ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI...

188
1 ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej Wydziału Farmaceutycznego ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTÓW KOSMETOLOGII STUDIA LICENCJACKIE i MAGISTERSKIE POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK Łódź 2014

Transcript of ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI...

  • 1

    ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej

    Wydziału Farmaceutycznego

    ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTÓW KOSMETOLOGII

    STUDIA LICENCJACKIE i MAGISTERSKIE

    POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK

    Łódź 2014

  • 2

    AUTORZY: Bożena Dudkiewicz Wioletta Kmieciak Anna Kwaszewska Paweł Lisiecki Maria Sobiś-Glinkowska Jadwiga Szarapińska-Kwaszewska Magdalena Szemraj Eligia M. Szewczyk

    ISBN: 978-83-64344-05-3 Wydanie drugie zmienione i poprawione

  • 3

    Część I Przedmiot: MIKROBIOLOGIA Studia licencjackie

    Rozdział 1 Morfologia drobnoustrojów………………………………………………………..…………7 Rozdział 2 Pożywki i hodowla drobnoustrojów…………………………………………….………23 Rozdział 3 Techniki posiewu bakterii na podłoża. Otrzymywanie czystych hodowli...............................................................................................33 Rozdział 4 Wymagania wzrostowe bakterii……………………………………………………..……41 Rozdział 5 Wykorzystanie cech biochemicznych bakterii do ich identyfikacji….……49 Rozdział 6 Dezynfekcja, antyseptyka, konserwacja………………………………………………59 Rozdział 7 Sterylizacja……………………………………………………………………………………….…75 Rozdział 8 Drobnoustroje bytujące na skórze………………………………………………….……83 Rozdział 9 Liczenie bakterii………………………………………………………………………………..…91 Rozdział 10 Czystość mikrobiologiczna gotowego produktu kosmetycznego……..…101

  • 4

    Część II Przedmiot: MIKROBIOLOGIA KLINICZNA Studia magisterskie

    Rozdział 1 Bakterie bytujące na skórze i błonach śluzowych………………..…….……..111 Rozdział 2 Bakterie w przewodzie pokarmowym…………………………….…….……….…127 Rozdział 3 Inne bakterie bytujące w środowisku człowieka……………………… .…… 147 Rozdział 4 Bakterie wywołujące choroby o swoistym przebiegu, trudne do hodowli lub identyfikacji…………….……………………………………….…….155 Rozdział 5 Mikologia ……………………………………………………………………….…….………..165 Rozdział 6 Podstawy wiedzy o antybiotykach i antybiotykoterapii …………….… …177

  • 5

    CZĘŚĆ I

    PRZEDMIOT: MIKROBIOLOGIA

    STUDIA LICENCJACKIE

  • 6

  • 7

    Rozdział 1

    Morfologia drobnoustrojów Cześć teoretyczna Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne Do mikroorganizmów (drobnoustrojów), którymi zajmuje się mikrobiologia zaliczamy wirusy, bakterie, archeony, grzyby (bez kapeluszowych), niektóre glony i pierwotniaki. Organizmy te różnią się przynależnością taksonomiczną. Bakterie należą do domeny Bacteria, archeony do domeny Archaea, a grzyby, glony i pierwotniaki do domeny Eukarya. W zależności od budowy mikroorganizmy dzielimy na: prokariotyczne i eukariotyczne. Do organizmów prokariotycznych zaliczamy - bakterie i archeony, a do eukariotycznych - grzyby, glony i pierwotniaki. Te dwie grupy organizmów prezentują dwa odmienne typy budowy komórki. Wirusy nie mogą być zaliczone do żadnej z wymienionych grup, gdyż nie mają struktury ani organizacji komórkowej. Bakterie są mikroorganizmami. Jednak nie wszystkie mikroorganizmy są bakteriami. Choroby u ludzi wywołują zarówno drobnoustroje prokariotyczne (bakterie), jak i eukariotyczne (grzyby i pierwotniaki). Organizmy eukariotyczne mogą być zbudowane z jednej lub wielu komórek. Wszystkie drobnoustroje prokariotyczne są organizmami jednokomórkowymi. Cechą charakterystyczną ich komórek jest brak jądra otoczonego błoną jądrową i jąderka. Ich materiał genetyczny w formie nukleoidu, będącego podwójną nicią DNA styka się bezpośrednio z cytoplazmą. Nie mają one również dobrze wykształconych organelli komórkowych i systemu błon wewnętrznych, takich jak retikulum endoplazmatyczne czy aparat Golgiego. W komórkach prokariotycznych brak mitochondriów i lizosomów. Prawie wszystkie komórki prokariotyczne (poza bakteriami z rodziny Mycoplasmataceae) mają ścianę komórkową, która zawiera peptydoglikan. Rybosomy prokariotów są mniejsze niż eukariotów. Wykazują mniejszą masę cząsteczkową

  • 8

    i niższą stałą sedymentacji. Podstawowe różnice w budowie komórki i replikacji materiału genetycznego pomiędzy komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi przedstawiono w tabeli 1.

    Tabela 1. Podstawowe różnice w strukturze komórek prokariotycznych i eukariotycznych.

    Cecha Komórka prokariotyczna Komórka eukariotyczna

    DNA wolny zawieszony w cytoplazmie; stanowiący jeden chromosom

    zawarty w jądrze; otoczonym błoną jądrową

    Rozmnażanie tylko bezpłciowe przez podział komórki

    podział komórek przez mitozę; rozmnażanie płciowe z wytworzeniem gamet

    Wymiana materiału genetycznego

    poprzez koniugację; transdukcję i transformację

    w czasie rozmnażania płciowego

    Rybosomy 70 S 80 S (cytoplazmatyczne), 70 S (mitochondrialne)

    Mitochondria brak obecne

    Układ błon wewnętrznych

    brak retikulum endoplazmatyczne; aparat Golgiego

    Ściana komórkowa

    zawiera peptydoglikan u grzybów zawiera chitynę mannany; glukany

    Błona cytoplazmatyczna

    brak steroli (poza mikoplazmami)

    obecne sterole

    Wielkość i kształt komórek Bakterie wykazują znaczną rozpiętość wymiarów. Wymiar większości komórek bakteryjnych wynosi od 1 do 10 µm. Rozmiar najmniejszych

  • 9

    wynosi od 0,15 do 0,2 µm, co jest na granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego. Wymiar największych wynosi od 250 do 600 µm. Przeciętna długość komórki bakteryjnej to 1-5µm, a średnica od 1-2 µm. Komórki bakterii mogą przybierać różne kształty. Bakterie kuliste, nazywane także ziarenkowcami, mogą być ułożone pojedynczo lub tworzyć charakterystyczne układy komórek. Powstanie układów związane jest z płaszczyzną i liczbą podziałów komórek w trakcie rozmnażania oraz brakiem ich rozdziałów po podziale. Wśród bakterii kulistych wyróżniamy następujące układy popodziałowe:

    dwoinki – komórki po podziale pozostają po dwie,

    ziarniaki czworacze (Tetracocus) – komórki dzielą się w dwóch płaszczyznach,

    pakietowce (Sarcina) – komórki dzielą się w trzech płaszczyznach do siebie prostopadłych tworząc sześcianki,

    paciorkowce (Streptococcus) – komórki układają się w krótsze lub dłuższe łańcuszki,

    gronkowce (Staphylococcus) – komórki mogą się dzielić w dwóch lub trzech płaszczyznach, tworząc skupiska przypominające kiście winogron. Do bakterii cylindrycznych zaliczamy: pałeczki (Bacterium), laseczki (Bacillus), maczugowce (Corynebacterium), prątki (Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Niektóre formy bakterii cylindrycznych mogą także tworzyć charakterystyczne układy przestrzenne: dwoinki, łańcuszki, palisady, ugrupowania w kształcie liter V, X, Y. Do bakterii spiralnych zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato zagiętą komórką, śrubowce (Spirillum), które tworzą pełną spiralę, krętki (Borrelia, Treponema, Leptospira), różniące się między sobą liczbą skrętów, grubością komórki i wyglądem jej biegunów. Niektóre gatunki bakterii wskazują tendencję do różnorodności morfologicznej i wielokształtności komórek. Ich komórki mogą różnić się wielkością i kształtem. Obok form kulistych mogą występować formy cylindryczne i odwrotnie. Zjawisko to nazywamy polimorfizmem. Komórki grzybów są większe od komórek bakteryjnych (2-40 μm). Wielkość komórek drożdży i grzybów drożdżopodobnych waha się zależnie

  • 10

    od gatunku i warunków hodowli, od 2-8 µm średnicy i od 1-8 µm długości. Komórki drożdży mogą mieć kształt: kulisty, elipsoidalny, jajowaty, mniej lub bardziej wydłużony. Kształt ich komórek nie może być uważany za element diagnostyczny, ponieważ zależy od wieku komórki i warunków hodowli. Drożdże mogą tworzyć skupiska w postaci łańcuszków powstałych poprzez podział komórek (pączkowanie). Komórki grzybów pleśniowych (nitkowatych) tworzą strzępki. W mikroskopie widoczne są one jako nitkowate, cylindryczne twory, proste lub rozgałęzione. U niektórych gatunków pleśni strzępki są jednokomórkowe, u innych zaś powstają w ich wnętrzu poprzeczne porowate przegrody, dzielące je na szereg komórek. Średnica strzępki waha się od 1 do 1,5 μm. Strzępki mogą być różnej długość, zarówno krótkie, jak i dochodzące do kilku metrów.

    Struktury anatomiczne komórki bakteryjnej Strukturami anatomicznymi występującymi w każdej komórce bakteryjnej są: nukleoid, rybosomy, cytoplazma i błona (membrana) cytoplazmatyczna. Większość bakterii ma ścianę komórkową. Strukturami anatomicznymi spotykanymi u niektórych tylko bakterii są: plazmidy, rzęski, fimbrie, otoczka, glikokaliks, mogą także tworzyć przetrwalniki (endospory), gromadzić w cytoplazmie materiały zapasowe. Liczne bakterie potrafią żyć w formie osiadłych zbiorowisk, które określamy jako biofilm. Nukleoid bakteryjny styka się bezpośrednio z cytoplazmą i zbudowany jest z kolistej i spiralnie skręconej podwójnej nici DNA. Nie jest otoczony błoną jądrową; tworzy pojedynczy chromosom. Nukleoid jest funkcjonalnym odpowiednikiem jądra komórek eukariotycznych. W cytoplazmie wielu komórek występują elementy informacji genetycznej poza chromosomalne zwane plazmidami. Najczęściej są to koliste cząsteczki dwuniciowego DNA, które mogą replikować samodzielnie. Wszystkie geny komórki tworzą jej genotyp. Wyznacza on pojawiające się cechy strukturalne i fizjologiczne komórki, czyli jej fenotyp.

  • 11

    Rybosomy bakterii są ośrodkami syntezy białek. W cytoplazmie komórki występują pojedynczo lub w skupiskach zwanych polirybosomami, w których powiązane są łańcuchem informacyjnego RNA (mRNA). Rybosomy zbudowane są w 60% z RNA i w 40% z białka i wykazują stałą sedymentacji 70S. Każdy rybosom składa się z dwóch podjednostek 30S i 50S. Cytoplazma to wewnętrzna zawartość komórki bakteryjnej ograniczona błoną cytoplazmatyczną. Podstawowym jej składnikiem jest woda (80%), w której rozpuszczone są białka głównie enzymatyczne, węglowodany, lipidy, sole mineralne i inne niskocząsteczkowe związki organiczne i nieorganiczne. Całość ma charakter roztworu koloidalnego. Błona cytoplazmatyczna otacza cytoplazmę i odgradza ją od otaczającego środowiska. U bakterii, które mają ścianę komórkową, styka się z nią bezpośrednio. Wykazuje ona strukturę dwuwarstwową, zbudowaną z cząsteczek lipidów, w której zanurzone są cząsteczki białek. Pod względem chemicznym w 20-35% zbudowana jest z białek i w 50-70% z lipidów – głównie fosfolipidów. Każda cząsteczka fosfolipidu zawiera część polarną zbudowaną z grupy fosforanowej i glicerolu, wykazującą hydrofilowy charakter oraz część niepolarną zbudowaną z kwasów tłuszczowych, wykazującą hydrofobowy charakter. Na zewnątrz w stronę białek ułożone są końce hydrofilowe. Fosfolipidy i białka są ruchliwe względem siebie. Taki sposób organizacji błony cytoplazmatycznej określany jest jako model płynnej mozaiki. Ściana komórkowa bakterii zawiera peptydoglikan (mureina), który styka się bezpośrednio z błoną cytoplazmatyczną. Składa się on z łańcuchów wielocukrowych, które mają charakter polimeru i zbudowane są z powtarzających się jednostek utworzonych z N-acetyloglukozaminy oraz kwasu N-acetylomuraminowego połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydo-wym. Do reszt kwasu N-acetylomuraminowego dołączone są krótkie peptydy, które poprzecznie wiążą ze sobą sąsiednie łańcuchy. Tworzy się w ten sposób charakterystyczne usieciowanie peptydoglikanu.

  • 12

    Peptydoglikanu występuje zarówno u bakterii gramdodatnich, jak i gramujemnych. Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich jest stosunkowo gruba i względnie jednorodna. Zawiera kilkadziesiąt warstw peptydoglikanu. W ich ścianie występują ponadto kwasy tejchojowe, lipotejchojowe i białka. Ściana bakterii gramujemnych jest cienka i ma budowę wielowarstwową. Jedną do trzech warstw peptydoglikanu pokrywa błona zewnętrzna - dominujący u nich element. Peptydoglikan oddzielony jest od błony zewnętrznej przestrzenią peryplazmatyczną. Błona zewnętrzna stanowi warstwę plastyczną ściany komórkowej; zbudowana jest z fosfolipidów, białek, lipoproteiny Brauna oraz lipopolisacharydu (LPS). Rzęski są elementami budowy niektórych bakterii, zwłaszcza cylindrycznych, które dzięki nim wykazują w środowisku płynnym lub półpłynnym, a nawet w cienkiej warstwie cieczy na podłożu stałym, zdolność poruszania się. Są to nitkowate wyrostki jednym końcem zaczepione w błonie cytoplazmatycznej i łączące się z cytoplazmą. Rzęski mają kształt lekko skręconej spirali i składają się z helikalnie zwiniętych cząsteczek białka zwanego flageliną. W komórkach bakterii występuje najczęściej jeden z trzech typów urzęsienia: monotrichalny – jedna rzęska na biegunie, lofotrichalny – pojedyncza rzęska lub ich pęczek na obu biegunach, perytrichalny – wiele rzęsek dookoła komórki. Ruch krętków warunkuje włókno osiowe, które składa się z pęczka włókienek przypominających budową rzęski. Wyrastają one z bieguna komórki i tworząc włókno osiowe spiralnie ją oplatają. Rzęski można oglądać w mikroskopie elektronowym lub po odpowiednim wybarwieniu w zwykłym mikroskopie świetlnym. Barwienie rzęsek jest jednak trudne i kłopotliwe. Fimbrie są włókienkowatymi powierzchniowymi strukturami niektórych komórek bakteryjnej. Spotykamy je przede wszystkim u bakterii gramujemnych. Są liczne i występują na całej powierzchni komórki. Są cieńsze i krótsze niż rzęski. Widoczne są tylko w mikroskopie elektronowym. Odmianą fimbrii są sztywne wyrostki zawierające kanał dla

  • 13

    transportu DNA w procesie koniugacji – noszą one nazwę fimbrii płciowych (pili). Jedna komórka wytworzyć może tylko jeden pilus. Przetrwalniki (endospory) tworzą tylko nieliczne bakterie. Do najważniejszych należą laseczki z rodzajów Bacillus i Clostridium. Powstają one w wyniku różnicowania się komórek wegetatywnych – jeden przetrwalnik z jednej komórki. Powstawanie przetrwalników nazywamy sporulacją. Cechą charakterystyczną przetrwalników jest stan uśpienia metabolizmu i znacznie większa niż u form wegetatywnych oporność na działanie czynników fizyko-chemicznych. Przetrwalniki zawdzięczają oporność swojej unikatowej budowie: płaszczom zewnętrznemu i wewnętrznemu, z którymi wiąże się oporność na czynniki chemiczne oraz korze, która w dużym stopniu decyduje o oporności na wysoką temperaturę. Wytworzony przetrwalnik zachowuje żywotność, czyli zdolność do kiełkowania z wytworzeniem komórki wegetatywnej przez długi czas. Przetrwalnik może mieć kształt kulisty lub owalny i być umieszczony centralnie, podbiegunowo lub biegunowo. Przetrwalnik może mieć średnicę mniejszą lub większą od wymiaru porzecznego komórki. W przypadku, gdy jest większa, powoduje zniekształcenie komórki, nadając jej charakterystyczny kształt. Przetrwalniki nie barwią się zwykłymi metodami. Można je obserwować w komórkach nie zabarwionych, jako struktury silniej załamujące światło niż reszta komórki bakteryjnej (mikroskop fazowo-kontrastowy). Można je również obserwować w preparatach barwionych np. metodą Grama. W zabarwionej komórce widać wtedy bezbarwny przetrwalnik. Ziarnistości zapasowe gromadzone w cytoplazmie niektórych bakterii, nazywamy też wtrętami cytoplazmatycznymi lub ciałami zapasowymi. Mają one charakter polimerów, które gromadzone są w komórce w czasie jej wzrostu w warunkach nadmiaru substancji odżywczych, zużywane zaś w warunkach głodu - niedoboru związków pokarmowych. Do najczęściej występujących u bakterii ciał zapasowych należy kwas poli-β-hydroksy-masłowy. Częstym materiałem zapasowym są ziarnistości polimeta-fosforanowe, które zbudowane są z nieorganicznych fosforanów. Nazywamy je także wolutyną. Bakterie mogą także gromadzić polimery glukozy – skrobię, glikogen. Bakterie siarkowe gromadzą w cytoplazmie

  • 14

    koloidalną siarkę. Niektóre ziarnistości zapasowe można wykryć w komórce stosując specjalne metody barwienia. Otoczka lub warstwa śluzowa otaczać może pojedyncze komórki lub grupy niektórych bakterii. Mogą one syntetyzować i wydzielać zewnątrzkomórkowe substancje o charakterze polimerów. Jeśli polimer tworzy zbitą warstwę, ściśle otaczającą komórkę i jest mocno z nią związany – nazywamy go otoczką. Polimer tworzący luźną warstwę, swobodnie przylegającą do powierzchni komórki, łatwo tracony i znajdowany w pożywce, w której wzrastają bakterie nazywamy śluzem. Otoczka może obejmować jedną lub dwie komórki. Warstwa śluzowa obejmuje zwykle wiele komórek bakteryjnych. Bakteryjne otoczki i śluzy najczęściej maja charakter polisacharydów. Otoczki niektórych bakterii mają strukturę polisacharydowo-peptydową lub peptydową. Polisacharydowe zewnątrzkomórkowe polimery bakteryjne niekiedy określane są jak glikokaliks. Otoczki trudno się wybarwiają. Można je obserwować w zwykłym mikroskopie świetlnym w preparatach zabarwionych metodą pozytywno-negatywną. Zewnątrzkomórkowy śluz umożliwia bakteriom wspólne bytowanie w naturze, tworzą dzięki niemu biofilm. Jest to zespół wzajemnie komunikujących się komórek osiadłych na określonym podłożu, przylegających do siebie i osłoniętych zewnątrzkomórkowymi polisacharydami. Bakterie mogą tworzyć biofilm w organizmie człowieka na powierzchni błon śluzowych układu oddechowego, pokarmowego, moczowo-płciowego, na powierzchni implantów z metalu i polimerów oraz w środowisku - w naturalnych systemach wodnych, na skałach opłukiwanych wodą czy rurach kanalizacyjnych. Przekształcenie formy bytowania bakterii ze swobodnie żyjących do związanych z biofilmem daje im wiele korzyści, ale stwarza wiele problemów człowiekowi. Jednym z najważniejszych jest większa oporność bakterii w biofilmie, w porównaniu z komórkami z nim nie związanymi, na antybiotyki, chemioterapeutyki i środki dezynfekcyjne. Stwarza to ogromne problemy w leczeniu zakażeń wywoływanych przez bakterie tworzące biofilm. Utrudnia to także eliminację biofilmów bakteryjnych ze środowiska szpitalnego czy linii produkcyjnych, na których wytwarzane są leki czy kosmetyki.

  • 15

    Tabela 2. Podstawowe funkcje pełnione przez struktury komórki bakteryjnej.

    Struktura komórkowa

    Pełniona funkcja

    Nukleoid zapis wszystkich potencjalnych możliwości komórki

    Rybosomy synteza białek

    Błona cytoplazmatyczna

    transport substancji pokarmowych do komórki, wydzielanie związków na zewnątrz, udział w procesach fosforylacji oksydatywnej

    Ściana komórkowa nadaje kształt komórce, chroni komórkę przed uszkodzeniami mechanicznymi i lizą osmotyczną, bariera przepuszczalności dla substancji wielkocząsteczkowych; składniki ściany mogą być induktorami odpowiedzi imunologicznej

    Otoczka ochrona przed wysychaniem, ochrona przed fagocytozą, czynnik zjadliwości; udział w adhezji bakterii do powierzchni

    Rzęski ruch

    Fimbrie udział w adhezji bakterii do powierzchni

    Fimbrie płciowe (pili)

    udział w procesie koniugacji – przekazywania materiału genetycznego z komórki do komórki

    Przetrwalniki nadają gatunkom je wytwarzającym wyjątkową oporność na działanie czynników fizyko-chemicznych

    Metody Mikroskopowanie Do obserwacji bakterii wykorzystuje się przede wszystkim mikroskop z jasnym polem widzenia, którego zdolność rozdzielcza wynosi 0,2 µm. Zdolność rozdzielcza mikroskopu jest to najmniejsza odległość między

  • 16

    dwoma punktami oglądanego obiektu, przy której widziane są one jako dwa oddzielne punkty. Preparaty trwałe barwione należy oglądać przy użyciu obiektywu immersyjnego dającego powiększenie 100 razy i okularów powiększających 5-10 razy przy maksymalnie podniesionym kondensorze. Pozwala to na osiągnięcie największego powiększenia (1000 razy), jakie możemy uzyskać w mikroskopie świetlnym. Powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia okularu i powiększenia obiektywu. Obiektyw immersyjny wymaga zastosowania olejku immersyjnego, w którym należy zanurzyć soczewkę obiektywu przed przystąpieniem do oglądania preparatów. Promienie świetlne po przejściu przez szkiełko preparatu, wpadając do warstwy powietrza, ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie olejku immersyjnego niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakończeniu mikroskopowania z obiektywu należy usunąć pozostałości olejku bawełnianą szmatką. W przypadku zaschnięcia olejku na obiektywie, co grozi jego uszkodzeniem, usuwamy go specjalnym zmywaczem. Na jakość obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie ma także wpływ oświetlenie oglądanego preparatu. Posługując się światłem dziennym, należy zastosować lusterko płaskie, a przy świetle sztucznym - lusterko wklęsłe. Preparaty przyżyciowe (tzw. „mokre”) oglądamy najczęściej przy pomocy obiektywów powiększających 40x lub 60x przy obniżonym kondensorze. Preparat w kropli spłaszczonej jest najłatwiejszy do wykonania. Badany materiał zawiesza się w kropli wody umieszczonej na szkiełku podstawowym i przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, które należy opuścić na szkiełko podstawowe ukośnie tak, aby do kropli nie dostały się pęcherzyki powietrza. Jeśli badany materiał jest płynny, przenosi się kroplę wprost na szkiełko. Niekiedy stosuje się barwienie przyżyciowe, co ułatwia obserwację kształtu drobnoustrojów.

    Przygotowanie rozmazów do preparatów trwałych Rozmazy wykonuje się na odtłuszczonych w płomieniu palnika szkiełkach podstawowych. Jeśli sporządza się rozmaz z bakterii zebranych z hodowli

  • 17

    stałej, na szkiełko należy najpierw nanieść 1 oczko ezy wody, a następnie zawiesić w niej bardzo niewielką ilość masy bakteryjnej. Powstała zawiesina powinna lekko opalizować. Nie może być ona zbyt gęsta, gdyż nie uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komórek, co jest warunkiem prawidłowej oceny ich morfologii. Z hodowli płynnej nanosi się ezą na szkiełko 2-3 krople materiału. Każdą kroplę, przed naniesieniem następnej należy wysuszyć. Trzeba też pamiętać o przepaleniu ezy przed powtórnym zanurzeniem jej w hodowli. Przygotowane rozmazy suszy się w powietrzu lub w strumieniu ciepłego powietrza trzymając szkiełko w palcach nad palnikiem. Utrwalenie preparatu osiąga się przez trzykrotne przeciągnięcie spodu szkiełka przez płomień palnika. Można też zalać szkiełko np. alkoholem metylowym i pozostawić do jego całkowitego odparowania. W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynności należy wykonywać w pobliżu palnika, pamiętając o opalaniu ezy i wylotów probówek w trakcie pobierania materiału.

    Barwienie preparatów trwałych Bakterie najczęściej oglądamy w preparatach barwionych. Możemy w nich zaobserwować cechy morfologiczne komórek bakteryjnych, takie jak wymiar, kształt, sposób układania się komórek i nieliczne struktury anatomiczne. Barwienie pozwala także na różnicowanie bakterii między sobą i odróżnienie ich od składników otoczenia, w którym się znajdują. Barwniki wykorzystywane w pracowni mikrobiologicznej dzielimy na barwniki kwaśne i barwniki zasadowe. Barwniki kwaśne to sole, w których kationem jest metal, a anion jest jonem barwnym. Do najczęściej wykorzystywanych należą: nigrozyna, tusz chiński, kolargol, zieleń malachitowa i eozyna. W barwnikach zasadowych jonem barwnym jest kation. Do najczęściej wykorzystywanych zaliczamy: fiolet krystaliczny, fuksynę zasadową, safraninę i błękit metylenowy. Mechanizm barwienia polega na adsorpcji barwnika na powierzchni komórki i na łączeniu się go ze związkami chemicznymi, głównie białkami, wchodzącymi w skład komórki bakteryjnej. W pH hodowli – zwykle obojętnym lub lekko zasadowym – białka bakteryjne mają ładunek ujemny. Kwasy nukleinowe,

  • 18

    z którymi też będą łączyć się barwniki, w tych warunkach również wykazują ujemne naładowanie. Dlatego właśnie do barwienia bakterii używa się barwników zasadowych. Barwniki kwaśne stosowane są do barwienia tła – otoczenia, w którym znajdują bakterie. Barwienie komórek bakteryjnych określamy barwieniem pozytywnym. Barwienie tła, otoczenia, w którym znajdują się komórki, określamy barwieniem negatywnym. Metoda Grama Barwienie metodą Grama jest podstawowym barwieniem różnicującym stosowanym w mikrobiologii, dzielącym bakterie na dwie grupy: gramdodatnie i gramujemne. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki:

    barwnik podstawowy – fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (gencjana);

    zaprawę w postaci roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola);

    odbarwiacz - alkohol etylowy;

    barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna 1:10).

    Wykonanie barwienia - na utrwalony preparat należy nalać świeżo przesączony przez bibułę roztwór gencjany na 2 minuty; - preparat spłukać wodą; - nalać płyn Lugola na 1 minutę; - spłukać wodą; - odbarwiać alkoholem przez 15-20 sekund; - spłukać wodą; - dobarwić przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny; - spłukać wodą; - osuszyć lekko odciskając w bibule. Wynik barwienia: Bakterie gramdodatnie – fioletowogranatowe, gramujemne - różowe. O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubość warstwy peptydoglikanu ściany komórkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii

  • 19

    gramdodatnich jest grubsza niż u bakterii gramujemnych. Fiolet krystaliczny przedostaje się do wnętrza komórki i łącząc się z jodem, tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną bakterii gramdodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych. Powoduje on również odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniając w ten sposób ścianę komórkową. Gruba warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym. W przypadku bakterii gramujemnych kompleks ten wydostaje się na zewnątrz przez cienką warstwę peptydoglikanu. Fuksyna jako barwnik kontrastowy zabarwia komórki bakterii gramujemnych na różowo. W preparatach, w których obok bakterii znajdują się grzyby chorobotwórcze (drożdżopodobne) barwią się one gramdodatnio, ale nie ma to związku z budową ich osłon. .

    Zadania do wykonania Zadanie 1 Przygotowanie i barwienie prapratów Otrzymujesz hodowlę stałą jednego z drobnoustrojów: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus lub Candida albicans w płytce Petriego. Drobnoustroje posiane zostały w sposób pasmowy. - Wykonaj preparat z hodowli jednego z drobnoustrojów i zabarw go metodą Grama. - Nastaw i obejrzyj go pod mikroskopem wykorzystując obiektyw immersyjny. Narysuj obraz mikroskopowy. - Określ powiększenie oglądanego preparatu, kształt i sposób układania się komórek. Zwróć uwagę na różnice w wielkości komórek bakteryjnych i komórek drożdży. Czy badany drobnoustrój okazał się gramdodatni czy gramujemny ?

  • 20

    Powiększenie....... gram............

  • 21

    Wypełnienie poniższej tabeli pozwoli ci zapamiętać sposób reagowania bakterii na odczynniki wykorzystywane w metodzie Grama. Napisz, jaką barwę przyjmują komórki lub jakie zachodzą reakcje.

    Używane odczynniki

    Bakterie gramdodatnie Bakterie gramujemne

    Fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (Gencjana)

    Roztwór jodu w jodku potasu (płyn Lugola)

    Alkohol etylowy

    Alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (Fuksyna 1:10)

  • 22

  • 23

    Rozdział 2

    Pożywki i hodowla drobnoustrojów Cześć teoretyczna Czynniki warunkujące wzrost na podłożach Drobnoustroje mogą się rozwijać tylko w takich środowiskach, które zaspokajają ich wymagania pokarmowe. Pobrane składniki są źródłem substancji budulcowych komórki oraz energii potrzebnej dla rozmnażania i wzrostu. Do elementów pokarmowych, bez których wzrost nie jest możliwy należą: węgiel (C), azot (N), fosfor (P), siarka (S), tlen (O), wodór (H). Pierwiastki te wchodzą w skład większości związków organicznych tworzących komórkę i określane są jako pierwiastki budulcowe lub biogenne. Węgiel (C) jest budulcem wszystkich organicznych związków występujących w komórce. Źródłem węgła dla organizmów samożywnych (autotroficznych) może być dwutlenek węgla (CO2). Większość drobnoustrojów pozyskuje jednak ten pierwiastek z jego organicznych połączeń – są heterotrofami. Do łatwo przyswajalnych źródeł węgla należą węglowodany (glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, glikogen, celuloza). Do stosunkowo łatwo przyswajalnych źródeł węgla należą też kwasy organiczne i alkohole jedno- i wielowodorotlenowe (glicerol, mannitol). Niektóre bakterie wyspecjalizowały się w pozyskiwaniu węgla z jego bardzo specyficznych źródeł – metan, etanol, węglowodory aromatyczne czy lignina. Azot (N) wchodzi w skład bakteryjnych białek, aminocukrów, zasad purynowych i pirymidynowych, które tworzą nukleotydy i kwasy nukleinowe. Większość drobnoustrojów wykorzystuje azot z połączeń nieorganicznych w postaci soli amonowych, azotynów, azotanów. Sole amonowe są najlepiej przyswajalnym źródłem azotu. Nieliczne grupy bakterii mogą pobierać azot atmosferyczny. Mikroorganizmy mogą także czerpać azot ze związków organicznych – aminokwasy, zasady purynowe i pirymidynowe.

  • 24

    Fosfor (P) wchodzi w skład nukleotydów, tworzących kwasy nukleinowe, fosfolipidów i kwasów tejchojowych i lipotejchojowych. Powszechnym źródłem fosforu dla bakterii są nieorganiczne fosforany wykorzystywane przez komórkę do syntezy ATP. Siarka (S) jest składnikiem aminokwasów siarkowych (cystyna, cysteina, metionina), które są elementem składowym wielu białek. Siarka jest przyswajalna przez mikroorganizmy tylko w formie zredukowanej. Najczęściej wykorzystywanym źródłem siarki są siarczany. Niektóre bakterie wykorzystują siarkowodór. Najchętniej wykorzystywanym przez drobnoustroje organicznym źródłem tego pierwiastka jest – cysteina. Jego źródłem mogą być także pozostałe aminokwasy siarkowe. Tlen (O) i wodór (H) występują we wszystkich związkach organicznych komórki. Wchodzą także w skład wody, która jest podstawowym rozpuszczalnikiem substancji komórkowych. Pewne grupy bakterii nie są zdolne do wzrostu, jeśli nie dostarczymy im gotowych związków, które nazywamy czynnikami wzrostowymi. Należą do nich witaminy, szczególnie z grupy B, zasady purynowe i pirymidynowe, a także niekiedy cholesterol, hem, hemina, NAD, NADP i nienasycone kwasy tłuszczowe. Drobnoustroje do wzrostu wymagają znacznych ilości wody. W wodzie rozpuszczone są związki odżywcze. Woda jest także środowiskiem, w którym zachodzą procesy metaboliczne, a także jest istotnym źródłem wodoru i tlenu. Większość mikroorganizmów nie wzrasta, jeśli zawartość wody w środowisku jest niższa niż 20%. Zawartość wody w podłożach hodowlanych wynosi 50-90%. Wzrost drobnoustrojów zależny jest także od obecności soli mineralnych. Jony Mg2+, Fe2+, Ca2+ , Mn2+, Zn2+ są aktywatorami niektórych reakcji enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymów. Sole mineralne są również czynnikami regulującymi ciśnienie osmotyczne komórki.

    Podłoża do hodowli drobnoustrojów Pożywki (podłoża) służą do hodowli mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych. Odpowiednie dobranie składu podłoża pozwala na przeniesienie ich z naturalnych środowisk (organizm człowieka, gleba,

  • 25

    woda) i namnożenie. Drobnoustroje hodujemy na stałych lub w płynnych pożywkach, które umieszczone zostały w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego, kolby Erlenmayera, probówki). Wzrost i rozwój drobnoustrojów na pożywkach, a szczególnie bakterii pozwala na ich wyodrębnienie i zbadanie ich cech morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych i serologicznych. Wiele drobnoustrojów wyrasta na sztucznych podłożach. Nie ma jednak uniwersalnej pożywki umożliwiającej ich wzrost. Pożywki stosowane do namnażania drobnoustrojów powinny:

    zawierać odpowiednie składniki pokarmowe,

    mieć odpowiednią wilgotność,

    mieć odpowiednie pH,

    mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne,

    być jałowe. Biorąc pod uwagę ich skład chemiczny, podłoża bakteriologiczne dzielimy na syntetyczne (ściśle zdefiniowane chemiczne) i złożone (kompleksowe). Skład pożywek syntetycznych jest dokładnie zdefiniowany i oparty na syntetycznych związkach organicznych i nieorganicznych. Jest więc zawsze możliwy do dokładnego odtworzenia. Pożywki te znajdują niekiedy zastosowanie w laboratoriach badawczych. Pożywki złożone to podłoża zawierające dodatkowo surowce pochodzenia naturalnego, których skład nie jest dokładnie określony. Są to ekstrakty mięsne, hydrolizaty kwaśne i enzymatyczne białek i inne składniki. Podłoża złożone mają szerokie zastosowanie w laboratoriach diagnostycznych i naukowych. Pożywki dzielimy na proste (podstawowe), stosowane do hodowli drobnoustrojów o małych wymaganiach pokarmowych i wzbogacone, które służą do hodowli drobnoustrojów o dużych wymaganiach odżywczych. Podstawową pożywką płynną dla bakterii jest bulion odżywczy, a stałą agar odżywczy. Bulion odżywczy zawiera wyciąg mięsny, pepton i NaCl. Poprzez dodanie do bulionu odżywczego agaru w stężeniu 1,5-2% otrzymujemy podłoże stałe. Agar to wielocukier otrzymywany z glonów

  • 26

    morskich. Silnie chłonie wodę, upłynnia się w temperaturze 100°C, a zestala w temperaturze 45-48°C. W temperaturze 37°C, a więc optymalnej dla wzrostu większości bakterii ma konsystencję stałą. Służy on do zestalenia pożywki. Nie jest wykorzystywany przez bakterie jako składnik odżywczy. Agar odżywczy przygotowywany jest w postaci skosów agarowych, słupków lub płytek agarowych. Grzyby, zarówno drożdżopodobne, jak i nitkowate mają niewielkie wymagania pokarmowe i rosną dobrze na prostych podłożach zawierających pepton i węglowodany. Najczęściej stosowaną pożywką do izolacji lub hodowli grzybów chorobotwórczych jest podłoże Sabouraud (płynne lub stałe), zawierające pepton i 4% glukozy lub maltozy. Podłoża wzbogacone to najczęściej podłoża podstawowe, zawierające dodatkowe składniki odżywcze. Elementami wzbogacającymi pożywki dla bakterii mogą być: węglowodany (np. glukoza), białka zwierzęce (surowica lub krew), hydrolizaty białek (np. kazeiny). Powszechnie wykorzysty-wanym w badaniach bakteriologicznych podłożem wzbogaconym jest agar z krwią. Zawiera on 5-10% odwłóknionej jałowej krwi (najczęściej baraniej), zmieszanej z roztopionym agarem odżywczym. Po wylaniu na płytkę Petriego otrzymujemy tak zwaną „płytkę krwawą”. Innym, często wykorzystywanym podłożem wzbogaconym jest agar czekoladowy. Zawiera on agar odżywczy i zdenaturowaną termicznie krew. Po zestaleniu podłoża ma ono barwę czekoladową, stąd jego nazwa. Pożywki mogą zawierać dodatkowe składniki, które wpływają na rozwój hodowanych na nich bakterii. Ze względu na wynikające z ich składu zastosowanie, podłoża możemy podzielić na:

    namnażające lub namnażająco-wybiórcze,

    wybiórcze (selektywne),

    diagnostyczne (różnicujące),

    transportowe. Pożywki namnażające lub namnażająco-wybiórcze są to najczęściej podłoża płynne, wykorzystywane do namnażania bakterii występujących

  • 27

    w niewielkiej ilości w badanej próbce, często jako pojedyncze komórki, w licznej populacji bakterii towarzyszących. Skład pożywki i warunki hodowli umożliwiają namnożenie się tylko bakterii poszukiwanych. Pożywki wybiórcze (selektywne), oprócz składników odżywczych, zawierają składniki wybiórcze, które powodują całkowite zahamowanie wzrostu pewnych gatunków bakterii lub znaczne ograniczenie ich wzrostu. Czynnikami decydującymi o wybiórczości podłoża może być azydek sodu, sole kwasów żółciowych niektóre barwniki i antybiotyki. Są to najczęściej podłoża stałe. Przykładem podłoża wybiórczego jest podłoże Loewensteina-Jensena do hodowli prątków gruźlicy. Wybiórcze podłoża są też stosowane do hodowli grzybów, ze względu na stosunkowo wolny ich wzrost, szczególne do hodowli grzybów nitkowatych. Hodowane są one na podłożach o kwaśnym pH i wysokim ciśnieniu osmotycznym (stężenie sacharozy nawet do 50%). Do podłoża dodaje się również antybiotyki przeciwbakteryjne. Zapobiega to wzrostowi szybciej rosnących bakterii. Pożywki różnicujące (diagnostyczne) pozwalają na zmierzające do identyfikacji, różnicowanie bakterii i niektórych tylko grzybów. Zawierają one substrat diagnostyczny, który może być rozłożony enzymatycznie tylko przez określone gatunki bakterii. Do podłoża często dodawany jest wskaźnik, który na przykład zmienia swoje zabarwienie w zależności od pH pożywki. Dlatego właśnie rozkład substratu manifestuje się zmianą zabarwienia pożywki (podłoża stałe lub podłoża płynne) lub odpowiednim zabarwieniem wyrosłych kolonii (podłoża stałe). Stałe podłoża różnicujące mogą być jednocześnie podłożami wybiórczym dla określonej grupy bakterii i są nazywane wybiórczo-różnicującymi. Przykładem takiej pożywki może być podłoże SS (Salmonella-Shigella) służące do izolacji pałeczek z rodzajów Salmonella i Shigella oraz podłoże Chapmana służące do izolacji gronkowców. Podłoża transportowe nie zawierają składników pokarmowych. Zawierają składniki optymalne dla przeżycia bakterii, w tym roztwory buforowe i sole mineralne. Zadaniem tych podłozy jest utrzymanie żywotności bakterii w próbce, zanim trafi ona do laboratorium mikrobiologicznego.

  • 28

    Na rynku dostępne są podłoża o wystandaryzowanym składzie, jałowe i gotowe do użycia, w jednorazowych naczyniach, o określonej dacie przydatności. Zastosowanie gotowych podłoży znacznie skraca czas przygotowań do badań mikrobiologicznych. Można też je przygotowywać samodzielnie, korzystając z pożywek w proszku o wystandaryzowanym składzie i innych chemicznych składników. Własnoręczne komponowanie pożywek wymaga zastosowania procedur i kontroli zapewniających powtarzalność ich składu, pozwalającą na porównywanie wyników hodowli otrzymywanych w różnym czasie i w różnych laboratoriach. Bezpośrednio po przygotowaniu, takie pożywki należy wyjałowić, stanowią bowiem podłoże wzrostu także dla drobnoustrojów licznie obecnych w użytych składnikach i otoczeniu. Sterylizacji tej dokonuje się najczęściej w autoklawie lub w aparacie Kocha.

    Optymalny czas hodowli W podłożu zawierającym niezbędne do wzrostu składniki, bakterie podwajają swoją masę i replikują swój materiał genetyczny, co w konsekwencji prowadzi do ich podziału. Wzrost populacji bakterii odbywa się zgodnie z postępem geometrycznym (20 ,21 ,22 , 23…2n). Czas generacji (okres międzypodziałowy) jest to czas potrzebny do podwojenia liczby komórek w populacji. Szybkość wzrostu bakterii jest cechą charakterystyczną rodzaju (gatunku). Zależy ona także od rodzaju podłoża wzrostowego oraz warunków środowiskowych. W optymalnych warunkach wzrostu w laboratorium okres międzypodziałowy większości bakterii wynosi od 20 do 40 minut, ale może też być znacznie dłuższy - od kilku do kilkunastu godzin. Stąd, czas potrzebny na wyhodowanie bakterii na pożywce tak, aby ich wzrost był widoczny gołym okiem jest różny, ale dla większości bakterii chorobotwórczych wynosi 18-24 godziny. Hodowla grzybów chorobotwórczych wymaga dłuższego czasu. Czas potrzebny na wyhodowanie grzybów drożdżopodobnych wynosi 48-72 godzin, ale grzyby pleśniowe wymagają hodowli przez 1-2 tygodni.

  • 29

    Krzywa wzrostu bakterii w hodowli płynnej Bakterie na podłożach płynnych można namnażać w warunkach hodowli okresowej (zwykłej) lub ciągłej. W hodowli okresowej bakterie namnażają się w systemie zamkniętym (probówki, kolbki, butelki, bioreaktory) do momentu wyczerpania substancji odżywczych zawartych w pożywce lub nagromadzenia w niej dużej ilości toksycznych dla bakterii produktów ich metabolizmu. W hodowli ciągłej, którą prowadzi się w specjalnych bioreaktorach, wzrost bakterii można utrzymywać nieskończenie długo. Możliwe jest to na wskutek ciągłego dostarczania do bioreaktora świeżej pożywki z jednoczesnym odprowadzeniem takiej samej objętości pożywki zawierającej wyrosłe bakterie i produkty ich metabolizmu. Objętość płynu hodowlanego w trakcie prowadzenia hodowli utrzymuje się na stałym poziomie. Wzrost bakterii w hodowli okresowej można przedstawić graficznie pod postacią krzywej, którą nazywamy krzywą wzrostu hodowli bakteryjnej. Jest to krzywa w układzie półlogarytmicznym. Opisuje ona zależność logarytmu dziesiętnego liczby żywych komórek bakterii od czasu hodowli i ilustruje wzrost populacji (rycina 1). Obraz krzywej wzrostu dla większości bakterii jest bardzo podobny i można w nim wyróżnić sześć faz. Czas trwania poszczególnych faz wzrostu jest zależny od rodzaju bakterii i warunków hodowli. Poszczególne fazy wzrostu różnią się częstością podziałów komórek i szybkością ich wymierania. Faza pierwsza, nazywana jest fazą zastoju. Bakterie przystosowują swój metabolizm do nowego środowiska. Wzrasta ilość rybosomów i zawartość RNA. Pojedyncze komórki powiększają swój wymiar i przygotowują się do podziału. Faza druga - przyspieszonego wzrostu. Komórki wykazują intensywny metabolizm. Rozpoczynają się podziały komórkowe. Faza trzecia, nazywana fazą wzrostu wykładniczego (logarytmicznego), jest okresem rzeczywistego rozwoju hodowli. Metabolizm komórek jest bardzo intensywny. Liczba żywych komórek przyrasta w postępie geometrycznym. W populacji prawie wszystkie komórki są żywe. W tej fazie wzrostu bakterie są najbardziej wrażliwe na działanie fizycznych i chemicznych czynników środowiskowych.

  • 30

    Rycina 1. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli okresowej: 1- faza zastoju, 2 – faza przyspieszonego wzrostu, 3 – faza wzrostu logarytmicznego, 4 – faza zwolnionego wzrostu, 5 – faza stacjonarna, 6 – faza zamierania Faza czwarta jest fazą zwolnionego wzrostu. Rozmiar komórek maleje. Zmniejsza się ilość rybosomów i zawartość RNA. Zwiększa się liczba komórek martwych. Częstość podziałów maleje. Faza piąta, nazywana fazą stacjonarną (równowagi), charakteryzuje się stałą liczbą żywych komórek w hodowli. Z powodu braku substancji pokarmowych komórki zużywają własne materiały zapasowe. Sporadyczne podziały komórkowe rekompensują ubytki komórek spowodowane ich wymieraniem. Faza szósta – zamierania. Wzrasta liczba martwych komórek. Zaczynają się procesy autolizy, czyli samorozpuszczania się bakterii pod wpływem własnych enzymów. Zmniejsza się liczba żywych komórek i ogólna biomasa hodowli. Brak podziałów komórkowych.

    Wzrost na podłożach płynnych i stałych Wygląd wzrostu na podłożach może stanowić ważne kryterium przy identyfikacji bakterii i grzybów chorobotwórczych.

    czas hodowli

    lg lic

    zb

    y ż

    yw

    ych

    ko

    rek

    12

    3

    45

    5

    6

  • 31

    Na podłożach płynnych drobnoustroje wyrastają w postaci jednolitego zmętnienia, osadu na dnie naczynia, kożuszka lub błonki na powierzchni płynu. Czasami zmętnieniu towarzyszy delikatny osad lub zagęszczenie przy powierzchni, a na granicy faz (pożywka-powietrze) tworzy się przylegająca do ścianek naczynia warstwa biofilmu. Na podłożach stałych możemy oceniać wygląd kolonii. Istotna może być też ocena obfitości wzrostu lub obserwacja zdolności bakterii do wzrostu mgławicowego. Kolonię definiujemy jako widoczne makroskopowo na powierzchni lub w głębi stałej pożywki skupisko bakterii wyrosłe z jednej jednostki wzrostowej (jtk – jednostka tworząca kolonie; cfu – ang. colony forming unit). Przez jednostkę wzrostową rozumiemy jedną lub kilka komórek bakteryjnych, które nie rozdzieliły się po podziale (układ popodziałowy), a także przetrwalnik. Umiejętność oceny morfologii kolonii jest bardzo ważna, gdyż w przypadku niektórych bakterii może w istotny sposób ważyć na ich identyfikacji, jest też istotna przy określaniu czystości hodowli. W określonych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami. W przypadku grzybów drożdżopodobnych tworzą się kolonie bardzo podobne do kolonii bakteryjnych, zaś grzyby pleśniowe tworzą kolonie puszyste, często kolorowe, o pomarszczonej strukturze. W przypadku tych ostatnich, zaczątek kolonii mogą stanowić znaczne, wielokomórkowe fragmenty grzybni, ale także zarodniki. Definicja kolonii bakteryjnej nie jest zatem w pełni do tych kolonii przystająca.

    Metody

    Opis kolonii Dla celów diagnostycznych opisuje się kolonie wyrosłe na takich podłożach, które nie powodują ich nienaturalnego zabarwienia w wyniku oddziaływania zawartych w nich wskaźników czy barwników. Niekiedy jednak istotny także bywa opis ich wyglądu na podłożach diagnostycznych.

  • 32

    Należy opisywać kolonie oddalone od pozostałych tak, aby ich wzrost nie był ograniczony przez zbyt liczne sąsiedztwo. W opisie kolonii należy wziąć pod uwagę następujące jej elementy:

    wielkość - średnica (mm);

    kształt - okrągła, owalna, nitkowata, rozgałęziona nieregularna, .. ;

    brzeg - równy, postrzępiony, falisty, ząbkowany, ... ;

    powierzchnię - gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, ... ;

    wzniesienie (profil kolonii) - płaska, wypukła, pępkowata, grudkowata, wrastająca w podłoże, ... ;

    przejrzystość - przezroczysta, opalizująca, mętna, ... ;

    barwę - biała, kremowa, szara, czerwona, ... ;

    otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podłoża.

    Zadania do wykonania Zadanie 1. Charakterystyka kolonii bakteryjnej - Obejrzyj płytkę z podłożem agarowym, na której wyrosły pojedyncze kolonie. Powstały one w wyniku rozmnożenia się komórek bakterii i przetrwalników, które opadły na podłoże (sedymentowały) z powietrza. - Wybierz jedną kolonię i opisz ją uwzględniając cechy opisane wyżej.

  • 33

    Rozdział 3

    Techniki posiewu bakterii na podłoża. Otrzymywanie czystych hodowli. Część teoretyczna Populację bakterii rosnącą na podłożu stałym lub płynnym nazywamy hodowlą. Hodowlę składającą się z różnych gatunków bakterii nazywamy hodowlą mieszaną. Czystą hodowlą nazywamy hodowlę bakterii jednego rodzaju. Szczep to populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku wyróżniająca się określonymi cechami. Szczepy wyprowadzone z pojedynczej komórki nazywamy klonami. W większości przypadków, przy badaniu bakteriologicznym wody, żywności, wymazów pobranych od pacjentów, zanieczyszczonych leków czy kosmetyków, spodziewamy się w próbce więcej niż jednego rodzaju drobnoustrojów. Ocena drobnoustrojów występujących w badanym materiale może nastąpić dopiero po ich wyodrębnieniu i uzyskaniu czystych hodowli. Do tego celu wykorzystuje się metodę posiewu redukcyjnego. Taki typ posiewu pozwala na ocenę morfologii wyrosłych kolonii. Zakłada się, choć jest to pewne uproszczenie, że każda z nich powstaje z jednej jednostki wzrostowej (często jednej komórki). A zatem, ile typów kolonii, tyle rodzajów bakterii w hodowli. Ponieważ morfologia kolonii różnych gatunków czy nawet rodzajów może być zbliżona, czasem pomocnym w odróżnieniu kolonii jest posiew redukcyjny na płytkę z podłożem diagnostycznym. Izolacja pojedynczej kolonii z posiewu redukcyjnego prowadzi zwykle do uzyskania hodowli czystej.

    Metody

    Posiew bakterii na podłoża Materiał zawierający bakterie posiewa się na podłoża stałe (skos agarowy, płytka agarowa) lub płynne (bulion) ezą, pipetą lub wacikiem. Posiewając

  • 34

    ezą, należy ją wyjałowić wyżarzając w płomieniu palnika przed i po wykonaniu posiewu. Używamy też wyjałowionych, odpowiednio opakowanych pipet szklanych, końcówek do pipet automatycznych lub wacików. W trakcie posiewania bakterii na podłoża płynne należy także pamiętać o opalaniu wylotu naczyń w płomieniu palnika po otwarciu i przed ich zamknięciem. Ma to zapobiec zakażeniu pożywki drobnoustrojami z zewnątrz i zapewnić bezpieczeństwo osobie pracującej. Każda próbka pobierana do posiewu z hodowli lub zawiesiny bakterii, którą zakażamy świeże podłoże stanowi inokulum. Posiew na podłoże płynne ezą polega na uwolnieniu z niej materiału stanowiącego inokulum do pożywki przez pocieranie o ścianki naczynia (probówki lub kolbki). Przy posiewaniu do naczyń zawierających większe objętości pożywki konieczne jest zachowanie odpowiednich proporcji między wielkością inokulum a objętością podłoża. Zwykle stosuje się zasadę, że inokulum stanowi 5% końcowej objętości pożywki. Posiewu możemy dokonywać pipetą wprowadzając np. 5 mL hodowli stanowiącej inokulum do 95 mL pożywki. Posiewu na podłoża stałe na płytkach Petriego dokonuje w różny sposób – zależnie od celu takiego posiewu. Ważnym, często stosowanym przy izolacji bakterii sposobem, prowadzącym do otrzymania pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby w kolejnych sektorach na powierzchni płytki znajdowało się coraz mniej bakterii. Sposób wykonania takiego posiewu przedstawia rycina 1. W poszczególnych etapach raz naniesiony materiał zostaje rozprowadzany na kolejne sektory płytki. Każdorazowe opalanie ezy przed rozsianiem bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcję ich liczby do takiej ilości, przy której w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w postaci pojedynczych kolonii. Czasem wykonuje się posiew redukcyjny z materiału z wacika. Oznacza to, że pierwsza jego strefa posiana jest wacikiem, którym np. pobrano materiał kliniczny – wymaz, a następne już w klasyczny sposób ezą z zachowaniem zasady jej przepalania w trakcie posiewu.

  • 35

    Można wykonać na płytce także posiew pasmowy lub punktowy, który pozwala umieścić na płytce wiele próbek, których cechy chcemy porównywać. Polega on na naniesieniu na płytkę inokulum z ezy w postaci pasma różnej długości. Czasem istnieje potrzeba zasiania całej powierzchni płytki i uzyskania wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu można dokonać wacikiem (tzw. wymazówką). Inokulum stanowi zwykle próbka pobrana z podłoża płynnego (nadmiar płynu z wacika należy w trakcie pobierania odcisnąć o ścianki naczynia), którą rozprowadza się równomiernie na powierzchni podłoża w płytce. Czasem zawiesina stanowiąca inokulum w tej metodzie posiewu jest w odpowiedni sposób standaryzowana. Inokulum o określonej objętości, zwykle 0,1 mL można także rozprowadzić głaszczką lub odpowiednio zagiętą ezą. Rycina 1. Posiew redukcyjny

    A

    B

    C

    D

  • 36

    Przy posiewie na podłoże stałe w postaci skosu agarowego w probówce należy wprowadzić ezę z inokulum do dna probówki i rozprowadzić na powierzchni skosu. Prowadzi się w tym celu ezę zygzakowatym ruchem od ścianki do ścianki próbówki, przesuwając ją ku wylotowi naczynia. W zależności od rodzaju posiewanego materiału i wykorzystywanego podłoża spotykamy się z następującymi możliwościami przesiewania bakterii.

    Otrzymywanie czystych hodowli Postępowanie zmierzające do otrzymania czystych hodowli z nieznanych próbek sprowadza się do następujących kroków.

    Z pożywki płynnej

    Z pożywki stałej (płytka agarowa, skos agarowy)

    Na pożywkę płynną (pipeta, eza)

    Na skos agarowy (eza)

    Na płytkę agarową (eza, wacik, pipeta)

    Na pożywkę płynną (eza)

    Na skos (eza)

    Na płytkę agarową (eza)

  • 37

    Badany materiał posiewa się redukcyjnie na odpowiednio dobrane podłoże.

    Po inkubacji (czasem wydłużonej nawet do 5 dni) w temperaturze optymalnej dla oczekiwanych drobnoustrojów ocenia się morfologię wyrosłych kolonii. Obecność różnic w ich wyglądzie wskazuje, że mamy do czynienia z hodowlą mieszaną.

    Izoluje się wtedy pojedyncze kolonie i posiewa się je redukcyjnie na oddzielne płytki.

    Otrzymana w wyniku takiego posiewu hodowla może być uznana za czystą, jeśli kolonie posiadają jednakową morfologię.

    Namnożona (na skosie, w pożywce płynnej lub w inny sposób) pojedyncza kolonia z takiej płytki może być materiałem dla wykonywania prób i posiewów identyfikacyjnych, czy służących do określenia właściwości fizjologicznych, biochemicznych i antygenowych bakterii.

    Szybką, choć czasem zawodną metodą sprawdzenia czystości hodowli płynnej jest ocena morfologii komórek tworzących ją bakterii w preparatach barwionych metodą Grama.

    Zadania do wykonania

    Zadanie 1. Otrzymywanie czystej hodowli - Materiał z otrzymanej hodowli płynnej posiej redukcyjnie na płytkę agarową. - Podpisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny). - Obejrzyj posiew zwracając szczególną uwagę na pojedyncze kolonie w trzeciej i czwartej strefie posiewu. - Opisz każdy z widocznych rodzajów kolonii.

    - Wykonaj z każdej z nich preparat barwiony metodą Grama i uzupełnij opis kolonii o morfologię komórki.

    - Każdą z wybranych kolonii posiej redukcyjnie na nową płytkę. Opisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny).

  • 38

    Kolonia: Preparat:

    Kolonia: Preparat:

  • 39

    Kolonia: Preparat:

    Jeśli na każdej z posianych płytek wyrosną kolonie tylko jednego rodzaju, o wyglądzie zgodnym z wcześniej wykonanym opisem, otrzymałeś czyste hodowle tych bakterii – czyli hodowle jednego gatunku pochodzące z pojedynczej kolonii, a zatem – czyste hodowle poszczególnych szczepów bakteryjnych.

  • 40

  • 41

    Rozdział 4

    Wymagania wzrostowe bakterii Część teoretyczna

    Wymagania pokarmowe Bakterie, podobnie jak inne organizmy żywe, potrzebują dostępu do odpowiednich składników odżywczych, umożliwiających im prawidłowy wzrost i rozmnażanie. Wymagania pokarmowe bakterii są bardzo różnorodne, od bakterii skrajnie wymagających, które mają najmniejsze zdolności biosyntetyczne i wymagają do wzrostu związków wielkocząsteczkowych, poprzez stanowiące największą grupę bakterie o wymaganiach pośrednich, do których zalicza się większość bakterii chorobotwórczych, aż do skrajnie niewymagających, które wykorzystują jako źródło węgla CO2. Wymagania pokarmowe są w dużej mierze związane ze stopniem pasożytnictwa poszczególnych drobnoustrojów.

    Źródła węgla i azotu Węgiel jest podstawowym pierwiastkiem budulcowym organizmów żywych. W zależności od źródeł z jakich bakterie mogą go pozyskiwać podzielono je na:

    autotrofy czerpiące węgiel tylko z CO2 i przekształcające go do związków organicznych;

    heterotrofy czerpiące węgiel ze związków organicznych. Heterotrofy do prawidłowego wzrostu potrzebują w środowisku co najmniej jednego związku organicznego. Najwięcej drobnoustrojów ma zdolność do rozkładu glukozy, ale zdarzają się także bakterie mogące korzystać z mleczanu, bursztynianu, metanu, a także bardziej złożonych związków jak lignina czy węglowodory aromatyczne. Heterotrofy zostały podzielone na:

  • 42

    - prototrofy – drobnoustroje o małych wymaganiach

    pokarmowych, którym do wzrostu wystarczy jeden prosty związek organiczny i sole mineralne co świadczy o ich dużych, gwarantujących szerokie rozprzestrzenienie, możliwościach enzymatycznych,

    - auksotrofy – drobnoustroje o dużych wymaganiach odżywczych, rosnące jedynie w obecności, co najmniej dwóch związków organicznych stanowiących źródło węgla i azotu, których nie są w stanie same syntetyzować, co w znacznym stopniu uzależnia je od środowiska.

    Zarówno prototrofizm, jak i auksotrofizm mogą być wykorzystywane dla celów diagnostycznych, na przykład w identyfikacji pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae czy przy ustalaniu gatunku pałeczek z rodzaju Haemophilus. Bakterie auksotroficzne często wymagają do wzrostu specjalnych czynników wzrostowych, którymi mogą być aminokwasy, puryny i pirymidyny lub witaminy. Azot, który jest ważnym pierwiastkiem wchodzącym w skład białek i kwasów nukleinowych, prototrofy mogą pozyskiwać ze związków nieorganicznych (np. soli amonowych, azotanów i azotynów), a auksotrofy wykorzystują organiczne źródła azotu.

    Źródła energii oraz donatory elektronów Drobnoustroje mają zdolność wykorzystywania energii słonecznej lub energii chemicznej uwalnianej ze związków wysokoenergetycznych. Pozwala to wyróżnić wśród bakterii:

    fototrofy – które korzystają z energii słonecznej (bakterie fotosyntetyzujące),

    chemotrofy – korzystające z energii pochodzącej z rozkładu związków organicznych i nieorganicznych.

    W zależności od donatorów elektronów dzielimy bakterie na:

    litotrofy korzystające z donatorów nieorganicznych,

    organotrofy korzystające z donatorów organicznych.

  • 43

    Zatem zależnie od wykorzystywanych przez bakterie źródeł energii i donatorów elektronów możemy wyróżnić cztery typy pokarmowe: fotolitotrofy, fotoorganotrofy, chemolitotrofy i chemoorganotrofy. Bakterie stanowiące mikrobiota (florę fizjologiczną) człowieka i te, które są dla niego chorobotwórcze są chemoorganotrofami pozyskującymi węgiel ze związków organicznych.

    Wymagania tlenowe bakterii Bakterie różnią się pomiędzy sobą zapotrzebowaniem na tlen. Bezwzględnie tlenowe rosną tylko w jego obecności, bezwzględne beztlenowe rosną przy jego braku, a względnie beztlenowe rosnące zarówno przy dostępie jak i braku tlenu. Różnice te wynikają ze sposobu pozyskiwania energii przez bakterie w procesie oddychania. Oddychanie tlenowe jest możliwe tylko u organizmów, w którym końcowym akceptorem przenoszonych przez łańcuch oddechowy elektronów jest tlen cząsteczkowy. W przypadku oddychania beztlenowego końcowym akceptorem elektronów w łańcuchu oddechowym są związki nieorganiczne: azotany, siarczany. Możliwe jest jeszcze pozyskiwanie energii w procesie fermentacji, gdzie akceptorem elektronów jest związek organiczny. Bakteriom bezwzględnie tlenowym tlen jest niezbędny do prawidłowego wzrostu i rozmnażania. W przypadku braku tlenu giną, gdyż przenoszenie elektronów łańcucha oddechowego zostaje zahamowane i nie jest magazynowana energia. Bakterie te mają enzymy, które chronią je przed toksycznym działaniem tlenu. Dysmutaza nadtlenkowa wiąże wolne rodniki z wodorem, w wyniku czego powstaje nadtlenek wodoru. Jest on rozkładany przez dwa inne enzymy: katalazę i peroksydazę do wody i tlenu. Do bezwzględnie tlenowych, chorobotwórczych bakterii zaliczane są m.in.: Mycobacterium, Bacillus, Nocardia. Bakterie względnie beztlenowe mogą rosnąć zarówno w obecności tlenu, jak i przy jego braku w środowisku o obniżonym potencjale oksydacyjno-redukcyjnym. Do tej grupy należy wiele bakterii, w tym też chorobotwórczych. Jeżeli tlen jest obecny w środowisku, mogą korzystać

  • 44

    z energii pozyskiwanej w wyniku oddychania tlenowego. Przy braku tlenu mogą przestawić metabolizm na fermentacyjny, jak np.: Escherichia coli lub na oddychanie beztlenowe np.: Pseudomonas denitrificans. Bakterie bezwzględnie beztlenowe mogą się rozwijać tylko wyłącznie przy braku dostępu do tlenu. Jest on dla nich toksyczny, ponieważ nie mają żadnych mechanizmów redukujących jego szkodliwe działanie. Niektóre z nich mogą rosnąć w obecności tlenu jednak pod warunkiem obniżenia potencjału oksydoredukcyjnego poprzez dodanie do hodowli glutationu, cystyny bądź tioglikolanu sodu. Do tej grupy należą liczne bakterie chorobotwórcze dla człowieka, m.in. z rodzajów Clostridium, Bacteroides czy Fusobacterium. Grupa bakterii mikroaerofilnych (np. Helicobacter) rośnie dobrze przy dostępie niewielkich ilości tlenu (do 20%), ale czasem wyrasta także w warunkach beztlenowych (np. Propionibacterium).

    Wymagania temperaturowe bakterii Temperatura ma istotny wpływ na rozwój bakterii. Każdy ich rodzaj ma optymalną dla siebie temperaturę, w której wszelkie procesy metaboliczne prowadzone są najbardziej wydajnie. Temperatura minimalna wyznacza dolną granicę, poniżej której wzrost danego rodzaju zanika, a maksymalna jest temperaturą powyżej której bakterie już się nie dzielą. Preferencje dotyczące temperatury dzielą bakterie na grupy. Termofile (bakterie ciepłolubne) najlepiej rosną w temperaturze 40oC do 70oC. Bakterie takie jak Geobacillus stearothermophilus czy Thermoactinomyces vulgaris żyją w kompoście, glebie, nawozach organicznych. Znane są także bakterie rosnące w wyższych temperaturach Np. Thermus aquaticus w 65oC. Znane są i takie, które mnożą się w temperaturze 90-110oC. Określane są one jako termofile ekstremalne. Zainteresowanie nimi wynika z możliwości jakie stwarzają ciepłoodporne enzymy tych bakterii, np. dla biologii molekularnej. Mezofile to największa grupa drobnoustrojów, rosnąca w zakresie temperatur 25-45

    oC. Wśród nich są bakterie z optimum rozwoju

    w temperaturze 37oC blisko związane z człowiekiem jako pasożyty i komensale (np. rodzaje Streptococcus, Staphylococcus, Salmonella).

  • 45

    Niektóre mezofile mogą rosnąć w szerokim zakresie temperatur, jak na przykład dobrze mnożąca się w temperaturze lodówki Listeria – o spektrum od 1o do 45oC . Psychrofile to bakterie zimnolubne, których metabolizm najefektywniej funkcjonuje w niskich temperaturach. Są wśród nich psychrofile względne o optymalnej temperaturze 200C, ale mogące też rosnąć w 0oC, występujące w głębi oceanów oraz psychrofile bezwzględne o istotnym znaczeniu dla człowieka. Rosną one dobrze w 00C mnożąc się w żywności przechowywanej w chłodniach. Powodują jej psucie i mogą być przyczyną zachorowań. Należą tu m.in. niektóre gatunki Flavobacterium, Aerobacter, a także Bacillus czy Lactobacillus.

    Metody

    Badanie zdolności korzystania z soli amonowych lub aminokwasów jako źródła azotu Bakterie posiane na stałe podłoże nie zawierające źródła azotu, na które punktowo (na bibułowych krążkach czy do metalowych cylinderków) naniesiono roztwory NH4(SO4)2 i aminokwasów wyrosną tylko w pobliżu tego źródła azotu, który mogą wykorzystywać.

    Metody hodowli bakterii tlenowych Tlen jest ważnym czynnikiem warunkującym wzrost bakterii tlenowych i względnie beztlenowych. Pobierają one tlen rozpuszczony w pożywce. Dostępność tlenu dla bakterii w hodowlach płynnych możemy zwiększyć przez ich napowietrzanie. Najprościej osiągnąć to przez energiczne wstrząsanie lub mieszanie hodowli na tzw. wytrząsarkach. W hodowlach płynnych prowadzonych na skalę przemysłową stężenie tlenu zwiększa się przepuszczając powietrze lub tlen przez pożywkę.

  • 46

    Metody hodowli bakterii beztlenowych Obecność tlenu może uniemożliwić wyhodowanie bakterii bezwzględnie beztlenowych. Jest wiele sposobów usunięcia tlenu z pożywki. W przypadku pożywki płynnej najprostszym sposobem jest jej zagotowanie, szybkie schłodzenie i pokrycie powierzchni podłoża płynną parafiną. Metoda ta jednak może być zawodna. Najczęściej bakterie beztlenowe hoduje się w specjalnych, szczelnych słojach, wewnątrz których atmosferę beztlenową uzyskuje się na drodze reakcji chemicznej zachodzącej w specjalnych saszetkach (nazwa zależy od jej wytwórcy). Saszetka zawiera zestaw substancji, z których po jej otwarciu wydzielany jest wodór. Ten reaguje z tlenem obecnym w słoju tworząc wodę. Reakcja ta zachodzi szybko i gwarantuje uzyskanie warunków beztlenowych. Efektywność tego procesu sprawdza się przy pomocą wskaźnika, błękitu metylenowego, który w warunkach beztlenowych jest bezbarwny. Odczynniki zawarte w niektórych rodzajach saszetek wymagają do swojej aktywności zetknięcia z wodą. Aby zwiększyć szybkość łączenia się wodoru z tlenem stosuje się wtedy katalizator palladowy umieszczany w specjalnym pojemniku przytwierdzonym do wieka słoja. W powietrzu atmosferycznym tlen stanowi 20%. Do namnażania bakterii mikroaerofilnych stosuje się saszetki, które pozwalają uzyskać środowisko o niewielkim stężeniu tlenu rzędu 7-10%. Niektóre bakterie wymagają do swojego optymalnego wzrostu zwiększonego stężenia CO2. Znajdują wtedy zastosowanie saszetki, które pozwalają na uzyskanie środowiska o podwyższonym stężeniu CO2 (średnio od 3 do 6%). Wiele bakterii beztlenowych można wyhodować na podłożach o obniżonym potencjale redukcyjno-oksydacyjnym, co jest osiągane poprzez dodanie odpowiednich związków chemicznych. W powszechnie używanym podłożu Brewera jest to tioglikolan sodu.

  • 47

    Zadania do wykonania Zadanie 1. Typy pokarmowe bakterii Uzupełnij poniższą tabelę:

    Typ pokarmowy

    Źródło energii Źródło węgla Donatory elektronów

    chemoorganotrofy

    związki nieorganiczne

    CO2 i inne związki nieorganiczne

    związki nieorganiczne

    światło

    związki nieorganiczne

    związki nieorganiczne

    fotoorganotrofy

    związki organiczne

    Zadanie 2. Wpływ warunków gazowych na rozwój bakterii w hodowli płynnej - Otrzymujesz hodowle bulionowe: Clostridium botulinum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Każdy drobnoustrój posiany był do dwóch probówek, z których jedna pokryta została płynną parafiną. - Wyniki hodowli (wzrost) zaznacz w tabeli. Określ wymagania tlenowe tych bakterii.

  • 48

    Clostridium botulinum

    Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa

    bulion

    bulion pod parafiną

    określenie wymagań tlenowych bakterii

    Zadanie 3. Wpływ temperatury na wzrost bakterii - Obejrzyj otrzymane hodowle. - Uzupełnij poniższą tabelę oceniając intensywność wzrostu w skali +, ++ lub –

    Wzrost w temp. 4

    oC

    Wzrost w temp. 37

    oC

    Wzrost w temp. 45

    oC

    psychrofil

    mezofil

    termofil

  • 49

    Rozdział 5

    Wykorzystanie cech biochemicznych bakterii do ich identyfikacji Część teoretyczna

    Metabolizm bakterii Podobnie jak w innych żywych komórkach, metabolizm bakterii obejmuje anabolizm (reakcje syntezy) i katabolizm (reakcje rozkładu). Oba te procesy są ze sobą ściśle powiązane i zachodzą w komórce jednocześnie. Reakcje rozkładu związków wysokocząsteczkowych uwalniają energię, która następnie jest magazynowana w ATP. W pierwszym etapie duże cząsteczki węglowodanów, białek, tłuszczy, kwasów nukleinowych ulegają degradacji do mniejszych cząstek: heksoz i pentoz, aminokwasów, glicerolu i kwasów tłuszczowych, nukleotydów. W dalszych etapach procesów katabolicznych w wyniku licznych przemian powstają proste cząsteczki, które włączane są w cykl Krebsa będący końcowym etapem rozkładu. Ostatecznymi produktami są woda, dwutlenek węgla i energia. Umożliwia to przebieg procesów anabolicznych wymagających jej nakładu. Energia uzyskiwana jest przez bakterie w procesach katabolicznych polegających na utlenianiu biologicznym substratów oddechowych i przenoszeniu elektronów na odpowiednie akceptory. Najbardziej wydajnym energetycznie procesem jest, angażujące cykl Krebsa, oddychanie tlenowe, w którym protony i elektrony są przenoszone poprzez łańcuch oddechowy na tlen atmosferyczny. Zdolność bakterii do oddychania tlenowego ma istotne znaczenie z punktu widzenia ich identyfikacji, gdyż liczne próby biochemiczne pozwalają na wykrywanie metabolitów pośrednich cyklu Krebsa oraz obecność enzymów łańcucha oddechowego. Oddychanie beztlenowe ma podobny przebieg z tym, że ostatecznym akceptorem protonów i elektronów w łańcuchu oddechowym są związki

  • 50

    nieorganiczne, np.: azotany, azotyny, siarczany. Wykrywanie produktów ich rozkładu a także enzymów biorących udział w tych procesach także wykorzystywane jest w identyfikacji bakterii. Przykładem jest wykrywanie reduktazy azotanowej przekształcającej azotany do azotynów. Trzeci z energiodajnych procesów – fermentacja pozwala na metabolizowanie substratów bez udziału czynnika utleniającego, w którym utlenienie jednego związku jest równoważone redukcją innego. Ostatecznymi akceptorami protonów i elektronów są związki organiczne powstałe jako produkty pośrednie, np.: etanol, mleczan, maślan, bursztynian, izopropanol. Od tych produktów tworzone są nazwy fermentacji np. fermentacja mlekowa, propionowy czy alkoholowa.

    Fermentacja mlekowa jest prowadzona przez bakterie mlekowe (Lactobacillus), ale także inne bakterie, np. gronkowce. Bakterie mlekowe stanowią mikrobiota (florę fizjologiczną) przewodu pokarmowego niemowląt, są wykorzystywane jako probiotyki. Stanowią też normalną mikrobiota pochwy u kobiet.

    Fermentacja propionowa prowadzona jest przez beztlenowe pałeczki z rodzaju Propionibacterium bytujące w przewodzie pokarmowym przeżuwaczy, a także na skórze człowieka. Jako produkt podstawowy tej fermentacji powstaje kwas propionowy.

    Jako substrat energetyczny bakterie mogą wykorzystywać cukry proste, oligocukry i cukry złożone. Te ostatnie muszą ulec strawieniu zewnątrzkomórkowemu przy udziale odpowiednich, produkowanych przez bakterie enzymów. Dotyczy to m.in. skrobi, glikogenu czy celulozy. Do komórki transportowane są cukry proste, które wykorzystywane są jako główne substraty oddechowe. Jeżeli w podłożu znajduje się wiele substratów zwykle pierwszym rozkładanym są cukry proste. W przypadku większości bakterii jest to glukoza. Także białka i lipidy są zbyt dużymi cząsteczkami, aby w stanie nie zmienionym mogły być przyswajane przez bakterie. Muszą one ulec degradacji w środowisku przy udziale odpowiednich enzymów proteolitycznych czy lipolitycznych. W rozkładzie białek biorą udział endopeptydazy rozkładające je do oligopeptydów i egzopeptydazy odłączające aminokwasy, które podlegają dalszym przemianom. Lipidy są

  • 51

    zwykle degradowane przez esterazy, o szerokiej swoistości substratowej. Niektóre bakterie wytwarzają lipazy o wąskiej specyficzności – na przykład lecytynazę.

    Cechy wykorzystywane do identyfikacji bakterii W identyfikacji bakterii przeprowadzanej metodami fenotypowymi próby oparte na wykrywaniu cech metabolicznych bakterii odgrywają bardzo ważną rolę. Bada się źródła węgla i azotu wykorzystywane przez bakterie, poszukuje enzymów biorących udział w procesach katabolicznych, oznacza charakterystyczne końcowe produkty metabolizmu. Zwykle diagnostykę prowadzi się w oparciu o wiele, zwykle kilka lub kilkanaście prób dobranych specjalnie pod kątem identyfikacji określonych bakterii. Tworzone są w ten sposób schematy diagnostyczne. Istotne miejsce mogą w nich mieć także takie cechy jak morfologia mikroskopowa bakterii i morfologia kolonii. Dla wielu rodzajów bakterii określa się także właściwości biologiczne. Wśród nich ważną rolę odgrywa oznaczanie często występujących u bakterii hemolizyn (typ hemolizy na agarze z krwią), wytwarzanie enzymów (np. katalazy, oksydazy), czy też charakterystyczne dla mniejszej liczby lub wręcz dla pojedynczych gatunków próby, takie jak wytwarzanie koagulazy, toksyn i inne. Istotną pomoc w identyfikacji niektórych bakterii (pałeczki jelitowe, paciorkowce) stanowią cechy antygenowe wykrywane badaniami serologicznymi.

    Metody

    Próby biochemiczne wykonywane w celu identyfikacji bakterii W praktyce określa się następujące właściwości biochemiczne:

    związane z metabolizmem azotowym,

    związane z metabolizmem węglowodanów,

    związane z metabolizmem lipidów,

    związane z procesami oddechowymi (enzymy red-ox).

  • 52

    Podłoża, na których określa się właściwości biochemiczne należą do grupy pożywek diagnostycznych. Niektóre próby biochemiczne wykrywające obecność tych samych enzymów lub produktów często możemy wykonać w różny sposób. Poniżej przedstawiono kilkanaście podstawowych prób w najczęściej stosowanych wariantach.

    Metabolizm azotowy Właściwości proteolityczne - rozkład żelatyny (metoda probówkowa) Pożywka z żelatyną w temperaturze pokojowej (ok. 22

    oC) ma konsystencję

    stałą, ale w cieplarce (37oC) jest płynna. Posiana bakteriami, które mają

    enzym – żelatynazę, po długim zazwyczaj okresie inkubacji, ulega stałemu upłynnieniu i nie daje się zestalić przez obniżenie temperatury. Wytwarzanie H2S – na podłożu Kliglera Podłoże Kliglera wykorzystywane jest głównie w diagnostyce Enterobacteriaceae. Służy ono do oceny wytwarzania przez bakterie H2S, ale także zdolności rozkładu glukozy i laktozy. Ma ono postać półskosu o barwie łososiowej. Bakterie należy posiać do słupka i na skos. Wynik odczytuje się po 24 godzinnej inkubacji w 37

    0C. Wytwarzany siarkowodór

    reaguje z jonami żelaza, a powstający siarczek żelaza powoduje zaczernienie podłoża. Wytwarzanie indolu z tryptofanu Badane bakterie posiewa się na wodę peptonową zawierającą DL-tryptofan. Po 24 godzinnej inkubacji w 370C na podłoże należy nawarstwić zmodyfikowany odczynnik Ehrlicha. Zawiera on p-dimetylo-amino-benzaldehyd, alkohol amylowy i stężony HCl. Jeżeli bakterie rozłożyły tryptofan pojawia się ciemnoróżowa obrączka w górnej warstwie pożywki. Rozkład mocznika Zdolność bakterii do wytwarzania ureazy – enzymu rozkładającego mocznik do amoniaku i dwutlenku węgla bada się na podłożu Christensena z mocznikiem. W podłożu zawarty jest wskaźnik pH - czerwień krezolowa. Powstający amoniak alkalizuje podłoże, co powoduje zmianę jego zabarwienia z żółtego na różowe.

  • 53

    Metabolizm węglowodanów Wykrywanie zdolności rozkładu cukrów przez bakterie o małych wymaganiach Bakterie posiewa się do probówek zawierających wodę peptonową z dodatkiem 1% cukru oraz wskaźnik pH: purpurę bromokrezolową (fioletowa w pH obojętnym; żółta w kwaśnym) lub błękit bromotymolowy (zielony w pH obojętnym; żółty w kwaśnym). Dodatkowo do probówek wkładane są dnem do góry tzw. rurki Durhama, w których niekiedy w wyniku rozkładu cukru może zbierać się gaz. Po 24 godzinnej inkubacji w 37

    0C rozkład cukru prowadzi do zakwaszenia środowiska i zmiany

    zabarwienia podłoża. Zestaw prób dla kilku cukrów nazywa się zwykłym szeregiem cukrowym. Wykrywanie drogi rozkładu cukru: fermentacja czy utlenianie, na podłożu Hugh-Leifsona. Bakterie posiewa się do dwóch probówek ze świeżo przygotowanym, wygotowanym bezpośrednio przed użyciem podłożem. Powierzchnia, jednego z nich pokrywana jest płynną parafiną. Podłoże jako wskaźnik pH zawiera błękit bromotymolowy. W przypadku bakterii nie rozkładających cukru barwa podłoża się nie zmienia. Natomiast jeśli bakterie rozkładają cukier tylko w warunkach tlenowych zmienia się barwa pożywki w probówce bez parafiny. Zmiana barwy w obu probówkach świadczy o wykorzystywaniu cukru na drodze fermentacji. Wykorzystanie podłoża stałego dla oceny rozkładu laktozy - podłoże MacConkeya Podłoże MacConkeya służy do izolacji pałeczek gramujemnych. Jest to podłoże diagnostyczne, ale zawiera też takie składniki jak sole żółciowe i fiolet krystaliczny, które decydują o jego słabej wybiórczości i hamują wzrost bakterii gramdodatnich. Zawarta w podłożu laktoza, jeśli jest rozkładana (bakterie laktozododatnie), zakwasza środowisko co manifestuje się różowym zabarwieniem kolonii zależnym od wskaźnika – czerwieni obojętnej. Bakterie laktozoujemne rosną w postaci kolonii w kolorze nie posianej pożywki.

  • 54

    Metabolizm lipidowy Wytwarzanie lipaz (esteraz) na podłożu z Tween 80 W celu sprawdzenia zdolności bakterii do wytwarzania lipaz posiewa się je na płytkę z podłożem agarowym z dodatkiem Tween 80 (polietyleno-sorbitol jednooleinowy) i chlorku wapniowego. Wynik ocenia się po 48 godzinach inkubacji. Wokół kolonii bakterii wytwarzających lipazy pojawia się strefa zmętnienia. Jest ona wynikiem reakcji uwolnionych przez lipazy kwasów tłuszczowych z obecnymi w pożywce jonami wapnia powodującej powstanie nierozpuszczalnych mydeł wapniowych.

    Wytwarzanie enzymów utleniająco-redukujących Wytwarzanie katalazy Katalaza rozkłada H2O2 do H2O i O2. Jej wytwarzanie sprawdza się poprzez zawieszenie badanych bakterii w kropli 3% wody utlenionej umieszczonej na szkiełku podstawowym. Można także dodać wodę utlenioną bezpośrednio do hodowli. Pojawiające się pęcherzyki tlenu świadczą o obecności katalazy.

    Badanie zdolności hemolitycznych bakterii Hemolizyny bakterii mają zdolność niszczenia krwinek czerwonych ludzi i zwierząt. Ich wytwarzanie sprawdza się na podłożu agarowym zawierającym 5% krwi baraniej. Po odpowiedniej dla danych bakterii inkubacji ocenia się czy nastąpił rozpad krwinek. Wyróżnia się dwa typy hemolizy:

    α hemoliza – widoczna jest na płytce krwawej w postaci zielonej strefy wokół kolonii, co jest wynikiem częściowego rozpadu krwinek (przekształcenie hemoglobiny do methemoglobiny);

    β hemoliza – widoczna na płytce krwawej jako pełne przejaśnienie wokół kolonii, powstałe wskutek całkowitej lizy krwinek i wyługowania barwnika.

  • 55

    Wielkość stref hemolizy może być różna dla różnych gatunków czy szczepów.

    Zestawy prób biochemicznych do identyfikacji bakterii W laboratoriach zajmujących się rutynową diagnostyką mikrobiologiczną do identyfikacji drobnoustrojów stosowane są gotowe, standaryzowane zestawy testów biochemicznych. Najczęściej mają one postać płytek pleksiglasowych z dołkami lub galeryjek z pojemniczkami wypełnionymi substratami dostosowanymi do identyfikacji danej grupy bakterii. Zmiany barwy zawartości studzienek po dodaniu badanego szczepu, inkubacji i jeśli trzeba, odpowiednich odczynników, umożliwiają odczytanie wyników i przy użyciu książki kodowej zidentyfikowanie zwykle do gatunku.

    Zadania do wykonania Zadanie 1. Badanie niektórych cech biochemicznych bakterii wykorzystywanych do ich identyfikacji Opisz wszystkie przedstawione na ćwiczeniach demonstracje w poniższej tabeli:

    Metabolizm azotowy

  • 56

    Metabolizm węglowodanów

  • 57

    Metabolizm lipidowy

    Enzymy utleniająco-redukujące

  • 58

    Właściwości biologiczne

    Szybkie testy biochemiczne

  • 59

    Rozdział 6

    Dezynfekcja, antyseptyka, konserwacja Część teoretyczna Ważnymi czynnikami kształtującymi skład ekosystemów są czynniki fizyczne, takie jak: temperatura, pH, wilgotność, ciśnienie osmotyczne, potencjał oksydacyjno-redukcyjny, a także promieniowanie. Związki chemiczne zawarte w środowisku mają także istotne znaczenie dla różnorodności i liczebności populacji żyjących w nim mikroorganizmów. Znajomość stopnia indywidualnej wrażliwości poszczególnych gatunków bakterii na te czynniki pozwala je namnażać w warunkach laboratoryjnych, ale także ograniczać ich rozprzestrzenianie, sprawować nad nimi kontrolę. Temperatura jest jednym z czynników najsilniej oddziałujących na drobnoustroje. Dla większości bakterii temperatura nieco poniżej 0

    oC jest

    bójcza, gdyż tworzące się kryształki lodu niszczą struktury komórki. Nagłe obniżenie temperatury do kilkudziesięciu stopni poniżej zera (–70oC), szczególnie w obecności glicerolu, nie uszkadza komórek i pozwala zachować żywotność przez długie okresy czasu. Podwyższenie temperatury otoczenia powyżej maksymalnej temperatury kardynalnej powoduje śmierć drobnoustrojów. Drobnoustroje różnią się wrażliwością na podwyższoną temperaturę, większość z nich ginie po 30 minutach ogrzewania w temperaturze około 60oC, jednak niektóre z nich, a także zarodniki grzybów czy przetrwalniki bakterii, znoszą nawet bardzo wysokie temperatury. Inne warunki środowiskowe mogą wpływać na skutek działania wysokiej temperatury na drobnoustroje. W środowisku wodnym są one bardziej wrażliwe na wysoką temperaturę niż w stanie wysuszenia. Obecność węglowodanów, białek i tłuszczów chroni je przed działaniem ciepła, zaś sole obecne w środowisku mogą podwyższać lub obniżać ciepłooporność, zależy to od rodzaju soli i drobnoustroju.

  • 60

    Kwasowość środowiska może stymulować lub hamować rozwój drobnoustrojów. Optymalne dla rozwoju większości drobnoustrojów pH mieści się w granicach 6,5-7,5. Bakterie chorobotwórcze rozwijają się najlepiej w pH obojętnym lub lekko alkalicznym, grzyby preferują środowisko lekko kwaśne, a wirusy zachowują zakaźność w pH 5 do 8. Niekorzystny dla bakterii odczyn środowiska jest często czynnikiem wspomagającym procesy dekontaminacji np. pod wpływem temperatury. Woda to podstawowy składnik i warunek rozwoju drobnoustrojów, ale niektóre z nich mogą w stanie wysuszenia przetrwać wiele lat (np. prątki gruźlicy). Oporność drobnoustrojów na wysychanie zwiększa obecność w środowisku materii organicznej (materiał kliniczny, żywność, kosmetyki). Obecność wody sprzyja procesom dekontaminacji. Dla ciśnienia osmotycznego drobnoustroje wykazują dużą tolerancję, ale tylko nieliczne bakterie mogą przeżywać i rozwijać się w środowisku hipertonicznym, i fakt ten wykorzystuje się w praktyce do konserwacji produktów spożywczych. Wysokie ciśnienie osmotyczne może stanowić o wybiórczości podłoży np. do hodowli grzybów. Promieniowanie ultrafioletowe (UV) i jonizujące działa na drobnoustroje w zależności od dawki i czasu ekspozycji mutagennie lub letalnie. Promieniowanie ultrafioletowe (dł. fali 230 - 270 nm) działa najsilniej przy długości fali 260 nm. Jest ono wybiórczo pochłaniane przez zasady purynowe i pirymidynowe kwasów nukleinowych i powoduje ich uszkodzenie. Największą, chociaż zróżnicowaną, wrażliwość na działanie promieniowania UV wykazują formy wegetatywne bakterii, znacznie bardziej oporne są wirusy i przetrwalniki bakterii, a najbardziej oporne są zarodniki pleśni. Drobnoustroje w otoczeniu człowieka mogą stanowić zagrożenie, które minimalizuje się stosując następujące zabiegi określane wspólnym mianem dekontaminacji.

    Dezynfekcja to proces usuwania drobnoustrojów ze środowiska i powierzchni przedmiotów. Zakłada się, że w procesie dezynfekcji giną formy wegetatywne bakterii i grzybów chorobotwórczych, a ilość pozostałych drobnoustrojów ulega maksymalnemu zmniejszeniu. Zatem dezynfekcja nie eliminuje wszystkich drobnoustrojów, w tym

  • 61

    przetrwalników czy niektórych wirusów. Procesem prowadzącym do usunięcia wszystkich form życia (a zatem, wszystkich drobnoustrojów i ich form) z określonego materiału jest omówiona w rozdziale 7 sterylizacja.

    Dezynfekcję powinna poprzedzać, jeśli to możliwe, sanityzacja. Polega ona na zmniejszeniu liczby drobnoustrojów na przedmiotach i skórze za pomocą środków myjących i czyszczących.

    Antyseptyka to eliminacja lub hamowanie rozwoju drobnoustrojów na żywych tkankach – skórze i błonach śluzowych.

    Aseptyka to zgodne z określonymi procedurami postępowanie, które ma na celu zapobieganie zakażeniu. Takie postępowanie obowiązuje w laboratoriach mikrobiologicznych, w medycynie zabiegowej, aptekach, zakładach farmaceutycznych oraz produkujących kosmetyki i żywność, także w gabinetach kosmetycznych. W pracy aseptycznej wykorzystuje się procesy sanityzacji, dezynfekcji i sterylizacji.

    Konserwacja ma na celu zapobieganie rozwojowi drobnoustrojów i zabezpieczenie produktu przed wtórnym (w czasie użytkowania) skażeniem. Konserwuje się m.in. żywność, leki, preparaty biologiczne, produkty stosowane w kosmetologii.

    Środki dezynfekcyjne, antyseptyczne i konserwujące to związki chemiczne mające zdolność niszczenia lub hamowania rozwoju drobnoustrojów.

    Metody Dezynfekcję można przeprowadzać metodami z zastosowaniem czynników fizycznych (temperatury, promieniowania, filtracji) i przy użyciu związków chemicznych. W czasie gotowania w temperaturze wrzenia wody (100oC) – dekoktacji w ciągu 10 minut ginie większość form wegetatywnych drobnoustrojów, ale przeżywają przetrwalniki i niektóre wirusy.

  • 62

    Pasteryzacja – ogrzewanie w temperaturze 62oC przez 30 minut

    lub gwałtowne podniesienie temperatury na 15 sekund do 72oC powoduje

    zabicie form wegetatywnych drobnoustrojów chorobotwórczych, maleje także ogólna liczba drobnoustrojów. Dezynfekcja za pomocą promieniowania UV niszczy przede wszystkim formy wegetatywne drobnoustrojów, wirusy i przetrwalniki są bardziej oporne. Ze względu na nieprzenikliwość promieniowania UV, skuteczność tej metody jest ograniczona. Działanie ultradźwiękami pozwala na dokładne oczyszczenie sprzętu (sanityzacja), ale usuwane są także drobnoustroje, z których znaczna część ginie w wyniku zniszczenia osłon komórkowych. Ta metoda czasem poprzedza sterylizację w autoklawie. Znaczne ograniczenie liczby drobnoustrojów w płynach lub gazach można osiągnąć przez filtrację. Stopień oczyszczenia zależy od wielkości porów zastosowanego filtra. Większość bakterii zatrzymywana jest przez filtry

    o średnicy porów 0,45 m. Znanych jest wiele grup związków chemicznych o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Większość z n