenoadduktów zasad DNA powstających pod wpływem aldehydu

chlorooctowego (CAA)

Źródło: Kochetkov NK i in., 1971

Tymina nie tworzy cyklicznych adduktów, ponieważ jako jedyna z zasad azotowych

nie posiada egzocyklicznej grupy aminowej w cząsteczce.

Historia badań nad etenoadduktami sięga początków lat 70-tych ubiegłego stulecia,

kiedy Kochetkov wraz ze współpracownikami po raz pierwszy otrzymali

etenoadeninę i etenocytozynę w reakcji aldehydu chlorooctowego z adeniną

i cytozyną. Badania mechanizmu reakcji CAA z resztami adeniny i cytozyny

wykazały, iż we wstępnym etapie następuje wytworzenie zasady Schiffa w reakcji

grupy aldehydowej CAA z egzocyklicznymi grupami aminowymi 6-NH2 adeniny lub

4-NH2 cytozyny. Następnie zachodzi cyklizacja w wyniku alkilowania przez

ugrupowanie –CH2Cl endocyklicznego atomu azotu w najbliższym sąsiedztwie

grupy –NH2. Aby powstała taka struktura związek chemiczny atakujący zasadę musi

N

NH

N

N

N

O

NH

N N

N

N

O

NH

NH2 N

N+

N

OCHO

N

N

NO

OH

N

N

NO

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

OH

25

posiadać dwie grupy funkcyjne zdolne do utworzenia nowego wiązania, jak również

zasada powinna zawierać dwa reaktywne ugrupowania. Powstałe w ten sposób

stosunkowo stabilne produkty przejściowe (hydraty) 1,N6εA · H2O i 3,N

4εC · H2O

w wyniku dehydratacji ulegają przekształceniu odpowiednio w 1,N6εA i 3,N

4εC

(Mroczkowska-Słupska MM, Kuśmierek JT, 1994).

Rysunek 9. Dehydratacja 3,N4-(N

4–α-hydroksyetano)cytozyny (3,N

4εC · H2O)

Źródło: Opracowanie własne na podstawie Maciejewska AM i in., 2010

3,N4-etenodeoksycytozyna (3,N

4-εC) jest jednym z egzocyklicznych etenowych

uszkodzeń zasad DNA. Może powstawać zarówno w wyniku ekspozycji na niektóre

kancerogeny środowiskowe, np. aldehyd chlorooctowy (CAA), jak i na skutek

peroksydacji lipidów.

W warunkach fizjologicznych połowiczny czas (t1/2) dehydratacji 3,N4-α-

hydroksyetanocytozyny (HEC) w polinukleotydzie wynosi około 1 dobę (Kuśmierek

JT, Singer B, 1982), co sugeruje, że addukt ten może odgrywać niezależną od

3,N4-εC rolę w mutagenezie i naprawie.

1,N6-etenoadenina (1,N

6-εA) powstaje w reakcji, w której azot N1 pierścienia

adeniny oraz azot egzocykliczny tworzą pięcioczłonowy pierścień, dzięki nasyceniu

wiązania podwójnego przy azocie N1 (Frick LE i in., 2007). Tak jak inne

etenoaddukty, etenoadenina powstaje w wyniku działania m. in. aldehydu

chlorooctowego (metabolitu chlorku winylu) oraz produktów peroksydacji

ω-6-wielonienasyconych kwasów tłuszczowych na zasady DNA. Etenoadenina

została wykryta w tkankach ludzi i gryzoni w bardzo zróżnicowanych ilościach,

w przedziale od 0,043 do 31,2 cząsteczek etenoadeniny na 108 niezmodyfikowanych

26

adenin występujących w DNA. Traktowanie szczurów chlorkiem winylu

powodowało wzrost ilości etenoadeniny w DNA ich wątroby, płuc, limfocytów

i jąder (w wątrobie i płucach kilkukrotny). U bakterii polimeraza DNA rozpoznaje

zwykle etenoadeninę jako niezmodyfikowaną adeninę, rzadko dając podstawienia

AT→TA (Moriya M i in., 1994). W komórkach E.coli i Saccharomyces cerevisiae

zaobserwowano aktywność enzymatyczną identyfikowaną jako alkilo-N-puryno-

DNA glikozylazy wycinające etenoadeninę, odpowiednio AlkA1 i MAG

2 (Saparbaev

M i in., 1995). Wykryto również aktywność enzymatyczną wycinającą etenoadeninę

w ssaczym ekstrakcie komórkowym (Oesch F i in., 1986). Częściowo oczyszczono

ludzkie białko ANPG3 wiążące się do, i usuwające etenoadeninę (Saparbaev M i in.,

1995; Singer B i in., 1992). Zaobserwowano, że ANPG jest zdecydowanie bardziej

efektywnym białkiem niż alkilo-N-puryno-DNA glikozydazy (Saparbaev M i in.,

1995).

I.2. Sposoby naprawy DNA

Komórki wykształciły szereg systemów naprawczych mających na celu

przeciwdziałanie efektom wpływu czynników mutagennych i cytotoksycznych.

U Escherichia coli wyróżnia się cztery sposoby naprawy uszkodzeń kwasów

nukleinowych spowodowanych przez związki alkilujące:

1) naprawa przez wycinanie zasad – ang. base excision repair (BER),

2) naprawa przez wycinanie nukleotydów – ang. nucleotide excision repair (NER),

3) naprawa błędnie sparowanych zasad – ang. mismatch repair (MMR),

4) naprawa bezpośrednia przez odwrócenie, np. metylotransferazy

(alkilotransferazy) lub oksydacyjne demetylazy (Nieminuszczy J, Grzesiuk E,

2007).

Procesy naprawcze zmodyfikowanej adduktami molekuły DNA zapobiegają

gromadzeniu się tych modyfikacji i ich przekształcaniu w mutacje. Większość

1 Białko AlkA jest 3-metyloadeninową glikozylazą II DNA indukowaną w odpowiedzi na alkilację

DNA. Chroni komórki przed negatywnymi działaniem alkilowanych zasad DNA poprzez katalizę ich

wycinania, włączając w to N-3 i N-7 addukty adenozyny i guanozyny oraz O2 –addukty tymidyny i

cytydyny. 2 MAG – białko drożdży Saccharomyces cerevisiae

3 ANPG – ludzka 3-metyloadeninowa glikozylaza DNA, in. ludzka N-glikozylaza DNA alkilowanych

zasad

27

oksydacyjnych modyfikacji DNA, takich jak zmiany struktury chemicznej zasady,

reszty cukrowej oraz obecność miejsc apurynowych i pirymidynowych, jest

naprawiana z wykorzystaniem mechanizmu wycięcia zasady (BER). Wykazano, że

według tego mechanizmu usuwane są etenoaddukty: 1,N6-etenoadenina,

3,N4-etenocytozyna, N

2,3-etenoguanina i 1,N

2-etenoguanina (Gros L i in., 2003).

Najważniejszym elementem jest tu aktywność enzymatyczna glikozylaz DNA.

Glikozylazy w procesie naprawy hydrolizują N-glikozydowe wiązanie pomiędzy

zmienioną chemicznie zasadą a cukrem, a także eliminują zmodyfikowane zasady,

np. alkilowane puryny czy glikol tyminowy oraz utlenioną 2’-deoksyrybozę.

W zależności od rodzaju uszkodzenia obserwowano proces naprawczy z udziałem

endonukleaz nacinających DNA w miejscu 5’ oksydacyjnie zmienionej zasady,

pozostawiając wolne końce 3’-hydroksylowe i 5’-fosforanowe, co określono

mianem: naprawa przez nacięcie nukleotydu (nucleotide incision repair – NIR)

(Ishchenko AA, Saparbaev MK, 2002).

Kolejnym mechanizmem naprawczym jest naprawa przez wycięcie nukleotydu

(NER), który usuwa objętościowe addukty zmieniające konformację helisy DNA

(Costa RMA i in., 2003). Częścią tego mechanizmu jest proces naprawczy połączony

z transkrypcją (transcription coupled repair – TCR). Naprawa przez wycinanie

nukleotydów (NER) jest procesem, w efekcie którego usuwane są uszkodzone

nukleotydy. U bakterii E. coli proces taki odbywa się przy udziale białek UvrA,

UvrB, UvrC i UvrD.

Naprawa błędnie sparowanych zasad (MMR) dotyczy źle sparowanych zasad na

potomnej nici utworzonych w czasie procesu replikacji, a które uniknęły poprawy

polimerazy DNA.

Oprócz skomplikowanych kompleksów naprawczych, komórka może

wykorzystywać także proste mechanizmy naprawy DNA, nie naruszające jego

integralności. Przykładem jest bezpośrednia naprawa przez odwrócenie, w której

bierze udział pojedyncze, wysoce specyficzne białko, nie nacinające wiązania

pomiędzy reszta cukrową a fosforanową, ani nie wycinające zmodyfikowanej

zasady. Wprowadzone dodatkowe grupy atomów są eliminowane bezpośrednio

w miejscu ich przyłączenia. Jednym z takich mechanizmów jest działanie fotoliazy

reaktywowanej pod wpływem światła ultrafioletowego. Fotoliazy przekształcają

cyklobutanowe dimery pirymidynowe z powrotem do monomerów. Białka te

zawierają grupę prostetyczną absorbującą światło niebieskie i transportują energię na

28

pierścień cyklobutanowy powodując tym samym jego rozszczepienie. Należy

zaznaczyć, że fotoliza nie występuje w komórkach wyższych eukariotów.

Do kolejnej grupy białek naprawczych możemy zaliczyć alkilotransferazy

(np. metylotransferaza O6-metyloguaniny). Białka te transportują grupy metylowe ze

zmodyfikowanych zasad DNA na grupę tiolową cysteiny własnej cząsteczki.

W DNA zostaje więc naprawiona zasada, natomiast metylotransferaza ulega

nieodwracalnej inaktywacji poprzez zablokowanie reszty cysteinowej (Falnes PØ

i in., 2004). Dioksygenazy AlkB odgrywają kluczową rolę w mechanizmie

bezpośredniej naprawy przez odwrócenie. Białka te katalizują reakcję całkowitej

naprawy uszkodzenia bez naruszenia ciągłości nici DNA, a do reakcji wymagają

obecności łatwo dostępnych w komórce α-ketoglutaranu i tlenu jako kosubstratów

oraz Fe (II) jako kofaktora. Uczestniczą one w usuwaniu uszkodzeń alkilacyjnych,

takich jak: 1-meA czy 3-meC oraz egzocyklicznych etenoadduktów DNA, które

mogą być również usuwane przez system naprawy przez wycinanie zasad (BER)

(Lau AY i in., 2000; Aas PA i in., 2003).

I.2.1. AlkB

Gen alkB został odkryty w 1983 roku podczas izolowania mutantów Escherichia coli

ze zwiększoną wrażliwością na czynniki alkilujące. Obecnie produkt tego genu –

białko AlkB u E. coli (EcAlkB) – uważane jest za białko uczestniczące w naprawie

alkilacyjnych uszkodzeń DNA (Kataoka H i in., 1983). Jego homologi występują też

u innych organizmów, gdzie uczestniczą w naprawie uszkodzeń w DNA lub/i RNA,

a także mogą pełnić funkcje nie związane z naprawą DNA (van den Born E i in.,

2009).

W 2002 roku dwie niezależne grupy badawcze potwierdziły eksperymentalnie udział

białek AlkB w naprawie DNA (Falnes PØ i in., 2002; Trewick SC i in., 2002).

Analiza bioinformatyczna wykazała, iż białka te należą do rodziny dioksygenaz

zależnych od Fe(II) i α-ketoglutaranu (Aravind L, Koonin EV, 2001). Enzym AlkB

wymaga Fe(II) jako kofaktora oraz α-ketoglutaranu i tlenu jako kosubstratów.

I.2.1.1. Mechanizm działania

Białko AlkB usuwa zarówno alkilacyjne, jak i etenowe uszkodzenia zasad DNA.

Mechanizm naprawy alkilowych modyfikacji można podzielić na dwa etapy.

29

W pierwszej kolejności następuje hydroksylacja wiązania C-H w dołączonej do

zasady grupie alkilowej, co związane jest z oksydatywną dekarboksylacją

α-ketoglutaranu, w wyniku której uwolnione zostają cząsteczki bursztynianu

i dwutlenku węgla. Jeden z atomów cząsteczki tlenu wbudowany zostaje we

fragment alkilowy jako grupa hydroksylowa, natomiast drugi stanowi część grupy

karboksylowej bursztynianu (Prescott AG, Lloyd MD, 2000; Ryle MJ, Hausinger

RP, 2002; Schofield CJ, Hang Z, 1999). Z wykorzystaniem tej drogi naprawy, białko

AlkB bezpośrednio przekształca 1-metyloadeninę i 3-metylocytozynę odpowiednio

w adeninę i cytozynę z jednoczesnym uwolnieniem utlenionej grupy metylowej w

postaci formaldehydu (Trewick SC i in., 2002). Produktami przejściowymi są

1-hydroksymetyloadenina i 3-hydroksymetylocytozyna, które są niestabilne

i spontanicznie rozkładają się regenerując nieuszkodzoną zasadę (Schemat 4).

Schemat 4. Mechanizm naprawy uszkodzeń alkilacyjnych przez białko AlkB

Źródło: Begley TJ, Samson LD, 2003

Mechanizm naprawy uszkodzeń adduktów etenowych opiera się na podobnej

zasadzie jak usuwanie grup alkilowych (Sedgwick B, Lindahl T, 2002). Najpierw

mostek etenowy utleniany jest do epoksydu, który w wyniku addycji cząsteczki

wody tworzy glikol. W dalszej kolejności powstały alkohol uwalnia się

spontanicznie w postaci glioksalu (Delaney JC i in., 2005) z odtworzeniem

wyjściowej zasady.

30

Schemat 5. Mechanizm naprawy etenowych uszkodzeń przez białko AlkB

Źródło: Delaney JC i in., 2005

W celu potwierdzenia hipotezy naprawy εA przez AlkB skonstruowano trimer DNA

T(εA)T, który traktowano białkiem AlkB E. coli. Po reakcji analiza HPLC wykazała

całkowity zanik piku dla T(εA)T i pojawienie się nowego piku reprezentującego

TAT. Trimer TAT został dodany do tej samej mieszaniny, która była analizowana na

HPLC. Zwiększenie gęstości w nowym piku potwierdza, że TAT zostało uzyskane

jako produkt ostateczny. Eksperyment sprawdzający został przeprowadzony

w dokładnie takich samych warunkach z T(εA)T, Fe(NH4)2(SO4)2, α-ketoglutaranem

i askorbinianem w buforze MES albo HEPES z wyłączeniem AlkB. Analiza HPLC

tego roztworu pokazała, że żadna reakcja naprawcza nie wystąpiła przy braku AlkB.

Swoistości TAT i T(εA)T w roztworze zostały następnie potwierdzone przy użyciu

spektrometrii masowej MALDI (Mishina Y i in., 2005).

Po przeprowadzonej reakcji białka AlkB zachowują aktywność enzymatyczną

(Trewick SC i in., 2002; Falnes PØ i in., 2002).

I.2.1.2. Struktura przestrzenna AlkB

Poznanie trójwymiarowej struktury białek AlkB w kompleksie z różnymi substratami

pozwoliło na identyfikację kluczowych reszt aminokwasowych zaangażowanych

w rozpoznanie substratu oraz ujawniło, że białko EcAlkB składające się z 216

aminokwasów zawiera trzy domeny. Są to:

- N-terminalna domena (aa 1-45),

- sekwencja NRL (ang. nucleotide-recognition lid) (aa 46-89),

- C-terminalna domena dioksygenazowa, część katalityczna (aa 90-216) (Yang CG

i in., 2008; Yu B i in., 2006).

31

Bakteryjne białka AlkB są zbudowane z 190-220 aminokwasów, zawierają silnie

zakonserwowaną domenę dioksygenazową oraz słabiej zakonserwowany region

N-terminalny. Przypuszczalnie domena N-terminalna zawiera reszty decydujące

o specyficzności substratowej.

Rysunek 10. Struktura krystaliczna kompleksu białka AlkB E. coli z Fe(II), 2OG i

metylowanym trójnukleotydem. Kolorem pomarańczowym zaznaczono Fe, natomiast atomy w 2OG

i dT-(1-me-dA)-dT są zaznaczone zgodnie z atomową identyfikacja (węgiel-biały; tlen-czerwony;

azot-niebieski; fosfor-pomarańczowy). Niezmienne łańcuchy Fe-2OG dioksygenazy zaznaczono

kolorem czerwonym lub magenta (czerwono-fioletowym) w zależności od interakcji odpowiednio z

Fe lub 2OG (Yu B i in., 2006)

Źródło: http://www.nature.com/nature/journal/v439/n7078/fig_tab/nature04561_F1.html

I.2.1.3. Rodzina bakteryjnych białek AlkB

Na podstawie analizy sekwencji bakteryjnych białek AlkB opracowano drzewo

filogenetyczne z wyodrębnieniem czterech grup: 1A, 1B, 2A, 2B. Rozproszone

występowanie białek w obrębie królestwa bakterii wskazuje na horyzontalny transfer

kodujących je genów (van den Born E i in., 2009).

W białkach należących do grupy 1B w domenie N-terminalnej występują takie same

konserwowane sekwencje, jak w białkach należących do grupy 2B. Podobnie,

w obrębie domeny NRL, występuje kilka konserwowanych ewolucyjnie

aminokwasów wspólnych dla białek grupy 1B oraz 2B. Natomiast, w przypadku

32

grup 1A i 2A, takie same konserwowane sekwencje występują wyłącznie w białkach

należących do tej samej grupy.

Badania nie ujawniły podobieństwa sekwencji pomiędzy N-terminalną domeną

białek z grup 1A i 1B, jednak przypuszcza się, iż zawierają one kilka kluczowych

reszt w obrębie domeny NRL, łącznie z resztami Trp69 i Tyr76, co jest związane ze

specyficznością substratową (Yu B i in., 2006). Sekwencje domeny NRL białek

grupy 1B wykazują homologię do białek z grupy 1A i 2B, co sugeruje, że białka tych

trzech grup mogą rozpoznawać podobne substraty (van den Born E i in., 2009).

Białka należące do grupy 1A, 2B oraz 1B mają kilka takich samych

konserwowanych ewolucyjnie aminokwasów w rejonie odpowiadającym domenie

NRL EcAlkB co pozwala przypuszczać, że te trzy grupy białek mogą oddziaływać

z takim samym substratem (kwasem nukleinowym).

Białka z grup 1A, 1B oraz 2B uczestniczą głównie w naprawie DNA, podczas gdy

funkcją białek z grupy 2A jest przede wszystkim modyfikacja tRNA (van den Born E

i in., 2009).

Tabela 1. Rozmiary homologów białka AlkB wybranych (badanych) gatunków bakterii

Białko Obecność/gatunek bakterii Wielkość (aa)

MT-2B Mycobacterium tuberculosis 205

SA-1A Streptomyces avermitilis 222

SA-2B Streptomyces avermitilis 208

SC-1A Streptomyces coelicolor 216

SC-2B Streptomyces coelicolor 210

XC-1B Xanthomonas campestris 201

XC-2B Xanthomonas campestris 211

EcAlkB Escherichia coli 216

Źródło: Zmodyfikowano na podstawie van den Born E i in., 2009

Grupa 1A

Białka należące do tej grupy są szeroko rozpowszechnione w królestwie bakterii,

szczególnie u proteobacteria. Do grupy tej należy białko AlkB E. coli, także białka

SA-1A i SC-1A; oba występują u bakterii z rodzaju Streptomyces, w 79% są

identyczne na poziomie sekwencji aminokwasowej oraz mają podobne właściwości.

Przypuszczalnie grupa 1A składa się z białek o funkcji podobnej do białka

modelowego dla całej super rodziny AlkB – EcAlkB (van den Born E i in., 2009).

33

Grupa 1B

Białka z grupy 1B występują u β- i γ-proteobacteria, a także u cyanobacteria.

Wykazują podobieństwo do białek ALKBH2/ALKBH3 występujących

u kręgowców. Do grupy tej należy białko XC-1B, charakteryzujące się wysoką

aktywnością naprawczą. Analiza bioinformatyczna oraz liczne badania

doświadczalne wykazały, iż białka z grupy 1B to białka naprawcze o funkcji

zbliżonej do AlkB u E. coli (van den Born E i in., 2009).

Grupa 2A

Białka tej grupy występują u α-proteobacteria, u takich rodzajów jak Agrobacterium,

Rickettsia czy Rhizobium. Niektóre z tych bakterii są patogenami roślin, a geny

kodujące białka tej grupy u niektórych bakterii, np. Roseobacter denitrificans,

Roseobacter etli, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium medicae występują częściej

na plazmidach niż na chromosomach. Białka grupy 2A wykazują dużą homologię

względem roślinnych oraz zwierzęcych białek ALKBH8 (Falnes PØ i in., 2009).

Analizy bioinformatyczne sugerują, że białka tej grupy są zaangażowane raczej

w modyfikację tRNA niż w naprawę DNA.

Grupa 2B

Białka tej grupy występują głównie u Actinobacteria, a także u niektórych

patogenów roślinnych, np. Xanthomonas (γ-proteobacteria) i Burkholderia

(β-proteobacteria), które mogły nabyć geny kodujące białka AlkB przez

horyzontalny transfer genów z Actinobacteria, które większości są bakteriami

glebowymi (Madigan MT i in., 2003). Analiza sekwencji wykazała, że białka

z grupy 2B zawierają kilka takich samych konserwowanych reszt aminokwasowych

w regionie NRL, co białka grupy 1B oraz uczestniczą w naprawie DNA. Białka

należące do tej grupy: MT-2B, SA-2B, SC-2B oraz XC-2B ujawniają aktywność

naprawczą, jednak specyficzność substratowa tych białek jest dość zróżnicowana,

począwszy od białka MT-2B, z wysoką aktywnością w stosunku do uszkodzeń

metylowych i niską w stosunku do etenoadduktów, co różni je od białka XC-2B (van

den Born E i in., 2009).

I.2.1.4. Homologi AlkB

Sekwencja aminokwasowa białka AlkB wykazuje konserwatyzm od bakterii po

człowieka (Mishina Y i in., 2005). Homologi tegoż białka znaleziono m.in.

34

u niektórych gatunków Actinobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria

i Proteobacteria. Natomiast u Arche i Firmicutes nie udało się ich odnaleźć, co może

świadczyć o zbyt odmiennej sekwencji aminokwasowej lub o braku białka o funkcji

podobnej do AlkB.

Organizmy wielokomórkowe posiadają kilka homologów białka AlkB (ALKBH).

U ssaków zidentyfikowano dziewięć takich białek: ALKBH1- ALKBH8 (Drablos F

i in., 2004; Aravind L, Koonin EV, 2001; Kurowski MA i in., 2003) oraz związane

z otyłością białko FTO, które jest funkcjonalnym białkiem ALKBH (Gerken T i in.,

2007). Najlepiej poznane są: hABH2, hABH3 i FTO.

hABH2, hABH3 oraz FTO wykazują podobną do AlkB E. coli reaktywność

i specyficzność substratową. Ponadto, EcAlkB oraz ALKBH3 uczestniczą

w naprawie uszkodzeń alkilacyjnych w RNA (Aas PA i in., 2003; Falnes PØ i in.,

2004) oraz ujawniają preferencje w stosunku do ssDNA, a także dość efektywnie

uczestniczą w demetylacji RNA, natomiast hABH2 oddziałuje z dsDNA i ma niskie

powinowactwo do substratów RNA (Aas PA i in., 2003). Przypuszcza się, iż mogą

one uczestniczyć w procesach innych niż naprawa DNA czy RNA (Falnes PØ i in.,

2009; Sedgwick B i in., 2007).

hABH2 i hABH3 mają różną lokalizację wewnątrzkomórkową. hABH2 występuje

wyłącznie w jądrze komórkowym i odgrywa rolę w naprawie DNA w pobliżu

widełek replikacyjnych. Z kolei hABH3 występuje zarówno w jądrze, jak

i cytoplazmie (Duncan T i in., 2002; Aas PA i in., 2003).

Białko hABH2 ma ogromne znaczenie w obronie przeciwko toksycznym

uszkodzeniom alkilacyjnym DNA (Ringvoll J i in., 2006).

Rolą ssaczego białka hABH3, podobnie jak AlkB, może być naprawa RNA lub

usuwanie pewnych naturalnych metylacji w różnego rodzaju RNA (Duncan T i in.,

2002; Aas PA i in., 2003; Ougland R i in., 2004).

Jądrowe białko FTO uczestniczy w naprawie 3-meT w ssDNA.

Zróżnicowane właściwości ssaczych homologów AlkB sugerują, że mogą one pełnić

różne funkcje, a naprawa DNA może być jednym z kilku procesów, takich jak:

naprawa RNA, metylacja i demetylacja RNA oraz demetylacja białek (Sundheim O

i in., 2008).

Wszystkie zidentyfikowane homologi mają trzy motywy powtarzające się

w sekwencjach aminokwasowych LHXD, X, RXXXXXR. Odpowiadają one za

formowanie centrum aktywnego enzymu i miejsc, z którymi oddziałuje Fe2+

35

i α-ketoglutaran (α-KG) (Mishina Y i in., 2005). Sekwencja AlkB ma postać

H131XD133…H187, gdzie grupy His i Asp wiążą żelazo, a dodatkowo Asp oddziałuje

z α-KG.

Większość bakterii zawiera tylko jedno białko AlkB, ale niektóre gatunki,

np. Streptomyces, posiadają więcej tego typu białek (Falnes PØ, Rognes T, 2003).

Dlaczego Streptomyces coelicolor?

W Zakładzie Biologii Molekularnej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej

Akademii Nauk w Warszawie podjęto badania nad homologami AlkB ze szczepu

Streptomyces coelicolor we współpracy z grupą badawczą kierowaną przez prof.

P.Ø. Falnesa (University of Oslo) w ramach grantu „The AlkB protein and its

eukaryotic homologues – the role in DNA repair and the possible role in cancer

etiology and target in cancer therapy”. Szczep ten jest interesującym obiektem ze

względu na obecność przynajmniej dwóch stwierdzonych homologów białka

EcAlkB.

Stereptomyces coelicolor reprezentuje grupę bakterii zwaną promieniowcami

(Actinomycetales). Promieniowce nie wytwarzają jądra komórkowego. Wykazują

podobieństwo do bakterii właściwych składem ściany komórkowej i błony

cytoplazmatycznej, jak również budową organelli komórkowych (Różalski A, 1998).

Naturalnym środowiskiem ich życia jest gleba, rozkładająca się masa roślinna,

wilgotne stogi siana, torfowiska, sterty odpadów organicznych, rzadziej zbiorniki

wodne. Są przeważnie tlenowcami i chemoorganotrofami i należą do drobnoustrojów

Gram-dodatnich. Ich optymalna temperatura wzrostu mieści się w granicach 25-30ºC

(zakres 15-37ºC), a optymalne pH jest bliskie 7 (zakres 5-9). Tworzą pseudogrzybnie

- powietrzne, powierzchniowe (podstawowe) i wgłębne – obserwacja rozgałęziania

których pozwala odróżnić bakterie od grzybów. Rozmnażają się przez podział,

fragmentację pseudogrzybni oraz segmentację. U Streptomyces występują nitki

konidioforowe, których podział prowadzi do powstania spor. Trzon kolonii

właściwej tworzy pseudogrzybnia podstawowa, która składa się z silnie splecionych

ze sobą strzępek. Pseudogrzybnię powietrzną stanowią strzępki uformowane

w delikatną masę (zdjęcie). Na końcach tych nici powstają wyrostki sporonośne

(mycelia), na których wytwarzane są spory (Różalski A, 1998).

36

Zdjęcie 1. Kolonie Stereptomyces coelicolor

Źródło: www.jic.ac.uk/science/ molmicro/Strept.html

Stereptomyces coelicolor jest pierwszym organizmem tej glebo-zależnej grupy

bakterii, którego genom (jego sekwencja) został całkowicie poznany. Składa się on

z 8 667 507 par zasad i najprawdopodobniej zawiera 7 825 genów, w skład których

wchodzi ponad 20 klasterów kodujących metabolity wtórne (Bentley SD i in., 2002).

Wśród nich znajdują się substancje o różnorodnej aktywności biologicznej,

np. zaangażowane w reakcje na bodźce zewnętrzne. Większość poznanych genów

tego drobnoustroju jest podobna do opisanych wcześniej genów innych bakterii oraz

genów regulatorowych. Pośród organizmów bakteryjnych unikalne i niezwykłe są

geny odpowiedzialne za różnicowanie faz rozwoju szczepu Streptomyces (Bentley

SD i in., 2002).

Mikroorganizmy te odpowiedzialne są za biosyntezę antybiotyków stosowanych

w medycynie i weterynarii. Spośród idiolitów produkowanych przez Streptomyces

coelicolor na szczególną uwagę zasługują: aktynorodyna, metylenomycyna,

undecylodigiosyna, przeciwgrzybowy antybiotyk polienowy (pochodna

amfoterycyny B) oraz CDA (calcium-dependent peptide antibiotic). Związki te mogą

37

być wytwarzane przez kolonie S. coelicolor w różnych ilościach w zależności od

zmieniających się warunków otoczenia (źródło takie samo jak zdjęcie).

Szczepy Streptomyces wydzielają do środowiska tzw. egzopigmenty zmieniające

barwę otoczenia. Większość wytwarza również endopigmenty, zabarwiające

komórkę i kolonie (Różalski A, 1998).

I.2.1.5. Znaczenie badań nad białkami AlkB

Bakteryjne białko AlkB posiada szerokie spektrum specyficzności substratowej

i może brać udział w naprawie różnego typu adduktów zasad zarówno DNA, jak

i RNA (Aas PA i in., 2003; Ougland R i in., 2004). Fakt ten sprawia, że białko to jest

uniwersalnym komponentem systemów naprawy, które podczas stresu, zarówno

alkilacyjnego, jak i oksydacyjnego, jest odpowiedzialne za utrzymanie wierności

replikacji, transkrypcji i translacji w komórce. Tak ważna rola białka AlkB skłoniła

wielu naukowców do wnikliwszych badań związanych z mechanizmem naprawy

oraz warunkami, jakie muszą zaistnieć, by doszło do wydajnej rewersji uszkodzonej

zasady. AlkB preferuje łączenie się z fragmentem cząsteczki DNA na odcinkach,

gdzie tworzy ono formę jednoniciową. Wynika to faktu, że pojedyncza nić DNA jest

znacznie bardziej elastyczna i dzięki temu dopasowuje się do narzuconej przez

białko „formy”, czyli zagłębienia w strukturze proteiny, do której wsuwa się DNA.

Problem z badaniami białek podobnych do AlkB polega na tym, że wiążą one

docelową cząsteczkę bardzo słabo, przez co trudno jest obserwować ich strukturę

w stanie odpowiadającym wykonywaniu swojego zadania. Z tego powodu

przeprowadzono specjalny proces, w którym zmuszono DNA i AlkB do połączenia

się ze sobą silnymi wiązaniami chemicznymi, przez co ustabilizowano ich wzajemne

położenie. Połączone ze sobą cząsteczki poddano analizie krystalograficznej,

tzn. określono dokładnie rozkład przestrzenny atomów wewnątrz cząsteczek. Udało

się dzięki temu zdefiniować tzw. miejsca aktywne w strukturze AlkB, których

zablokowanie powinno znacząco obniżyć aktywność proteiny.

Białko AlkB uczestniczy w naprawie uszkodzeń, które są preferencyjnie generowane

w ssDNA. Enzym ten kontroluje materiał genetyczny podczas replikacji

i transkrypcji (Begley TJ, Samson LD, 2003). Naprawia również 1-meA i 3-meC

w RNA (Aravind L, Koonin EV, 2001), które prowadzą do śmierci komórek,

38

zarówno bakteryjnych, jak i ludzkich (Kataoka H i in., 1983; Chen BJ i in., 1994).

Usuwaniu uszkodzeń przez białka AlkB towarzyszy generowanie formaldehydu

w mieszaninie reakcyjnej, który może dodatkowo uszkadzać DNA (Lutz WK, 1990),

co sugeruje, że podczas naprawy z udziałem białek AlkB mogą powstawać wtórne

uszkodzenia. Komórki jednak wykształciły mechanizmy zapobiegające ich

powstawaniu lub usuwające takie modyfikacje.

Zarówno AlkB, jak i hABH2, usuwają tzw. grupy alkilowe, powstające w wyniku

reakcji z prostymi związkami organicznymi. Proces dołączania grup alkilowych jest

niezwykle groźny dla stabilności genetycznej komórki. Stanowi zagrożenie nie tylko

dla prawidłowo funkcjonujących komórek, ale także dla komórek nowotworu, które

nie potrafią odtworzyć powstających uszkodzeń. Problem pojawia się gdy nowotwór

jest wyposażony w skuteczny system naprawy DNA – może się on wówczas

skutecznie bronić przed chemioterapią. Z tego powodu trwają poszukiwania nad

sposobami ograniczenia aktywności systemów naprawczych wewnątrz guza.

Mogłoby to znacznie zwiększyć skuteczność leczenia chorób nowotworowych.

39

II. Cel pracy

Celem pracy było zbadanie specyficzności substratowej homologów AlkB

w stosunku do adduktów egzocyklicznych. Wykorzystano tu modyfikujące własności

aldehydu chlorooctowego i akroleiny. Naprawa powodowanych przez nie uszkodzeń

przebiega w sposób bezpośredni - bez naruszania ciągłości nici DNA. Przedmiotem

badań były wyizolowane i oczyszczone białka SC-1A i SC-2B ze szczepu

Streptomyces coelicolor oraz XC-1B i XC-2B ze szczepu Xanthomonas campestris,

stanowiące homologi EcAlkB. Dzięki przeprowadzonym doświadczeniom

wyznaczono optymalne warunki naprawy egzocyklicznych uszkodzeń zasad DNA

przez białko SC-1A.

40

III. Materiały i metody

III.1. Materiały

III.1.1. Odczynniki

Kwas octowy (CH3COOH, AcOH) – POCh

Octan sodu (NaCOOH) – Chempur

Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazino-1-etanosulfonowy (HEPES) – Sigma

Bis-Tris – Sigma

Ditiotreitol (DTT) – Sigma

Wodorotlenek sodu (NaOH) – Stanlab

Kwas solny (HCl) – Chempur

Trietyloamina (TEA, Et3N) – Merck

Metanol (CH3OH, MeOH) – Lab-scan

2-oksoglutaran (α-ketoglutaran, αKG) – Fluka

Sześciouwodniony siarczan amonowo-żelazawy (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O – Fluka

Aldehyd chlorooctowy (CAA) – Fluka

Akroleina (ACR) – Fluka

Odczynniki do elektroforezy

Żel rozdzielający (15%):

30% akrylamid - 2,5ml – Fluka

1,5M Tris (pH 8.8) – 1,3ml

10% SDS – 0,05ml

miliQ H2O – 1,1ml

10% nadsiarczan amonu (APS) - 0,05ml – Bio-Rad

N, N, N’ N’ - tetrametyletylenodiamina (TEMED) – 0,002ml - Fluka

Żel zagęszczający (4,5%):

30% akrylamid – 0,17ml

1M Tris (pH 6,8) – 0,13ml

10% SDS – 0,01ml

miliQ H2O – 0,68ml

10% nadsiarczan amonu (APS) – 0,01ml

41

N, N, N’ N’ - tetrametyletylenodiamina (TEMED) – 0,001ml

Marker

SigmaMarker™ Low Range (M.W. 6,500 - 66,000) – Sigma

Barwnik Coomasie Brillant Blue G – 250

0,2 % Coomasie Brillant Blue G – 250

45 % metanol

10 % kwas octowy

Odbarwiacz

25 % metanol

10 % kwas octowy

III.1.2. Bufory

III.1.2.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka

Bufor sodowo-fosforanowy 160mM pH 7,4

Bufor do wiązania (BB) pH 7,4

Bufor do elucji (EB) pH 7,4

Bufor do przechowywania (ST) pH 7,4

Bufor do elektroforezy SDS-PAGE (pH 8,3)

0,125M Tris/HCl pH 8,3

0,96M glicyna

0,5% SDS

Bufor Laemmli’ego (pH 6,8)

0,25M Tris/HCl pH 6,8

50% glicerol

25% β-merkaptoetanol

10% SDS

0,05% błękit bromofenolowy

Bufor do dializy (pH 7,4)

40mM Tris/HCl pH 7,4

200mM NaCl

10% glicerol

5mM DTT

1mM PMSF

42

III.1.2.2. Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy

przez badane białka

0,5M bufor octanowy w zakresie pH 4,2 – 5,6

0,5M HEPES w zakresie pH 6,8 – 7,8

0,5M Bis-Tris w zakresie pH 5,8 – 7,0

1,5M TEAB pH ok. 7-8 (węglan trietyloaminy)

Bufor TE pH 7,8 (10mM Tris-HCl pH 7,8 + 1mM EDTA pH 8,0)

Bufor kakodylanowy pH 6,5 – (CH3)2AsO2Na x 3H2O (BDH)

Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej

1M TEAA (octan trietyloaminy) pH ok. 6,5

30% metanol w H2O

III.1.3. Pentamery

TTATT – Metabion, Martinsried, Germany

TTCTT – Metabion, Martinsried, Germany

III.1.4. Enzymy

Preparaty oczyszczonych białek EcAlkB, SC-1A, SC-2B, XC-1B i XC-2B (His-tag)

otrzymano w Zakładzie Biologii Molekularnej IBB PAN wykorzystując plazmid

pET28a. Plazmid niosący sklonowany gen alkB z E. coli otrzymano z pracowni prof.

Seeberga (Uniwersytet w Oslo), natomiast plazmidy pET28a niosące sklonowane

geny białek SC-1A, SC-2B, XC-1B i XC-2B z pracowni prof. Falnesa (Uniwersytet

w Oslo). Plazmidem transformowano szczep E. coli BL21 (DE3). Białko SC-1A

zostało oczyszczane z ekstraktu komórkowego poprzez chromatografię

powinowactwa (zob 3.9.). Białko SC-2B zostało oczyszczone w Zakładzie Biologii

Molekularnej przez dr Jadwigę Nieminuszczy, a XC-1B i XC-2B przez mgr Annę

Domańską.

III.1.5. Antybiotyki

Kanamycyna – Sigma

43

III.1.6. Pożywki

Pożywka LB płynna

0,5 % NaCl

0,5 % ekstrakt drożdżowy

1 % trypton

Pożywka LB stała

Podłoże LB płynne z dodatkiem 1 % agaru

III.1.7. Aparatura

III.1.7.1. Aparatura do oczyszczania białek

Zestaw do chromatografii niskociśnieniowej Äcta prime (Amersham)

Kolumna niklowa HisTrap (Amersham)

Spektrofotometr: Cary 3 UBV – Visible Spectrophotometer Varian

Spektrofotometr ULTROSPEC PLUS 4054 UV/VISIBLE Spectrophotometer LKB

BIOCHROM

Wytrząsarka

Elektroporator: TransPorator Plus - BTX

Wirówka J2-21M/E – Beckman

Wirówka miniSpin – Eppendorf

Sonikator Branson Sonifier 250

pH-metr - inoLab

III.1.7.2. Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez

badane białka

HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) firmy Knauer na bazie systemu

podwójnego, zapewniającego gradient dwuskładnikowy, obsługiwany przez program

EuroChrom Basic Edition (wersja 3.05) i wyposażony w detektor UV.

Zarówno analityczny, jak i preparatywny rozdział próbek przeprowadzono na

kolumnach:

- Waters Nova-Pak® C18, 60Å, 4μm, 4,6mm x 250mm, z prędkością przepływu 1

ml/min.

- HR C18, 60Å, 6μm, 3,9mm x 300mm, z prędkością przepływu 1,75 ml/min.

z użyciem liniowego gradientu 20mM octanu trietyloaminy o pH 6,5 x 30% MeOH

w wodzie przez 30 minut i detekcją UV przy długości fali 270nm

44

Spektrofotometr: Cary 3 UBV – Visible Spectrophotometer Varian

Wirówka miniSpin – Eppendorf

pH-metr – MeterLab®

III.1.8. Inne materiały

kuwety do elektroporacji – Bio-Rad

kuwety do spektrofotometrii – Medlab

szyby 14cm x 16cm z przekładkami i grzebieniem 0,4mm

bibuła 3mm – Whatman

folia spożywcza do przykrywania żeli

papierki wskaźnikowe – MERCK

III.2. Metody

III.2.1. Sporządzanie buforów

Wszystkie bufory zostały wykonane na bazie wody dejonizowanej mQ.

• W celu sporządzenia 400ml buforu wiążącego (BB) zmieszano 50ml buforu

sodowo-fosforanowego z 2ml 10mM imidazolu i uzupełniono wodą miliQ,

stabilizując kwasem solnym pH do wartości 7,4.

• Bufor do elucji (EB) wykonano mieszając 12,5ml tego samego buforu sodowo-

fosforanowego z 25ml 500mM imidazolu i uzupełniając wodą do 100ml, pH

ustabilizowano również do wartości 7,4. Tak przygotowane bufory BB i EB

schłodzono.

• Bufor do przechowywania (ST) uzyskano przez zmieszanie 40mM Tris/HCl,

200mM NaCl, 10% glicerolu i ustabilizowaniu pH do wartości 7,4.

• Z przygotowanych wcześniej 0,5M buforów: octanowego, HEPES i Bis-Tris

sporządzono 0,2M bufory. Do każdego z nich dodano 5mM DTT w objętości 5μl/ml.

• Przygotowanie 1M octanu trójetyloaminy (TEAA) pH ~ 6,5

I° Destylacja TEA: Do kolby (o objętości 500ml) z TEA ~ 300ml wrzucono kilka sit

molekularnych („porcelanek”) i ogrzano do wrzenia. Następnie obniżono

temperaturę. Zebrano właściwy produkt TEA oraz przedgon (do ustabilizowania się

temperatury niższej niż 90ºC) w objętości około 200ml. Wyłączono transformator i

pozostawiono wszystko do wystygnięcia.

45

II° Schłodzono 1 mol (139,2 ml) destylowanej trójetyloaminy (Et3N, TEA), 1 mol

(57,5 ml) 17,4M kwasu octowego (AcOH) i 700 ml H2O mQ. Zlewkę z wodą

wstawiono w łaźni lodowej na mieszadło. Dodano TEA, który pływał po

powierzchni jak olej. Kontrolowano pH powoli dodając AcOH aż do uzyskania

wartości 6,5. Uzupełniono wodą do 1000 ml. Całość przesączono na sączku do

HPLC.

Do rozdziałów chromatograficznych używano 20mM TEAA.

III.2.2. Elektroforeza białkowa

Białka obecne we frakcjach zebranych podczas oczyszczania (osad bakterii

nieidukowanych IPTG oraz supernatant przed nałożeniem na złoże, a także frakcje

zebrane po dializie) zostały rozdzielone elektroforetycznie w żelu

poliakryloamidowym w obecności SDS-PAGE (warunki denaturujące). Zastosowano

metodę według modyfikacji Laemmli’ego, czyli w tzw. systemie nieciągłym, gdzie

żel składa się z dwóch części – górnej, o niższym stężeniu akrylamidu, 4,5%

i pH 6,8, która służy do zagęszczenia białek oraz dolnej, zawierającej 15% akrylamid

o pH 8,8, w której dochodzi do rozdziału białek w zależności od ich wielkości.

Przed nałożeniem na żel do próbek o objętości 5µl dodano 5x stężony bufor

Laemmli’ego (1,5µl). Elektroforezę prowadzono w buforze do elektroforezy SDS-

PAGE (1x) pod napięciem 200 V do momentu wyjścia barwnika z żelu. W celu

oceny wielkości białka na żelu rozdziałowi poddano także marker wielkości białek

SigmaMarker™ Low Range w zakresie 6,5 - 66 kDa. Po rozdziale białka barwiono

Coomassie Brillant Blue G-250. Po 30 minutach barwnik zlewano, a żel

umieszczano w odbarwiaczu, który zmieniano kilkakrotnie, aż do całkowitego

odbarwienia się tła.

III.2.3. Przygotowanie komórek kompetentnych i transformacja bakterii

III.2.3.1. Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem

pET28a/alkB

Dwa eppendorfy zawierające po 100μl kompetentnych komórek bakterii szczepu

E. coli BL21 (DE3) rozmrożono na lodzie. Jeden z nich stanowił kontrolę

negatywną, do drugiego natomiast dodano 1μl plazmidu pET28a/pSC. Tak

przygotowaną mieszaninę transformacyjną przenoszono do schłodzonej w lodzie

kuwety, którą następnie wstawiano do elektroporatora i poddawano działaniu

46

impulsu elektrycznego o napięciu 2,5 kV/cm. Następnie do mieszaniny

transformacyjnej dodawano 1ml LB i inkubowano przez 1 godz. w 37ºC w celu

wyrażenia genu oporności na kanamycynę. Mieszaninę bakteryjną po transformacji

wysiano na płytki ze stałym podłożem LB zawierającym kanamycynę o końcowym

stężeniu 50 μg/ml, inkubowano przez noc w temperaturze 37ºC, a następnie

sprawdzano na płytkach obecność transformantów jak również brak wzrostu na

kontroli negatywnej.

III.2.3.2. Ekspresja białka SC-1A w szczepie E. coli BL21 (DE3)

W celu wyrażenia SC-1A pojedynczą kolonią szczepu E. coli BL21 (DE3) pET28a-

SC-1A, niosącego plazmid kodujący białko AlkB pET28a-SC-1A zaszczepiano

100ml płynnej pożywki LB z dodatkiem kanamycyny (50μg/ml). Bakterie hodowano

w 37ºC z wytrząsaniem 200 rpm przez noc. Po tym czasie nastąpiło przeniesienie

hodowli do świeżej pożywki (3 x 1 litr): do każdej kolby zawierającej 1 litr płynnej

pożywki LB z kanamycyną dodano 20 ml hodowli nocnej, a zawartości kolb

połączono. Całość wstawiono do 37ºC z wytrząsaniem na ok. 2,5 godziny do

momentu osiągnięcia gęstości OD600=0,6. Z zawiesiny bakterii pobrano 1 ml co

stanowiło kontrolę nieindukowaną. Pozostałą część chłodzono w 16ºC w chłodni,

a następnie w celu zaindukowania ekspresji białka dodano izopropylo-β-

tiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia 0,1mM. Po indukcji bakterie

hodowano przez 16 godzin w 16ºC z wytrząsaniem 150 rpm. Po tym czasie hodowle

wirowano (6000 rpm w 4ºC przez 15 min), supernatant odrzucono, a osady

zamrożono w -20ºC.

III.2.3.3. Dysrupcja komórek

Do osadu komórek bakteryjnych, w którym uzyskano nadekspresję

rekombinowanego białka SC-1A, dodano β-merkaptoetanol (70μl/100ml) i PMSF

(1ml/100ml). Całość następnie zawieszono w 60 ml buforu wiążącego pH 7,4

(20mM bufor fosforanowy, 0,5M NaCl, 10mM imidazol). Tak przygotowaną

zawiesinę przeniesiono do falkonów i umieszczono w ciekłym azocie w celu

szybkiego zamrożenia, a potem rozmrożono zimną, bieżącą wodą. W dalszej części

(po przeniesieniu zawartości falkonów do dwóch zlewek i umieszczeniu w łaźni

lodowej) komórki sonikowano 2 razy po 3 minuty za pomocą ultradźwięków

o energii 250 W, przy użyciu sonikatora Branson Sonifier 250. Po sonikacji próbki

47

zwirowano z prędkością 12000 x g/10 min w 4ºC (ultrawirówka Beckman

J2-21M/E), natomiast supernatant zebrano i przefiltrowano przez filtr celulozowo-

nitrowy 0,2μm (Milipore), a osad odrzucono.

III.2.2. Oczyszczanie białka SC-1A

Plazmid bakteryjny pSC kodujący białko SC-1A (homolog AlkB) otrzymano od

prof. Seeberga z Uniwersytetu w Oslo. Plazmid pET28a/SC zawierał wklonowaną

sekwencję cDNA kodującą białko SC-1A.

Wszystkie etapy oczyszczania białka przebiegały w temperaturze 4ºC.

Supernatant nakładano na kolumny ze złożem niklowym HisTrap (Amersham)

z wykorzystaniem urządzenia Äcta Prime. Następnie białko eluowano w buforze

elucyjnym gradientem stężenia imidazolu od 10mM do 0,5M. Zebrane frakcje

zachowano do dalszej analizy, zaś frakcje, zawierające SC-1A zostały poddane

dializie do buforu do przechowywania 2xST (storage buffer) pH 7,4 (40mM Tris-

HCl, 200mM NaCl, 10% glicerol). Po dializie dodano glicerol do końcowego

stężenia 50%.

III.2.3. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford

Wykonano trzy powtórzenia każdego pomiaru, a ostateczny wynik stanowił średnią

arytmetyczną wszystkich wyników dla danej frakcji. Do pomiaru pobierano 5μl

każdej z analizowanych frakcji, rozcieńczano w kuwetach zawierających po 795μl

sterylnej wody miliQ, dodawano 200μl odczynnika Bradford, mieszano i odstawiano

na 10 minut w ciemności. Po tym czasie mierzono absorbancję roztworów przy

długości fali 595 nm względem kontroli, którą stanowiła mieszania 800μl wody

i 200μl odczynnika Bradford. Stężenie białka w poszczególnych frakcjach określano

na podstawie krzywej wzorcowej.

Oczyszczone białka przechowywano w temperaturze -80ºC.

III.2.4. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka

III.2.4.1. Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksyetanocytozynę

TT(HEC)TT i TT(εC)TT w reakcji pentameru TTCTT z aldehydem

chlorooctowym (CAA)

Do 1,5M buforu TEAB pH ok. 7-8 w objętości 276,5μl dodano 12,5μl pentameru

TTCTT o stężeniu 2 OD/μl (555nmoli) oraz 29,75μl (180μmol) 45% roztworu

aldehydu chlorooctowego (CAA). Całość wymieszano i inkubowano w 37°C przez

48

2,5 h. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną, zawierającą nieprzereagowany

TTCTT oraz TT(HEC)TT i TT(εC)TT, oczyszczano za pomocą HPLC na kolumnie

preparatywnej, nakładając całkowitą objętość reakcji. Zebrane frakcje zawierające

TT(HEC)TT poddano pomiarowi absorbancji w celu określenia stężenia oligomeru,

a następnie rozdziałowi za pomocą HPLC na kolumnie analitycznej (nakładano

1nmol substancji). Do frakcji zawierającej czysty TT(HEC)TT dodano 1M bufor

kakodylanowy pH 6,5, zliofilizowano, następnie rozpuszczono w buforze TE do

stężenia 500pmoli/μl i przechowywano w temp. - 20ºC. Natomiast frakcje

zawierające mieszaninę TT(HEC)TT i TT(εC)TT poddano procesowi dehydratacji

przez ogrzewanie 72 godz. w 37ºC w pH 6,5.

III.2.4.2. Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksypropanocytozynę

TT(HPC)TT w reakcji pentameru TTCTT z akroleiną (ACR)

Do 1M buforu octanowego (pH 4,5) w objętości 214μl dodano 5μl pentameru

TTCTT o stężeniu 2 OD/μl (222nmoli) oraz 39μl (1nmol) akroleiny (ACR). Całość

inkubowano w 37°C przez 4 h. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną

oczyszczano za pomocą HPLC na kolumnie preparatywnej, nakładając całkowitą

objętość reakcji. Zebrane frakcje zawierające TT(HPC)TT poddano pomiarowi

absorbancji w celu określenia stężenia oligomeru, a następnie rozdziałowi za pomocą

HPLC na kolumnie analitycznej (nakładano 1nmol substancji). Frakcje zawierające

pożądany produkt połączono i zliofilizowano, a w dalszej kolejności rozpuszczono w

buforze TE do stężenia 500pmoli/μl.

III.2.4.3. Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT

w reakcji pentameru TTATT z aldehydem chlorooctowym (CAA)

Substrat został zrobiony przez dr Agnieszkę Maciejewską z Zakładu Biologii

Molekularnej IBB PAN.

Po każdej modyfikacji wykonywano pomiar spektrofotometryczny zebranych

w czasie rozdziału frakcji (1min. = 1000μl, bo przepływ 1ml/min.). I tak np. dla

modyfikacji TTCTT x CAA maksymalne długości fal sześciu zmierzonych frakcji

mieściły się w spodziewanym zakresie od λ max = 258,5 nm do λ max = 270 nm.

49

Modyfikacja TTCTT x CAA

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

230 250 270 290 310

Długość fali

Ab

so

rban

cja

Frakcja 1

Frakcja 2

Frakcja 3

Frakcja 4

Frakcja 5

Frakcja 6

Dla modyfikacji TTCTT x ACR maksymalne długości fal pięciu zebranych

i zmierzonych frakcji zawierały się w zakresie od λ max = 267,0 do λ max = 267,5 nm.

Modyfikacja TTCTT x ACR

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

230 250 270 290 310

Długość fali

Ab

so

rban

cja

Frakcja 1

Frakcja 2

Frakcja 3

Frakcja 4

Frakcja 5

III.2.5. Badanie aktywności białek i wykonanie zależności

Analogiczne zależności przeprowadzono z udziałem wszystkich badanych

homologów EcAlkB, a więc u występujących u Streptomyces coelicolor białek

SC-1A i SC-2B oraz u występujących u Xanthomonas campestris białek XC-1B

i XC-2B. W tym celu przygotowano 0,2M bufory: Bis-Tris, HEPES i octanowy

w różnych zakresach pH wraz z dodatkiem 1M DTT (5μl/ml). Reakcje prowadzono

w zależności od pH buforu, stężenia jonów żelaza i stężenia α-ketoglutaranu.

Doświadczenie z udziałem białek XC-1B i XC-2B przeprowadzono w stosunku do

każdego z czterech rodzajów uszkodzeń zasad DNA. Aby sprawdzić czy i jak ilość

50

białka wpływa na stopień naprawy w reakcjach wykorzystano po 20pm i po 50pm

każdego z tych dwóch białek. Objętości wszystkich mieszanin reakcyjnych były

równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu

reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu

mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC.

III.2.5.1. Zależność od pH

Reakcje startowano przyporządkowanym danemu substratowi buforem

o odpowiednim pH. Reakcje z TT(HEC)TT przeprowadzone zostały w zakresie pH

od 5,8 do 7,0; reakcje z TT(HPC)TT w pH od 6,8 do 7,8; natomiast z TT(εC)TT

i TT(εA)TT w warunkach od 4,2 do 5,6. Skład i ilość pozostałych komponentów

reakcji były identyczne. α-ketoglutaran i jony żelaza (II) w postaci

(NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O dodawano tuż przed reakcją ze względu na ich nietrwałość.

Stężenia jonów Fe(II) i αKG wynosiły odpowiednio: dla TT(εA)TT i dla TT(εC)TT

– 3mM i 0,5mM; dla TT(HEC)TT – 0,5mM i 0,5mM; dla TT(HPC)TT – 0,05mM i

0,1mM.

TT(HEC)TT

Reakcje prowadzono w buforze Bis-Tris o pięciu wartościach pH: 5,8; 6,0; 6,2; 6,6

i 7,0. We wszystkich mieszaninach końcowe stężenia α-ketoglutaranu i świeżo

przygotowanego żelaza (II) wynosiły po 0,5mM. Pozostałe składniki stanowiła woda

miliQ, substrat TT(HEC)TT (500pm) oraz białko SC-1A (20pm). Analogiczną

zależność wykonano również z udziałem białka SC-2B. Objętości mieszanin

reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po

upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej

w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu mieszaniny

reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC.

TT(HPC)TT

Reakcje prowadzono w buforze HEPES o pięciu wartościach pH: 6,8; 7,2; 7,4; 7,6

i 7,8. We wszystkich mieszaninach końcowe stężenia α-ketoglutaranu wynosiły

0,1mM, natomiast stężenia świeżo przygotowanego Fe (II) 0,05mM. Pozostałe

składniki stanowiła woda miliQ, substrat TT(HPC)TT (500pm) oraz białko SC-1A

(50pm). Analogiczna zależność została przeprowadzona z udziałem białka SC-2B,

51

z tym że użyto go w ilości 20pm. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B

i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch różnych ilościach każdego z nich:

20pm i 50pm na reakcję. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich

inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje

zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej)

i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej

przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC.

TT(εC)TT i TT(εA)TT

Reakcje prowadzono w buforze octanowym o pięciu wartościach pH: 4,2; 4,6; 5,0;

5,4 i 5,6. We wszystkich mieszaninach końcowe stężenia α-ketoglutaranu wynosiły

0,5mM, natomiast stężenia świeżo przygotowanego żelaza (II) 3mM. Pozostałe

składniki stanowiła woda miliQ, substrat TT(εC)TT (500pm) oraz białko SC-1A

(100pm). Białka SC-2B użyto w ilości 50pm. Dla substratu TT(εA)TT seria reakcji

miała analogiczny skład i przebieg. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B

i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm

na reakcję. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja

(w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano

poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. -

20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału

analitycznego na HPLC.

III.2.5.2. Zależność od stężenia jonów Fe(II)

Szereg rozcieńczeń jonów żelaza (II) w postaci (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O

przygotowywano z wyjściowego 100mM roztworu w celu porównania uzyskanych

wyników i zminimalizowania błędu pipetowania. Pozostałe składniki były

identyczne z używanymi wcześniej.

TT(HEC)TT

Dla białka SC-1A reakcje przeprowadzono w dwóch buforach: octanowym (pH 5,4)

i Bis-Tris (pH 5,8; 6,2). Stężenia żelaza w każdej reakcji wynosiły odpowiednio

0,1mM, 0,5mM, 1mM i 3mM, przy 20pm białka. Gdy rezultat okazał się

niezadowalający wówczas zależność tę przeprowadzono w buforze Bis-Tris

(pH 5,8), zwiększając ilość białka SC-1A do 50pm. Pozostałe składniki stanowiły:

52

α-ketoglutaran (50μM), woda miliQ i substrat TT(HEC)TT (500pm). W przypadku

zaś białka SC-2B stężenia jonów żelaza (II) w poszczególnych reakcjach wynosiły:

dla TT(HEC)TT 0,1; 0,25; 0,5; 1 i 2mM, stężenie α-ketoglutaranu we wszystkich

reakcjach było równe 100μM, ilość użytego białka była także wynosiła 20pm.

Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC)

trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie

230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę

składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na

HPLC.

TT(HPC)TT

Podczas badania naprawy THPC z użyciem białka SC-1A połączono dwie

zależności: od pH i stężenia Fe. Zastosowano bufor HEPES w następujących

zakresach pH: 6,8; 7,4 i 7,6. Stężenie αKG było równe 100μM w każdej reakcji,

natomiast stężenia żelaza wynosiły odpowiednio 10μM, 50μM, 100μM, 250 μM,

500μM i 750μM. Pozostałe składniki stanowiła woda, substrat TT(HPC)TT (500pm)

i enzym (100pm). Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została

przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm. Objętości

mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30

minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody

(schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu

mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC.

TT(εA)TT

Reakcje naprawy TεA przez białko SC-1A przeprowadzono w buforze octanowym

o pH 5,0. Użyte stężenie αKG było równe 50μM, natomiast stężenia Fe (II) wynosiły

0,5mM, 1mM, 2mM, 3mM, 5mM i 7mM. Pozostałe składniki stanowiła woda,

substrat TT(εA)TT (500pm) i enzym (100pm). Dodanie enzymu stanowiło moment

rozpoczęcia reakcji. Zależność od żelaza w przypadku białka SC-1B wykonano

stosując następujące stężenia Fe (II): 0,5; 1; 2; 3 i 5mM. Stężenie αKG było równe

100μM i użyto 50pm białka. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B

została przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm.

Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC)

trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie

53

230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na

drodze rozdziału analitycznego na HPLC.

TT(εC)TT

Reakcje naprawy TT(εC)TT wykonane zostały dla białek: SC-1A, SC-2B, XC-1B i

XC-2B. W przypadku SC-2B użyte stężenia jonów żelaza (II) w poszczególnych

reakcjach wynosiły: 0,5; 1; 2; 3 i 5mM, stężenie αKG było równe 100μM, natomiast

białka użyto 50pm. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została

przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm. Objętości

mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30

minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody

i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze

rozdziału analitycznego na HPLC.

III.2.5.3. Zależność od stężenia αKG

Dla trzech substratów (TT(HEC)TT, TT(HPC)TT i TT(εA)TT) przeprowadzona

została niniejsza zależność w optymalnych pozostałych warunkach reakcji

(oddzielnych dla każdego substratu), a więc dla THEC – bufor Bis-Tris pH5,8, Fe(II)

0,5mM; dla THPC – bufor HEPES pH 6,8 i 7,4 (celem ostatecznego rozstrzygnięcia

optymalnego pH), Fe(II) 0,05mM oraz dla TεA – bufor octanowy pH 5,0, Fe(II)

3mM. Stężenia α-ketoglutaranu w szeregu reakcji dla każdego z uszkodzeń wynosiły

0μM, 10μM , 25μM, 50μM, 100μM i 250μM. Pozostałe składniki dla

poszczególnych mieszanin reakcyjnych były takie same: woda, substrat i białko

SC-1A. Każdego z substratów zastosowano w ilości 500 pm na reakcję, natomiast

białka SC-1A odpowiednio dla TT(HEC)TT 50 pm oraz dla TT(HPC)TT

i TT(εA)TT po 100 pm. Reakcji tych nie przeprowadzono z użyciem białek: SC-2B,

XC-1B i XC-2B. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja

(w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano

poprzez dodanie 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej

przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC.

54

IV. Wyniki

IV.1. Oczyszczanie białka SC-1A

Plazmid pET28a/pSC wtransformowano do komórek elektrokompetentnych szczepu

E. coli BL21 (DE3). Jedną z uzyskanych kolonii zaszczepiono w płynnej pożywce

LB z dodatkiem kanamycyny (50μg/ml). Namnożono hodowlę bakteryjną szczepu

Streptomyces coelicolor niosącego plazmid pET28a/pSC-1A, nadprodukujący białko

SC-1A. Zebrany osad sonikowano 2 razy po 3 minuty za pomocą ultradźwięków

o energii 250 W przy użyciu sonikatora Branson Sonifier 250. Nałożono na kolumnę

niklową HisTrap (Amersham), którą umieszczono w zestawie do chromatografii

niskociśnieniowej Äcta prime (Amersham). Analizę jakościową frakcji zebranych

podczas oczyszczania białka SC-1A metodą chromatografii powinowactwa na

kolumnie niklowej HisTrap przeprowadzono poprzez poddanie otrzymanych próbek

rozdziałowi elektroforetycznemu w buforze standardowym do SDS-PAGE:

kDa M 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zdjęcie 2. Żel przedstawiający rozdział frakcji zebranych podczas oczyszczania białka SC-1A

barwionego Coomasie Brilliant Blue G-250

M - Marker masy cząsteczkowej M3913-1VL

2 – frakcja 13 SC-1A

3 – frakcja 14 SC-1A

66

45

36

29

24

20,1

6,5

55

4 – frakcja 15 SC-1A

5 – osad

6 – ekstrakt

7 – frakcja 3 – wyciek

8 – frakcja 8 – płukanie

9 – frakcja 13

10 – frakcja 17

Otrzymane w wyniku oczyszczania frakcje białka SC-1A charakteryzowały się różną

czystością. Dlatego w doświadczeniach wykorzystano najbardziej czystą – frakcję 15

(pozycja nr 4 na zdjęciu żelu), posiadającą sekwencję aminokwasową pełnej

długości. Białko w tej frakcji migruje na wysokość 25 kDa, czyli dokładnie tak, jak

miało to miejsce w pracy van den Born E i in., 2009.

W celu zmierzenia zawartości białka dokonano pomiaru absorbancji przy długości

fali λ=595 nm z zastosowaniem odczynnika Bradford. Stężenie białka

w poszczególnych frakcjach określono na podstawie krzywej wzorcowej.

Uzyskano 2 ml białka SC-1A o gęstości 7 µg/µl (7000 ng/µl, 292,9 pm/µl).

IV.2. Modyfikacja pentametrów zwierających cytozynę

W pierwszej kolejności uzyskano dwie pochodne pentameru zawierającego cytozynę

(TTCTT). Były to pochodne hydroksyetenocytozyny (HEC)

i hydroksyporpanocytozyny (HPC), powstałe odpowiednio w reakcjach z aldehydem

chlorooctowym (CAA) i akroleiną (ACR). Kolejny etap polegał na oczyszczeniu

interesujących produktów za pomocą preparatywnego rozdziału na HPLC, w wyniku

którego otrzymano czyste pochodne. Do pochodnej pentameru zawierającej cytozynę

zaliczyć można również etenocytozynę (εC), która powstaje w wyniku dehydratacji

HEC, a która używana była także jako substrat dla badanych białek.

IV.2.1. Uzyskanie pentameru zawierającego hydroksypropanocytozynę

TTCTT + ACR → TT(HPC)TT (hydroksypropanocytozyna)

Po reakcji TTCTT z akroleiną w 1M buforze octanowym o pH 4,6 i 3,5 godz.

inkubacji w temperaturze 37°C otrzymano całkowite przekształcenie cytozyny do

hydroksypropanocytozyny (HPC). Wydajność reakcji wynosiła 100% (Rysunek 11).

56

Do monitorowania postępu reakcji oraz czystości otrzymanej pochodnej

zastosowano technikę HPLC. Na kolumnę analityczną nałożono 1nmol mieszaniny

reakcyjnej.

[min.]Time

0 5 10 15 20 25 30

[mAU]

Abso

rbance

0

10

20

30

40

50

13,3

5 1

25,7

8 2

27,4

5 3

TC5 x ACR 1nmol 18.11.2009

Rysunek 11. Rozdział analityczny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT akroleiną. Pik 13,35

min – akroleina; 25,78 min – uzyskany produkt, pentamer TT(HPC)TT; 27,45- niezidentyfikowany,

uboczny produkt reakcji

W celu sprawdzenia uzyskanego produktu dodano 500 pm substratu TTCTT

i poddano rozdziałowi na HPLC.

[min.]Time

0 5 10 15 20 25 30

[mAU]

Abso

rbance

0

10

20

30

40

50

60

4,1

0 1

7,7

7 2

14,5

8 3

24,4

7 4

25,1

8 5

26,1

3 6

26,9

5 7

28,2

2 8

30,0

3 9

TCxACR reakcja +TC5 po 500pm18-lis-2009

Rysunek 12. Kontrola – mieszanina reakcyjna wraz z substratem TTCTT. Pik 14,58 min –

akroleina; 24,47 min – substrat TTCTT (TC5); 25,18 min – TT(HPC)TT; pozostałe piki stanowią

uboczne produkty reakcji

57

Następnie całość mieszaniny reakcyjnej nałożono na kolumnę preparatywną.

[min.]Time

0 5 10 15 20 25 30

[AU]

Abso

rbance

0,0

0,5

1,0

1,5

11,9

3 1

12,6

2 2

13,3

3 3

16,6

8 4

20,6

3 5

22,3

5 6

23,1

7 7

24,8

7 8

26,3

8 9

27,2

8 10

28,3

7 11

TC5 x ACR calosc 18.11.2009

Rysunek 13. Rozdział preparatywny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT akroleiną.

Zebrano jedną frakcję 24-26 min zawierającą TT(HPC)TT.

IV.2.2. Uzyskanie pentamerów zawierających hydroksyetanocytozynę

i etenocytozynę

TTCTT + CAA → TT(HEC)TT/TT(εC)TT (hydroksyetanocytozyna/etenocytozyna)

Po potraktowaniu TTCTT aldehydem chlorooctowym w 1,5M buforze TEAB o pH

ok. 7-8 przez 3,5 godz. w temperaturze 37°C uzyskano głównie

hydroksyetenocytozynę (HEC), natomiast etenocytozyna (εC) jest produktem

wtórnym powstającym wskutek spontanicznej dehydratacji HEC.

Modyfikacja ta miała na celu wygenerowanie uszkodzeń: etenocytozyny i jej

prekursora hydroksyetanocytozyny. Po 3,5 godz. inkubacji uzyskano modyfikację na

poziomie 72,3%.

58

Przeprowadzono rozdział 1,5 nmola mieszaniny reakcyjnej na kolumnie

półpreparatywnej HR. Chromatogram miał następujący obraz:

[min.]Time

0 5 10 15 20 25 30

[mAU]

Abso

rbance

0

10

20

30

40

24,9

5 1 2

5,8

3 2

27,1

3 3

TCxCAA 1,5nmola 27-sty-2010

Rysunek 14. Rozdział reakcji modyfikacji pentameru TTCTT aldehydem chlorooctowym. Pik

24,95 min – niezmodyfikowana cytozyna w formie pentameru TTCTT; 25,83 min – zmodyfikowana

TT(HEC)TT; 27,13 min – TT(εC)TT

W wyniku reakcji substytucji nukleofilowej aldehydu chlorooctowego z cytozyną

powstaje HEC. Półokres jej dehydratacji w temperaturze 37 C i w pH 6,5 wynosi 72

godz. Egzocykliczny mostek hydroksyetanowy po dehydratacji zmienia się

w ugrupowanie etenowe. Obie dodatkowe grupy blokują tworzenie prawidłowych

wiązań wodorowych, przez co mogą prowadzić do mutacji.

59

W tym wypadku również dokonano rozdziału preparatywnego całości próbki:

[min.]Time

0 5 10 15 20 25 30

[AU]

Abso

rbance

0,0

0,5

1,0

1,5

22,9

0 1

23,5

3 2

24,6

7 3

25,5

3 4

26,6

5 5

27,5

0 6

30,8

3 7

TCxCAA całość prep 27-sty-2010

Rysunek 15. Rozdział preparatywny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT aldehydem

chlorooctowym.

Zebrano frakcje zawierające TT(HEC) i TT(εC)TT.

IV.3. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-1A

W celu zbadania aktywności naprawczej bakteryjnych homologów EcAlkB

przeprowadzono szereg doświadczeń na substratach DNA zawierających cztery

rodzaje uszkodzeń: 3,N4-α-HPC, 3,N

4-α-HEC, 1,N

6-εA oraz 3,N

4-εC. Reakcje

prowadzono przez 30 min. wykorzystując różne ilości białek, tzn. 20, 50 i 100 pm.

Po inkubacji bakteryjnych homologów EcAlkB z substratami zawierającymi

egzocykliczne addukty, konieczne było odróżnienie oligomerów naprawionych od

uszkodzonych. W przeprowadzonych doświadczeniach wykorzystano technikę

rozdziału substancji – wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC).

Przed wykonaniem właściwych doświadczeń sprawdzono czy przechowywanie

białka SC-1A ma wpływ na jego aktywność. W tym celu obydwu białek użyto w

ilości 100 pm, a wszystkie reakcje prowadzono w 0,5mM stężeniu αKG. Stężenia

jonów Fe(II) i pH dobrano odpowiednio do poszczególnych substratów: dla

TT(HEC)TT – 0,5mM Fe(II), pH 6,0; dla TT(εC)TT – 3mM Fe(II), pH 4,6; dla

TT(εA)TT – 3mM Fe(II), pH 4,6 oraz dla TT(HPC)TT – 100mM Fe(II), pH 7,5.

60

Aktywność SC-1A (próba pierwsza)

0

5

10

15

20

25

THEC TεC TεA THPC

substrat (uszkodzenie)

% n

ap

raw

y

substrat

Wykres 1. Sprawdzenie aktywności białka SC-1A

Po 3-miesięcznym przechowywaniu białka w -80ºC, a substratów w -20ºC reakcje

powtórzono zachowując poprzednie warunki. Aktywność spadła tylko w przypadku

TT(εC)TT, wzrosła zaś przy naprawie TT(HPC)TT, przy pozostałych substratach

utrzymuje się na w miarę stałym poziomie.

Aktywność SC-1A (próba druga)

0

5

10

15

20

25

THEC TεC TεA THPC

substrat (uszkodzenie)

% n

ap

raw

y

substrat

Wykres 2. Sprawdzenie aktywności białka SC-1A trzy miesiące później

61

IV.3.1. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od pH reakcji

TT(εA)TT

Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 4,2 do 5,6. W reakcjach użyto 3mM

stężenia jonów Fe(II), 0,5mM stężenia αKG i 100 pm SC-1A. Najlepszą naprawę

uzyskano w pH 5,0. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 3.

SC-1A - zależność naprawy TεA od pH

0

5

10

15

20

25

30

35

4,2 4,6 5 5,4 5,6

pH

% n

ap

raw

y

TεA

Wykres 3. Zależność naprawy TT(εA)TT od pH (białko SC-1A)

[min.]Time

0 5 10 15 20 25 30

[mAU]

Abso

rbance

0

1

2

3

4

5

24,3

8 1

25,0

3 2

SC1 O 5,0 eA Fe 3mM 10-gru-2009

Rysunek 16. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(εA)TT

przez białko SC-1A. Pik 24,38 min reprezentuje produkt naprawy: TTATT, pik 25,03 min

nienaprawiony TT(εA)TT. Wyjściowy substrat do reakcji zawierał 85,9% TT(εA)TT, po reakcji jest

go 56,3%

62

TT(HEC)TT

Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 5,8 do 7,0. W reakcjach użyto 0,5mM

stężenia jonów Fe(II), 0,5mM stężenia αKG i 20 pm SC-1A. Najlepszą naprawę

uzyskano w pH 5,8. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 4.

SC-1A - zależność naprawy THEC od pH

0

2

4

6

8

10

12

14

16

5,8 6 6,2 6,6 6,8 7

pH

% n

ap

raw

y

THEC

Wykres 4. Zależność naprawy TT(HEC)TT od pH (białko SC-1A)

[min.]Time

0 5 10 15 20 25 30

[mAU]

Abso

rbance

0

5

10

15

20

24,4

0 1

25,3

7 2

SC1 BT 5,8 HEC Fe 0.5mM 09-gru-2009

Rysunek 17. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru

TT(HEC)TT przez białko SC-1A. Pik 24,40 min reprezentuje produkt naprawy: TTCTT, pik 25,37

min nienaprawiony TT(HEC)TT, a ostatni pik to TT(εC)TT.

63

TT(HPC)TT

Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 6,8 do 7,8. W reakcjach użyto 0,05mM

steżęnia jonów Fe(II), 0,1mM stężenia αKG i 50 pm SC-1A. Najlepszą naprawę

uzyskano w pH 7,4. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 5.

SC-1A - zależność naprawy THPC od pH

0

2

4

6

8

10

6,8 7,2 7,4 7,6 7,8

pH

% n

ap

raw

y

THPC

Wykres 5. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH (białko SC-1A)

IV.3.2. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia jonów Fe(II)

w reakcji

TT(εA)TT

Reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń jonów Fe(II) od 0,5mM do 7mM.

Reakcje przeprowadzono w pH 5,0, 50μM stężenia αKG, i 100 pm SC-1A.

Najlepszą naprawę uzyskano przy 3mM stężeniu jonów Fe(II). Uzyskane wyniki

przedstawiono graficznie na wykresie 6.

64

SC-1A - zależność naprawy TeA od stężenia Fe

0

20

40

60

80

100

0,5 1 2 3 5 7

stężenie Fe [mM]

% n

ap

raw

y

TεA

Wykres 6. Zależność naprawy TT(εA)TT od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A)

Rysunek 18. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(εA)TT

przez białko SC-1A. Pik 24,97 min reprezentuje produkt naprawy: TTATT, pik 25,62 min

nienaprawiony TT(εA)TT. Wyjściowy substrat do reakcji zawierał 85,9% TT(εA)TT, po reakcji jest

64,9% TT(εA)TT

TT(HEC)TT

Reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń jonów Fe(II) od 0,05mM do 3mM.

Reakcje przeprowadzono w pH 5,8, przy 50μM stężeniu αKG i 50 pm SC-1A.

Najlepszą naprawę uzyskano przy 0,5mM stężeniu jonów Fe(II). Uzyskane wyniki

przedstawiono graficznie na wykresie 7.

65

SC-1A - zależność naprawy THEC od stężenia Fe

0

5

10

15

20

25

0,05 0,1 0,5 1 2 3

stężenie Fe [mM]

% n

ap

raw

y

THEC

Wykres 7. Zależność naprawy TT(HEC)TT od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A)

Rysunek 19. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru

TT(HEC)TT przez białko SC-1A. Pik 23,93 min reprezentuje produkt naprawy: TTCTT, pik 24,92

min nienaprawiony TT(HEC)TT, a pik 26,32 min TT(εC)TT, powstały z dehydratacji TT(HEC)TT

podczas trwania reakcji i rozdziału. Wyjściowy substrat do reakcji zawierał 72,3% TT(εC)TT, po

reakcji jest 58,2% TT(εC)TT

Wynik ten okazał się być adekwatny do przeprowadzonego wcześniej doświadczenia

z użyciem 25pm EcAlkB (Wykres 8).

66

AlkB - naprawa THEC w zależności od stężenia Fe

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0,05 0,075 0,1 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 2,5 3

stęż. Fe [mM]

% n

ap

raw

y THEC pH 5.8

THEC pH 6.0

THEC pH 6.2

THEC pH 6.6

Wykres 8. Zależność naprawy TT(HEC)TT od stężenia jonów Fe(II) (EcAlkB)

TT(HPC)TT

Postępując tym samym tropem wykonano najpierw zależność naprawy

hydroksypropanocytozyny z zastosowaniem białka AlkB E.coli. Reakcje

przeprowadzone zostały nie tylko w zależności od stężenia jonów Fe(II) lecz także

w zależności od pH. W tym przypadku ilość EcAlkB wynosiła również 25pm.

Wyniki doświadczenia przedstawiono na wykresie 9.

AlkB - zależność naprawy THPC od pH i od stężenia Fe

0

10

20

30

40

50

60

70

80

10 25 50 100 250 500

stężenie Fe [uM]

% n

ap

raw

y

6.8

7.2

7.4

7.6

7.8

Wykres 9. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH i od stężenia jonów Fe(II) (EcAlkB)

67

Analogiczne wykonanie i przeprowadzenie reakcji naprawy THPC przez białko

SC-1A pozwoliło uzyskać porównywalne wyniki (Wykres 10).

Reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń jonów Fe(II) od 10μM do 750μM.

Reakcje przeprowadzono w następujących zakresach pH: 6,8; 7,4 i 7,6, 100μM

stężenia αKG, i 100 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano przy 50μM stężeniu

jonów Fe(II). Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 10.

SC-1A - zależność naprawy THPC od pH i stężenia Fe

0

20

40

60

80

100

120

10 50 100 250 500 750

stężenie Fe [uM]

% n

ap

raw

y

pH 6.8

pH 7.4

pH 7.6

Wykres 10. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH i od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A)

IV.3.3. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia αKG w reakcji

TT(εA)TT, TT(HEC)TT, TT(HPC)TT

W celu naprawy TεA, THEC, THPC reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń αKG

od 0 μM do 250μM. Pozostałe warunki reakcji dla substratów: TT(εA)TT - pH 5,0,

3mM Fe(II) i 100pm SC-1A; TT(HEC)TT - pH5,8, 0,5mM Fe(II) i 50pm SC-1A;

TT(HPC)TT - pH 6,8 i 7,4 (celem rozstrzygnięcia optymalnego pH), 0,05mM Fe (II)

i 100pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano przy 10μM stężeniu αKG. Uzyskane

wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 11.

68

SC-1A - zależność naprawy THEC THPC TeA od stężenia aKG

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 25 50 100 250

stężenie aKG [uM]

% n

ap

raw

y THEC pH 5.8

THPC pH 6.8

THPC pH 7.4

TeA pH 5.0

Wykres 11. Zależność naprawy TT(HEC)TT, TT(HPC)TT i TT(εA)TT od stężenia α-

ketoglutaranu (białko SC-1A)

Rysunek 20. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru

TT(HPC)TT przez białko SC-1A. Pik 24,28 min reprezentuje produkt naprawy: TTCTT, pik 26,00

min - nienaprawiony TT(HPC)TT.

IV.4. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-2B

Białko SC-2B jest drugim z homologów EcAlkB występującym u Streptomyces

coelicolor. Przeprowadzono analizę aktywności tego białka w naprawie

TT(HEC)TT, TT(HPC)TT, TT(εC)TT i TT(εA)TT.

69

IV.4.1. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od pH reakcji

TT(εA)TT i TT(εC)TT

Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 4,2 do 5,6. W reakcjach użyto 3mM

stężenia jonów Fe(II), 0,5mM stężenia αKG i 50 pm SC-2B. Najlepszą naprawę

uzyskano w pH 5,0. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 12.

SC-2B - zależność naprawy TeA i TeC od pH

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

4,2 4,6 5 5,4 5,6

pH

% n

ap

raw

y

TεA

TεC

Wykres 12. Zależność naprawy TT(εA)TT i TT(εC)TT od pH (białko SC-2B)

TT(HEC)TT

Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 5,8 do 7,0. W reakcjach użyto 0,5 mM

stężenia jonów Fe(II), 0,5mM stężenia αKG i 20 pm SC-2B. Najlepszą naprawę

uzyskano w pH 6,2 i w pH 6,6. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na

wykresie 13.

70

SC-2B - zależność naprawy THEC od pH

0

2

4

6

8

10

5,8 6 6,2 6,6 6,8 7

pH

% n

ap

raw

y

THEC

Wykres 13. Zależność naprawy TT(HEC)TT od pH (białko SC-2B)

TT(HPC)TT

Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 6,8 do 7,8. W reakcjach użyto 0,05 mM

stężenia jonów Fe(II), 0,1mM stężenia αKG i 20 pm SC-2B. Uzyskane wyniki

przedstawiono graficznie na wykresie 14.

SC-2B - zależność naprawy THPC od pH

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

6,8 7 7,2 7,4 7,6 7,8

pH

% n

ap

raw

y

THPC

Wykres 14. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH (białko SC-2B)

71

IV.4.2. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia jonów Fe(II)

w reakcji

TT(εA)TT

Reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń jonów Fe(II) od 0,5mM do 5mM.

Reakcje przeprowadzono w pH 5,6, 100μM stężenia αKG i 50 pm SC-2B. Najlepszą

naprawę uzyskano przy 3mM stężeniu jonów Fe(II). Uzyskane wyniki

przedstawiono graficznie na wykresie 15.

SC-2B - zależność naprawy TεA w pH 5.6 od stężenia Fe

0

1

2

3

4

5

0,5 1 2 3 5

stężenie Fe [mM]

% n

ap

raw

y

TεA pH 5.6

Wykres 15. Zależność naprawy TT(εA)TT od stężenia jonów Fe(II) w pH 5,6 (białko SC-2B)

Innych zależności z udziałem białka SC-2B nie wykonano.

IV.5. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białka XC-1B

i XC-2B

Kolejno analizowanymi białkami były pochodzące od Xanthomonas campestris

XC-1B i XC-2B. Reakcje naprawy substratów z ich udziałem, przy użyciu dwóch

stężeń (20pm i 50pm), przeprowadzono w następujących warunkach. Dla naprawy

TT(HPC)TT – w pH 7,4, 0,1mM stężeniu jonów Fe(II), 50μM stężeniu αKG;

TT(εA)TT – w pH 5,0, 3mM stężeniu jonów Fe(II), 25μM stężeniu αKG;

TT(εC)TT – w pH 5,0, 5mM stężeniu jonów Fe(II), 25μM stężeniu αKG.

Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresach 16 i 17.

72

Aktywność XC-1B (różne stęż.)

0

2

4

6

8

10

THPC TεA TεC

substrat

% n

ap

raw

y

XC-1B 20pm

XC-1B 50pm

Wykres 16. Aktywność białka XC-1B wobec TT(HPC)TT, TT(εA)TT i TT(εC)TT

Aktywność XC-2B (różne stęż.)

0

2

4

6

8

10

THPC TεA TεC

substrat

% n

ap

raw

y

XC-2B 20pm

XC-2B 50pm

Wykres 17. Aktywność białka XC-2B wobec TT(HPC)TT, TT(εA)TT i TT(εC)TT

Nie zaobserwowano naprawy 3,N4-α-hydroksyetanocytozyny (HEC) w tych

warunkach reakcji.

73

V. Wnioski

1. Białko SC-1A jest homologiem AlkB naprawiającym takie uszkodzenia jak

TT(HEC), TT(HPC)TT, TT(εA)TT.

2. Optymalne warunki naprawy:

- dla TT(HEC)TT – pH 5,8, Fe 0,5mM, αKG 10μM;

- dla TT(HPC)TT – pH 7,4, Fe 0,05mM (50μM), αKG 10μM;

- dla TT(εA)TT – pH 5,0, Fe 3mM, αKG 10μM;

- dla TT(εC)TT – brak naprawy.

3. Zarówno białko SC-2B, jak też białka XC-1A i XC-2B, w bardzo nieznacznym

stopniu naprawiają egzocykliczne uszkodzenia zasad DNA w warunkach

stosowanych w tej pracy.

74

VI. Dyskusja

Naprawa DNA przez białko AlkB Escherichia coli zachodzi według

bezprecedensowego mechanizmu, polegającego na usuwaniu uszkodzeń z zasady bez

naruszania integralności nici DNA. Enzym ten utlenia grupy metylowe

1-metyloadeniny i 3-metylocytozyny w jednoniciowym DNA (ssDNA) (Trewick SC

i in., 2002; Falnes PØ i Seeberg E, 2002), dwuniciowym DNA (dsDNA) oraz

jednoniciowym RNA (ssRNA). AlkB usuwa także mostek etenowy z etenoadeniny

bezpośrednio przekształcając ją w adeninę (Delaney JC i in., 2005; Mishina Y i in.,

2005), oraz naprawia etenocytozynę i jej hydratowany prekursor

hydroksyetanocytozynę, przywracając cytozynę (Maciejewska AM i in., 2010).

Opublikowane dotychczas tylko w formie doniesienia konferencyjnego badania,

prowadzone w Zakładzie Biologii Molekularnej IBB przez dr Agnieszkę

Maciejewską, wykazały, że białko AlkB z E. coli oprócz znanych wcześniej

substratów naprawia także z dużą wydajnością hydroksypropanocytozynę. Optimum

pH dla naprawy substratów AlkB jest zależne od ich pKa. Do naprawy adduktów

egzocyklicznych AlkB wymaga wyższego stężenia Fe(II) i niższego stężenia αKG,

niż dla naprawy 3meC, co również jest zależne od pKa (Maciejewska AM i in., praca

w przygotowaniu). pKa jest to taka wartość pH, przy której połowa cząsteczek

danego związku jest w formie uprotonowanej, połowa w formie obojętnej. Obniżenie

pH powoduje dalszą protonację. Przyjmuje się, że w pH niższym o 1 od pKa

związku, wszystkie jego cząsteczki są uprotonowane. Wyniki uzyskane w omawianej

pracy przedstawiono w tabeli 2.

75

Tabela 2. Zależność optymalnych warunków naprawy poszczególnych substratów od ich pKa

Substrat AlkB pKa Optymalne pH Optymalne

stęż. Fe(II)

[µM]

Optymalne

stęż. αKG

[µM]

3meC 9,0 8,0 50 500

HPC 8,6 7,5 100 50

HEC 6,9 5,8 1000 25

εA 3,9 4,6 3000 25

εC 3,7 4,6 5000 25

εG 2,2 – 2,5 - - -

Źródło: Maciejewska AM i in., plakat

Niniejsza praca stanowi kontynuację w/w badań i miała na celu określenie

specyficzności substratowej homologicznych białek AlkB z innych bakterii,

tj. Streptomyces coelicolor i Xanthomonas campestris oraz sprawdzenie, czy

wydajność naprawy tych substratów jest również zależna od pKa.

Powyższe dane stanowiły punkt odniesienia dla wykazania optymalnych warunków

aktywności homologów białka AlkB Escherichia coli.

Efektywność naprawy analizowano dla 3,N4-α-hydroksyetanocytozyny (HEC),

3,N4-α-hydroksypropanocytozyny (HPC), 1,N

6-etenoadeniny oraz

3,N4-etenocytozyny przy różnych stężeniach badanych białek pochodzących od

różnych szczepów bakteryjnych.

W tabeli 3 zebrano procentowe naprawy poszczególnych substratów przez białko

SC-1A (pochodzące od Streptomyces coelicolor) przy różnych jego stężeniach

(wartości w nawiasach obok napraw):

76

Tabela 3. Naprawa badanych uszkodzeń przez białko SC-1A

Substrat białka

SC-1A

% naprawy / stężenie białka

pH Fe(II) αKG

TT(HPC)TT 6% (50pm) 57% (100pm) 68,3 (100pm)

TT(HEC)TT 14,4% (20pm) 19,4% (50pm) 11% (50pm)

TT(εA)TT 30,6% (100pm) 29% (100pm) 32,95% (100pm)

TT(εC)TT - - -

Źródło: Opracowanie własne

Wyniki te wskazują wyraźnie, że stopień naprawy danych modyfikacji zależny jest

od stężenia białka SC-1A - im wyższe stężenie tym lepsza naprawa – co jest

oczywiste. Ze względu na wydajność napraw analizowane substraty można zatem

uszeregować w następującej kolejności: THPC >>> TεA >> THEC > TεC (brak

naprawy). Jednakże, aby mieć całkowitą pewność co do tego uszeregowania

należałoby jeszcze powtórzyć reakcje naprawy wszystkich badanych substratów w

optymalnych dla nich warunkach reakcji i przy tym samym stężeniu enzymu w

reakcji.

W tym miejscu chcę zaznaczyć, że przechowywanie białka SC-1A w -80ºC nie

wpływa na pogorszenie aktywności (zobacz „Wyniki”, wykres 1 i 2).

Wyniki moich badań dotyczące białka SC-1A i jego optymalnych warunków

naprawy poszczególnych substratów zawiera tabela 4.

Tabela 4. Optymalne warunki naprawy białka SC-1A

Substrat dla białka

SC-1A

Optymalne pH Optymalne stęż.

Fe(II) [μM]

Optymalne stęż.

αKG [μM]

TT(HPC)TT 7,4 50 10

TT(HEC)TT 5,8 500 10

TT(εA)TT 5,0 3000 10

TT(εC)TT - - -

Źródło: Opracowanie własne

77

Porównując uzyskane przeze mnie wyniki optymalnych warunków naprawy przez

białko SC-1A (Tabela 4) z optymalnymi warunkami naprawy EcAlkB (Tabela 2) „na

pierwszy rzut oka” widać że białko SC-1A wymaga do naprawy mniejszego stężenia

α-ketoglutaranu przy wszystkich substratach. Jest ono od 2,5 (dla TT(HEC)TT i dla

TT(εA)TT) do 5 razy (dla TT(HPC)TT) mniejsze niż w przypadku AlkB E. coli.

Podobna sytuacja ma miejsce w przypadku optymalnych stężeń jonów Fe(II). O ile

białko SC-1A do naprawy TT(εA)TT wymaga także 3 mM Fe(II) o tyle

w aktywności względem TT(HPC)TT i TT(HEC)TT stężenia te pozostają 2 razy

mniejsze niż dla naprawy przez AlkB. Jeśli chodzi o pH identyczne wartości

przedstawiają się w przypadku TT(HEC)TT, bardzo zbliżone (różnica 0,1) są przy

naprawie TT(HPC)TT, natomiast w przypadku naprawy TT(εA)TT optimum

naprawy dla SC-1A jest 0,4 wyższe niż dla AlkB. Różnice te mogą wynikać z różnej

wrażliwości porównywanych białek na niskie pH środowiska reakcji.

Optymalne pH dla naprawy TT(HPC)TT wynosi 7,4, co stanowi potwierdzenie

hipotezy, że optimum pH rewersji zmodyfikowanej zasady jest zależne i niższe od jej

stałej kwasowej pKa (która w tym przypadku wynosi 8,6). Sugeruje to, że centrum

aktywne białka AlkB wiąże tylko uprotonowane (dodatnio naładowane) formy

substratów.

Optymalnym pH w naprawie TT(HEC)TT jest 5,8, co potwierdza wcześniejsze

spostrzeżenia dotyczące zależności optimum pH, w jakim zachodzi naprawa danego

substratu od jego stałej kwasowej pKa. W tym przypadku pKa równa się 6,9, zatem

w najkorzystniejszych warunkach naprawy pod względem pH substrat jest

uprotonowany (pH jest niższe, niż jego stała kwasowa).

pKa εA wynosi 3,9, toteż jest ona całkowicie uprotonowana w pH < 3. Maksymalną

wydajność naprawy etenoadeniny przez białko AlkB obserwujemy w pH 5,0,

ponieważ w niższym pH enzym najprawdopodobniej ulega dezaktywacji.

Zebrane dane ujawniły również, że im wyższe pH, tym wymagane stężenie jonów

żelaza (II) jest niższe. Może to wynikać z faktu, że w centrum aktywnym białek

z rodziny AlkB kluczową rolę odgrywają reszty histydynowe. Uprotonowanie

histydyn znacznie osłabia ich zdolność do koordynowania dwuwartościowych jonów

żelaza sprawiając, że do prawidłowego funkcjonowania białka wymagane jest ich

wyższe stężenie.

Rozważane białka typu AlkB ze Streptomyces coelicolor (SC-1A) i z Escherichia

coli (EcAlkB) należą do grupy 1A wyróżnionej przez van den Born’a. Stąd też

78

wynika niewątpliwa funkcja tych białek w naprawie uszkodzeń DNA. Inne

z badanych przeze mnie homologów to białka z grup 1B i 2B o znacznie mniejszej

aktywności naprawczej, bądź innej specyficzności substratowej.

W moich badaniach białka XC-1B i XC-2B (ze szczepu Xanthomonas campestris)

w bardzo nieznacznym stopniu naprawiają analizowane substraty. Białka z grupy 2B

naprawiają etenoaddukty, ale bez znaczenia są dla nich metylowane uszkodzenia

zasad (van den Born i in., 2009). W swych doświadczeniach wskazuje on jakoby

większość białek z grupy 1B, jak również kilka z grupy 2B, wykazywały naprawy

podobne do EcAlkB i tak np. białko XC-2B z wysoką wydajnością naprawia εA.

Jednak zarówno XC-1B jak i XC-2B nie naprawiały badanych w tej pracy adduktów

– być może przyczyną jest inna specyficzność substratowa?

Niewykluczone jest jednak także, że preparaty białka używane w pracy nie miały

wysokiej aktywności. Jednakże były to te same preparaty, których w swoich

badaniach używała mgr Anna Domańska – były aktywne (zobacz dalej).

Przeprowadzone doświadczenia, mające na celu zbadanie optymalnych warunków

dla aktywności homologów białka AlkB (SC-1A, SC-2B, XC-1B, XC-2B) wobec

TT(HPC)TT, TT(HEC)TT, TT(εA)TT i TT(εC)TT, polegały na prowadzeniu reakcji

oczyszczonego białka z modyfikowanym substratem przy różnych stężeniach Fe(II)

i α-ketoglutaranu oraz w różnych pH reakcji. Zespół Essigmanna wykazał, że reakcja

ta polega na usunięciu mostka etenowego przez AlkB poprzez epoksydację wiązania

podwójnego i ostateczne uwolnienie go w postaci glioksalu (Delaney JC i in., 2005).

Ten sam mechanizm potwierdzono dla εA (Mishina Y i in., 2005). Wyniki mojej

pracy wykazały, że do uzyskania pełnej aktywności enzymu przy naprawie

TT(HPC)TT potrzeba 50 μM Fe(II) i 10 μM αKG, a reakcja powinna przebiegać

w pH około 7,4. van den Born badał warunki reakcji białka AlkB względem

3-metylocytozyny. Wobec tego uszkodzenia białka SC-2B i XC-2B wykazywały

słabą aktywność lub jej brak (van den Born i in., 2009). Z tego też powodu

modyfikacja 3meC jak i εG (nie naprawiana przez AlkB E. coli) nie były przeze

mnie badane. Z kolei białko hABH1, jak donoszą badania z ostatnich lat, jest

dioksygenazą mitochondrialną mającą zdolność naprawy 3-metylocytozyny

w ssDNA oraz RNA (Westbye MP i in., 2008). Natomiast od swojego bakteryjnego

homologa białka hABH2, hABH3, hABH1 odróżnia jedynie słaba aktywność wobec

εA (Duncan T i in., 2002). Jeśli chodzi o drugi z metylowanych uszkodzeń zasad

DNA – 1meA – van den Born i wsp. wykryli aktywność naprawczą w przypadku

79

EcAlkB, MT-2B i XC-1B. Według Falnesa uszkodzenie to jest najwydajniej

naprawiane w pH 8 przy 3 μM Fe(II) i 10 μM α-ketoglutaranu (Falnes PØ i in.,

2002). Aminokwasem centrum aktywnego białka AlkB, który oddziałuje z

uszkodzoną zasadą DNA jest naładowana ujemnie Arg161 (Yu B i in., 2006). Aby

enzym mógł wydajnie naprawiać uszkodzenia, zmodyfikowana zasada musi być

odpowiednio uprotonowana. Stała jonizacji pKa 3meC wynosi około 9, dlatego

uzyskuje ona całkowity ładunek dodatni w pH 8 i może być wtedy wydajnie

naprawiana przez białko AlkB.

Chciałabym zatrzymać się przez chwilę nad czwartym z analizowanych substratów -

TT(εC)TT będącym produktem dehydratacji TT(HEC)TT. Otóż

w przeprowadzonych doświadczeniach z udziałem białka SC-1A substrat ten nie był

naprawiany. Nie chcę umniejszać roli TT(εC)TT jako substratu dla homologów

EcAlkB, gdyż analizując naprawy uszkodzeń przez drugie z białek Streptomyces

coelicolor, SC-2B, dało się zaobserwować prawie 9% naprawę tego uszkodzenia

w pH 5,0 (Wykres 12). Enzym SC-2B, choć mało aktywny, może stanowić

(wg mnie) pewnego rodzaju uzupełnienie w aktywności SC-1A. Podobna sytuacja

przedstawia się w odniesieniu do białek wyizolowanych z Xanthomonas campestris,

XC-1B i XC-2B. Obydwa enzymy zastosowane w ilości 50pm z taką samą

wydajnością (5,6%) naprawiają TT(εC)TT (Wykres 16 i 17).

Mgr A. Domańska wykazała wysokie aktywności naprawcze enzymów XC-1B

i XC-2B, mniej aktywne wg niej były SA-1A, SC-1A, SC-2B. Dioksygenazy SC-1A,

SA-2B i SC-2B najbardziej efektywnie naprawiały ε-guaninę (ok. 70%

naprawionych oligodeoksynukleotydów w dsDNA, przy najwyższym stężeniu

białka), w około 20% eliminowały z DNA ε-adeninę, natomiast najmniej wydajnie

usuwały ε-cytozynę (około 10-15% naprawa). W swych badaniach wykazała

również, że efektywność naprawy etenoadduktów przez białko SA-1A jest dużo

niższa niż przez SC-1A, SC-2B i SA-2B. Białko SA-1A z podobnie niską

wydajnością naprawiało εA i εG (około 35%), zaś jedynie minimalnie εC (około

7,5%).

W moich doświadczeniach sytuacja przedstawiała się nieco inaczej. To białka

XC-1B i XC-2B i SC-2B charakteryzowały się nieznaczną naprawą w warunkach

optymalnych dla naprawy innych homologów, zaś białko SC-1A wykazywało jedne

z najwyższych wartości napraw spośród analizowanych przeze mnie białek (około

70% naprawy THPC, zobacz wykres 11). Ustalone przeze mnie optymalne warunki

80

dla naprawy egzocyklicznych modyfikacji zasad przez białko SC-1A nie jest

równoznaczne z wykazywaniem naprawy (w tych samych warunkach reakcji) przez

białko SC-2B. Wynikać z tego może, że białko SC-2B pełni inną funkcję w komórce

bakteryjnej. SC-1A widocznie jest na tyle szybko (poprzez obniżanie energii

aktywacji) i skutecznie działającym enzymem, że bakteria Streptomyces coelicolor

nie wymaga obecności drugiego białka pełniącego taką rolę w komórce. Jaka zatem

jest funkcja białka SC-2B? Pytanie to pozostaje nadal otwarte.

Porównując wyniki mgr Domańskiej z moimi, należy wziąć pod uwagę wszystkie

aspekty. Trzeba więc m.in. zauważyć fakt stosowania przez nas odmiennych metod.

Mgr Domańska po przeprowadzeniu reakcji badanego oligomeru z białkiem typu

AlkB, używała kolejnego enzymu - glikozylazy ze szlaku BER, który usuwał

nienaprawione wcześniej uszkodzenia pozostawiając miejsce

apurunowe/apirymidynowe (AP). Używała MUG (dotyczy εC i εG), HAP-1, ANPG

(dotyczy εA). O naprawie etenoadduktów wnioskowała na podstawie wystąpienia

lub braku fragmentacji nici DNA, obserwowanych po rozdziale w żelu

poliakrylamidowym. Fragmentacja wynikała z pęknięć nici w miejscu AP, a więc

świadczyła o braku naprawy. Obserwowała działanie enzymów w dsDNA i ssDNA

(w większości przypadków pożądane efekty osiągane były jedynie przy naprawie εG

w dsDNA), ja natomiast stosując dużo krótsze odcinki DNA tj. pentametry,

wykorzystałam technikę HPLC. Korzystałyśmy także z innych substratów (oprócz

tych samych 1,N6-εA i 3,N

4-εC) – Ona używała 1,N

2-εG, a ja THEC i THPC. Jeśli

chodzi o warunki to reakcje prowadziła w innym pH i w innej temperaturze, a także

ilości używanych białek były u Niej znacznie większe; do tego stopnia, że nadmiar

enzymu doprowadzał do zahamowania procesu naprawy. W moich badaniach enzym

miał spełniać rolę katalizatora i wykazać naprawę egzocyklicznych uszkodzeń zasad

DNA.

Zarówno Streptomyces coelicolor jak i Mycobacterium tuberculosis należą do

promieniowców, choć prowadzą odmienny tryb życia (Bentley SD i in., 2002).

Badania nad białkami SA-1A (ze szczepu Streptomyces avermitilis) i MT-2B

(ze szczepu Mycobacterium tuberculosis) przeprowadzone przez Beatę Krowisz,

wykazały naprawę tylko w przypadku SA-1A (praca magisterska w przygotowaniu).

Badane dioksygenazy naprawiają DNA z większą lub mniejszą wydajnością,

a różnice w efektywności naprawy są czasami bardzo znaczne. Wskazuje to na różne

81

preferencje substratowe badanych białek. Enzymy wykazujące niską aktywność

naprawczą być może pełnią w komórce inne funkcje, np. modyfikacji RNA. Niektóre

organizmy bakteryjne posiadają tylko jedno białko typu AlkB (np. E. coli), zaś inne,

jak Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor czy Xanthomonas campestris

posiadają przynajmniej po dwa; odpowiednio: SA-1A i SA-2B, SC-1A i SC-2B oraz

XC-1B i XC-2B. Nie jest więc wykluczone, że również u różnych gatunków bakterii

nastąpiło częściowe rozdzielnie funkcji naprawy DNA i modyfikacji RNA przez

białka z rodziny AlkB. Istnieją rozmaite koncepcje wyjaśniające ten problem. Aas

i wsp., 2003 na przykład stwierdzili, iż EcAlkB preferencyjnie naprawia DNA,

podczas gdy ludzki homolog AlkB hABH3 oddziałuje z taką samą wydajnością

z DNA, jak i z RNA, co może wskazywać na większe znaczenie naprawy bardziej

stabilnego eukariotycznego mRNA w porównaniu do naprawy prokariotycznego

mRNA. Z drugiej jednak strony wiele tRNA i rRNA dla prawidłowego

funkcjonowania wymaga obecności 1-meA oraz 3-meC.

Pomimo różnic w specyficzności substratowej oraz wydajności naprawy in vitro,

w komórkach bakterii wszystkie badane białka mogą pełnić funkcje naprawy DNA.

82

Aneks

Wyniki uzyskane w tej pracy będą prezentowane w postaci plakatu na konferencji

Europejskiego Towarzystwa Mutagenów Środowiskowych

40th annual meeting of The European Environmental Mutagen Society

(EEMS), September 15-18 2010, Oslo

NEW SUBSTRATES FOR ALKB DIOXYGENASE FROM ESCHERICHIA

COLI AND OTHER BACTERIA

Maciejewska1, Agnieszka M; Nieminuszczy

1, Jadwiga; van den Born

2, Edwin;

Krowisz1, Beata; Wrona

1, Joanna; Grzesiuk

1, Elżbieta; Falnes

2,3, Pål Ø and

Kuśmierek1, Jarosław T

1Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 02-106

Warsaw, 5A Pawińskiego Str, Poland

2Department of Molecular Biosciences, University of Oslo, PO Box 1041 Blindern,

0316 Oslo, Norway,

3Centre for Molecular Biology and Neuroscience, Institute of Medical Microbiology,

Oslo University Hospital and University of Oslo, N-0027 Oslo, Norway,

Name and E-mail of presenting author: Agnieszka M. Maciejewska; agniesza@ibb.waw.pl

Keywords: DNA repair; AlkB dioxygenase homologues; exocyclic adducts to DNA bases;

Conference: EEMS

The AlkB-type proteins are repair enzymes which remove alkyl lesions from bases

via an oxidative mechanism restoring native DNA structure. Recently, it was found

that they also repair DNA etheno( )-adducts. Exocyclic adducts ( -adducts among

them) can originate endogenously from reaction of lipid peroxidation products: α, β-

unsaturated- and epoxy- aldehydes with DNA bases. They are also formed upon

exposure to various industrial carcinogens: e.g., vinyl chloride metabolites,

chloroethylene epoxide and chloroacetaldehyde (CAA), or dietary and environmental

toxin acrolein (ACR). We reacted 5-mer oligodeoxynucleotides, TTXTT, where X is

C or A, with CAA, ACR, croton aldehyde or MMS, and we obtained 5-mers

83

containing modified cytosines: 3,N4-α-hydroxyethano- (HEC), 3,N

4-etheno- (εC),

3,N4-α-hydroxypropano- (HPC), 3,N

4-α-hydroxy-γ-methyl-propano- (mHPC) or

3-methyl- (3mC), respectively, or 1,N6-ethenoadenine (εA). The hydrolytic

deamination of TT(3mC)TT at pH 9.2 gave TT(3mU)TT. All prepared modified

5-mers were studied as substrates for E. coli AlkB protein. Using HPLC technique,

which allows to separate the modified from unmodified (repaired) oligomer, we have

found that with exception of mHPC, all the modifications are repaired by E. coli

AlkB dioxygenase. Appearance of repaired oligomer was also confirmed by mass

spectrometry. We observed that the repair efficiency is pH dependent and correlated

with pKa value of repaired adduct what suggests that enzyme recognizes protonated

form of substrate. The efficiency of repair decreases in the following order

3mC>εA>HPC>HEC>εC>3mU. The repair of 3mU can be observed only at a high

enzyme/substrate ratio. We have also checked the repair of HEC, εC, HPC and εA by

following bacterial AlkB homologues: Streptomyces avermitilis SA-1A and SA-2A,

Streptomyces coelicolor SC-1A and SC-2A, and Mycobacterium tuberculosis MT-2B.

All of them were known to repair 3mC. The SA-1A and SC-1A proteins repair HEC and

HPC efficiently, but εC weakly; εA is repaired by SC-1A but not by SA-1A protein.

We did not observe any repair activity of SA-2B, SC-2B and MT-2B against the

studied exocyclic adducts.

84

Literatura

Aas PA, Otterlei M, Falnes PØ, Vagbo CB, Skorpen F, Akbari M, Sundheim O,

Bjoras M, Slupphaug G, Seeberg E, Krokan HE. (2003) Human and bacterial

oxidative demethylases repair alkylation damage in both RNA and DNA, Nature

421: 859-63.

Alleviation of 1,N6-ethanoadenine genotoxicity by the Escherichia coli adaptive

Ames BN, Gold LS, Willett WC. (1995) The causes and prevention of cancer, Proc

Natl Acad Sci USA 92: 5258-65.

Aravind L, Koonin EV. (2001) The DNA-repair protein AlkB, EGL-9, and leprecan

define new families of 2-oxoglutarate- and iron-dependent dioxygenases, Genome

Biology 2(3): 0007.1-0007.8.

Barbin A, Bereziat J-C, Croisy A, O’Neil IK, Bartsch H. (1990) Chem-Biol Interact

73: 261-77.

Barbin A, Bresil H, Crossy A, Jacquingnon P, Malaveille C, Montesano R, Bartsch

H. (1975) Biochem Biophys Res Commun 67: 596-602.

Bartsch H, Nair J, Owen RW. (2002) Exocyclic DNA adducts as oxidative stress

markers in colon carcinogenesis: potential role of lipid peroxidation, dietary fat and

antioxidants, Biol Chem 383: 915-21.

Begley TJ, Samson LD. (2003) AlkB mystery solved: oxidative demethylation of

N1-methyladenine and N3-methylcytosine adducts by a direct reversal mechanism,

Trends Biochem Sci 28(1): 2-5.

Benamira M, Johnson K, Chaudhary A, Bruner K, Tibbetts C, Marnett LJ. (1995)

Induction of mutations by replication of malondialdehydemodified M13 DNA in

Escherichia coli: determination of the extent of DNA modification, genetic

requirements for mutagenesis, and types of mutations induced, Carcinogenesis 16:

93-9.

Bentley SD, Chater KF, Cerdeño-Tárraga A-M, Challis GL, Thomson NR, James

KD, Harris DE, Quail MA, Kieser H, Harper D, Bateman A, Brown S, Chandra G,

Chen CW, Collins M, Cronin A, Fraser A, Goble A, Hidalgo J, Hornsby T, Howarth

S, Huang C-H, Kieser T, Larke L, Murphy L, Oliver K, O'Neil S, Rabbinowitsch E,

Rajandream M-A, Rutherford K, Rutter S, Seeger K, Saunders D, Sharp S, Squares

R, Squares S, Taylor K, Warren T, Wietzorrek A, Woodward J, Barrell BG, Parkhill

85

J, Hopwood DA. (2002) Complete genome sequence of the model actinomycete

Streptomyces coelicolor A3(2), Nature 417, 141-147.

Beranek DT. (1990) Distribution of methyl and ethyl adducts following alkylation

with monofunctional alkylating agents, Mutat Res 231: 11-30.

Blair IA. (2001) Lipid hydroperoxide-mediated DNA damage, Exp Gerontol 36:

1473-81.

Borys-Brzywczy E, Arczewska KD, Saparbaev M, Hardeland U, Schär P,

Kuśmierek JT. (2005) Mismach dependent uracil/thymine-DNA glycosylases excise

exocyclic hydroxyethano and hydroxypropano cytosine adducts, Acta Biochim Pol

52: 149-65.

Burcham PC. (1998) Genotoxic lipid peroxidation products: their DNA damaging

properties and role in formation of endogenous DNA adducts, Mutagenesis 13: 287-

305.

Chen BJ, Carroll P, Samson L. (1994) The Escherichia coli AlkB protein protects

human cells against alkylation-induced toxicity, J Bacteriol 176: 6255-61.

Costa RMA, Chigancas V, daSilva-Galhardo R, Carvalho H, Menck FM. (2003) The

eukaryotic nucleotide excision repair pathway, Biochimie 85: 1083-99.

Delaney JC, Smeester L, Wong C, Frick LE, Taghizadeh K, Wishnok JS, Drennan

CL, Samson LD, Essigmann JM. (2005) AlkB reverses etheno DNA lesions caused

by lipid oxidation in vitro and in vivo, Nat Struct Mol Biol 12: 855-60.

Dotan Y, Lichtenberg D, Pinchuk I. (2004) Lipid peroxidation cannot be used as a

universal criterion of oxidative stress, Prog Lipid Res 43: 200-27.

Douki T, Odin F, Caillat S, Favier A, Cader J. (2004) Predominance of the 1,N2-

propano-2’-deoksyguanosine adduct among 4-hydroxy-2-nonenal induced DNA-

lesions, Free Radic Biol Med 37: 62-70.

Drablos F, Feyzi E, Aas PA, Vaagbo CB, Kavli B, Bratlie MS, Pena-Diaz J, Otterlei

M, Slupphaug G, Krokan HE. (2004) Alkylation damage in DNA and RNA – repair

mechanisms and medical significance, DNA Repair (Amst) 3: 1389-407.

Duncan T, Trewick SC, Koivisto P, Bates PA, Lindahl T, Sedgwick B. (2002)

Reversal of DNA alkylation damage by two human dioxygenases, Proc Natl Acad

Sci USA 99: 16660-5.

Eckl P, Esterbauer H. (1989) Genotoxic effects of 4-hydroxynonenals, Adv Biosci

76: 141-57.

86

Esterbauer H, Eckl P, Ortner A. (1990) Possible mutagens derived from lipids and

lipid precursors, Mutat Res Rev Genet Toxicol 238: 223-33.

Falnes PØ, Bjoras M, Aas PA, Sundheim O, Seeberg E. (2004) Substrate

specificities of bacterial and human AlkB proteins, Nucleic Acids Res 32: 3456–61.

Falnes PØ, Johansen RF, Seeberg E. (2002) AlkB-mediated oxidative demethylation

reverses DNA damage in Escherichia coli, Nature 419: 178-82.

Falnes PØ, Rognes T. (2003) DNA repair by bacterial AlkB proteins, Res Microbiol

154(8): 531-8.

Falnes PØ, van den Born E, Meza TJ. (2009) Demethylation of DNA and RNA by

AlkB Proteins. In Grosjean H (ed.), DNA and RNA Modification Enzymes:

Structure, Mechanism, Function and Evolutio, Landes Bioscience, Austin, USA.

Frick LE, Delaney JC, Wong C, Drennan CL and Essigmann JM. (2007) Alleviation

of 1,N6-ethanoadenine genotoxicity by the Escherichia coli adaptive response

protein AlkB, Proc Natl Acad Sci USA 104(3): 755-60.

Gerken T, Girard CA, Tung YC, Webby CJ, Saudek V, Hewitson KS, Yeo GS,

McDonough MA, Cunliffe S, McNeill LA, Galvanovskis J, Rorsman P, Robins P,

Prieur X, Coll AP, Ma M, Jovanovic Z, Farooqi IS, Sedgwick B, Barroso I, Lindahl

T, Ponting CP, Ashcroft FM, O’Rahilly S, Schofield CJ. (2007) The obesity-

associated FTO gene encodes a 2-oxoglutarate-dependent nucleic acid demethylase,

Science 318: 1469-72.

Golding BT, Slaich PK, Kennedy G, Bleasdale C, Waston WP. (1996) Mechanisms

of formation of adducts from reactions of glycidaldehyde with 2’-deoxyguanosise

and/or guanosine, Chem Res Toxicol 9: 147-57.

Gothe R, Callerman CJ, Ehrenberg L, Wachmeister CA. (1974) Ambio 3: 234-6.

Gros L, Ishchenko AA, Saparbaev M. (2003) Enzymology of repair of etheno-

adducts, Mutat Res 531: 219-29.

Hemminki K, Dipple A, Shuker DEG, Kadlubar FF, Segerbäck D, Bartsch H.

(1994) DNA adducts: identification and biological significance, IARC Sci Publ 125:

1-478.

http://e-biotechnologia.pl/index.php?module=Strony&func=display&pageid=4

http://www.jic.ac.uk/science/molmicro/Strept.html

http://www.nature.com/nature/journal/v439/n7078/fig_tab/nature04561_F1.html

Ishchenko AA, Saparbaev MK. (2002) Alternative nucleotide incision repair

pathway for oxidative DNA damage, Nature 415: 183-7.

87

Kaczmarska Z. (2008) Rola białka AlkB w naprawie etenoadduktów cytozyny,

Praca licencjacka

Kaczmarska Z. (2009) Nowe substraty dioksygenazy AlkB z Escherichia coli,

Praca magisterska

Kataoka H, Yamamoto Y, Sekiguchi M. (1983) A new gene (alkB) of Escherichia

coli that controls sensitivity to methyl methane sulfonate, J Bacteriol 153: 1301-7.

Kochetkov NK, Shibaev VN, Kost AA. (1971) New reaction of adenine and

cytosine derivatives potentially useful for nucleic acid modification, Tetrahedron

Lett 22: 1993-6.

Konishi N, Nakamura M, Ishida E, Shimada K, Mitsui E, Yoshikawa R, Yamamoto

H, Tsujikawa K. (2005) High expression of a new marker PCA-1 in human prostate

carcinoma, Clin Cancer Res 11: 5090-7.

Kowalczyk P, Cieśla JM, Komisarski M, Kuśmierek JT, Tudek B. (2004) Long-

chain adducts of trans-4-hydroxy-2-nonenal to DNA bases causa recombination, base

substitutions and frameshift mutations in M13 phage, Mutation Research 550: 33-48.

Kurowski MA, Bhagwat AS, Papaj G, Bujnicki JM. (2003) Phylogenomic

identification of five new human homologs of the DNA repair enzyme AlkB, BMC

Genomics 4, 48.

Kuśmierek JT, Singer B. (1982) Chloroacetaldehyde-treated ribo- and

deoxyribopolynucleotides. 1. Reaction products, Biochemistry 21: 5717-22.

Lau AY, Wyatt MD, Glassner BJ, Samson LD, Ellenberger T. (2000) Molecular

basis for discriminating between normal and damaged bases by the human

alkyladenine glycosylase, AAG, Proc Natl Acad Sci USA 97(25):13573-8.

Lutz WK. (1990) Endogenous genotoxic agents and processes as a basis of

spontaneous carcinogenesis, Mutat Res 238: 287-95.

Maciejewska AM, Ruszel KP, Nieminuszczy J, Lewicka J, Sokołowska B, Grzesiuk

E, Kuśmierek JT. (2010) Chloroacetaldehyde-induced mutagenesis in Escherichia

coli: The role of AlkB protein in repair of 3,N4-ethenocytosine and 3,N

4-α-

hydroxyethanocytosine, Mutation Research 684: 24-34.

Madigan MT, Martinko JM, Parker J. (2003) Brock Biology of Microorganisms,

Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ

Matulewicz Ł, Przybyszewski WM. (2004) Wpływ lipidów na aktywność

polimeraz DNA, Post Biol Kom 31: 277-84.

88

Mishina Y, He C. (2006) Oxidative dealkylation DNA repair mediated by the

mononuclear non-heme iron AlkB proteins, J Inorg Biochem 100: 670-8.

Mishina Y, Yang C-G, He C. (2005) Direct repair of the exocyclic DNA adduct

1,N6-ethenoadenine by the DNA repair AlkB proteins, J Am Chem Soc 127(42):

14594–5.

Moriya M, Zhang W, Johnson F, Grollman AP. (1994) Mutagenic potency of

exocyclic DNA adducts: marked differences between Escherichia coli and simian

kidney cells, Proc Natl Acad Sci USA 91: 11899-903.

Mroczkowska-Słupska MM, Kuśmierek JT. (1994) Molekularne podstawy

mutagennego działania chlorku winylu, Post Bioch 40(1): 31-39.

Nair V, Offerman RJ. (1985) Ring-extended products from the reaction of epoxy

carbonyl compounds and nucleic acid bases, J Org Chem 50: 5627-31.

Nieminuszczy J, Grzesiuk E. (2007) Bacterial DNA repair genes and their

eukaryotic homologues: 3. AlkB dioxygenase and Ada methyltransferase in the

direct repair of alkylated DNA Acta Biochim Pol 54(3): 459-68.

Oesch F, Adler S, Rettelbach R, Doerjer G. (1986) Repair of etheno DNA adducts

by N-glycosylases, IARC Sci Publ 373-9.

Oliński R, Jurgowiak M. (1999) Oksydacyjne uszkodzenia DNA (8-oksodG) –

biomarkerem niektórych chorób człowieka, Kosmos 48(3): 329-38.

Osterman – Golkar S, Hultmark D, Segerback D, Calleman CJ, Gothe R, Ehrenberg

L, Wachtemeister CA. (1977) Biochem Biophys Res Commun 76: 259-266.

Ougland R, Zhahg CM, Liiv A, Johansen RF, Seeberg E, Hou YM, Remme J,

Falnes PØ. (2004) AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA

inactivated by chemical methylation, Mol Cell 16: 107–16.

Pierzynowska J, Grzesiuk E. (1999) Mutagenność i kancerogenność aflatoksyny

AFB1, Post Bioch 45(4): 313-319.

Plant N. (2003) Molecular Toxicology, BIOS Scientific, London; New York, 15-16.

Pluskota-Karwatka D. (2008) Modifications of nucleosides by endogenous

mutagens-DNA adducts arising from cellular processes, Bioorganic Chemistry 36:

198-213.

Porter NA. (1986) Mechanisms for the autoxidation of polyunsaturated lipids, Acc

Chem Res 19: 262-8.

Prescott AG, Lloyd MD. (2000) The iron (II) and 2-oxoacid-dependent

dioxygenases and their role in metabolism, Nat Prod Rep 17: 367-83.

89

Przybyszewski WM, Kasperczyk J, Stokłosa K, Bkhiyan A. (2005) Uszkodzenia

DNA powodowane przez produkty peroksydacji lipidów, Post Higieny i Med

Doświadczalnej 59: 75-81.

Ringvoll J, Nordstrand LM, Vagbo CB, Talstad V, Reite K, Aas PA, Lauritzen KH,

Liabakk NB, Bjork A, Doughty RW, Falnes PØ, Krokan HE, Klungland A. (2006)

Repair deficient mice reveal mABH2 as the primary oxidative demethylase for

repairing 1meA and 3meC lesions in DNA, EMBO J 25: 2189-98.

Różalski A. (1998) Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Skrypt dla studentów

biologii, część I – teoretyczna, Wyd. II, Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego,

Łódź, 135-39.

Rydberg B, Lindahl T. (1982) Nonenzymatic methylation of DNA by the

intracellular methyl group donor S-adenosyl-l-methionine is a potentially mutagenic

reaction, EMBO J 1: 211-6.

Ryle MJ, Hausinger RP. (2002) Non-heme iron oxygenases, Curr Opin Chem Biol

6: 193-201.

Saparbaev M, Kleibl K, Laval J. (1995) Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae,

rat and human 3-methyladenine DNA glycosylases repair 1,N6-ethenoadenine when

present in DNA, Nucl Acids Res 23: 3750-5.

Schofield CJ, Zhang Z. (1999) Structural and mechanistic studies on 2-oxoglutarate-

dependent oxygenases and related enzymes, Curr Opin Struct Biol 9: 722-31.

Sedgwick B, Bates PA, Paik J, Jacobs SC, Lindahl T. (2007) Repair of alkylated

DNA: Recent advances, DNA Repair (Amst) 6: 429-42.

Sedgwick B, Lindahl T. (2002) Recent progress on the Ada response for inducible

repair of DNA alkylation damage, Oncogene 21: 8886-94 .

Seńczuk W. (2002) Toksykologia. Podręcznik dla studentów, lekarzy i farmaceutów,

Wyd. IV, PZWL, Warszawa, 671-2, 708-10.

Singer B, Antoccia A, Basu AK, Dosanjh MK, Fraenkel-Conrat H, Gallagher PE,

Kuśmierek JT, Qiu ZH, Rydberg B. (1992) Both purified human

1,N6-ethenoadenine-binding protein and purified human 3-methyladenine-DNA

glycosylase act on 1,N6-ethenoadenine and 3-methyladenine, Proc Natl Acad Sci

USA 89: 9386-90.

Smart RC, Hodgson E. (2008) Molecular and Biochemical Toxicology, Fourth

Edition, John Wiley & Sons, cop., Hoboken, 246, 466-467.

90

Sodum RS, Chung FL. (1989) Structural characterization of adducts formed in the

reaction of 2,3-epoxy-4-hydroxynonanal with deoxyguanosine, Chem Res Toxicol 2:

23-8.

Sodum RS, Chung FL. (1991) Stereoselective formation of in vitro nucleic acid

adducts by 2,3-epoxy-4-hydroxynonanal, Cancer Res 51(1): 137-43.

Spengler SJ, Singer B. (1988) Formation of interstrand cross-links in

chloroacetaldehyde-treated DNA demonstrated by ethidium bromide fluorescence.

Cancer Res 48(17): 4804-6.

Sundheim O, Talstad VA, Vagbo CB, Slupphaug G, Krokan HE. (2008) AlkB

demethylases flip out in different ways, DNA Repair 7(11): 1916-23.

Śliwiński T, Błasiak J. (2005) Naprawa DNA przez wycinanie zasad, Post Bioch

51(2): 120-8.

Trewick SC, Henshaw TF, Hausinger RP, Lindahl T, Sedgwick B. (2002) Oxidative

demethylation by Escherichia coli AlkB directly reverts DNA base damage, Nature

419: 174-7.

van den Born E, Bekkelund A, Moen MN, Omelchenko MV, Klungland A, Falnes

PØ. (2009) Bioinformatics and functional analysis define four distinct groups of

AlkB DNA-dioxygenases in bacteria, Nuc Acid Res 37: 7124-36.

Wallace SS. (1994) DNA damages processed by base excision repair: biological

consequences, Int J Radiat Biol 66: 579-89.

Westbye MP, Feyzi E, Aas PA, Vågbø CB. (2008) Human AlkB homolog 1 is a

mitochondrial protein that demethylates 3-methylcytosine in DNA and RNA,

Department of Cancer Research and Molecular Medicine, Norwegian University of

Science and Technology, N-7489 Trondheim, Norway

Yang CG, Yi C, Duguid EM, Sullivan CT, Jian X, Rice PA, He C. (2008) Crystal

structures of DNA/RNA repair enzymes AlkB and ABH2 bound to dsDNA, Nature

452: 961–65.

Yu B, Edstrom WC, Benach J, Hamuro Y, Weber PC, Gibney BR, Hunt JF. (2006)

Crystal structures of catalytic complexes of the oxidative DNA/RNA repair enzyme

AlkB, Nature 439: 879-84.

91

Spis rysunków

Rysunek 1. Struktura dimeru tyminowego

Rysunek 2. Struktura fotoproduktu pirymidyno (6-4) pirymidynowego

Rysunek 3. Struktura trwałego adduktu aflatoksyny B1

Rysunek 4. Wybrane uszkodzenia oksydacyjne

Rysunek 5. Przykłady uszkodzeń alkilacyjnych

Rysunek 6. Wzór hydroksypropanocytozyny

Rysunek 7. Struktura adduktu HNE do guanozyny

Rysunek 8. Wzory chemiczne etenoadduktów zasad DNA powstających pod

wpływem aldehydu chlorooctowego (CAA)

Rysunek 9. Dehydratacja 3,N4-(N

4–α-hydroksyetano)cytozyny (3,N

4εC · H2O)

Rysunek 10. Struktura krystaliczna kompleksu białka AlkB E. coli z Fe(II), 2OG

i metylowanym trójnukleotydem

Rysunek 11. Rozdział analityczny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT akroleiną

Rysunek 12. Kontrola – mieszanina reakcyjna wraz z substratem TTCTT

Rysunek 13. Rozdział preparatywny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT

akroleiną

Rysunek 14. Rozdział reakcji modyfikacji pentameru TTCTT aldehydem

chlorooctowym

Rysunek 15. Rozdział preparatywny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT

aldehydem chlorooctowym

Rysunek 16. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru

TT(εA)TT przez białko SC-1A

Rysunek 17. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru

TT(HEC)TT przez białko SC-1A

Rysunek 18. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru

TT(εA)TT przez białko SC-1A

Rysunek 19. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru

TT(HEC)TT przez białko SC-1A

Rysunek 20. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru

TT(HPC)TT przez białko SC-1A

Spis schematów

Schemat 1. Wpływ promieniowania jonizującego na funkcjonowanie komórek

Schemat 2. Aktywacja metaboliczna chlorku winylu

92

Schemat 3. Powstawanie propano- i etenoadduktów pod wpływem produktów

peroksydacji lipidów

Schemat 4. Mechanizm naprawy uszkodzeń alkilacyjnych przez białko AlkB

Schemat 5. Mechanizm naprawy etenowych uszkodzeń przez białko AlkB

Spis tabel

Tabela 1. Rozmiary homologów białka AlkB wybranych (badanych) gatunków

bakterii

Tabela 2. Zależność optymalnych warunków naprawy poszczególnych substratów

od ich pKa

Tabela 3. Naprawa badanych uszkodzeń przez białko SC-1A

Tabela 4. Optymalne warunki naprawy białka SC-1A

Spis wykresów

Wykres 1. Sprawdzenie aktywności białka SC-1A

Wykres 2. Sprawdzenie aktywności białka SC-1A trzy miesiące później

Wykres 3. Zależność naprawy TT(εA)TT od pH (białko SC-1A)

Wykres 4. Zależność naprawy TT(HEC)TT od pH (białko SC-1A)

Wykres 5. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH (białko SC-1A)

Wykres 6. Zależność naprawy TT(εA)TT od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A)

Wykres 7. Zależność naprawy TT(HEC)TT od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A)

Wykres 8. Zależność naprawy TT(HEC)TT od stężenia jonów Fe(II) (EcAlkB)

Wykres 9. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH i od stężenia jonów Fe(II)

(EcAlkB)

Wykres 10. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH i od stężenia jonów Fe(II)

(białko SC-1A)

Wykres 11. Zależność naprawy TT(HEC)TT, TT(HPC)TT i TT(εA)TT od stężenia

α-ketoglutaranu (białko SC-1A)

Wykres 12. Zależność naprawy TT(εA)TT i TT(εC)TT od pH (białko SC-2B)

Wykres 13. Zależność naprawy TT(HEC)TT od pH (białko SC-2B)

93

Wykres 14. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH (białko SC-2B)

Wykres 15. Zależność naprawy TT(εA)TT od stężenia jonów Fe(II) w pH 5,6

(białko SC-2B)

Wykres 16. Aktywność białka XC-1B wobec TT(HPC)TT, TT(εA)TT i TT(εC)TT

Wykres 17. Aktywność białka XC-2B wobec TT(HPC)TT, TT(εA)TT i TT(εC)TT

Spis zdjęć

Zdjęcie 1. Kolonie Stereptomyces coelicolor

Zdjęcie 2. Żel przedstawiający rozdział frakcji zebranych podczas oczyszczania

białka SC-1A barwionego Coomasie Brilliant Blue G-250