tom 47 zeszyt 1 rok 2008 · 2017-03-02 · RADA REDAKCYJNA JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski),...

http://www.pm.microbiology.pl

RADA REDAKCYJNA

JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), MIECZYS£AW K. B£ASZCZYK (SGGW Warszawa),RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski), JERZY D£UGOÑSKI (Uniwersytet £ódzki),

DANUTA DZIER¯ANOWSKA (Centrum Zdrowia Dziecka), EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy),JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków),

MAREK JAKÓBISIAK (Akademia Medyczna w Warszawie), ANDRZEJ PASZEWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN),ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski), ANTONI RÓ¯ALSKI (Uniwersytet £ódzki),

BOHDAN STARO�CIAK (Akademia Medyczna w Warszawie), BOGUS£AW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdañski),EL¯BIETA TRAFNY (Wojskowy Instytut Higieny i Epidemiologii),

STANIS£AWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Pañstwowy Zak³ad Higieny),GRZEGORZ WÊGRZYN (Uniwersytet Gdañski), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski)

REDAKCJA

JERZY HREBENDA (redaktor naczelny), JACEK BIELECKI (zastêpca),BOHDAN STARO�CIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich)

Adresy redakcji

Redaktorzy:Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski

ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (0 22) 554 13 05/304, fax (0 22) 554 14 04e-mail: [email protected]; [email protected]

SekretarzZak³ad Mikrobiologii Farmaceutycznej, Akademia Medyczna

ul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa, tel. (0 22) 628 08 22, (0 22) 621 13 51e-mail: [email protected]

PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY

Redaktor odpowiedzialny: STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA (Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie)

Adres Redaktora dzia³u Publikacje Metodyczne i Standardy

Katedra i Zak³ad Mikrobiologii i Immunologii Pomorskiej Akademii Medycznej, Al. Powstañców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin,tel./fax: (091) 46 616 51, 52, lub fax: (091) 46 616 59, e-mail: [email protected] lub [email protected]

Stali recenzenci:

JERZY D£UGOÑSKI (Uniwersytet £ódzki), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków),JÓZEF KUR (Politechnika Gdañska), EUGENIUSZ MA£AFIEJ (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki),

ANNA PRZONDO-MORDARSKA (Akademia Medyczna we Wroc³awiu)

CZASOPISMO WYDAWANE Z FINANSOW¥ POMOC¥KOMITETU BADAÑ NAUKOWYCH

Index Copernicus ICV = 3,43 (2007)

Na ok³adce:

Koegzystencja grzybni Paecilomyces sp. (¿ó³ta w centrum) z koloni¹ Bacillus sp.(w kszta³cie spl¹tanego sznura) na p³ytce z agarem od¿ywczym.

Coexistence of Paecilomyces sp. (yellowish one in the centre) and Bacillus sp.(rope-shaped) on an nutrient agar plate.

Fot. dr Jerzy Pi¹tkowski, Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Wydzia³ Nauk Przyrodniczych,Uniwersytet Wroc³awski

Projekt ok³adki: Jerzy Grzegorkiewicz

P O L S K I E T O W A R Z Y S T W O M I K R O B I O L O G Ó W

Nak³ad 1150 + 15 egz., Objêto�æ 10 arkuszy wyd., Papier offser 80 g

Sk³ad i druk:Zak³ad Wydawniczy Letter Quality, 01-216 Warszawa, Brylowska 35/38,tel. 0 22 631 45 18, 0 607 217 879, e-mail: [email protected]

POST. MIKROBIOL.,2008, 47, 1, 3�4http://www.pm.microbiology.pl

Wanda Wo�niak urodzi³a siê 23.06.1928 r. w War-szawie-Golêdzinowie. W latach 1935�1941 uczêsz-cza³a do Publicznej Szko³y Powszechnej, a nastêpnieprzez 3 lata do Pañstwowego Gimnazjum im. Hoffma-nowej w Warszawie, które w okresie wojny by³o tajn¹szko³¹, wystêpuj¹ca pod nazw¹ szko³y gospodarczej.Powstanie Warszawskie zasta³o j¹ w Otwocku. Poroku samodzielnej nauki, w 1945 zda³a, koñcz¹cy gim-nazjum, egzamin z ma³ej matury w Otwocku. Równie¿w Otwocku, po nauce w liceum, zda³a maturê w 1947 r.i w tym samym roku rozpoczê³a studia na WydzialeFarmaceutycznym Akademii Medycznej w Warsza-wie, uzyskuj¹c 31.12.1952 dyplom magistra farmacji.

Cztery lata pó�niej rozpoczê³a studia humanistycz-ne na Wydziale Filologicznym Uniwersytetu Warszaw-skiego, uzyskuj¹c w 1962 absolutorium na WydzialeFilologii Polskiej.

W 1974 r. w Warszawie po�lubi³a Tadeusza JózefaParnowskiego.

Pracê w Instytucie Leków, z którym zwi¹zana by³aprzez 50 lat, zaczyna³a jeszcze w okresie studiów� 07.04.1952 r. Przeby³a kolejne etapy kariery pracow-nika naukowego, od asystenta (1952�1954), st. asy-stenta (1954�1960), przez adiunkta (1960�1973), do-centa (1973�1984), a¿ do profesora (1984�2002). Pracêw Instytucie Leków rozpoczê³a w Pracowni Mikrobio-logicznego Badania Witamin Zak³adu Badania Orga-nopreparatów i Witamin, przekszta³conego nastêpniew Zak³ad Biochemii. W okresie 1962�1967 zatrudnio-na by³a w Zak³adzie Farmakologii, gdzie od pocz¹tku1963 r. kierowa³a Pracowni¹ Badañ Mikrobiologicz-nych, a od 01.12.64 by³a kierownikiem Pracowni Che-mioterapii Mikrobiologicznej. W 1967 r. zosta³a kie-rownikiem Samodzielnej Pracowni Kontroli Ja³owo�ciP³ynów Iniekcyjnych i Infuzyjnych, zajmuj¹cej siêkontrol¹ ja³owo�ci leków i materia³ów medycznych.W zwi¹zku z narastaj¹c¹ liczb¹ badañ mikrobiologicz-nych oraz ich ró¿norodno�ci¹, w Instytucie Lekówutworzono Zak³ad Mikrobiologii Farmaceutycznej,którego kierownikiem by³a od 01.10.1975 do koñca1996 r. Jednocze�nie w okresie 01.02.1984�11.04.1990pe³ni³a funkcjê Zastêpcy Dyrektora Instytutu Lekówds. kontroli jako�ci leków. Po odej�ciu na emeryturêz koñcem 1999r, nadal zatrudniona by³a na pe³nymetacie w Instytucie Leków, do 28.09.2002 r.

W swojej pracy zawodowej najpierw zajmowa³asiê mikrobiologicznymi metodami oznaczania witamini aminokwasów w lekach i materiale biologicznym.

Uzyskane wyniki sta³y siê przedmiotem rozprawy dok-torskiej pt: �Mikrobiologiczne badanie zawarto�cipodstawowych aminokwasów w hydrolizatach ludz-kiego osocza�, wykonanej pod kierunkiem prof. dr hab.Edmunda Mikulaszka. Po zdaniu egzaminu z mikro-biologii i po obronie doktoratu, na Wydziale Farma-ceutycznym Akademii Medycznej w Warszawie, dnia02.07.1962 otrzyma³a stopieñ doktora farmacji.

W Zak³adzie Farmakologii Instytutu Leków zajmo-wa³a siê pracami dotycz¹cymi badañ ja³owo�ci. W roku1966, kiedy Pracownia Mikrobiologii zosta³a prze-kszta³cona w Samodzieln¹ Pracowniê Mikrobiologii,zakres pracy zwi¹zany z mikrobiologiczn¹ analiz¹ le-ków rozszerzy³ siê o ocenê dzia³ania przeciwbakteryj-nego zwi¹zków o dzia³aniu tuberkulostatycznym. PaniProfesor opracowa³a tak¿e metody mikrobiologiczneoznaczania aminokwasów, co pozwoli³o na zastosowa-nie nowych metod w badaniach bia³ek krwi w stanachfizjologicznych i patologicznych. Metody te wykorzy-sta³a w badaniu spektrum bia³ek w przebiegu gru�licyeksperymentalnej. Przez osiem miesiêcy, w latach1967�68, pracowa³a w Instytucie Pasteura, gdzie pro-wadzi³a badania sk³adu aminokwasowego bia³ek BCG.Prace te sta³y siê podstaw¹ rozprawy habilitacyjnej.Dnia 20.06.1969, na podstawie rozprawy pt: �Badanianad zmianami ilo�ciowymi i jako�ciowymi bia³ek oso-cza w gru�licy do�wiadczalnej �winek morskich� i pokolokwium habilitacyjnym na Wydziale Farmaceu-tycznym Akademii Medycznej w Krakowie uzyska³astopieñ doktora habilitowanego nauk mikrobiologicz-nych, który zosta³ zatwierdzony w 1972 r.

Równolegle do badañ naukowych, po powrocie zestypendium we Francji, w 1968 r. rozpoczê³a pracenad nowym w Polsce zagadnieniem � ocen¹ czysto�ci

Profesor dr hab. n. farm.Wanda Wo�niak-Parnowska

1928�2007

4 WANDA WO�NIAK-PARNOWSKA (1928�2007)

mikrobiologicznej leków nieparenteralnych. Uzyskanewyniki by³y przedmiotem konferencji naukowej zorga-nizowanej w pa�dzierniku 1969 r. w Instytucie Leków.W tym roku równie¿ rozpoczê³a prace nad opracowa-niem norm dotycz¹cych badañ mikrobiologicznychleków i materia³ów medycznych dla �Compendium Me-dicamentorum� przygotowywanego w ramach RWPG.

Rozwiniêciem tych zainteresowañ by³a redakcjaksi¹¿ki �Mikrobiologiczne metody badañ leków i mate-ria³ów biologicznych� wydanej przez PZWL w 1973 r.,w której by³a autorem wielu rozdzia³ów.

Zainteresowanie problemami mikrobiologii farma-ceutycznej kontynuowane a¿ do koñca pracy w Insty-tucie spowodowa³o, ¿e Pani Profesor by³a bardzocenionym fachowcem w tej dziedzinie.

Opublikowa³a ponad 100 prac naukowych zwi¹za-nych g³ównie z kontrol¹ mikrobiologicznej jako�ciproduktów leczniczych i wyrobów medycznych, asep-tycznym wytwarzaniem leków, badaniem aktywno�ciprzeciwdrobnoustrojowej zwi¹zków chemicznych, pre-paratów antyseptycznych i dezynfekcyjnych, badaniemskuteczno�ci �rodków konserwuj¹cych a tak¿e wali-dacj¹ procesów sterylizacji. Wielokrotnie bra³a udzia³w zjazdach krajowych i zagranicznych, wyg³asza³areferaty i prezentowa³a wyniki badañ w postaci plaka-tów. Wyg³asza³a wyk³ady we Wszechnicy PAN orazby³a autork¹ dwóch filmów edukacyjnych, bra³a kil-kakrotnie udzia³ w imprezach organizowanych przezUniwersytet Warszawski i PAN w ramach FestiwaluNauki. By³a promotorem 2 prac doktorskich wykona-nych w Instytucie Leków.

Bra³a udzia³ w opracowaniu szeregu monografiimikrobiologicznych do V wydania Farmakopei Pol-skiej. Przez kilka lat by³a przewodnicz¹c¹ podkomisjimikrobiologii w Komisji Farmakopei Polskiej. Ponad-to, w ramach dzia³alno�ci dydaktycznej prowadzonejw Instytucie Leków oraz w Katedrze Farmacji Cen-trum Medycznego Kszta³cenia Podyplomowego, pro-wadzi³a szkolenia dotycz¹ce metod mikrobiologicz-nych analizy leków oraz higieny procesu wytwarzaniaproduktów leczniczych, dla pracowników przemys³u,laboratoriów kontrolnych i placówek naukowych.Wielokrotnie wizytowa³a zak³ady przemys³u farma-ceutycznego, uczestnicz¹c w rozwi¹zywaniu aktual-nych problemów mikrobiologicznych.

Bieg³a znajomo�æ jêzyków francuskiego i angiel-skiego, a tak¿e niemieckiego oraz studia filologicznepomaga³y jej w pracy naukowej i dydaktycznej.

Uchwa³¹ Rady Pañstwa z 27.10.1983 nadano doc.Wandzie Wo�niak-Parnowskiej tytu³ naukowy profe-sora nadzwyczajnego nauk farmaceutycznych, Mini-ster Zdrowia i Opieki Spo³ecznej Tadeusz Szelachow-ski powo³a³ J¹ w dniu 01.02.1984 na stanowiskoprofesora nadzwyczajnego w Instytucie Leków.

Ponadto uzyska³a specjalizacjê II° w zakresie mi-krobiologii i serologii. Z pocz¹tkiem 1983 r. powo³ana

zosta³a na stanowisko zastêpcy, a po roku na stano-wisko przewodnicz¹cego Zespo³u Specjalistycznegow dziedzinie farmacja na okres 3 lat.

Od 1970 roku by³a cz³onkiem Zespo³u Mikrobiolo-gicznego Miêdzynarodowej Federacji Farmaceutycznej� FIP (Federation International of Pharmacy) i aktyw-nie uczestniczy³a w jej pracach (w latach 90-tych jednoze spotkañ tego Zespo³u FIP zorganizowa³a w Warsza-wie pod opiek¹ Instytutu Leków). Wspó³praca nauko-wa i teoretyczna z FIP pozwoli³a na szybkie docieraniedo naszego kraju miêdzynarodowych opinii i osi¹gniêænaukowych dotycz¹cych badañ ja³owo�ci i czysto�cimikrobiologicznej leków oraz zwi¹zanych z ograni-czaniem niebezpieczeñstwa tzw. zaka¿eñ odlekowych.Waga istniej¹cego problemu spowodowa³a, ¿e RadaNaukowa przy Ministrze Zdrowia zleci³a Pani Profesoropracowanie odpowiedniej monografii. Praca pt: �Mi-krobiologiczne ska¿enie leków� zosta³a opublikowanaw 1975 r. W tym samym roku Pani prof. W. Wo�niak-Parnowska napisa³a ksi¹¿kê pt: �Konserwacja leków�.

By³a podporucznikiem pomocniczej s³u¿by wojsko-wej kobiet i prowadzi³a sprawy wojskowo-obronnew Instytucie Leków. Bra³a udzia³ w obradach komisjiRWPG w kraju i za granic¹.

Zosta³a odznaczona Srebrnym Krzy¿em Zas³ugi(1976), odznak¹ �Za wzorow¹ Prace w S³u¿bie Zdro-wia� (1982), nagrod¹ specjaln¹ II stopnia MZiOS �Zaszczególne osi¹gniêcia w pracy na rzecz ochrony zdro-wia i pomocy spo³ecznej� oraz honorowym medalemim. £ukasiewicza, nadawanym osobom ze �rodowiskafarmaceutycznego.

Pani prof. dr hab. Wanda Wo�niak-Parnowska by³aaktywnym cz³onkiem towarzystw naukowych: Pol-skiego Towarzystwa Badañ Radiacyjnych, PolskiegoTowarzystwa Mikrobiologów (przez dwie kadencjeby³a Przewodnicz¹c¹ Oddzia³u Warszawskiego PTMi w roku 1983 organizowa³a XX Zjazd PTM), Polskie-go Towarzystwa Farmaceutycznego (w latach 1996�1999 by³a Prezesem Oddzia³u Warszawskiego PTF).

Pod koniec swojej pracy w Instytucie Leków,w zwi¹zku z jubileuszem 50-lecia Instytutu napisa³aciekaw¹, bogato ilustrowan¹ ksi¹¿kê: �Instytut Leków1951�2001 Dzieje � ludzie � dokonania�, wydan¹w 2001 roku przez Instytut Leków. Równolegle przygo-towa³a rozprawê: �Charakterystyka naukowego dorobkuInstytutu Leków (1951�2002)�, opublikowan¹ w perio-dyku Instytutu Historii Nauki PAN Analecta w 2002 r.

Pani prof. dr hab. Wanda Wo�niak-Parnowska za-koñczy³a pracê w Instytucie Leków tu¿ przed jegoprzekszta³ceniem w Narodowy Instytut Zdrowia Pu-blicznego (01.10 2002). Zmar³a 26.12.2007 r. i zosta³apochowana na Cmentarzu Komunalnym d. Wojsko-wym na Pow¹zkach.

Stefan TyskiZak³ad Mikrobiologii i Antybiotyków

Narodowy Instytut Leków


1. Wstêp

Wirus JC (JC virus, JCV) nale¿y do rodzaju Polyo-mavirus znajduj¹cego siê w obrêbie rodziny Polyoma-viridae (wcze�niej by³ klasyfikowany w rodziniePapovaviridae). Materia³ genetyczny cz¹steczki wi-rusa stanowi dwuniciowy kolisty DNA wielko�ci ok.5130 pz (par zasad) [30]. Jego naturalnym i jedynymgospodarzem jest cz³owiek [21]. JCV jest ma³o znanymwirusem, choæ bardzo powszechnie wystêpuj¹cymw populacji �wiatowej. Obecno�æ przeciwcia³ anty-JCVstwierdza siê u ok. 90% osób na �wiecie [11]. Nato-miast, wed³ug szacunków ekspertów ok. 40% ludzi toosoby zaka¿one nim, co oznacza, ¿e w ich moczu znaj-duje siê wirusowe DNA, wykrywalne metod¹ PCR [2].Wirusa JC po raz pierwszy wyizolowano w 1970 r.,od osoby chorej na postêpuj¹c¹ wieloogniskow¹ leuko-encefalopatiê (progressive multifocal leucoencephalo-pathy � PML), chorobê polegaj¹c¹ na demielinizacjio�rodkowego uk³adu nerwowego (OUN) [12]. W j¹d-rach zaka¿onych komórek mikrogleju wykryto wirionyo budowie typowej dla poliomawirusa, którego nazwa-no od inicja³ów pacjenta wirusem JC [12]. Okaza³o siêpó�niej, ¿e JCV jest czynnikiem etiologicznym PML[38]. Choæ JCV jest szeroko rozpowszechniony w�ród

ludzi, to nie jest patogenny dla wiêkszo�ci z nich, wy-wo³uj¹c jedynie przelotne zaburzenia uk³adu moczo-wego u nielicznych osób. Wirus ten uaktywnia siê do-piero w wyniku os³abienia uk³adu immunologicznego,np. na skutek podawania leków immunosupresyjnychpo przeszczepach organów [38]. U osób bez zaburzeñimmunologicznych PML prawie siê nie spotyka.

Celem tego artyku³u jest ogólne przedstawieniewiedzy dotycz¹cej wirusa JC oraz jego zwi¹zku z nie-którymi schorzeniami, zwi¹zanymi z os³abieniem uk³a-du immunologicznego oraz nowotworami przewodupokarmowego i mózgu.

2. Budowa wirusa JC

2.1. Kapsyd

Wirion JCV zawiera ikozaedralny kapsyd o �red-nicy 45�50 nm [34]. Kapsyd liczy 72 kapsomery zbu-dowane z trzech bia³ek kodowanych przez genomwirusa: VP1, o d³ugo�ci 360 reszt aminokwasowych(360 cz¹steczek tego bia³ka przypada na wirion), VP2o d³ugo�ci 350 reszt aminokwasowych (30�60 cz¹ste-czek) i VP3 o d³ugo�ci ok. 230 reszt aminokwasowych(30�60 cz¹steczek) [34].

ROLA WIRUSA JC W PATOGENEZIECHORÓB NOWOTWOROWYCH I ZABURZEÑ

ZWI¥ZANYCH Z OS£ABIENIEM ODPORNO�CI

Dariusz Kmieciak, Szymon Dêbicki

Katedra Biochemii i Biologii Molekularnej Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiegoul. �wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ, tel. (0-61) 8546516; faks (0-61) 8546510, e-mail: [email protected]

Wp³ynê³o w styczniu 2008

1. Wstêp. 2. Budowa wirusa JC. 2.1. Kapsyd. 2.2. Genom. 2.3. Cykl replikacyjny. 3. Sposób zaka¿enia i zmienno�æ JCV. 4. Rola JCVjako czynnika etiologicznego w schorzeniach o�rodkowego uk³adu nerwowego i przewodu pokarmowego. 4.1. Udzia³ JCV w postê-puj¹cej wieloogniskowej leukoencefalopatii. 4.2. Mechanizm molekularny wp³ywu JCV na rozwój nowotworów. 4.2.1. Nowotworyprzewodu pokarmowego. 4.2.2. Guzy mózgu. 5. Podsumowanie

Role of the JC virus in the pathogenesis of cancer diseases and disorders associated with compromised immunity

Abstract: JC virus is a common human virus, found by PCR analysis in the urine of about 40% of tested individuals. In case ofserious immune deficiency, like AIDS, some cancers or after organ transplantation, JCV can infect and proliferate in neural tissue. Itresults in a demyelinating disease of the brain, progressive multifocal leukoencephalopathy (PML). Recent reports have also pointedto a role of JCV in cancerogenesis, in which viral proteins, particularly large antigen T, are involved. It applies to different braintumors and cancers of gastrointestinal tract, especially esophageal carcinomas, gastric cancers and colon rectal carcinomas. The aimof this article is to describe molecular mechanisms of the JCV-mediated oncogenesis.

1. Introduction. 2. JC virion structure. 2.1. Capsid. 2.2. Genome. 2.3. Replication cycle. 3. Infection mode and heterogeneity of JCV.4. JCV as an etiological agent in diseases of central nervous system and gastrointestinal tract. 4.1. Role of JCV in progressivemultifocal leucoencephalopathy. 4.2. Molecular mechanism of JCV influence on tumor development. 4.2.1. Cancers of gastrointestinaltract. 4.2.2. Brain tumors. 5. Conclusion

S³owa kluczowe: wirus JC, du¿y antygen T, guzy mózgu, nowotwory przewodu pokarmowegoKey words: JC virus, large antigen T, brain tumors, cancers of gastrointestinal tract

6 DARIUSZ KMIECIAK, SZYMON DÊBICKI

2.2. Genom

Genom JCV stanowi dwuniciowy, superhelikalniezwiniêty, kolisty DNA o d³ugo�ci 5130 pz [30] (Rys. 1).Organizacja genomu wirusa JC jest bardzo konserwa-tywna i podobna do genomów innych poliomawiru-sów: SV40 i BK [30]. Homologia miêdzy SV40 i JCVwynosi 69%, a pomiêdzy genomami BK i JCV siêga75% [30]. W genomie JCV mo¿na wyró¿niæ trzyregiony: tzw. wczesny i pó�ny region koduj¹cy orazregion regulatorowy (transcriptional control region� TCR) [30] (Rys. 1). Region TCR zawiera liczne, za-chodz¹ce na siebie sekwencje regulatorowe, a tak¿emiejsce pocz¹tku replikacji (ori), wzmacniacze orazwczesne i pó�ne promotory, z których bezpo�redniozachodzi transkrypcja odpowiednich genów wczesnychi pó�nych [30]. W obrêbie TCR znajduj¹ siê sekwen-cje, rozpoznawane przez niektóre komórkowe czynnikitranskrypcyjne takie jak: c-Jun i c-Fos tworz¹ce ro-dzinê AP-1 (activating protein 1 family) oraz czynnikNF-1X (Nuclear factor 1X) [56]. Bliskie s¹siedztwomiejsc wi¹zania obu czynników w promotorze JCVwskazuje na mo¿liwo�æ ich interakcji miêdzy sob¹.Badania in vitro wykaza³y, ¿e czynnik NF-1X wp³ywana zwiêkszenie produkcji bia³ek wirusowych [56].Na wi¹zanie NF-1X oddzia³ywuje negatywnie c-Jun,który w ten sposób obni¿a produkcjê bia³ek wiruso-wych, a co zatem idzie, mo¿e regulowaæ poziom ak-tywno�ci wirusa JC [56].

Produkty wczesnego regionu koduj¹cego, tzw. an-tygeny T, pojawiaj¹ siê jako pierwsze w procesie trans-krypcji zaraz po wnikniêciu wirusa do j¹dra i jego od-

p³aszczeniu, i bior¹ udzia³ w stymulacji komórki go-spodarza do wytwarzania enzymów potrzebnych doreplikacji DNA komórkowego, przygotowuj¹c tym sa-mym komórkê do replikacji wirusowego DNA [63].Bia³ka pó�nego regionu koduj¹cego czyli bia³ka kap-sydu (viral proteins 1�3; VP1, VP2 i VP3) oraz agno-proteina powstaj¹ dopiero po replikacji wirusowegogenomu i nie bior¹ bezpo�redniego udzia³u w ekspre-sji informacji genetycznej wirusa [34].

Wczesny prekursorowy mRNA wirusa JC podlegaalternatywnemu sk³adaniu (splicing) do piêciu dojrza-³ych transkryptów, koduj¹cych bia³ka: du¿y antygen T(T-Ag), ma³y antygen t (t-ag), T�(165), T�(136) orazT�(135) [51]. Wszystkie te bia³ka posiadaj¹ jednakowekoñce aminowe (N-koñce) z³o¿one z 81 reszt amino-kwasowych. Poza tym ka¿de bia³ko charakteryzuje siêw³asnym unikalnym koñcem karboksylowym (C-ko-niec), z wyj¹tkiem T-Ag i T�(165), u których C-koñcepokrywaj¹ siê [51]. Obecno�æ podobnych sekwencjimiêdzy bia³kami wczesnymi wirusa JC sugeruje, ¿e an-tygeny te wchodz¹ w interakcje miêdzy sob¹, a funk-cjonaln¹ domen¹, która odpowiada za te oddzia³ywaniajest domena N-koñcowa [51]. Najlepiej zbadanym bia³-kiem wczesnym wirusa JC jest du¿y antygen T (T-Ag)[34]. Oko³o 95% T-Ag jest zlokalizowane w j¹drzekomórki gospodarza [34]. Wystêpuje tam w nukleoplaz-mie w formie wolnej lub zasocjowanej z chromatyn¹i macierz¹ j¹drow¹ [34]. Antygen T jest wieloczynno�-ciowym bia³kiem, które poprzez bezpo�rednie interak-cje z czynnikami komórkowymi bierze udzia³ w regu-lacji cyklu komórkowego i przetrwaniu komórki [66].Wykazano, ¿e czynniki c-Jun oraz c-Fos potrafi¹ zna-cz¹co zmniejszyæ replikacjê i transkrypcjê genów JCV[41]. Wynika to m.in. z fizycznej interakcji pomiêdzyc-Jun, a bia³kiem regulatorowym wirusa T-Ag [41].Jak siê wydaje, jest to jeden ze sposobów w jaki du¿yantygen T-Ag powoduje transregulacjê promotorówzarówno wirusowych, jak i komórkowych, której skut-kiem s¹ zmiany w ekspresji genów [66]. Wreszcie,T-Ag jest jedynym bia³kiem wirusowym wymaganymdo replikacji w³asnego DNA, wi¹¿¹c siê z nim i wyka-zuj¹c aktywno�æ helikazy [3, 66]. Antygen T ulegamodyfikacjom potranslacyjnym g³ównie przez fosfo-rylacjê reszt seryny i treoniny, ale równie¿ przez o-gli-kozylacjê, acylacjê, adenylacjê, ADP-rybozylacjê [66].Ma³y antygen t (t-ag) jest bia³kiem bogatym w cyste-inê, zlokalizowanym g³ównie w j¹drze komórkowymgospodarza, rzadziej w cytoplazmie. Posiada zdolno�æwi¹zania siê z niektórymi bia³kami komórkowymi,czego efektem mo¿e byæ stymulacja wzrostu komórki[34]. Bia³ka T�(135), T�(136), T�(165) s¹ izoformamidu¿ego antygenu T, które powstaj¹ w wyniku alterna-tywnego sk³adania prekursorowego wczesnego mRNA.Podobnie jak du¿y antygen T, mog¹ wi¹zaæ siê z nie-którymi bia³kami regulacyjnymi komórki, takimi jak:

Rys. 1. Schemat genomu wirusa JCKolisty dwuniciowy DNA, o d³ugo�ci ok. 5130 pz, podzielony jest nadwa regiony. Wczesny region koduj¹cy, obejmuje geny dla ma³ego anty-genu t (t-ag) oraz du¿ego antygenu T (T-Ag), wraz z jego formamipowstaj¹cymi w wyniku alternatywnego sk³adania: T�(165), T�(136)i T�(135). Pó�ny region koduj¹cy zawiera gen bia³ka pomocniczego agno-proteiny (LP1) oraz geny bia³ek kapsydu VP1-3. Pomiêdzy nimi znajdujesiê region regulatorowy (TCR), w którym znajduje siê miejsce startu repli-kacji (ori), a tak¿e sekwencje promotorowe i regulatorowe dla wczesnegoi pó�nego regionu koduj¹cego. Numeracja zasad (podana w kpz) rozpo-czyna siê od miejsca ori i biegnie zgodnie z ruchem wskazówek zegara.

7ROLA WIRUSA JC W PATOGENEZIE CHORÓB NOWOTWOROWYCH I ZABURZEÑ ZWI¥ZANYCH Z OS£ABIENIEM ODPORNO�CI

p107 i p130, nale¿¹cymi do rodziny pRB (wiêcej w dal-szej czê�ci tekstu), upo�ledzaj¹c ich funkcje, i w kon-sekwencji doprowadzaj¹c do nowotworzenia [8].

Pó�ny rejon koduj¹cy wirusa JC zawiera geny agno-proteiny (inaczej bia³ko LP1 � leader protein 1) oraztrzech bia³ek kapsydu: VP1, VP2, VP3. Agnoproteinajest 71-aminokwasowym bia³kiem o masie cz¹steczko-wej 8 kD, produkowanym w pó�nej fazie cyklu repli-kacyjnego wirusa, jednak¿e nie stwierdza siê jej wy-stêpowania w wirionie [15, 26]. W komórkach mo¿naj¹ znale�æ g³ównie w cytoplazmie, szczególnie w rejo-nach oko³oj¹drowych, podczas gdy w j¹drze wystêpujew ma³ych ilo�ciach [15]. Podobn¹ lokalizacjê obser-wowano w komórkach transfekowanych plazmidamizawieraj¹cymi gen agnoproteiny [15]. Przypuszczalniebia³ko to pe³ni rolê regulatorow¹ w replikacji i ekspre-sji genów wirusa, jak równie¿ w sk³adaniu wirionówi ich rozprzestrzenianiu [15, 40]. Liczne badania poka-za³y równie¿, ¿e agnoproteina ma mo¿liwo�æ wi¹zaniasiê do innych bia³ek wirusowych (np. T-Ag), jak rów-nie¿ do czynników komórkowych takich jak: p53 orazKu70 i Ku80, dereguluj¹c cykl komórkowy [14, 15].Obecno�æ samej agnoproteiny, bez innych bia³ek wiru-sa JC, wp³ywa hamuj¹co na wzrost komórek poprzezzatrzymanie ich g³ównie w fazie G2/M [14]. Obserwu-je siê wtedy równie¿ zmniejszon¹ aktywno�æ cyklin Ai B [14]. Dodatkowo, agnoproteina wywiera toksycznywp³yw na komórkê poprzez hamowanie i uniemo¿li-wianie naprawy uszkodzonego DNA [15]. Pod jej wp³y-wem zwiêksza siê w komórce liczba pofragmentowa-nych chromosomów oraz pojawiaj¹ siê zgrupowaniafragmentów j¹dra [15]. Rola agnoproteiny w hamowa-niu procesu naprawy DNA polega na jej wi¹zaniu siêdo dwóch czynników, Ku70 i Ku80, bior¹cych udzia³w tym procesie i inaktywacji ich [15]. Modulacja dzia-³ania bia³ek Ku70 i Ku80 mo¿e byæ jednym z wa¿nychczynników steruj¹cych cyklem ¿yciowym wirusa JC,a tak¿e przyczyn¹ nowotworzenia [15]. W przypadkukoinfekcji astrocytów ludzkich wirusami JCV i HIV-1,zaobserwowano spadek poziomu replikacji HIV-1,z równoczesnym niewielkim podniesieniem poziomureplikacji JCV [37]. Za efekt ten mo¿e byæ odpowie-dzialna agnoproteina, gdy¿ eksperymenty wykaza³y, ¿ewi¹¿e siê ona z bia³kiem Tat HIV-1 [37]. W ten sposóbhamuje ona jego interakcjê z sekwencj¹ docelow¹ RNAHIV-1, TAR, a tak¿e z cyklin¹ T1, bia³kiem bêd¹cympodjednostk¹ tzw. pozytywnego czynnika b elongacjitranskrypcji (positive transcription elongation factorb, P-TEFb), z podjednostk¹ p65 czynnika NF-kappaBoraz z czynnikiem Sp1 [37, 55]. W przypadku zabu-rzonej funkcji Tat, polimeraza RNA II nie przeprowa-dza wydajnej transkrypcji genów HIV-1 z miejscastartu tj. z LTR (Long Terminal Repeat) wirusa, sekwen-cji zawieraj¹cej miejsca wi¹zania ró¿nych komórko-wych czynników transkrypcyjnych [37, 55].

2.3. Cykl replikacyjny

W cyklu replikacyjnym JCV mo¿na wyró¿niæ dwiefazy: wczesn¹ i pó�n¹. Faza wczesna obejmuje adsorp-cjê wirusów do komórki i trwa do rozpoczêcia repli-kacji wirusowego DNA [34]. W tym czasie cz¹steczkiwirusa ³¹cz¹ siê z powierzchni¹ komórki, wykorzystu-j¹c do tego celu reszty kwasu sjalowego obecne w re-ceptorach glikoproteinowych [22, 31, 32]. Na podsta-wie badañ z u¿yciem cz¹steczek wirusopodobnych,tzw. VLP (virus-like particles), zawieraj¹cych na swo-jej powierzchni tylko g³ówne bia³ko kapsydu VP1,

Rys. 2. Wej�cie wirusa JC do komórkiW adsorpcji JCV do komórki uczestnicz¹ reszty kwasu sjalowego, bêd¹-cego sk³adnikiem glikoprotein powierzchniowych. Nastêpnie dochodzido po³¹czenia z receptorem. Doniesiono, ¿e tak¹ rolê pe³ni receptorserotoninowy. W wyniku endocytozy zale¿nej od klatryny, bia³ka, któreuczestniczy w uformowaniu siê pêcherzyka endosomalnego, wirus wcho-dzi do �rodka komórki. Jak siê s¹dzi, JCV, podobnie jak i inne ligandy,przechodzi typow¹ drogê, polegaj¹c¹ na skierowaniu do wczesnych endo-somów, a potem podlega sortowaniu, decyduj¹cemu o tym, czy znajdziesiê w endosomie powracaj¹cym na powierzchniê komórki czy te¿ w endo-somie pó�nym i/lub lizosomie. W przypadku wirusa JC, etapy te s¹ nadalw trakcie badañ. Po dotarciu w pobli¿e j¹dra wirion opuszcza endosomi zostaje zwi¹zany z importyn¹ ", która rozpoznaje sygna³ lokalizacjij¹drowej (NLS) obecny na powierzchni bia³ka kapsydu VP1. Importyna" tworzy heterodimer z importyn¹ $, która z kolei rozpoznaje kompleksporowy j¹dra (nuclear pore complex, NPC). W rezultacie wirion wnikaprzez ten kompleks do j¹dra, gdzie ulega odp³aszczeniu i dochodzi do

transkrypcji genów wirusowych.


skonstruowano prawdopodobny mechanizm penetracjiwirusa JC [52, 53] (Rys. 2). Po wnikniêciu do komórkidrog¹ endocytozy zale¿nej od bia³ka komórkowegoklatryny, cz¹steczki wirusa zamkniête w endosomachulegaj¹ przemieszczaniu w kierunku j¹dra komórko-wego. Opuszczenie endosomów przez wiriony nastê-puje dopiero przy zewnêtrznej stronie b³ony j¹drowej[52, 53]. Samo wej�cie wirusa JC do j¹dra nastêpujeprzez kompleks porowy j¹dra (nuclear pore complex� NPC) przy udziale importyn " i $ [52, 53]. Jest tomo¿liwe gdy¿ importyna " rozpoznaje sygna³ lokali-zacji j¹drowej (nuclear localization signal � NLS)obecny w bia³ku kapsydowym VP1 [52, 53] (Rys. 2).W j¹drze komórkowym genom wirusowy ulega od-p³aszczeniu i zachodzi jego transkrypcja z u¿yciempolimerazy RNA II gospodarza, prowadz¹ca do po-wstania mRNA wczesnych [63]. Na tych mRNA syn-tetyzowane s¹ wirusowe bia³ka wczesne � antygeny T,które stymuluj¹ komórkê gospodarza do wytwarzaniaenzymów potrzebnych do replikacji DNA komórko-wego, przygotowuj¹c tym samym komórkê do repli-kacji DNA wirusowego [63]. Proces ten zachodzidziêki zdolno�ci antygenu T do aktywacji ekspresjigenów komórkowych oraz w³asnych [63]. Geny wiru-sowe s¹ aktywowane po zwi¹zaniu siê T-Ag z rejo-nem wzmacniacza transkrypcji promotora wiruso-wego. Antygen T wi¹¿e siê tak¿e z polimeraz¹ DNA "oraz z innymi bia³kami odpowiedzialnymi za regula-cjê wzrostu komórki [62, 63].

Faza pó�na cyklu replikacyjnego wirusa JC roz-poczyna siê wraz z inicjacj¹ replikacji DNA wiru-sowego [34]. Jednak¿e trzeba zaznaczyæ, ¿e sam pro-ces replikacji nie jest do koñca poznany w przypadkuwirusa JC, a przedstawiana wiedza w tym zakresieopiera siê na badaniach nad innym, blisko spokrew-nionym wirusem SV40. Replikacja zachodzi w j¹drzekomórki gospodarza i bierze w niej udzia³ antygen T(T-Ag) oraz enzymy komórkowe [63]. Sze�æ cz¹ste-czek antygenu T, dziêki jego zdolno�ci do wi¹zaniaDNA i aktywno�ci helikazowej, przy³¹cza siê do DNAwirusa w miejscu startu replikacji i katalizuje roz-platanie nici DNA [3]. Po rozpleceniu nici DNA bia³-ko to tworzy kompleks z bia³kiem replikacyjnym A(RPA), tworz¹c kompleks preinicjuj¹cy replikacjê, doktórego przy³¹cza siê nastêpnie "-prymaza polimera-zy DNA, przekszta³caj¹c go w kompleks inicjacyjny[62]. Synteza DNA zachodzi w dwóch kierunkachwokó³ kolistego DNA wirusa. Przesuwanie siê wide-³ek replikacyjnych u³atwione jest dziêki aktywno�cihelikazowej antygenu T [3]. W fazie pó�nej zachodzirównie¿ ekspresja genów pó�nych koduj¹cych bia³kakapsydu wirusa, sk³adanie cz¹steczek wirusa w j¹drzezaka¿onej komórki oraz uwolnienie wirusa z komórki[34]. Proces uwolnienia wirusa JC prowadzi do lizykomórek [20].

3. Sposób zaka¿enia i zmienno�æ JCV

Dane serologiczne wskazuj¹, ¿e bezobjawowe infek-cje JCV czêsto zdarzaj¹ siê u ma³ych dzieci [65]. Pozaka¿eniu JCV utrzymuje siê w komórkach gospoda-rza z regu³y przez ca³e jego ¿ycie. Prawdopodobniewirus JC dostaje siê do organizmu cz³owieka drog¹pokarmow¹ (gdzie stwierdza siê jego obecno�æ) wrazz zanieczyszczon¹ wod¹ i ¿ywno�ci¹ [5]. Czêsto wy-krywany jest w migda³kach co sugeruje, ¿e mo¿e tobyæ pocz¹tkowe miejsce jego infekcji [44]. Po wnik-niêciu do organizmu wirus JC pozostaje w tkance ner-kowej, replikuj¹c siê na relatywnie niskim poziomiei mo¿e byæ izolowany z moczu [7]. W nerkach JCVpozostaje w fazie utajonej, nie przechodz¹c pe³negocyklu replikacyjnego i tym samym nie doprowadza dolizy komórek [65]. Wirus JC mo¿e równie¿ uaktyw-niaæ siê (tzw. aktywna infekcja) in vivo w stanachznacznego os³abienia uk³adu immunologicznego go-spodarza [19, 65]. Wówczas wnika do neuronów wy-korzystuj¹c, jak siê wydaje, ich receptory serotonino-we [23]. Poza tkank¹ nerkow¹ i mózgow¹ wirus JCmo¿e byæ wykrywany, jak wspomniano, w migda³-kach, a tak¿e w okrê¿nicy, wêz³ach ch³onnych, szpikukostnym, �ledzionie i w¹trobie, oraz innych tkankachwliczaj¹c osocze krwi i limfocyty [44, 24]. Te ostatnieprawdopodobnie s³u¿¹ wirusowi do przemieszcza-nia siê miêdzy nerkami (a tak¿e innymi tkankami),a o�rodkowym uk³adem nerwowym [17].

Forma wirusa zwykle wykrywana w moczu nazy-wana jest JCV archetypowym (archetype) i zawierapojedyncz¹ kopiê sekwencji wirusowego promotorai wzmacniacza w rejonie regulatorowym (TCR) [27,48]. Drugi wariant wirusa JC, nazywany przestawionym(rearranged), jest kojarzony z aktywn¹ infekcj¹ wirusaw mózgu, spowodowan¹ immunosupresj¹ gospodarza,np. w wyniku zaka¿enia wirusem HIV-1 [27, 28, 48].Ta forma posiada delecje i/lub duplikacje niektórych se-kwencji regulatorowych, co w konsekwencji prowadzido zmiany tropizmu tkankowego oraz potencja³u pa-togennego wirusa JC, przyczyniaj¹c siê do powstaniatakich chorób jak postêpuj¹ca wieloogniskowa leuko-encefalopatia (PML) i niektóre nowotwory [27, 28, 48].

Epidemiologicznie wirusy JC mo¿na podzieliæ naprzynajmniej siedem typów wystêpuj¹cych w ró¿nychobszarach geograficznych [2]. Klasyfikacja wirusówoparta jest o jego ró¿ne sekwencje w rejonie koduj¹-cym bia³ko kapsydu VP1 oraz w rejonie regulatorowym(TCR) [2]. Ró¿nice w sekwencjach miêdzy poszczegól-nymi typami wynosz¹ od 1�3% [1]. Typ 1 wystêpujeg³ównie w Europie, typy 2 i 7 s¹ charakterystyczne dlaAzji, a typy 3 i 6 dla Afryki. Ka¿dy typ mo¿e mieæ kil-ka podtypów, ró¿ni¹cych siê nieznacznie genotypami(0,5�1%) [35]. Charakterystycznymi typami dla krajówrozwiniêtych Europy oraz USA s¹: 1A, 1B oraz 2 [1, 2].


4. Rola JCV jako czynnika etiologicznegow schorzeniach o�rodkowego uk³adunerwowego i przewodu pokarmowego

4.1. Udzia³ JCV w postêpuj¹cej wieloogniskowejleukoencefalopatii

JCV jest g³ównie kojarzony jako czynnik etiologicz-ny zespo³u klinicznego o nazwie postêpuj¹ca wieloog-niskowa leukoencefalopatia (PML) [38, 39]. W 1958 r.ukaza³ siê pierwszy opis tego zespo³u, charakteryzuj¹-cego siê niedow³adem po³owicznym, zaburzeniami mo-wy i widzenia, otêpieniem oraz nieuchronnym zgonemchorego w ci¹gu kilku miesiêcy [12]. Nale¿y podkre�-liæ, ¿e PML, rzadko opisywana, wystêpuje najczê�cieju starszych osób, u których ju¿ wcze�niej stwierdzonoschorzenie uk³adu siateczkowo-�ródb³onkowego [39].Pierwsze trzy przypadki opisano u pacjentów chorychna bia³aczkê limfatyczn¹ b¹d� na chorobê Hodgkina[12]. Uszkodzenia mózgu polegaj¹ na pojawianiu siêlicznych ognisk demielinizacji tkanki nerwowej orazoligodendrocytów o nieprawid³owej budowie, któres¹ g³ównym miejscem aktywnej infekcji JCV [12]. Tecechy kliniczne i patologiczne odzwierciedla nazwazespo³u chorobowego � postêpuj¹ca wieloogniskowaleukoencefalopatia (PML). W leczeniu PML stosowa-no i wykazano niewielk¹ skuteczno�æ cytarabiny, alew praktyce rokowanie w przypadku tej choroby jestzawsze niepomy�lne [12]. PML a¿ do niedawna by³astosunkowo rzadk¹ chorob¹. Wiêkszego znaczenia na-bra³a ostatnio, jako objaw lub powik³anie AIDS, co niejest zaskakuj¹ce u tych chorych, maj¹cych tak bardzoupo�ledzon¹ odporno�æ. PML powoduje �mieræ oko³o5% chorych na AIDS [4]. Zasugerowano, ¿e po-wi¹zanie pomiêdzy zaka¿eniem HIV-1, a rozwojemPML wynika przynajmniej czê�ciowo z produkcji licz-nych cytokin w centralnym uk³adzie nerwowym w od-powiedzi na infekcjê HIV-1 [43]. Zwi¹zek przeciw-zapalny, cyklosporyna A, zapobiegaj¹c aktywacjiczynnika transkrypcyjnego zwanego j¹drowym czyn-nikiem aktywowanych komórek T 4 (nuclear factorof activated T cells 4, NFAT4), hamowa³ zaka¿eniekomórek gleju wirusem JC [43]. Z kolei sam NFAT4,jak wykazano, wi¹za³ siê do sekwencji promotoro-wych wirusa JC, aktywuj¹c w ten sposób transkryp-cjê zarówno genów wczesnych, jak i pó�nych, a pro-dukty genów wczesnych dodatkowo wzmacnia³y efektNFAT4 [43]. Udzia³ NFAT4 w zaka¿eniu centralnegouk³adu nerwowego przez JCV sugeruje zaanga¿owa-nie �cie¿ki sygna³owej z u¿yciem jonów wapnia w celuaktywacji tego czynnika [43].

Badania wykaza³y obecno�æ genów wirusa JCw leukocytach 40,3% pacjentów chorych na AIDS [20].Dla porównania u zdrowych ludzi procent ten wynositylko 8 [20]. W wyniku analizy próbek mózgu pobra-

nych od osób z PML, zarówno HIV-pozytywnych, jaki HIV-negatywnych, stwierdzono obecno�æ naciekówzapalnych (inflammatory infiltrates) wewn¹trz i wokó³zmienionej chorobowo tkanki [71]. Nacieki te zawie-ra³y g³ównie limfocyty T CD8+, prawdopodobnie roz-poznaj¹ce antygeny wirusowe [71].

4.2. Mechanizm molekularny wp³ywu JCVna rozwój nowotworów

Drug¹ wa¿n¹ grup¹ schorzeñ, w których postulujesiê udzia³ wirusa JC jako czynnika etiologicznego, s¹nowotwory [69]. Zaburzaj¹c cykl komórkowy JCVwp³ywa na komórkê gospodarza powoduj¹c jej przej�-cie z fazy G1 do fazy S, co w efekcie prowadzi donieograniczonej i niekontrolowanej proliferacji komór-kowej [66]. G³ównym elementem wirusa JC, który od-powiada za rozwój nowotworu jest jedno z bia³ekwczesnych wirusa, du¿y antygen T (T-Ag) [58, 69].Molekularny mechanizm dzia³ania antygenu T polegana wi¹zaniu siê do dwóch g³ównych czynników kon-troluj¹cych cykl komórkowy, tj. bia³ek nale¿¹cych dorodziny pRB (retinoblastoma protein family): p107i p130 oraz p53, powoduj¹c ich inaktywacjê i zaburze-nia w przebiegu cyklu komórkowego [9, 42] (Rys. 3).

Rys. 3. Udzia³ wirusa JC w nowotworzeniuW cyklu komórkowym bia³ka pRB i p53 zapobiegaj¹ zbyt wczesnemupodzia³owi komórki (pRB) oraz nagromadzeniu siê szkodliwych muta-cji (p53). Zwi¹zanie pRb z czynnikiem transkrypcyjnym E2F powoduje,¿e nie ulegaj¹ ekspresji kluczowe bia³ka odpowiedzialne za przej�ciekomórki z fazy G1(G0) do fazy S cyklu. Du¿y antygen T (T-Ag) wirusa JCwi¹¿e siê z pRB, przez co czynnik E2F zostaje uwolniony i aktywujetranskrypcjê genów odpowiedzialnych za proliferacjê materia³u gene-tycznego i podzia³ komórki. Dodatkowo, T-Ag wi¹¿e bia³ko p53, którepe³ni rolê w utrzymaniu integralno�ci genomu poprzez wp³yw na eks-presjê czynników bior¹cych udzia³ w naprawie DNA w przypadku jegouszkodzenia, a gdy uszkodzenia s¹ zbyt du¿e, w zahamowaniu podzia³ukomórki i wyindukowaniu apoptozy. Procesy te prowadz¹ do akumulo-wania siê zmian w materiale genetycznym i niekontrolowanego podzia³ukomórki, która przez to mo¿e przekszta³ciæ siê w komórkê nowotworow¹.


Bia³ka pRb reguluj¹ przej�cie komórki z fazy G1(G0)do fazy S cyklu komórkowego, natomiast p53 w przy-padku uszkodzenia genomu komórki zatrzymuje cyklw fazie G1, umo¿liwiaj¹c naprawê materia³u genetycz-nego. Gdy uszkodzenia s¹ zbyt du¿e, kieruje ono ko-mórkê na drogê apoptozy [9, 42].

Antygen T wi¹¿e siê z pRB po³¹czonym w kom-pleksie z czynnikiem transkrypcyjnym E2F (E2F/pRB),co prowadzi do rozbicia kompleksu E2F/pRB. Uwol-niony w ten sposób czynnik transkrypcyjny E2F akty-wuje liczne geny komórkowe, odpowiedzialne za wej�-cie komórki w fazê S cyklu komórkowego [9, 70](Rys. 3). Formy alternatywne du¿ego antygenu T,T�(135), T�(136) i T�(165) równie¿ wi¹¿¹ bia³ka z ro-dziny pRB oraz wzmacniaj¹ replikacjê wirusowegoDNA [29]. Prawdopodobnie, mimo ¿e posiadaj¹ tak¹sam¹ sekwencjê poczynaj¹c od koñca aminowego,formy alternatywne T�(135), T�(136) i T�(165) wi¹¿¹czynniki p107 oraz p130 i zmieniaj¹ poziom ich fos-forylacji w ró¿nym stopniu, ale dzia³aj¹c wspólnie,inaktywuj¹ bia³ka regulatorowe cyklu komórkowego,w koñcu prowadz¹c do transformacji komórkowej [8].Aktywno�æ samego antygenu T-Ag, jak równie¿ jegoform alternatywnych, tak¿e zale¿y od fosforylacji kon-serwatywnej reszty treoniny w miejscu 125 (T125)[66]. Mutacja tego miejsca polegaj¹ca na zamianie tre-oniny na alaninê powoduje powstanie niestabilnej for-my T-Ag, ale trzy bia³ka alternatywne T� zachowuj¹swoje w³a�ciwo�ci i wi¹za³y, chocia¿ ze s³abszym po-winowactwem, bia³ka rodziny pRB, jednak¿e nie by³yzdolne do uwolnienia czynnika transkrypcyjnego E2Fz kompleksów RB-E2F [66]. Co ciekawe, zarówno an-tygen T-Ag, jak i jego formy alternatywne T�, z muta-cj¹ polegaj¹c¹ na zamianie T125 na asparaginian, wi¹-za³y bia³ka pRB, p107 i p130, silniej ni¿ bia³ka typudzikiego, a dodatkowo formy T� wydajnie uwalnia³yczynnik E2F z kompleksów RB-E2F [66]. Jak siê wy-daje, w fosforylacji treoniny 125 bierze udzia³ kinazazale¿na od cykliny, w kompleksie z ni¹ (cyclin-cyclin-dependent kinase), co wskazywa³oby na to, ¿e tefunkcje T-Ag i trzech form T�, które odpowiadaj¹ zareplikacjê wirusa i transformacjê onkogenn¹, s¹ regulo-wane w sposób zale¿ny od cyklu komórkowego [66].

W przypadku p53 antygen T wi¹¿e siê z odpowied-ni¹ domen¹ tego bia³ka (odpowiedzialn¹ za oddzia³y-wania z DNA), przez co blokuje dostêp p53, jakoczynnika transkrypcyjnego, do odpowiednich sekwen-cji w DNA (koduj¹cych czynniki bior¹ce udzia³ w na-prawie DNA lub w apoptozie komórki) i tym samymhamuje ich transkrypcjê [34, 42] (Rys. 3).

Wskazano równie¿ na wp³yw du¿ego antygenu Tna �cie¿kê sygna³ow¹ aktywowan¹ przez substrat dlareceptora insulinowego 1 (insulin receptor substrate 1,IRS-1), g³ówn¹ cz¹steczkê sygna³ow¹ receptora insu-linopodobnego czynnika wzrostu I (insulin-like growth

factor I receptor, IGF-IR) [57]. Po translokacji IRS-1do j¹dra, w czym uczestniczy T-Ag, IRS-1 wi¹¿e bia³-ko Rad51 na miejscu uszkodzonego DNA powoduj¹chamowanie jego naprawy na zasadzie rekombinacjihomologicznej (homologous recombination directedDNA repair, HRR) [57]. W efekcie dochodzi do aku-mulacji mutacji w komórce, a wraz z nimi do nie-stabilno�ci genetycznej, naruszaj¹cej integralno�æmateria³u genetycznego. Zarówno wadliwa naprawauszkodzonego DNA, czy te¿ defekty w zachowaniutelomerów, rozdzia³u chromosomów, mog¹ z koleiprzyczyniæ siê do rozwoju nowotworów [57]. Ponie-wa¿ wiadomo, ¿e du¿y antygen T JCV posiada zdol-no�æ transformacji komórek in vitro, jak i przyczyniasiê do powstawania nowotworów u zwierz¹t do�wiad-czalnych, opisany powy¿ej mechanizm jego wp³y-wania na naprawê DNA mo¿e odgrywaæ wa¿n¹ rolêw powstawaniu nowotworów u cz³owieka [57].

4.2.1. Nowotwory przewodu pokarmowego

Liczne do�wiadczenia potwierdzi³y wysok¹ czês-totliwo�æ wystêpowania sekwencji genu T-Ag, a tak¿ewydajn¹ syntezê T-Ag w nowotworach przewodu po-karmowego, np. w raku prze³yku, ¿o³¹dka, jelita orazokrê¿nicy, co ma, jak siê wydaje, zwi¹zek z postulo-wanym sposobem zaka¿enia tym wirusem, tj. poprzezzanieczyszczon¹ wodê i ¿ywno�æ [10, 19, 46, 61]. Naprzyk³ad w tkankach nowotworowych okrê¿nicy (co-lon rectal carcinoma) sekwencje DNA wirusa JC, jakrównie¿ blisko spokrewnionego wirusa BK, zosta³yzidentyfikowane u 16 z 18 badanych pacjentów co sta-nowi 88,9% [10]. Natomiast badania przeprowadzonew Japonii wykaza³y, ¿e du¿y antygen T zosta³ ziden-tyfikowany w 6 z 23 próbek tkanek raka okrê¿nicy, costanowi 26,1%. [36]. Jednocze�nie nie wykryto w nichsekwencji swoistych dla bia³ka otoczki VP1 i agno-proteiny [36]. W doniesieniu z USA wykazano meto-d¹ PCR obecno�æ wczesnych sekwencji wirusowychw 22 z 27 próbek raka okrê¿nicy [25]. W ponad 50%pozytywnych przypadków stwierdzono ekspresjê bia-³ek T-Ag oraz agnoproteiny, ale nie bia³ek otoczki[25]. Nieobecno�æ tych ostatnich sugeruje, ¿e w ko-mórkach zmienionych nowotworowo nie dochodzi doreplikacji wirusa zakoñczonej pojawieniem siê wi-rionów potomnych [25, 36]. W komórkach rakachokrê¿nicy antygen T mo¿e wchodziæ w interakcjez beta-katenin¹ (beta-catenin), bia³kiem, którego ilo�æw cytozolu, a nastêpnie w j¹drze zwiêksza siê w wyni-ku aktywacji �cie¿ki sygna³owej Wnt [25]. W j¹drze$-katenina wchodzi w interakcje ze swoistymi czyn-nikami transkrypcyjnymi, stymuluj¹c w ten sposóbekspresjê genów, m.in. c-myc, którego produkt akty-wuje cykl komórkowy i proliferacjê [25]. W przypadkurównoczesnej produkcji i obecno�ci tych dwóch bia³ek,


tj. T-Ag oraz beta-kateniny, dochodzi do wzmocnieniatranskrypcji z promotora genu c-myc [25, 58]. Ponadto,w nowotworach okrê¿nicy antygen T wirusa JC pro-wadzi, jak siê wydaje, komórki do niestabilno�ci ge-netycznej i epigenetycznej, w³a�nie poprzez interakcjêm.in. z beta-katenin¹ i p53, co przejawia siê w postacizmienionych chromosomów [33, 47, 58]. Powód nie-stabilno�ci chromosomalnej polegaj¹cej na delecjach,duplikacjach i rearan¿acjach w komórkach raka okrê¿-nicy jest ci¹gle kwesti¹ w du¿ej mierze do wyja�nienia.W przypadku infekcji poliomawirusami postulowanymechanizm transformacji nowotworowej polega natym, ¿e JCV obecny w przewodzie pokarmowym uak-tywnia siê w przypadku zmian nowotworowych, lubwywo³uje je, i poprzez swoje bia³ko du¿y antygen Tprowadzi do wy¿ej wymienionych procesów uszkadza-j¹cych materia³ genetyczny [47]. Kiedy w ich wynikuw komórkach nowotworowych dojdzie do inaktywacjiwystarczaj¹cej liczby tkankowo swoistych genów ha-muj¹cych proces nowotworzenia, co zapewnia rozwójnowotworu, dalsze transformacje materia³u genetycz-nego spowodowane dzia³aniem wirusa JC mog¹ byæpotencjalnie niebezpieczne dla komórek nowotworo-wych i w jaki� sposób, metod¹ selekcji pozbywaj¹ siêone wirusa [47]. Inne doniesienia wskazuj¹, ¿e obec-no�æ antygenu T-Ag w komórkach raka okrê¿nicywp³ywa na wzór metylacji materia³u genetycznego[33, 64]. W stu przebadanych próbkach tego nowo-tworu ze stwierdzonymi niestabilno�ciami mikrosateli-tarnymi i chromosomalnymi sekwencje DNA w³a�ciwedla T-Ag JCV wykryto metod¹ PCR w 77% przypad-ków [33]. Nastêpnie metod¹ immunohistochemiczn¹w 56% tych pozytywnych przypadków potwierdzonoobecno�æ du¿ego antygenu T [33]. Ponadto sprawdzo-no wzór metylacji regionów promotorowych dziewiê-ciu genów supresorowych, których zmieniona ekspre-sja ma, jak siê s¹dzi, znaczenie w powstawaniu rakaokrê¿nicy i stwierdzono znacz¹c¹ korelacjê (P = 0,01)pomiêdzy obecno�ci¹ T-Ag, a stopniem metylacji pro-motorów tych genów, w porównaniu z próbkami,w których nie wykryto T-Ag [33].

W badaniach dotycz¹cych nowotworów prze³yku(esophageal carcinomas) du¿y antygen T wirusa JCwykryto w 10 z 19 analizowanych próbek (53%),a agnoproteinê w 8 próbkach (42%) [19]. W ¿adnejz 51 próbek z prze³yku, z normaln¹ tkank¹ czy te¿ zezmianami ³agodnymi i przedrakowymi, nie stwierdzo-no obecno�ci tych bia³ek wirusowych [19]. Natomiastw wyniku analizy sekwencji DNA wirusa JC w wybra-nych 5 próbkach pochodz¹cych z raka prze³yku usta-lono, ¿e DNA JCV wystêpuje we wszystkich próbkach(100%), a w badanych 13 próbkach kontrolnych w 11z nich (85%) [19]. Tak du¿a czêsto�æ wystêpowania wiru-sa JC w tkankach prze³yku mo¿e potwierdzaæ hipotezêjego wnikania do organizmu drog¹ pokarmow¹ [5, 19].

Podobnie jak w nowotworach prze³yku, w nowo-tworach ¿o³¹dka (gastric cancers) równie¿ stwier-dzono nastêpuj¹c¹ prawid³owo�æ: obecno�æ sekwencjiDNA wirusa JC swoistych dla genu T-Ag w tkancenowotworowej i w otaczaj¹cej nowotwór tkance nor-malnej, ale tylko w tkance nowotworowej wykazanoekspresjê T-Ag [61]. Z 37 analizowanych próbek no-wotworu ¿o³¹dka, sekwencje DNA swoiste dla du¿egoantygenu T JCV znaleziono w 21 (57%), a w bada-niach 23 próbek, dotycz¹cych obecno�ci bia³ka T-Ag,w 9 uzyskano pozytywny wynik (39%) [61]. Ponadto,doniesienie na temat wykrycia sekwencji DNA wirusaJC w nab³onku gruczo³owym prostaty (prostatic glan-dular epithelium) stwarza mo¿liwo�æ udzia³u JCVw kancerogenezie tego gruczo³u [72].

4.2.2. Guzy mózgu

Du¿¹ grup¹ nowotworów maj¹cych zwi¹zek z wi-rusem JC s¹ guzy mózgu (brain tumors) [68]. Ekspe-rymenty na zwierzêtach dowiod³y potencjalnie wa¿nejroli JCV w etiologii tych nowotworów [68]. Kluczow¹rolê w tej onkogenezie maj¹, wspomniane wcze�niej,trzy bia³ka wirusa: T-Ag, t-ag i agnoproteina [68].Przeprowadzone badania wykaza³y podwy¿szon¹ czê-stotliwo�æ wystêpowania sekwencji genu VP1 oraz se-kwencji TCR wirusa JC w guzach mózgu, co równie¿wskazywa³oby na JCV jako czynnik etiologiczny no-wotworów mózgu [6, 13, 50]. Dla przyk³adu 69%pacjentów z ró¿nymi nowotworami mózgu wykazujeobecno�æ sekwencji genów wczesnych JCV w tychtkankach [18]. W innym badaniu stwierdzono wystê-powanie sekwencji DNA charakterystycznych dla po-liomawirusów w 50% badanych próbek ró¿nych gu-zów mózgu, z czego 40,6% by³o swoistych dla JCV,a pozosta³e dla wirusa BK [16]. Sekwencje te wyizo-lowano z takich guzów mózgu jak: rdzeniak (medullo-blastoma), wy�ció³czak (ependymoma), glejak wielo-postaciowy (glioblastoma), gwia�dziak (astrocytoma),sk¹podrzewiak (oligodendroglioma) oraz innych no-wotworów pochodzenia glejowego [6, 13, 50]. O skalioddzia³ywania JCV na ekspresjê genów w astrocytach�wiadcz¹ eksperymenty in vitro, z u¿yciem technikimikromacierzy (oligonucleotide-based microarray),pozwalaj¹cej zmierzyæ zmiany w wielko�ci transkryp-cji 12600 genów [54]. Zauwa¿ono, ¿e pod wp³ywemJCV nast¹pi³o wzmocnienie transkrypcji prawie 355genów, a zmniejszenie w przypadku 130 genów [54].Wiele z tych genów, których ekspresja wzros³a, kodujebia³ka, które, jak siê s¹dzi, pe³ni¹ rolê w proliferacjikomórki [54]. Podobne badania, przeprowadzone z u¿y-ciem ludzkich komórek zarodkowych gleju (primaryhuman fetal glial cells) potwierdzi³y powy¿sze donie-sienie [67]. Stwierdzono w nich zmiany w ekspresjiw ponad 400 genach [67]. Podobnie, produkty wielu


z nich wp³ywaj¹ na wzrost komórki i oddzia³ywaniamiêdzykomórkowe [67]. Ponadto, zauwa¿ono zwiêk-szenie ekspresji genów zale¿nych od interferonu:STAT1 (signal transducer and activator of transcrip-tion 1), ISG56 (interferon stimulating gene 56), MxA(myxovirus resistance 1), syntetaza 2�5�-oligoade-nylowa (2�5�-oligoadenylate synthetase) i cig5 [67].Wskazuje to na siln¹ odpowied� przeciwwirusow¹,jak¹ wzbudza JCV, co prawdopodobnie przyczynia siêdo jego kontroli u osób bez zaburzeñ uk³adu immuno-logicznego [67].

Sekwencje wirusa JC mo¿na wykryæ w tkance no-wotworowej, jak i w p³ynie mózgowo-rdzeniowym,choæ badanie p³ynu wydaje siê obni¿aæ liczbê wykry-tych pozytywnych przypadków. Na przyk³ad 9 spo-�ród 22 próbek nowotworów mózgu zawiera³o se-kwencje wirusa JC (40,9%), ale spo�ród 15 próbekp³ynu mózgowo-rdzeniowego pobranych od chorychna raka mózgu, tylko 2 by³y pozytywne (13,3%) [6].

Na zakoñczenie warto dodaæ, ¿e kwestia powi¹-zania wirusa JC z guzami mózgu i jego rola w proce-sie nowotworzenia pozostaje nadal kontrowersyjna.Badania z u¿yciem 60 próbek nowotworów mózgu(w preparatach parafinowych), z których 55 by³o po-chodzenia glejowego (gliomas), 5 rdzeniakami (medul-loblastomas) oraz 15 próbek pochodz¹cych z mózgówz przerostem astrocytów (gliosis) ujawni³y obecno�æDNA JCV swoistego dla regionu VP3 lub T-Ag tylkow 5 przypadkach (3 nowotwory i 2 przerosty), a ¿adnapróbka nie by³a pozytywna w przypadku zastosowa-nia przeciwcia³ swoistych dla antygenu T [45]. Dlakontrastu wszystkie 4 próbki kontrolne uzyskane w wy-niku biopsji post mortem od pacjentów HIV-pozytyw-nych ze zdiagnozowanym PML zawiera³y sekwencjeDNA JCV oraz antygen T [45]. Inne badania przepro-wadzone w dwóch ró¿nych laboratoriach z u¿yciemtych samych 225 próbek guzów mózgu wykaza³yobecno�æ sekwencji poliomawirusów odpowiednio:w 9 (4%) przypadkach, z czego 3 by³y swoiste dlaJCV, 3 dla wirusa BK i 3 dla wirusa SV40 (w jednymlaboratorium); i w 1 przypadku, sekwencji swoistej dlawirusa SV40 (w drugim laboratorium) [59]. Z tychbadañ wynika, ¿e DNA JCV, jak równie¿ innych po-liomawirusów, jest jednak stosunkowo rzadko wykry-walny w próbkach nowotworów mózgu.

5. Podsumowanie

Wirus JC jest ma³o znanym, ale powszechnie wy-stêpuj¹cym wirusem w populacji �wiatowej. Jest onjednym z najbardziej powszechnych wirusów DNA na�wiecie. Poniewa¿ zasiêg JCV obejmuje ca³y glob, faktten jest wykorzystywany do konstruowania filogenezytego wirusa oraz map migracji populacji ludzkiej [49,

60]. W ostatnich latach notuje siê wzrost zainteresowa-nia wirusem JC jako czynnikiem etiologicznym PMLi jego zwi¹zkiem z AIDS [4]. Szereg doniesieñ wska-zuje tak¿e na po�redni i/lub bezpo�redni udzia³ JCVw procesie nowotworzenia [69]. Potwierdzeniem tegotaktu mog¹ byæ oddzia³ywania jednego z bia³ek wirusa� T-Ag z bia³kami supresorowymi nowotworów, cow konsekwencji zmienia ich dzia³anie [9, 42]. Drugimargumentem jest stosunkowo wysoka czêstotliwo�æwystêpowania sekwencji wirusowych w tkankach no-wotworowych jelita i mózgu [10, 61, 68]. Istotnymczynnikiem w cyklu rozwojowym JCV, maj¹cym zna-czenie dla jego patogenno�ci, jest zmiana statusu im-munologicznego gospodarza [65]. Znaczne os³abienieuk³adu siateczkowo-�ródb³onkowego wp³ywa na uak-tywnienie wirusa w mózgu i nieuchronny zgon chore-go w ci¹gu kilku miesiêcy [65]. Dok³adne poznanietego wirusa oraz jego cyklu ¿yciowego i miejsc wystê-powania w zaka¿onych organizmie, sposobu transfor-macji do formy wirulentnej, przyczyni siê do opraco-wania lepszych metod leczenia zaka¿enia tym wirusem.

Pi�miennictwo

1. Agostini H.T., Deckhut A., Jobes D.V., Girones R., SchlunckG., Prost M.G., Frias C., Perez-Trallero E., RyschkewitschC.F., Stoner G.L.: Genotypes of JC virus in East, Central andSouthwest Europe. J. Gen.Virol. 82, 1221�1331 (2001)

2. Agostini H.T., Ryschkewitsch C.F., Stoner G.L.: Genotypeprofile of human polyomavirus JC excreted in urine of im-munocompetent individuals. J. Clin. Microbiol. 34, 159�164(1996)

3. Alexandrov A.I., Botchan M.R., Cozzarelli N.R.: Characte-rization of simian virus 40 T-antigen double hexamersbound to a replication fork. The active form of the helicase.J. Biol. Chem. 277, 44886�44897 (2002)

4. Berger J.R.: Progressive multifocal leukoencephalopathy inacquired immunodeficiency syndrome: explaining the highincidence and disproportionate frequency of the illness rela-tive to other immunosuppressive conditions. J. Neurovirol.1, 38�41 (2003)

5. Boffil-Mass S., Formiga-Cruz M., Clemente-Casares P., Cala-fell F., Girones R.: Potential Trasmission of Human Polyoma-viruses through the Gastrointestinal Tract after Exposure toVirions or Viral DNA. J. Virol. 75, 10290�10299 (2001)

6. Boldorini R., Pagani E., Car P.G., Omodeo-Zorini E., BorghiE., Tarantini L., Bellotti C., Ferrante P., Monga G.: Molecularcharacterisation of JC virus strains detected in human braintumours. Pathology, 35, 248�253 (2003)

7. Boldorini R., Veggiani C., Barco D., Monga G.: Kidney andurinary tract polyomavirus infection and distribution: mole-cular biology investigation of 10 consecutive autopsies. Arch.Pathol. Lab. Med. 129, 69�73 (2005)

8. Bollag B., Kilpatrick L.H., Tyagarajan S.K., Tevethia M.J.,Frisque R.J.: JC virus T�135, T�136 and T�165 proteins inter-act with cellular p107 and p130 in vivo and influence viraltransformation potential. J. Neurovirol. 12, 428�442 (2006)

9. Caracciolo V., Reiss K., Khalili K., De Falco G., Giordano A.:Role of the interaction between large T antigen and Rb family


members in the oncogenicity of JC virus. Oncogene, 25,5294�5301 (2006)

10. Casini B., Borgese L., Del Nonno F., Galati G., Izzo L.,Caputo M., Perrone Donnorso R., Castelli M., Risuleo G.,Visca P.: Presence and incidence of DNA sequences of humanpolyomaviruses BKV and JCV in colorectal tumor tissues.Anticancer Res. 25, 1079�1085 (2005)

11. Chang H., Wang M., Tsai R.T., Lin H.S., Huan J.S., WangW.C., Chang D.: High incidence of JC viruria in JC-seroposi-tive older individuals. J. Neurovirol. 8, 447�451 (2002)

12. Collier L., Oxford J.: Wirusologia. Podrêcznik dla studentówmedycyny, stomatologii i mikrobiologii, PZWL, Warszawa,1996, 328

13. Croul S., Otte J., Khalili K.: Brain tumors and polyomaviru-ses. J. Neurovirol. 9, 173�182 (2003)

14. Darbinyan A., Darbinian N., Safak M., Radhakrishnan S.,Giordano A., Khalili K.: Evidence for dysregulation of cellcycle by human polyomavirus, JCV, late auxiliary protein.Oncogene, 21, 5574�5581 (2002)

15. Darbinyan A., Siddiqui K.M., Slonina D., Darbinian N.,Amini S., White M.K., Khalili K.: Role of JC virus agnopro-tein in DNA repair. J. Virol. 78, 8593�8600 (2004)

16. Delbue S., Pagani E., Guerini F.R., Agliardi C., Mancuso R.,Borghi E., Rossi F., Boldorini R., Veggiani C., Car P.G.,Ferrante P.: Distribution, characterization and significanceof polyomavirus genomic sequences in tumors of the brainand its covering. J. Med. Virol. 77, 447�454 (2005)

17. Del Valle L., Enam S., Lara C., Miklossy J., Khalili K., Gor-don J.: Primary central nervous system lymphoma expressingthe human neurotropic polyomavirus, JC virus, genome.J. Virol. 78, 3462�3469 (2004)

18. Del Valle L., Gordon J., Assimakopoulou M., Enam S., Ged-des J.F., Varakis J.N., Katsetos C.D., Croul S., Khalili K.:Detection of JC virus DNA sequences and expression of theviral regulatory protein T-antigen in tumors of the centralnervous system. Cancer Res. 61, 4287�4293 (2001)

19. Del Valle L., White M.K., Enam S., Oviedo S.P., Bromer M.Q.,Thomas R.M., Parkman H.P., Khalili K. Detection of JC virusDNA sequences and expression of viral T antigen and agno-protein in esophageal carcinoma. Cancer, 103, 516�527 (2005)

20. Dubois V., Dutronc H., Lafon M.E., Poinsot V., Pellegrin J.L.,Ragnaud J.M., Ferrer A.M., Fleury H.J.A.: Latency andReactivation of JC Virus in Peripheral Blood of HumanImmunodeficiency Virus Type 1-Infected Patients. J. Clin.Microbiol. 35, 2288�2292 (1997)

21. Eash S., Manley K., Gasparovic M., Querbes W., AtwoodW.J.: The human polyomaviruses. Cell. Mol. Life Sci. 63,865�876 (2006)

22. Eash S., Tavares R., Stopa E.G., Robbins S.H., Brossay L.,Atwood W.J. Differential Distribution of the JC Virus Recep-tor-Type Sialic Acid in Normal Human Tissues. Am. J. Pa-thol. 164, 419�428 (2004)

23. Elphick G.F., Querbes W., Jordan J.A., Gee G.V., Eash S.,Manley K., Dugan A., Stanifer M., Bhatnagar A., KroezeW.K., Roth B.L., Atwood W.J.: The human polyomavirus,JCV, uses serotonin receptors to infect cells. Science, 306,1380�1383 (2004)

24. Elsner C., Dorries K.: Human polyomavirus JC control re-gion variants in persistently infected CNS and kidney tissue.J. Gen. Virol. 79, 789�799 (1998)

25. Enam S., Del Valle L., Lara C., Gan D.D., Ortiz-Hidalgo C.,Palazzo J.P., Khalili K.: Association of human polyomavirusJCV with colon cancer: evidence for interaction of viral T-antigen and beta-catenin. Cancer Res. 62, 7093�7101 (2002)

26. Endo S., Okada Y., Orba Y., Nishihara H., Tanaka S., Naga-shima K., Sawa H.: JC virus agnoprotein colocalizes withtubulin. J. Neurovirol. 1, 10�14 (2003)

27. Fedele C.G., Ciardi M.R., Della S., Contreras G., Perez J.L.,De Ona M., Vidal E., Tenorio A.: Identical rearranged formsof JC polyomavirus transcriptional control region in plasmaand cerebrospinal fluid of acquired immunodeficiency syn-drome patients with progressive multifocal leukoencephalo-pathy. J. Neurovirol. 9, 551�558 (2003)

28. Fedele C.G., Polo C., Tenorio A., Niubo J., Ciardi M.R.,Perez J.L.: Analysis of the transcriptional control region ofJC polyomavirus in cerebrospinal fluid from HIV-negativepatients with progressive multifocal leucoencephalopathy.J. Med. Virol. 78, 1271�1275 (2006)

29. Frisque R.J., Bollag B., Tyagarajan S.K., Kilpatrick L.H.: T�proteins influence JC virus biology. J. Neurovirol. 9 (Suppl. 1),15�20 (2003)

30. Frisque R.J., Bream G.L., Cannella M.T.: Human polyoma-virus JC virus genome. J. Virol. 51, 458�69 (1984)

31. Gee G.V., Dugan A.S., Tsomaia N., Mierke D.F., AtwoodW.J.: The role of sialic acid in human polyomavirus infec-tions. Glycoconjug. J. 23, 19�26 (2006)

32. Gee G.V., Tsomaia N., Mierke D.F., Atwood W.J.: Modelinga Sialic Acid Binding Pocket in the External Loops of JCVirus VP1. J. Biol. Chem. 279, 49172�49176 (2004)

33. Goel A., Li M.S., Nagasaka T., Shin S.K., Fuerst F., Ricciar-diello L., Wasserman L., Boland C.R.: Association of JC virusT-antigen expression with the methylator phenotype in spo-radic colorectal cancers. Gastroenterology, 130, 1950�1961(2006)

34. Go�dzicka-Józefiak A. (red.).: Wirusologia molekularna.Wyd. Nauk. UAM, Poznañ, 2005, 103�104

35. Guo J., Kitamura T., Ebihara H., Sugimoto C., Kunitake T.,Takehisa J., Na Y.Q., Al-Ahdal M.N., Hallin A., Kawabe K.,Taguchi F., Yogo Y.: Geographical distribution of the humanpolyomavirus JC virus type A and B and isolation of newtype from Ghana. J. Gen.Virol. 77, 919�927 (1996)

36. Hori R., Murai Y., Tsuneyama K., Abdel-Aziz H.O., NomotoK., Takahashi H., Cheng C.M., Kuchina T., Harman B.V.,Takano Y.: Detection of JC virus DNA sequences in colo-rectal cancers in Japan. Virchows Arch. 447, 723�730 (2005)

37. Kaniowska D., Kaminski R., Amini S., Radhakrishnan S.,Rappaport J., Johnson E., Khalili K., Del Valle L., DarbinyanA.: Cross-interaction between JC virus agnoprotein and hu-man immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat modulatestranscription of the HIV-1 long terminal repeat in glial cells.J. Virol. 80, 9288�9299 (2006)

38. Khalili K., Gordon J., White M.K.: The polyomavirus, JCVand its involvement in human disease. Adv. Exp. Med. Biol.577, 274�287 (2006)

39. Khalili K., White M.K.: Human demyelinating disease andthe polyomavirus JCV. Mult. Scler. 12, 133�142 (2006)

40. Khalili K., White M.K., Sawa H., Nagashima K., Safak M.:The agnoprotein of polyomaviruses: a multifunctional auxi-liary protein. J. Cell. Physiol. 204, 1�7 (2005)

41. Kim J., Woolridge S., Biffi R., Borghi E., Lassak A., Fer-rante P., Amini S., Khalili K., Safak M.: Members of theAP-1 family, c-Jun and c-Fos, functionally interact with JCvirus early regulatory protein large T antigen. J. Virol. 77,5241�5252 (2003)

42. Krynska B., Lewin-Kowalik J., Sieron A.L.: Disturbance ofthe normal cell cycle by T antigens of SV40 viruses and JCcause some tumors. Post. Hig. Med. Do�w. 52, 237�257(1998)


43. Manley K., O�hara B.A., Gee G.V., Simkevich C.P., SedivyJ.M., Atwood W.J.: NFAT4 is required for JC virus infectionof glial cells. J. Virol. 80, 12079�12085 (2006)

44. Monaco M.C., Jensen P.N., Hou J., Durham L.C., Major E.O.:Detection of JC virus DNA in human tonsil tissue: evidencefor site of initial viral infection. J. Virol. 72, 9918�9923 (1998)

45. Munoz-Marmol A.M., Mola G., Ruiz-Larroya T., Fernandez-Vasalo A., Vela E., Mate J.L., Ariza A.: Rarity of JC virusDNA sequences and early proteins in human gliomas andmedulloblastomas: the controversial role of JC virus in hu-man neurooncogenesis. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 32,131�140 (2006)

46. Murai Y., Zheng H.C., Aziz H.O., Mei H., Kutsuna T., Naka-nishi Y., Tsuneyama K., Takano Y.: High JC virus load ingastric cancer and adjacent non-cancerous mucosa. CancerSci. 98, 25�31 (2007)

47. Niv Y., Goel A., Boland C.R.: JC virus and colorectal cancer:a possible trigger in the chromosomal instability pathways.Curr. Opin. Gastroenterol. 21, 85�89 (2005)

48. O�Neill F.J., Greenlee J.E., Dorries K., Clawson S.A., Car-ney H.: Propagation of archetype and nonarchetype JC virusvariants in human fetal brain cultures: demonstration ofinterference activity by archetype JC virus. J. Neurovirol. 9,567�576 (2003)

49. Pavesi A.: Utility of JC polyomavirus in tracing the patternof human migrations dating to prehistoric times. J. Gen. Virol.86, 1315�1326 (2005)

50. Pina-Oviedo S., De Leon-Bojorge B., Cuesta-Mejias T.,White M.K., Ortiz-Hidalgo C., Khalili K., Del Valle L.: Glio-blastoma multiforme with small cell neuronal-like component:association with human neurotropic JC virus. Acta Neuro-pathol. (Berl.) 111, 388�396 (2006)

51. Prins C., Frisque R.J.: JC virus T� proteins encoded by alter-natively spliced early mRNAs enhance T antigen-media-ted viral DNA replication in human cells. J. Neurovirol. 7,250�264 (2001)

52. Qu Q., Sawa H., Suzuki T., Semba S., Henmi C., Okada Y.,Tsuda M., Tanaka S., Atwood W.J., Nagashima K.: NuclearEntry Mechanism of the Human Polyomavirus JC Virus-likeParticle. J. Biol. Chem. 279, 27735�27742 (2004)

53. Querbes W., O�Hara B.A, Williams G., Atwood W.J.: Inva-sion of host cells by JC virus identifies a novel role for cave-olae in endosomal sorting of noncaveolar ligands. J. Virol.80, 9402�9413 (2006)

54. Radhakrishnan S., Otte J., Enam S., Del Valle L., Khalili K.,Gordon J.: JC virus-induced changes in cellular gene expres-sion in primary human astrocytes. J. Virol. 77, 10638�10644(2003)

55. Raha T., Grace Cheng S.W., Green M.R.: HIV-1 Tat Stimu-lates Transcription Complex Assembly through Recruitmentof TBP in the Absence of TAFs. PloS Biology 3(2), e44 (2005)(doi:10.1371/journal.pbio.0030044), na stronie: http://biology.plosjournals.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1371%2Fjournal.pbio.0030044

56. Ravichandran V., Sabath B.F., Jensen P.N., Houff S.A.,Major E.O.: Interactions between c-Jun, nuclear factor 1, andJC virus promoter sequences: implications for viral tropism.J. Virol. 80, 10506�10513 (2006)

57. Reiss K., Khalili K., Giordano A., Trojanek J.: JC virus largeT-antigen and IGF-I signaling system merge to affect DNArepair and genomic integrity. J. Cell. Physiol. 206, 295�300(2006)

58. Ricciardiello L., Baglioni M., Giovannini C., Pariali M.,Cenacchi G., Ripalti A., Landini M.P., Sawa H., NagashimaK., Frisque R.J., Goel A., Boland C.R., Tognon M., Roda E.,Bazzoli F.: Induction of Chromosomal Instability in ColonicCells by the Human Polyomavirus JC Virus. Cancer Res. 63,7256�7262 (2003)

59. Rollison D.E., Utaipat U., Ryschkewitsch C., Hou J., Goldth-waite P., Daniel R., Helzlsouer K.J., Burger P.C., Shah K.V.,Major E.O.: Investigation of human brain tumors for the pre-sence of polyomavirus genome sequences by two indepen-dent laboratories. Int. J. Cancer, 113, 769�774 (2005)

60. Shackelton L.A., Rambaut A., Pybus O.G., Holmes E.C.: JCvirus evolution and its association with human populations.J. Virol. 80, 9928�9933 (2006)

61. Shin S.K., Li M.S., Fuerst F., Hotchkiss E., Meyer R.,Kim I.T., Goel A., Boland C.R.: Oncogenic T-antigen of JCvirus is present frequently in human gastric cancers. Cancer,107, 481�488 (2006)

62. Smith R.W. P., Nasheuer H.P.: Initiation of JC virus DNAreplication in vitro by human and mouse DNA polymerase� primase. Eur. J. Biochem. 270, 2030�2037 (2003)

63. Sock E., Wegner M., Fortunato E.A., Grummt F.: LargeT-antigen and sequences within the regulatory region of JCvirus both contribute to the features of JC virus DNA repli-cation. Virology, 197, 537�548 (1993)

64. Strazzullo M., Cossu A., Baldinu P., Colombino M.,Satta M.P., Tanda F., De Bonis M.L., Cerase A., D�Urso M.,D�Esposito M., Palmieri G.: High-resolution methylationanalysis of the hMLH1 promoter in sporadic endometrial andcolorectal carcinomas. Cancer, 98, 1540�1546 (2003)

65. Sweet T.M., Del Valle L., Khalili K.: Molecular biology andimmunoregulation of human neurotropic JC virus in CNS.J. Cell. Physiol. 191, 249�256 (2002)

66. Tyagarajan S.K., Frisque R.J.: Stability and function of JCvirus large T antigen and T� proteins are altered by mutationof their phosphorylated threonine 125 residues. J. Virol. 80,2083�2091 (2006)

67. Verma S., Ziegler K., Ananthula P., Co J.K., Frisque R.J.,Yanagihara R., Nerurkar V.R.: JC virus induces altered pat-terns of cellular gene expression: interferon-inducible genesas major transcriptional targets. Virology, 345, 457�467(2006)

68. White M.K., Gordon J., Reiss K., Del Valle L., Croul S.,Giordano A., Darbinyan A., Khalili K.: Human polyoma-viruses and brain tumors. Brain Res. Rev. 50, 69�85 (2005)

69. White M.K., Khalili K.: Expression of JC virus regulatoryproteins in human cancer: potential mechanisms for tumo-urigenesis. Eur. J. Cancer, 41, 2537�2548 (2005)

70. White M.K., Khalili K.: Interaction of retinoblastoma proteinfamily members with large T-antigen of primate polyoma-viruses. Oncogene, 25, 5286�5293 (2006)

71. Wuthrich C., Kesari S., Kim W.K., Williams K., Gelman R.,Elmeric D., De Girolami U., Joseph J.T., Hedley-Whyte T.,Koralnik I.J. Characterization of lymphocytic infiltrates inprogressive multifocal leukoencephalopathy: co-localizationof CD8(+) T cells with JCV-infected glial cells. J. Neuro-virol. 12, 116�128 (2006)

72. Zambrano A., Kalantari M., Simoneau A., Jensen J.L.,Villarreal L.P.: Detection of human polyomaviruses andpapillomaviruses in prostatic tissue reveals the prostate asa habitat for multiple viral infections. Prostate, 53, 263�276(2002)


1. Wstêp

Adenowirusy (AdV) s¹ szeroko rozpowszechniony-mi w przyrodzie patogenami, wywo³uj¹cymi g³ówniezaka¿enia górnych dróg oddechowych, przewodu po-karmowego i oczu [3]. Pierwsze doniesienia o zaka¿e-niach adenowirusami pochodz¹ z XIX wieku z Nie-miec, gdzie u robotników fabrycznych zanotowanoliczne przypadki wystêpowania chorób oczu charak-teryzuj¹cych siê zapaleniami rogówki. W roku 1953R o w e i wsp. prowadzili prace nad wyprowadzeniemlinii komórkowych z usuniêtych dzieciom migda³kóww celu u¿ycia ich do namna¿ania wirusa polio [47].Niestety w a¿ 33 spo�ród 53 przypadków, w hodow-lach w krótkim czasie dosz³o do wolno postêpuj¹cegoprocesu cytopatycznego. Czynnik odpowiedzialny zaten efekt nazwany zosta³ od tkanki, w której wystê-powa³ (ang. adenoid), co da³o pocz¹tek nazwie ca³ejrodzinie wirusów.

Rodzina Adenoviridae dzieli siê na dwie podrodzi-ny: Mastadenovirus i Aviadenovirus, których natural-nymi gospodarzami s¹ odpowiednio ssaki i ptaki [3].Ludzkie adenowirusy podzielono na sze�æ podrodzajówoznaczonych literami od A do F, w obrêbie którychznajduje siê 51 serotypów znacznie ró¿ni¹cych siê podwzglêdem patogenno�ci [3, 51]. Ze wzglêdu na zró¿-

nicowany tropizm tkankowy mog¹ one wywo³ywaærozmaite objawy chorobowe. Zaka¿enia adenowirusa-mi stanowi¹ a¿ 13% wszystkich infekcji wirusowychu cz³owieka, st¹d pod wzglêdem czêsto�ci wystêpo-wania stawia je na drugim miejscu po rodzinie Herpes-viridae. Szerz¹ siê g³ównie drog¹ kropelkow¹ orazfekalno-oraln¹; sporadycznie �ród³em zaka¿enia mo¿ebyæ zanieczyszczona woda. Adenowirusy nale¿¹ce dopodrodzaju A s¹ odpowiedzialne g³ównie za biegunkiu dzieci. Podrodzaj B wywo³uje g³ównie stany zapalnedróg oddechowych w�ród dzieci oraz m³odych rekru-tów. Najbardziej patogenny jest typ AdV7, powoduj¹cyinfekcje dróg oddechowych. Z kolei podrodzaj C odpo-wiada za endemicznie wystêpuj¹ce przewlek³e zapale-nia gard³a u pacjentów pediatrycznych. Stwierdzono,¿e co najmniej 50% dzieci w wieku do 4 lat przesz³oinfekcjê wywo³an¹ przez wirusy AdV1 lub AdV2. Wi-rusy nale¿¹ce do tego podrodzaju s¹ odpowiedzialneza 50% wszystkich zaka¿eñ adenowirusowych zg³asza-nych do WHO. W�ród 28 serotypów z podrodzaju Dtyp AdV8 odpowiedzialny jest za ostre stany zapalnespojówki, powoduj¹c epidemiczne zaka¿enia w�ródludzi ¿yj¹cych w gêsto zaludnionych rejonach o suchymklimacie [3, 51]. Prowadzone w ostatnich latach bada-nia nad nale¿¹cymi do tego podrodzaju adenowiru-sami typu 36 i 37 wykaza³y ich przypuszczalny udzia³

ADENOWIRUSOWE ZAKA¯ENIA LUDZI

Tomasz Dzieci¹tkowski1, Agnieszka Rola2, Anna Midak-Siewirska1

1 Katedra i Zak³ad Mikrobiologii Lekarskiej Akademii Medycznej w Warszawieul. Cha³ubiñskiego 5, 02-004 Warszawa. e-mail: [email protected]

2 Wydzia³ Rolnictwa i Biologii Szko³y G³ównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawieul. Nowoursynowska 166, 02-786 Warszawa

Wp³ynê³o w pa�dzierniku 2007 r.

1. Wstêp. 2. Budowa adenowirusów. 3. Zaka¿enia górnych dróg oddechowych i zapalenia p³uc. 4. Okulistyczne nastêpstwa zaka¿e-nia adenowirusami. 5. Zaka¿enia uk³adu pokarmowego. 6. Krwotoczne zapalenia pêcherza. 7. Neuroinfekcje powodowane przezadenowirusy. 8. Diagnostyka zaka¿eñ ludzkimi adenowirusami. 9. Leczenie chorób o etiologii adenowirusowej. 10. Zapobieganiei profilaktyka. 11. Podsumowanie

Adenoviral infections in humans

Abstract: Human adenoviruses (HAdV) are a group of nonenveloped, double-stranded DNA viruses, which are endemic in thepediatric population. Adenoviruses cause a variety of infectious diseases in humans, such as respiratory disease, hemorrhagic cystitis,epidemic keratoconjunctivitis, encephalopathy and gastroenteritis. Fifty-one different serotypes of HAdVs have been identifiedon the basis of neutralization with type specific animal antisera, and these serotypes can be classified into six subgroups (A to F) onthe basis of their ability to agglutinate red blood cells. Adenoviruses are now also recognized as important pathogens causing severemorbidity and mortality in immunocompromised patients, especially in transplant recipients. The aim of this paper is the presenta-tion of current knowledge about infections caused by human adenoviruses as well as commonly used diagnostic procedures.

1. Introduction. 2. Adenovirus morphology. 3. Upper respiratory tract infections and pneumonia. 4. Ophthalmologic consequencesof adenoviral infection. 5. Enteric infections with adenoviruses. 6. Hemorrhagic cystitis. 7. Neuroinfections caused by adenoviruses.8. Diagnostics of adenoviral infections. 9. Chemotherapy. 10. Prevention and prophylaxis. 11. Summary

S³owa kluczowe: adenowirusy, zapalenie rogówki, biegunki wirusowe, krwotoczne zapalenie pêcherza, neuroinfekcja, diagnostykaKey words: adenoviruses, keratoconjunctivitis, viral diarrhea, hemorrhagic cystitis, neuroinfections, diagnosis

16 TOMASZ DZIECI¥TKOWSKI, AGNIESZKA ROLA, ANNA MIDAK-SIEWIRSKA

w wywo³ywaniu oty³o�ci u ludzi � doniesienia te s¹jednak nieliczne i temat wymaga dalszych prac [2, 27].Wirusy z podrodzaju E, wywo³uj¹ natomiast g³owniezaka¿enia dróg oddechowych, a w Europie oraz USAwystêpuj¹ bardzo rzadko. W roku 1980 stwierdzono,¿e adenowirus wywo³uj¹cy biegunkê w�ród niemow-l¹t nale¿y do odrêbnego podrodzaju okre�lanego od-t¹d jako podrodzaj F, do którego zaliczono tylko dwaadenowirusy AdV40 i AdV41 wywo³uj¹ce zaka¿eniaprzez ca³y rok [3, 51].

2. Budowa adenowirusów

Kompletny wirion adenowirusów czêsto opisywanyjest jako zbli¿ony wygl¹dem do sztucznego satelity.Jest on zbudowany z pojedynczej dwuniciowej cz¹-steczki kwasu dezoksyrybonukleinowego o wielko�ciok. 33�40 tysiêcy par zasad, zamkniêtej w kapsydzietworz¹cym swoisty p³aszcz bia³kowy. Ikoseadralny

kapsyd sk³ada siê z 252 jednostek strukturalnych,z których 12 jest pentametrami a pozosta³e heksamera-mi [54]. Na zakoñczeniu ka¿dego z pentonów wystêpu-je wychodz¹ce na zewn¹trz cz¹stki wirusowej trimero-we bia³ko, tzw. w³ókno [51]. Natomiast 240 heksonówtworzy boczne �ciany i krawêdzie cz¹stki wirusowejmaj¹cej od 70 do 100 nm �rednicy. Obserwacje w mi-kroskopie elektronowym oraz krystalografia rentge-nowska wykaza³y, i¿ genom adenowirusów przybierapostaæ o�miu domen o charakterze formy superzwiniê-tej skondensowanej wokó³ bia³ek. Czêsto obrazuje siêja jako rozetê, na zewn¹trz której wystêpuje osiem pêtlipo³¹czonych w centralnej czê�ci z bia³kami [51, 54].

Zastosowanie ró¿norodnych metod genetycznych,jak równie¿ hybrydyzacji mRNA do fragmentów DNAwirusowego umo¿liwi³o stworzenie mapy genomu ade-nowirusów. Bia³ka wczesne odpowiedzialne za funkcjeregulatorowe kodowane s¹ przez ORF: E1A, E1B,E2A, E2B, E3 i E4. W genomie znajduj¹ siê równie¿geny oznaczane od L1 do L5, które koduj¹ 1�5 bia³ek

A 12, 18, 31 zaburzenia jelitowe wysokaB 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50 zaka¿enia górnych dróg oddechowych,

zapalenia p³uc, krwotoczne zapalenie pêcherza s³abaC 1, 2, 5, 6 zaka¿enia górnych dróg oddechowych u dzieci niska

D 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22�30, zapalenia rogówki, zaburzenia jelitowe niska32�33, 36�39, 42�49, 51

E 4 zaka¿enia górnych dróg oddechowych, niskazapalenia p³uc

F 40, 41 biegunki niska

T a b e l a IKlasyfikacja ludzkich adenowirusów [3, 48]

PodgrupaSerotypy wystêpuj¹cew obrêbie podgrupy Choroby wywo³ywane u cz³owieka

Zdolno�æ do potencjalnejonkogenezy u zwierz¹t

Rys. 1. Mapa genomu adenowirusów na przyk³adzie AdV2.Strza³ki szare oznaczaj¹ geny z grupy wczesnych (E � early), których produkty pe³ni¹ dzia³anie regulatorowe.

Strza³ki cieniowane oznaczaj¹ geny pó�ne (L � late), koduj¹ce bia³ka strukturalne wirusa [25, 51, 55].

17ADENOWIRUSOWE ZAKA¯ENIA LUDZI

pó�nych pe³ni¹cych funkcje strukturalne [25]. Szcze-góln¹ uwagê po�wiêca siê bia³kom E1A i E1B, któreze wzglêdu na mo¿liwo�æ ³¹czenia siê z bia³kami re-guluj¹cymi cykl komórkowy gospodarza mog¹ odgry-waæ potencjaln¹ rolê w powstawaniu nowotworów[51, 55]. Do chwili obecnej nie potwierdzono onko-gennego wp³ywu adenowirusów na komórki ludzkie,za� wszystkie obserwacje opieraj¹ siê wy³¹cznie napracach na modelach zwierzêcych [51].

Transkrypcja genomu adenowirusów przebiega w ob-rêbie j¹dra zaka¿onej komórki w dwóch oddzielonychod siebie przedzia³ach czasowych, okre�lanych jakofazy wczesne i pó�ne. Fazy te rozdzielone s¹ wyra�n¹przerw¹, w której zachodzi replikacja wirusowegoDNA. W fazie wczesnej z najwiêksz¹ wydajno�ci¹ wy-ra¿ane s¹ geny dla E1A, E1B i E4, podczas gdy eks-presja pó�nych genów kierowana jest przez promotor(MLP) przebiega na minimalnym poziomie [57].

Po rozpoczêciu replikacji DNA wirusowego roz-poczyna siê transkrypcja pó�nych genów. W wynikutego procesu powstaje piêæ kaset transkryptów ozna-czonych od L1 do L5 syntetyzowanych w wynikuskomplikowanej obróbki pierwotnego transkryptu prze-biegaj¹cej na drodze splicingu. Po rozpoczêciu replika-cji DNA dochodzi do wysokiej ekspresji genów IVa2i plX, a promotor MLP ulega odblokowaniu i aktywacjioraz nastêpuje zahamowanie ekspresji wczesnych ge-nów. Ogólnie przyjmuje siê, ¿e rozpoczêcie procesureplikacji DNA wyznacza granicê pomiêdzy trans-krypcj¹ dwóch klas mRNA � wczesnych i pó�nych.Powstaj¹ce cz¹steczki mRNA s³u¿¹ jako matryca do

wytworzenia bia³ek strukturalnych oraz bia³ek bior¹-cych udzia³ w procesie pakowania DNA i dojrzewaniacz¹stek wirusowych w j¹drze komórkowym [57].

3. Zaka¿enia górnych dróg oddechowychi zapalenia p³uc

Typowe adenowirusowe zapalenia gard³a i górnychdróg oddechowych dotycz¹ g³ównie dzieci pomiêdzy6 miesi¹cem a 5 rokiem ¿ycia i powoduj¹ zazwyczaj³agodne, samoograniczaj¹ce siê schorzenia, czêstojednak przebiegaj¹ce z wysok¹ gor¹czk¹ [5, 20]. Kli-nicznie nie s¹ one odró¿nialne od podobnych infekcjio etiologii wirusowej [5]. W badaniach laboratoryj-nych wykryæ mo¿na natomiast: leukocytozê powy¿ej15 000 komórek/ml, OB > 30 mm/godz. oraz podwy¿-szony poziom bia³ka C-reaktywnego w surowicy.Wszystkie te parametry s¹ atypowe dla zaka¿eñ orto-i paramyksowirusami [48].

Kolejnym schorzeniem powszechnie wywo³ywa-nym przez AdV (19% wszystkich przypadków) jestzapalenie migda³ków podniebiennych. W tym przy-padku rutynowe badania laboratoryjne s¹ zwodnicze,gdy¿ podobne wyniki obserwuje siê przy zaka¿eniachstreptokokami [48]. Podstawow¹ ró¿nic¹ jest wiekpacjenta � infekcje adenowirusowe najczê�ciej obser-wuje siê u dzieci poni¿ej 3 roku ¿ycia, za� zapaleniao etiologii bakteryjnej spotyka siê zw³aszcza u osóbpomiêdzy 5 a 17 rokiem. Zaka¿enia adenowirusowepowoduj¹ tak¿e powstawanie na b³onach �luzowych

Rys. 2. Schemat cyklu ¿yciowego adenowirusów na przyk³adzie linii komórkowej HeLa zaka¿onej AdV2 [48, 51].Widoczne szybkie tempo replikacji wirusa oraz jego negatywny wp³yw na syntezê DNA i bia³ek komórki zaka¿onej (za zgod¹ Wydawcy) .


gard³a i migda³ków charakterystycznych delikatnychnalotów o bia³awej barwie [44, 48].

Oko³o 20% zapaleñ p³uc u pacjentów pediatrycz-nych wi¹zanych jest z zaka¿eniem adenowirusami.Najczê�ciej izolowanymi z tych przypadków seroty-pami s¹ typy: 7, 21 oraz 3 [40]. Adenowirusowe zapa-lenie p³uc jest klinicznie nierozró¿nialne od choróbp³uc wywo³anych przez inne rodziny wirusów. W ob-razie rentgenowskim widoczne s¹ rozproszone obszaryprzeja�nieñ oraz cechy niedodmy p³uc [21], podobnedo obserwowanych przy zaka¿eniach powodowanychprzez Mycoplasma pneumoniae. �miertelno�æ u dziecimo¿e byæ wysoka i dochodziæ do 30%. Szczególnieniebezpieczne nastêpstwa mo¿e mieæ zaka¿enie AdV7,bowiem 27 do 65% pacjentów wykazuje objawy trwa-³ego uszkodzenia p³uc [23, 53]. Czynnikami predys-ponuj¹cymi s¹ m³ody wiek oraz wspó³istniej¹ce zaka-¿enie wirusem odry, którego przej�ciowe dzia³aniesupresyjne na odpowied� typu komórkowego u³atwianamna¿anie adenowirusów [48].

Grup¹, w której adenowirusowe zaka¿enia drógoddechowych nios¹ szczególne zagro¿enie ¿ycia s¹pacjenci po zabiegach transplantacyjnych, zw³aszczapo przeszczepach szpiku [10]. Infekcje adenowiruso-we u doros³ych obserwuje siê czê�ciej w pó�nym okre-sie pooperacyjnym (>90 dnia) i wykrywa u oko³o 14%pacjentów [34]. Istotnym czynnikiem ryzyka jest ostrapostaæ choroby przeszczep przeciw gospodarzowi(Graft versus Host Disease � GvHD), wspó³istniej¹cezaka¿enia herpeswirusami (zw³aszcza wirusem cyto-megalii) oraz izolowanie adenowirusów z rozmaitychmateria³ów klinicznych [17]. Mimo prób stosowaniaterapii przeciwwirusowej czêstotliwo�æ zgonów jestwysoka i mo¿e siêgaæ 50% [17, 24]

Ze wzglêdu na mo¿liwo�æ wyst¹pienia przy zapa-leniu p³uc o etiologii adenowirusowej objawów suge-ruj¹cych zaka¿enie bakteryjne, powszechne jest sto-sowanie antybiotyków. Dzia³anie takie jest zbêdne i nieprzynosi ¿adnych korzy�ci terapeutycznych � o jegoczêsto�ci mo¿e za� �wiadczyæ, ¿e w czterech przepro-wadzanych badaniach do 86% pacjentów z infekcj¹wywo³an¹ przez adenowirusy pocz¹tkowo poddanychby³o antybiotykoterapii [48, 58].

4. Okulistyczne nastêpstwazaka¿enia adenowirusami

Jednym z najwcze�niej opisanych skutków zaka-¿enia wywo³anego przecz przedstawicieli rodzinyAdenoviridae jest adenowirusowe zapalenie rogówki.Choroba dotyczy g³ównie doros³ych i jest wywo³ywa-na przez typy 8, 19 oraz 37, nale¿¹ce do podgrupy D[18]. Epidemie s¹ stwierdzane zazwyczaj na tereniefabryk, szpitali, baz wojskowych i innych du¿ych, od-

izolowanych skupisk ludzkich [15, 50]. Wirus przenosisiê przez dotyk nieumytych r¹k personelu medycznegolub niedostatecznie odka¿one p³yny i instrumenty oku-listyczne [28]. Sporadycznie �ród³em zaka¿enia mo¿ebyæ kontakt z rêcznikami, gdzie wirus w formie ak-tywnej potrafi przetrwaæ do kilku tygodni [18].

Pierwotnymi objawami choroby s¹ ból, ³zawienie,�wiat³owstrêt i zapalenie spojówek. Po 3�4 dniach po-jawiaj¹ siê na rogówce pierwsze punktowe zmiany,które zazwyczaj zanikaj¹ samoistnie po up³ywie na-stêpnych 2 tygodni [8]. Przypadki d³u¿ej trwaj¹cychzaka¿eñ, które prowadz¹ do trwa³ych zmian w oku s¹sporadyczne i dotycz¹ g³ównie pacjentów z nieprawi-d³owo funkcjonuj¹cym uk³adem immunologicznym.

5. Zaka¿enia uk³adu pokarmowego

Adenowirusy wykrywane s¹ w od 4 do 15% próbekka³u pobranych od dzieci z zaburzeniami ¿o³¹dkowo-jelitowymi [6] i s¹ drugim w kolejno�ci, po rotawiru-sach, czynnikiem etiologicznym biegunek u pacjentówpediatrycznych. Najczê�ciej wykrywanymi s¹ serotypy40 i 41 [30, 56], nale¿¹ce do podgrupy F, choæ udajesiê izolowaæ z próbek ka³u tak¿e AdV1, 3 , 7 i 31 [30].

Biegunki adenowirusowe dotycz¹ g³ównie dzieci do2 lat, bowiem u wiêkszo�ci pacjentów w wieku lat 4wykrywane s¹ przeciwcia³a skierowane przeciwkoAdV40 i 41 [29]. Stolce s¹ zazwyczaj wodniste, bezkrwawych podbiegniêæ. Pasma �luzu wykrywa siêw 19�57% przypadków. Ilo�æ dziennych wypró¿nieñmo¿e siêgaæ 15, choæ zazwyczaj jest mniejsza. Bie-gunka o wywo³ania przez Adenoviridae trwa najczê�-ciej do 11 dni, zauwa¿alnie d³u¿ej od choroby wywo-³anej przez rotawirusy [29]. Typowa dla jej przebiegujest tak¿e zauwa¿alna gor¹czka oraz wymioty. W prze-ciwieñstwie do zaka¿eñ rotawirusami rzadkie s¹ in-fekcje w obrêbie jednej rodziny.

Zaka¿enia uk³adu pokarmowego wywo³ane przezenterotropowe szczepy adenowirusów s¹ zazwyczaj³agodne, z tendencjami do samoograniczenia. Mo¿liwes¹ jednak przypadki ciê¿kie, które prowadz¹ do zej�æ�miertelnych � dotycz¹ one g³ównie pacjentów podda-nych immunosupresji [19, 26] i osób z AIDS [14, 43].

6. Krwotoczne zapalenia pêcherza

Adenowirusy, zw³aszcza typ 11, s¹ podstawowymczynnikiem etiologicznym krwotocznych zapaleñ pê-cherza dzieci [52]. Choroba ta wystêpuje czê�cieju ch³opców ni¿ u dziewczynek i manifestuje siê krwio-i czêstomoczem, ze wspó³istniej¹c¹ gor¹czk¹. U pacjen-tów tych nie ma podwy¿szonego poziomu kreatyninyw surowicy, a w wirusologicznym badaniu moczu ob-


serwuje siê z³uszczone komórki nab³onka, w którychmetodami immunofluorescencyjnymi wykryæ mo¿naantygeny adenowirusów [48]. Wirusa ³atwo tak¿e wy-izolowaæ z moczu w hodowlach komórkowych.

Znacznie ciê¿szy przebieg maj¹ adenowirusowezapalenia pêcherza u pacjentów po przeszczepie ko-mórek krwiotwórczych oraz transplantacjach narz¹-dów unaczynionych. Zaka¿enia te wystêpuj¹ do�ærzadko � wykrywa siê je zaledwie u 0,3�1% osób pod-danych przeszczepowi szpiku [17] oraz u 4�10% pa-cjentów po przeszczepie w¹troby [38]. Czynnikamiryzyka s¹ w tym przypadku p³eæ ¿eñska, dodatni po-ziom przeciwcia³ antyadenowirusowych oraz ostra cho-roba przeszczep przeciw gospodarzowi. Szczyt czêsto-tliwo�ci jej wystêpowania pojawia siê w 3�4 tygodniupo operacji. Choroba trwa oko³o 2�4 tygodni i prze-biega podobnie do opisywanej u dzieci, jednak u wiêk-szo�ci chorych obserwuje siê podwy¿szony poziomkreatyniny. Pozytywne wyniki daje leczenie pulsemsterydowym (do 3 tygodni) [22], do¿ylne podawaniecidofowiru oraz obni¿enie stosowanych dawek lekówimmunosupresyjnych [41].

7. Neuroinfekcje powodowane przez adenowirusy

Neurologiczne powik³ania zaka¿eñ adenowirusamis¹ rzadkie; nios¹ jednak ze sob¹ wysokie ryzyko zgo-nu. Adenowirusy by³y izolowane zarówno z p³ynumózgowo-rdzeniowego, jak i bioptatów tkanek móz-gowych, g³ównie od pacjentów z meningoencephalitis[11]. Choroba czê�ciej dotyczy noworodków [46] orazosób z niewydolno�ci¹ uk³adu immunologicznego[16]. W diagnostyce wa¿ne jest zastosowanie testówbiologii molekularnej, gdy¿ ze wzglêdu na niskie mia-na wirusa w badanych materia³ach metody konwen-cjonalne czêsto dysponuj¹ zbyt nisk¹ czu³o�ci¹.

8. Diagnostyka zaka¿eñ ludzkimi adenowirusami

Ze wzglêdu na dobre namna¿anie siê adenowiru-sów w warunkach hodowli komórkowych przez d³u-gie lata stanowi³a ona �z³oty standard� w diagnostycezaka¿eñ AdV. Do namna¿ania adenowirusów u¿ywasiê g³ównie ustalonych linii HEp-2, HeLa oraz A549lub pierwotnych hodowli nerki ma³piej. Specyficznyefekt cytopatyczny pojawia siê najczê�ciej w ci¹gu od5 do 14 dni [31]. Wyj¹tek stanowi¹ wirusy nale¿¹cedo podgrupy F, których namna¿anie in vitro stanowiwci¹¿ powa¿ny problem. Najlepszy ich wzrost osi¹gasiê w linii Graham 239, która jest wyprowadzonaz embrionalnych komórek ludzkiej nerki transformo-wanych DNA adenowirusa typu 5. Materia³em stoso-wanym do zaka¿ania linii komórkowych mog¹ byæ

rozmaite próbki kliniczne, jak mocz, p³yn mózgowo-rdzeniowy, surowica krwi oraz próbki tkanek [48].

Z metod serologicznych najpowszechniej stosowa-ne s¹ testy aglutynacji lateksowej do wykrywania ade-nowirusów biegunkowych [56], metody immunoflu-oresencyjnej detekcji antygenów [13, 32] oraz testyELISA do okre�lania miana przeciwcia³ w surowicyi p³ynie mózgowo-rdzeniowym [37]. Stwierdzenie wy-stêpowania przeciwcia³ klasy IgM (markerów �wie¿oprzebytego zaka¿enia) ma wysok¹ warto�æ diagnostycz-n¹, bowiem przeciwcia³a klasy IgG ze wzglêdu na roz-powszechnienie adenowirusów w populacji ludzkiej s¹mniej istotne i s¹ g³ównie u¿ywane do okre�lania sta-tusu immunologicznego pacjentów oraz do monitoro-wania przebiegu zaka¿enia i terapii.

Ze wzglêdu na coraz czêstsze stwierdzanie zaka¿eñadenowirusami w�ród osób poddanych immunosupre-sji, niezbêdne sta³o siê wprowadzenie do diagnostykimetod biologii molekularnej. Historycznie pierwszy-mi by³y testy oparte na hybrydyzacji kwasów nukle-inowych [45], lecz ze wzglêdu na czaso- i materia³o-ch³onno�æ nie zyska³y one szerokiej popularno�ci.Zdecydowanie wiêksze zastosowanie diagnostycznew wykrywaniu adenowirusów ma reakcja ³añcucho-wej polimeryzacji (PCR) [1]. Konwencjonalne testyPCR maj¹ jednak ograniczon¹ czu³o�æ, która utrudniadetekcjê wirusa w tych materia³ach klinicznych, gdziepoziom wirusa osi¹ga niskie miana � zw³aszcza w p³y-nie mózgowo-rdzeniowym. Metody te s³u¿¹ g³ównie dostwierdzania obecno�ci wirusa w hodowli komórkowejprzed wyst¹pieniem specyficznego efektu cytopatycz-nego i stopniowo s¹ zastêpowane przez czulszy wariant,jakim jest real-time PCR [32]. Technika ta sta³a siêobecnie najlepszym testem w diagnostyce zaka¿eñadenowirusami, zw³aszcza w przypadkach neurologicz-nych oraz u pacjentów poddanych immunosupresji [12].

Rys. 3. Typowy rozproszony efekt cytopatyczny wywo³any przezadenowirusa typu 5 (AdV5) w hodowli komórkowej linii A549.Strza³ki wskazuj¹ komórki zniszczone dzia³aniem wirusa. Powiêkszenie

mikroskopu x400.


Jej szybko�æ wykonania i wysoka czu³o�æ umo¿liwiaj¹wykrycie wirusa na niskim poziomie i wdro¿enie od-powiedniego leczenia [35].

9. Leczenie chorób o etiologii adenowirusowej

W chwili obecnej nie ma skutecznej terapii, któraby³aby specyficzna dla zaka¿eñ wywo³ywanych przezadenowirusy � na szczê�cie konieczno�æ jej stosowa-nia dotyczy niemal wy³¹cznie pacjentów z dysfunk-cjami uk³adu odporno�ciowego [35, 59]. Cidofowiri rybawiryna wykazuj¹ wprawdzie dzia³anie przeciw-wirusowe w warunkach in vitro. Brak jest przeprowa-dzonych pe³nych badañ klinicznych, które udowodni-³yby ich przydatno�æ w leczeniu in vivo. Nielicznedostêpne dane literaturowe podaj¹ informacje o sku-tecznym wyniku do¿ylnego leczenia rybawiryn¹ adeno-wirusowego zapalenia p³uc u pacjentów pediatrycznych[7], podobnie jak krwotocznego zapalenia pêcherzau biorców przeszczepów [9]. Inni autorzy uwa¿aj¹ jed-nak rybawirynê za preparat nieskuteczny w leczeniupacjentów po zabiegach transplantacyjnych [33, 39].W grupie tej sugerowana jest raczej kuracja cidofowi-rem, jako lekiem o wiêkszej skuteczno�ci przeciw ade-nowirusom ex vivo [4, 35, 42]. Brak jest jednak danycho poziomie kopijno�ci wirusa w czasie i po zakoñ-czeniu terapii, co mog³oby jednoznacznie potwierdziæefektywno�æ prowadzonego leczenia.

10. Zapobieganie i profilaktyka

Ze wzglêdu na typowe dla adenowirusów przeno-szenie drog¹ fekalno-oraln¹, jedn¹ z najskuteczniej-szych metod zapobiegania ich transmisji jest czêstemycie r¹k i przedmiotów po kontakcie z chorym. Doodka¿ania nale¿y stosowaæ 60% etanol, który wykazujewysok¹ skuteczno�æ dzia³ania wobec AdV [49], w prze-ciwieñstwie do izopropanolu czy chlorheksydyny [18].

W przypadku zaka¿eñ szpitalnych sugerowane jestodizolowanie zaka¿onych pacjentów, jak równie¿ nosze-nie pe³nego ubioru ochronnego przez personel medycz-ny. Nale¿y ponadto bezwzglêdnie przestrzegaæ nakazunoszenia jednorazowych rêkawiczek oraz okularów,w celu zapobie¿enia przypadkom zapaleñ rogówkispowodowanych przez adenowirusy. Do dezynfekcjipowierzchni zalecany jest roztwór chloraminy T [18].

W 1971 roku zosta³a wprowadzona na rynek amery-kañski szczepionka doustna zawieraj¹ca ¿ywego, nie-atenuowanego wirusa, serotypów 4 i 7. Niespecyficznenamna¿enie wirusów w komórkach nab³onka jelitacienkiego nie powodowa³o objawów chorobowych,a skutkowa³o wytworzeniem specyficznej odpowiedzihumoralnej [48]. Program szczepieñ wdro¿ono w USA

pocz¹tkowo dla dzieci i m³odych mê¿czyzn w du¿ychzbiorowiskach. Jego zastosowanie obni¿y³o w�ród ¿o³-nierzy armii amerykañskiej czêstotliwo�æ zaka¿eñ ade-nowirusami o 95�99%, a ogóln¹ ilo�æ infekcji drógoddechowych o 50�60% [36]. Ze wzglêdu na licznedzia³ania niepo¿¹dane oraz brak mo¿liwo�ci jej stoso-wania u osób z niedoborami immunologicznymi,zosta³a ona wycofana z u¿ycia. Do chwili obecnej brakjest nowoczesnych i bezpiecznych u u¿yciu szczepio-nek podjednostkowych, zw³aszcza skierowanym prze-ciwko wariantom biegunkowym AdV40 i 41, niezwyk-le istotnym z pediatrycznego punktu widzenia [48].

11. Podsumowanie

Rozwój transplantologii, zarówno w dziedzinieprzeszczepów narz¹dów unaczynionych i komórekkrwiotwórczych powoduje, ¿e w zwi¹zku z wytworzo-n¹ g³êbok¹ immunosupresj¹ zaka¿enia ludzkimi ade-nowirusami mog¹ przebiegaæ czê�ciej i z nasilonymiobjawami. Dodatkowo w grupie pacjentów z obni¿o-n¹ wydolno�ci¹ uk³adu immunologicznego powa¿nymproblemem staj¹ siê infekcje mieszane, spowodowaneprzez nadka¿enia bakteryjne.

Choæ w wiêkszo�ci przypadków zaka¿eñ u osóbz prawid³ow¹ czynno�ci¹ uk³adu odporno�ciowegozaka¿enia adenowirusowe nie wymagaj¹ leczenia, brakjest niestety zweryfikowanych skutecznych form terapiiprzeciwwirusowej. Dostêpna do 2001 roku szczepion-ka zapobiega³a wy³¹czne zaka¿eniom adenowirusamiwywo³uj¹cymi infekcje oddechowe i zawiera³a ¿ywewiriony � z tego te¿ powodu nie by³o mo¿liwe stoso-wanie jej u pacjentów poddanych immunosupresji. Nieeliminowa³a tak¿e zagro¿enia ze strony adenowirusówbiegunkowych nale¿¹cych do podgrupy F, które s¹najwiêkszym zagro¿eniem dla dzieci. Tym bardziejkonieczne jest zastosowanie najczulszych metod dia-gnostycznych w celu ograniczenia ryzyka rozprze-strzeniania siê chorób o etiologii adenowirusowej.

Pi�miennictwo

1. Allard A., Girones R., Juto P., Wadell G.: Polymerase chainreaction for detection of adenoviruses in stool samples.J. Clin. Microbiol. 28, 2659�2667 (1990)

2. Atkinson R.L.: Viruses as an etiology of obesity. Mayo Clin.Proc. 82, 1192�1198 (2007)

3. Benkõ M., Harrach B., Both G.W., Russell W.C., Adair B.M.,Ádám E., de Jong J.C., Hess M., Johnson M., Kajon A.,Kidd A.H., Lehmkuhl H.D., Li Q.-G., Mautner V., Pring-Akerblom P., Wadell G.: Family Adenoviridae, [w:] Virustaxonomy. VIII th report of the International Committee onTaxonomy of Viruses. Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J.,Desselberger U., Ball L.A. (red.), Academic Press, New York,N.Y. 2004, s. 1162


4. Bordigoni P., Carret A.S., Venard V., Witz F., Le Faou A.:Treatment of adenovirus infections in patients undergoingallogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Clin. In-fect. Dis. 32, 1290�1297 (2001)

5. Brandt C.D., Kim H.W., Vargosko A., Jeffries B., Arrobio J.,Rindge B., Parrott R., Chanock R.: Infections in 18,000 in-fants and children in a controlled study of respiratory tractdisease. I. Adenovirus pathogenicity in relation to serologictype and illness syndrome. Am. J. Epidemiol. 90, 485�500(1969)

6. Brandt C.D., Kim H.W., Rodriguez W.J., Arrobio J.O.,Jeffries B.C., Stallings E.P., Lewis C., Miles A.J., Gard-ner M.K., Parrott R.H.: Adenoviruses and pediatric gastro-enteritis. J. Infect. Dis. 151, 437�443 (1985)

7. Buchdahl R.M., Taylor P., Warner J.D.: Nebulised ribavirinfor adenovirus pneumonia. Lancet, 2, 1070�1071 (1985)

8. Butt A.L., Chodosh J.: Adenoviral keratoconjunctivitis ina tertiary care eye clinic. Cornea, 25, 199�202 (2006)

9. Cassano W.F.: Intravenous ribavirin therapy for adenoviruscystitis after allogeneic bone marrow transplantation. BoneMarrow Transplant. 7, 247�248 (1991)

10. Chakrabarti S., Mautner V., Osman H., Collingham K.E.,Fegan C.D., Klapper P.E., Moss P.A., Milligan D.W.: Adeno-virus infections following allogeneic stem cell transplanta-tion: incidence and outcome in relation to graft manipula-tion, immunosuppression, and immune recovery. Blood, 100,1619�1627 (2002)

11. Chatterjee N.K., Samsonoff W.A., Balasubramaniam N.,Rush-Wilson K., Spargo W., Church T.M.: Isolation and cha-racterization of adenovirus 5 from the brain of an infant withfatal cerebral edema. Clin. Infect. Dis. 31, 830�833 (2000)

12. Claas E.C., Schilham M.W., de Brouwer C.S., Hubacek P.,Echavarria M., Lankester A.C., van Tol M.J., Kroes A.C.:Internally controlled real-time PCR monitoring of adeno-virus DNA load in serum or plasma of transplant recipients.J. Clin. Microbiol. 43, 1738�1744 (2005)

13. Darougar S., Walpita P., Thaker U., Viswalingam N., WishartM.S.: Rapid culture test for adenovirus isolation. Br. J. Oph-thalmol. 68, 405�408 (1984)

14. Dionisio D., Arista S., Vizzi E., Manneschi L.I., Di Lollo S.,Trotta M., Sterrantino G., Mininni S., Leoncini F.: Chronicintestinal infection due to subgenus F type 40 adenovirus ina patient with AIDS. Scand. J. Infect. Dis. 29, 305�307 (1997)

15. Dominguez-Berjon M.F., Hernando-Briongos P., Miguel-Arroyo P.J., Echevarria J.E., Casas I.: Adenovirus transmis-sion in a nursing home: analysis of an epidemic outbreak ofkeratoconjunctivitis. Gerontology, 53, 250�254 (2007)

16. Fianchi L., Scardocci A., Cattani P., Tartaglione T., PaganoL.: Adenovirus meningoencephalitis in a patient with largeB-cell lymphoma. Ann. Hematol. 82, 313�315 (2003)

17. Flomenberg P., Babbitt J., Drobyski W.R., Ash R.C., Carri-gan D.R., Sedmak G.V., McAuliffe T., Camitta B., HorowitzM.M., Bunin N.: Increasing incidence of adenovirus diseasein bone marrow transplant recipients. J. Infect. Dis. 169,775�781 (1994)

18. Ford E., Nelson K.E., Warren D.: Epidemiology of epidemickeratoconjunctivitis. Epidemiol. Rev. 9, 244�261 (1987)

19. Forrest G.: Gastrointestinal infections in immunocompro-mised hosts. Curr. Opin. Gastroenterol. 20, 16�21 (2004)

20. Gray G.C., Goswami P.R., Malasig M.D., Hawksworth A.W.,Trump D.H., Ryan M.A., Schnurr D.P.: Adult adenovirusinfections: loss of orphaned vaccines precipitates militaryrespiratory disease epidemics. Clin. Infect. Dis. 31, 663�670(2000)

21. Han B.K., Son J.A., Yoon H.K., Lee S.I.: Epidemic adenovirallower respiratory tract infection in pediatric patients: radio-graphic and clinical characteristics. Am. J. Roentgenol. 170,1077�1080 (1998)

22. Hofland C.A., Eron L.J., Washecka R.M.: Hemorrhagic ade-novirus cystitis after renal transplantation. Transplant. Proc.36, 3025�3027 (2004)

23. Hong J.Y., Lee H.J., Piedra P.A., Choi E.H., Park K.H.,Koh Y.Y., Kim W.S.: Lower respiratory tract infections dueto adenovirus in hospitalized Korean children: epidemio-logy, clinical features, and prognosis. Clin. Infect. Dis. 32,1423�1429 (2001)

24. Ikegame K., Takimoto T., Takahashi R., Murakami M.,Tamaki H., Fujioka T., Kawakami M., Hirabayashi N.,Soma T., Sugiyama H., Ogawa H.: Lethal adenovirus infec-tion in a patient who had undergone nonmyeloablative stemcell transplantation. Int. J. Hematol. 74, 95�100 (2001)

25. Imperiale M.J., Akusjnarvi G., Leppard K.N.: Post-trans-criptional control of adenovirus gene expression. Curr. Top.Microbiol. Immunol. 199, 139�171 (1995)

26. Jalal H., Bibby D.F., Tang J.W., Bennett J., Kyriakou C.,Peggs K., Cubitt D., Brink N.S., Ward K.N., Tedder R.S.:First reported outbreak of diarrhea due to adenovirus infec-tion in a hematology unit for adults. J. Clin. Microbiol. 43,2575�2580 (2005)

27. Jaworowska A., Bazylak G.: Infekcje wirusowe w etiologii ro-zwoju oty³o�ci. Postêpy Hig. Med. Do�w. 60, 227�236 (2006)

28. Koo D., Bouvier B., Wesley M., Courtright P., Reingold A.:Epidemic keratoconjunctivitis in a university medical centerophthalmology clinic; need for re-evaluation of the designand disinfection of instruments. Infect. Control. Hosp. Epi-demiol. 10, 547�552 (1989)

29. Kotloff K.L., Losonsky G.A., Morris J.G. Jr, Wasserman S.S.,Singh-Naz N., Levine M.M.: Enteric adenovirus infectionand childhood diarrhea: an epidemiologic study in three cli-nical settings. Pediatrics, 84, 219�225 (1989)

30. Krajden M., Brown M., Petrasek A., Middleton P.J.: Clinicalfeatures of adenovirus enteritis: a review of 127 cases. Pe-diatr. Infect. Dis. J. 9, 636�641 (1990)

31. Krisher K.K., Menegus M.A.: Evaluation of three types ofcell culture for recovery of adenovirus from clinical speci-mens. J. Clin. Microbiol. 25, 1323�1324 (1987)

32. Kuypers J., Wright N., Ferrenberg J., Huang M.L., Cent A.,Corey L., Morrow R.: Comparison of real-time PCR assayswith fluorescent-antibody assays for diagnosis of respi-ratory virus infections in children. J. Clin. Microbiol. 44,2382�2388 (2006)

33. La Rosa A.M., Champlin R.E., Mirza N., Gajewski J., Giralt S.,Rolston K.V., Raad I., Jacobson K., Kontoyiannis D., Elting L.,Whimbey E.: Adenovirus infections in adult recipients of bloodand marrow transplants. Clin. Infect. Dis. 32, 871�876 (2001)

34. Leen A.M., Bollard C.M., Myers G.D., Rooney C.M.: Ade-noviral infections in hematopoietic stem cell transplantation.Biol. Blood Marrow Transplant. 12, 243�251 (2006)

35. Lenaerts L., Naesens L.: Antiviral therapy for adenovirus in-fections. Antiviral Res. 71, 172�180 (2006)

36. McNeill K.M., Hendrix R.M., Lindner J.L., Benton F.R.,Monteith S.C., Tuchs Cheres M.A., Gray G.C., Gaydos J.C.:Large, persistent epidemic of adenovirus type 4-associatedacute respiratory disease in U.S. army trainers. Emerg. Infect.Dis. 5, 798�801 (1999)

37. Meurman O., Ruuskanen O., Sarkkinen H.: Immunoassaydiagnosis of adenovirus infections in children. J. Clin. Mi-crobiol. 18, 1190�1195 (1983)


38. Michaels M.G, Green M., Wald E.R., Starzl T.E.: Adenovirusinfection in pediatric liver transplant recipients. J. Infect. Dis.165, 170�174 (1992)

39. Morfin F., Dupuis-Girod S., Mundweiler S., Falcon D.,Carrington D., Sedlacek P., Bierings M., Cetkovsky P.,Kroes A.C., van Tol M.J., Thouvenot D.: In vitro suscepti-bility of adenovirus to antiviral drugs is species-dependent.Antivir Ther. 10, 225�229 (2005)

40. Munoz F.M., Piedra P.A., Demmler G.J.: Disseminated ade-novirus disease in immunocompromised and immunocom-petent children. Clin. Infect. Dis. 127, 1194�1200 (1998)

41. Nagafuji K., Aoki K., Henzan H., Kato K., Miyamoto T.,Eto T., Nagatoshi Y., Ohba T., Obama K., Gondo H., Hara-da M.: Cidofovir for treating adenoviral hemorrhagic cystitisin hematopoietic stem cell transplant recipients. Bone MarrowTransplant. 34, 909�914 (2004)

42. Neofytos D., Ojha A., Mookerjee B., Wagner J., Filicko J.,Ferber A., Dessain S., Grosso D., Brunner J., Flomenberg N.,Flomenberg P.: Treatment of adenovirus disease in stem celltransplant recipients with cidofovir. Biol. Blood MarrowTransplant. 13, 74�81 (2007)

43. Pollok R.C., Farthing M.J.: Enteric viruses in HIV-relateddiarrhoea. Mol. Med. Today, 6, 483�487 (2000)

44. Putto-Laurila A., Mertsola J., Ruuskanen O.: Viral causes oftonsillitis and fever unresponsive to antibiotic therapy. Pediatr.Infect. Dis. J. 18, 71�72 (1999)

45. Ranki M., Virtanen M., Palva A., Laaksonen M., Petters-son R., Kaariainen L., Halonen P., Soderlund H.: Nucleicacid sandwich hybridization in adenovirus diagnosis. Curr.Top. Microbiol. Immunol. 104, 307�318 (1983)

46. Rieger-Fackeldey E., Aumeier S., Genzel-Boroviczeny O.:Disseminated adenovirus infection in two premature infants.Infection, 28, 237�239 (2000)

47. Rowe W.P., Huebner R.J., Gilmore L.K.: Isolation of a cyto-pathogenic agent from human adenoids undergoing sponta-neous degeneration in tissue culture. Proc. Soc. Exp. Biol.Med. 84, 570�573 (1953)

48. Ruuskanen O., Meurman O., Akusjärvi G.: Adenoviruses. [w:]Clinical virology. Richman D.D., Whitley R.J., Hayden F.G.(red.) ASM Press, Washington 2002, s. 515�535

49. Sattar S.A., Abebe M., Bueti A.J., Jampani H., Newman J.,Hua S.: Activity of an alcohol-based hand gel against humanadeno-, rhino-, and rotaviruses using the fingerpad method.Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 21, 516�519 (2000)

50. Schrauder A., Altmann D., Laude G., Claus H., Wegner K.,Kohler R., Habicht-Thomas H., Krause G.: Epidemic con-junctivitis in Germany, 2004. Euro Surveill. 11, 185�187(2006)

51. Shenk T.: Adenoviridae: The viruses and their replication.[w:] Fundamental virology. Knipe D.M., Howley P.M.(red.) Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia 2001,s. 1053�1088.

52. Shindo K., Kitayama T., Ura T., Matsuya F., Kusaba Y.,Kanetake H., Saito Y.: Acute hemorrhagic cystitis caused byadenovirus type 11 after renal transplantation. Urol. Int. 41,152�155 (1986)

53. Similä S., Linna O., Lanning P., Heikkinen E., Ala-HouhalaM.: Chronic lung damage caused by adenovirus type 7: a ten-year follow-up study. Chest, 80, 127�131 (1981)

54. Stewart P.L., Burnett R.M..: Adenovirus structure by X-raycrystallography and electron microscopy. Curr. Top. Micro-biol. Immunol. 199, 25�38 (1995)

55. Strauss J.H., Strauss E.G.: Family Adenoviridae. [w:] Virusesand human disease. Strauss J.H., Strauss E.G. (red.) Acade-mic Press, San Diego 2002, s. 253�259

56. Uhnoo I., Wadell G., Svensson L., Johansson M.E.: Impor-tance of enteric adenoviruses 40 and 41 in acute gastroen-teritis in infants and young children. J. Clin. Microbiol. 20,365�372 (1984)

57. Van der Vliet P.C.: Adenovirus DNA replication. Curr. Top.Microbiol. Immunol. 199, 1�30 (1995)

58. Van Lierde S., Corbeel L., Eggermont E.: Clinical and labo-ratory findings in children with adenovirus infections. Eur.J. Pediatr. 148, 423�425 (1989)

59. van Tol M.J., Claas E.C., Heemskerk B., Veltrop-Duits L.A.,de Brouwer C.S., van Vreeswijk T., Sombroek C.C., KroesA.C., Beersma M.F., de Klerk E.P., Egeler R.M., LankesterA.C., Schilham M.W.: Adenovirus infection in children afterallogeneic stem cell transplantation: diagnosis, treatment andimmunity. Bone Marrow Transplant. 35, S73�76 (2005)


1. Wstêp

Apoptoza, czyli zaprogramowana �mieræ komórkijest procesem umo¿liwiaj¹cym utrzymanie homeos-tazy w organizmach wielokomórkowych. Uczestniczyw wielu procesach: w usuwaniu komórek z nieodwra-calnie uszkodzonym DNA, ontogenezie, odnowie tkan-kowej czy odpowiedzi immunologicznej. W odró¿-nieniu od martwicy, nie wywo³uje odczynu zapalnegow trakcie usuwania komórek [6].

Apoptoza wp³ywa tak¿e na patogenezê chorób za-ka�nych. Bakterie wykszta³ci³y wiele mechanizmówindukuj¹cych zaprogramowan¹ �mieræ zaka¿onych ko-mórek [69, 76]. W ostatnich latach pojawi³y siê licznedowody wskazuj¹ce na to, ¿e drobnoustroje wykazuj¹w³a�ciwo�ci antyapoptotyczne. Konsekwencj¹ tegomo¿e byæ nabywanie przez zaka¿one komórki cechnowotworowych, co obserwuje siê w przypadku zaka-¿eñ z udzia³em Helicobacter pylori [67] lub Chlamydiatrachomatis [33]. Prawdopodobnie dzia³anie antyapop-totyczne Neisseria meningitidis jest jednym z mecha-nizmów modyfikuj¹cych odpowiedz immunologiczn¹zaka¿onego organizmu. Umo¿liwia tym bakteriomadaptacjê do warunków panuj¹cych w komórkach go-spodarza i dalszy rozwój zaka¿enia [46]. Podobne zna-czenie maj¹ w³a�ciwo�ci antyapoptotyczne SalmonellaTyphimurium [32]. Wykazano, ¿e hamowanie apoptozy

monocytów przez bakterie Bartonella henselae prowa-dzi do przed³u¿onego wytwarzania czynnika wzrostuVEGF (vascular endothelial cell growth factor), maj¹-cego znaczenie w patogenezie takich chorób jak naczy-niakowato�æ bakteryjna czy plamica w¹trobowa [30].

2. Przebieg apoptozy

Apoptoza jest z³o¿onym procesem, któremu mo¿epodlegaæ w³a�ciwie ka¿da komórka organizmu. Jestniezbêdna do prawid³owego funkcjonowania ka¿degoorganizmu. Podlega szeregowi regulacji, równie¿ zestrony bakterii lub ich metabolitów.

Do zapocz¹tkowania apoptozy niezbêdna jest ini-cjacja, która mo¿e przebiegaæ jedn¹ z dwóch g³ów-nych dróg: zewn¹trzpochodn¹, do których zaliczanajest �cie¿ka receptorowa i szlak zale¿ny od perforyni granzymów oraz wewn¹trzpochodn¹, zale¿n¹ odmitochondrium lub siateczki �ródplazmatycznej [25].

Droga zewn¹trzpochodna wymaga po³¹czenia ligan-du z odpowiednim receptorem na powierzchni komórkidocelowej. Z tego powodu okre�lana jest mianemreceptorowej. Do receptorów, które bior¹ udzia³ w tejdrodze inicjacji apoptozy, nale¿¹: Fas, TRIAL (TNFrelated apoptosis inducing ligand), TNFR (tumornecrosis factor receptor). Ich charakterystyczn¹ cech¹

W£A�CIWO�CI ANTYAPOPTOTYCZNE BAKTERII

Adrian Re�liñski, Joanna Kwieciñska, Eugenia Gospodarek

Katedra i Zak³ad Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w BydgoszczyUniwersytet Miko³aja Kopernika w Toruniu, ul. M. Sk³odowskiej-Curie 9, 85-094 Bydgoszcz

tel. (52) 585 40 470, e-mail: [email protected]

Wp³ynê³o listopad 2007

1. Wstêp. 2. Przebieg apoptozy. 3. Hamowanie apoptozy przez bakterie. 3.1. Bezpo�rednie oddzia³ywanie z elementami szlakuapoptozy. 3.2.1. Udzia³ czynnika transkrypcyjnego NF-6B. 3.2.2. Udzia³ szlaku PI3K/Akt. 4. Podsumowanie

Bacterial antiapoptotic properties

Abstract: Apoptosis or programmed cell death is an active, genetically controlled process. It is an integral part of life that maintainshomeostasis in multicellular organisms. In contrast to necrosis, apoptosis allows the organism to eliminate unnecessary or damagedcells without an inflammatory reaction.

Programmed cell death also plays an important role in the pathogenesis of various infectious diseases. There is much evidence, thatbacteria have the ability to induce and/or block apoptosis. Bacteria can inhibit programmed cell death in a direct or indirect way. In thefirst case, bacteria directly interact with the apoptotic pathway. Indirect effect on apoptosis is mediated through signal transductionpathways inside the host cell such as the nuclear factor kappa B (NF-6B) and phosphatidylinositol-3-kinase/Akt (PI3K/Akt) pathways.

Many mechanisms by which bacterial pathogens inhibit the host cell apoptotic pathways are not fully understood. Furtherstudies are necessary for a better understanding of the host-pathogen relationship.

1. Introduction. 2. Course of apoptosis. 3. Inhibition of apoptosis by bacteria. 3.1. Direct interaction with the elements of an apoptoticpathway. 3.2.1. Contribution of nuclear factor NF-6B. 3.2.2. Contribution of PI3K/Akt pathway. 4. Summary

S³owa kluczowe: apoptoza, czynnik j¹drowy NF-6B, szlak PI3K/AktKey words: apoptosis, nuclear factor NF-6B, PI3K/Akt pathway

24 ADRIAN RE�LIÑSKI, JOANNA KWIECIÑSKA, EUGENIA GOSPODAREK

jest obecno�æ domeny �mierci (death domain, DD).W wyniku po³¹czenia receptora z ligandem dochodzido jego oligomeryzacji i rekrutacji bia³ek adaptorowychzwi¹zanych z DD Fas (adaptor protein Fas-associateddeath domain, FADD), które razem z prokaspaz¹-8tworz¹ kompleks DISC (death-inducing signalingcomplex). DISC ma zdolno�æ proteolizy zymogenukaspazy-8 do jej aktywnej formy, co uruchamia kas-kadê kaspaz [25].

W drodze wewn¹trzpochodnej w inicjacji apoptozybior¹ udzia³ cz¹steczki, które znajduj¹ siê w obrêbiemitochondrium, a od cytoplazmy komórkowej oddzielaje podwójna b³ona mitochondrialna. Zaburzenia w po-laryzacji tej b³ony wywo³uj¹ zmiany przepuszczal-no�ci, m.in. dla cz¹steczek cytochromu c, bia³ka Smac/DIABLO (second mitochondria derived activatorof caspase/direct IAP binding protein with low PI,Smac/DIABLO).

Za utrzymanie w³a�ciwej polaryzacji b³on mitochon-drialnych odpowiadaj¹ bia³ka z rodziny Bcl-2 (B cellleukemia/lymphoma-2, Bcl-2). Jedna grupa tych bia³ek,do których nale¿¹ Bcl-XL, Bcl-2, A1/Bfl-1, Mcl-1,zwiêksza integralno�æ b³on mitochondrium. Bia³ka Bak,Bok/Mtd, Bax, Bcl-XS, Bid, Bim/Bod, Bad, MAP-1,Bmf zaliczane s¹ do drugiej grupy, któr¹ okre�la siê jakoproapoptotyczne [41].

Po uwolnieniu cz¹steczek cytochromu c do cyto-plazmy, ³¹cz¹ siê one z czynnikiem aktywuj¹cym pro-teazy apoptozy (apoptosis protease-activating factor 1,Apaf-1), ATP i prokaspaz¹-9. Dochodzi do aktywacjikaspazy-9, która zapocz¹tkowuje kaskadê kaspaz [25].

Trzecia �cie¿ka aktywacji apoptozy przebiega zudzia³em perforyn, które s¹ zlokalizowane w b³oniekomórkowej. Perforyny wi¹¿¹ wybiórczo granzym B,

czego konsekwencj¹ jest uszkodzenie b³ony komórko-wej i uaktywnienie bezpo�rednio kaspazy-3.

Czwarta �cie¿ka, zale¿na od siateczki �ródplazma-tycznej i zale¿na od aktywacji kaspazy-12 pozostajenadal s³abo poznana.

Bez wzglêdu na rodzaj drogi inicjacji, kolejne etapyapoptozy przebiegaj¹ jednakowo. Obejmuj¹ one akty-wacjê kaspaz wykonawczych, do których zaliczane s¹kaspazy-3, -6, -7. W wyniku ich dzia³ania dochodzido uaktywnienia bia³ek odpowiedzialnych za konden-sacjê i fragmentacjê DNA, zagêszczenie cytoplazmyi wytworzenie charakterystycznych dla apoptozy cia³ekapoptotycznych, które zawieraj¹ elementy cytoplazmy,organelli komórkowych i chromatyny [25]. Schematprzebiegu apoptozy przedstawia rys. 1.

3. Hamowanie apoptozy przez bakterie

Bakterie wykszta³ci³y wiele mechanizmów hamu-j¹cych apoptozê. Mog¹ wywieraæ bezpo�redni lub po-�redni wp³yw na zaprogramowan¹ �mieræ komórek.Pierwsza mo¿liwo�æ jest zwi¹zana z bezpo�rednimniszczeniem lub blokowaniem czynników uczestni-cz¹cych w apoptozie. Natomiast dzia³anie po�redniejest zale¿ne od szlaków przeka�nikowych zlokali-zowanych wewn¹trz zaka¿onej komórki takich, jakNF-6B czy PI3K/Akt. S¹ one aktywowane przezstruktury bakteryjne wi¹¿¹ce siê z receptorem na po-wierzchni komórki gospodarza lub przez substancjewytwarzane przez drobnoustroje i transportowane doich wnêtrza. Nie wszystkie mechanizmy s¹ w pe³nipoznane, a wiele z nich opartych jest w du¿ym stopniuna hipotezach (tab. I).

Rys. 1. Przebieg apoptozy

FasL

Mitochondrium

Cyt c kaspaza-9

ATP

Apaf-1

prokaspaza-9

Fas DISC

prokaspaza-8

kaspaza-8

Perforyny

prokaspaza-3

kaspaza-3

kaspazy

efektorowe

APOPTOZA

Granzymy

Siateczka

�ródplazmatyczna

prokaspaza-12 kaspaza-12

25W£A�CIWO�CI ANTYAPOPTOTYCZNE BAKTERII

3.1. Bezpo�rednie oddzia³ywaniez elementami szlaku apoptozy

Do bakterii wywieraj¹cych bezpo�redni wp³yw nazaprogramowan¹ �mieræ komórki nale¿¹ Chlamydiaspp., które hamuj¹ apoptozê poprzez proteolityczn¹degradacjê bia³ek BH3-only (Bcl-2 homology domain3 only) takich, jak: Bim, Puma, Bad [15], Bmf, Noxa,tBid [83] i Bik [12]. Bia³ka BH3-only s¹ czynnikamiproapoptotycznymi. Aktywuj¹ bia³ka Bax i Bak, po-woduj¹ce uwolnienie cytochromu c z mitochondrium[29]. Jak wynika z badañ P i r b h a i i wsp. [59] zaproteolityczn¹ degradacjê bia³ek BH3-only w komór-kach zaka¿onych przez C. trachomatis jest odpowie-dzialna wydzielana do cytozolu proteaza CPAF (Chla-mydial protease/proteasome-like activity factor).

Mechanizm antyapoptotycznego dzia³ania bakteriiz rodzaju Chlamydia mo¿e byæ tak¿e zwi¹zany z se-kwestracj¹ kinazy bia³kowej C* (protein kinase C*,PKC*) na wodniczkach lub ich bezpo�redniej blisko�ci[70]. Enzym PKCä jest czynnikiem proapoptotycz-nym. Aktywowana kinaza przemieszcza siê do mito-chondrium [35, 44], gdzie wp³ywa na uwolnieniecytochromu c [44]. Zdaniem badaczy czynnikiem od-powiedzialnym za odizolowanie kinazy bia³kowej C*od miejsca docelowego dzia³ania, jest obecny w wod-niczkach DAG (diacyloglicerol), wi¹¿¹cy siê z dome-n¹ C1 enzymu [70].

Drobnoustroje mog¹ niszczyæ receptory niezbêdnedo indukcji apoptozy. Jak wynika z badañ B e c k i wsp.[3] bakterie Neisseria gonorrhoeae wytwarzaj¹ pro-teazê IgA1, która powoduje proteolityczn¹ degradacjêreceptora TNF-RII (tumor necrosis factor receptor II)znajduj¹cego siê na powierzchni komórek monocytar-nych U937 i zapobiega apoptozie wywo³ywanej przezTNF" (tumor necrosis factor ").

Pr¹tki Mycobacterium tuberculosis s¹ zdolne dohamowania apoptozy ludzkich makrofagów równie¿przez mechanizm zale¿ny od TNF-" [1]. W wynikuzaka¿enia makrofagów szczepami M. tuberculosis do-chodzi do wzrostu syntezy IL-10, która ma zdolno�æ

wywo³ywania akumulacji rozpuszczalnych recepto-rów dla TNF" (soluble TNF" receptor 2, sTNFR2).sTNFR2 wi¹¿¹ TNF", tworz¹c nieaktywny biologicz-nie kompleks ligand-receptor. Zablokowany TNF" nieposiada zdolno�ci indukowania apoptozy, przez comakrofag zachowuje zdolno�æ proliferacji.

Bezpo�redni wp³yw bakterii na zaprogramowan¹�mieræ komórek jest zwi¹zany hamowaniem aktywno�-ci kaspaz, kluczowych enzymów apoptozy. Z badañH e c z k i i wsp. [20] wynika, ¿e enteropatogenneszczepy Escherichia coli O103 (enteropathogenicE. coli O130, EPEC O130) mog¹ hamowaæ apoptozêkróliczych komórek jelita i kêpek Peyera. Mechanizmtego dzia³ania nie zosta³ jeszcze w pe³ni wyja�niony,ale prawdopodobnie zale¿y od wydzielania przez pa-³eczki EPEC wirulentnego bia³ka, które bezpo�redniohamuje aktywno�æ kaspazy-3.

W inny sposób hamuje apoptozê makrofagów liniiTHP-1 (human monocytic leukemia cell line) wywo-³ywan¹ czynnikami chemicznymi Orientia tsutsuga-mushi [31]. Mechanizm ten jest niezale¿ny od NF-6Bi obejmuje zahamowanie uwalniania wewn¹trzko-mórkowego wapnia. Czynnikiem odpowiedzialnym zazablokowanie apoptozy jest przypuszczalnie termosta-bilne bia³ko syntetyzowane przez O. tsutsugamushi,ale nieznany jest szlak przekazywania sygna³u do ko-mórki gospodarza.

Drobnoustroje mog¹ bezpo�rednio oddzia³ywaæ zb³on¹ mitochondrium zapobiegaj¹c uwolnieniu cyto-chromu c. Wed³ug M a s s a r i i wsp. [45, 46] zlokali-zowana na b³onie zewnêtrznej Neisseria meningitidisporyna PorB, w zaka¿onej komórce wi¹¿e siê z mito-chondrium. Bia³ko PorB oddzia³uje z bia³kowym sk³ad-nikiem por mitochondrialnych, poryn¹ VDAC (voltage-dependent anion channel, zale¿ny od napiêcia kana³anionowy) stabilizuj¹c elektrycznie b³ony mitochon-drialne i zapobiegaj¹c uwolnieniu cytochromu c do cy-tozolu [45]. Jak wynika z badañ Va n d e r H e i d e ni wsp. [71] zamkniêcie VDAC zapobiega wymianieATP i ADP pomiêdzy cytozolem i macierz¹ mitochon-drium, co prowadzi do nagromadzenia fosfokreatyny

Chlamydia trachomatis [74]Salmonella Typhimurium [32]Porphyromonas gingivalis [82]

T a b e l a IHamowanie apoptozy przez bakterie

Bezpo�rednie oddzia³ywanie bakteriiz elementami szlaku apoptozy

Po�redni wp³yw na apoptozê

Udzia³ czynnika j¹drowego NF-6B Udzia³ szlaku PI3K/Akt

Chlamydia trachomatis [59, 70]Neisseria gonorrhoeae [3]Mycobacterium tuberculosis [1]Neisseria meningitidis [45, 46]Escherichia coli O103 [20]Escherichia coli K1 [68]

Rickettsia rickettsii [9]Ehrlichia chaffeensis [84]Helicobacter pylori [42, 56, 81]Escherichia coli [16]Staphylococcus epidermidis [48]Staphylococcus aureus [40]Bartonella henselae[30]Neisseria gonorrhoeae [4]Chlamydophila pneumoniae [75]


w przestrzeni miêdzyb³onowej. Zaburzenia mitochon-drialnej wymiany ATP/ADP s¹ uwa¿ane za jedenz czynników mog¹cych braæ udzia³ w inicjacji apop-tozy [72]. Byæ mo¿e poryna PorB wp³ywa na kana³anionowy zale¿ny od napiêcia w sposób podobny doantyapoptotycznej proteiny Bcl-xL, która hamuje zam-kniêcie VDAC i utrzymuje przepuszczalno�æ zewnêtrz-nej b³ony mitochondrium dla ATP i ADP [73].

Blokowanie depolaryzacji b³on mitochondrium ma-krofagów zaobserwowano u pa³eczek E. coli [68].Szczepy E. coli K1, które wytwarzaj¹ zewnêtrzne bia³-ko b³onowe A (outer membrane protein A, OmpA)aktywuj¹ transkrypcjê Bcl-XL � antyapoptotycznychgenów, których produkty zapobiegaj¹ przemieszczeniucz¹steczek cytochromu c z mitochondrium do cytoplaz-my. Ponadto, w makrofagach zaka¿onych E. coli K1dochodzi do spadku aktywno�ci kaspazy-3, -6 i -9.Obecno�æ bia³ka OmpA jest niezbêdna dla replikacjii prze¿ycia E. coli K1 wewn¹trz makrofagów. Sam me-chanizm antyapoptotyczny nie jest jasny, ale prawdo-podobnie jest zwi¹zany z receptorami dla OmpA obec-nymi na makrofagach [68].

3.2.1. Udzia³ czynnika j¹drowego NF-6B

J¹drowy czynnik-6B (nuclear factor-6B, NF-6B)pe³ni wa¿n¹ rolê jako regulator transkrypcji. Aktywujeekspresjê szeregu genów, m. in., zwi¹zanych z dzia³a-niem antyapoptotycznym. Po�rednio wp³ywa na apop-tozê przez bia³ka cFLIP, które jest inhibitorem kas-pazy 8 [18].

Rodzinê bia³ek tworz¹cych czynnik transkrypcjij¹drowej NF-6B ssaków tworzy 5 cz¹steczek Rel,do których nale¿¹: NF-6B1 (p105/p50), NF-6B2(p100/p52), RelA (p65), c-Rel, RelB. Bia³ka NF-6B1i NF-6B2 powstaj¹ w komórce w postaci nieaktyw-nych cz¹steczek prekursorowych p105 i p100, którew trakcie modyfikacji potranslacyjnej zostaj¹ prze-kszta³cone w aktywne bia³ka p50 i p52 [5].

Wszystkie bia³ka Rel posiadaj¹ na N-koñcu kon-serwatywn¹ domenê homologiczn¹ Rel (rel homologydomain, RHD), której sekwencja wi¹¿e bia³ka hamu-j¹ce (inhibitor � 6B, I6B) i sekwencje docelowe w ob-rêbie ³añcucha DNA. Wa¿nym elementem RHD jestsekwencja lokalizacji j¹drowej (nuclear localisationsignal, TLS), która jest odpowiedzialna za przemiesz-czenie NF-6B do j¹dra komórkowego [62].

Cz¹steczki Rel tworz¹ formy z³o¿one, bêd¹ce homo-lub heterodimerami. Najczêstsz¹ postaci¹ jest hetero-dimer zbudowany z podjednostek RelA (p65) i NF6B1(p50) [18].

Fizjologicznie NF-6B znajduje siê w cytoplazmiew nieaktywnej postaci. NF-6B jest zwi¹zany ze swoiminhibitorem � I6B (I6B", I6B$, I6B(/p105, I6B*/p100,I6B., I6Bg i Bcl-3). Aktywacja NF-6B w komórce

mo¿e nast¹piæ dwiema drogami. Pierwsza z nich okre�-lana jest mianem klasycznej i obejmuje przede wszyst-kim dzia³anie kinaz I6B (I6B � kinases, IKK). Aktywa-cja IKK prowadzi do fosforylacji dwóch specyficznychreszt serynowych I6B, czego efektem jest przy³¹cze-nie do I6B cz¹steczek ubikwityny i proteoliza z udzia-³em podjednostki 26S proteasomu. W wyniku degrada-cji I6B zostaj¹ ods³oniête sekwencje TLS, uwolnionecz¹steczki dimeru NF-6B zostaj¹ przemieszczone doj¹dra komórkowego, gdzie reguluj¹ ekspresjê okre�-lonych genów.

Bod�ce stymuluj¹ce mog¹ poprowadziæ do aktywa-cji innych kinaz, fosforyluj¹cych bia³ka inhibitoroweI6B. Nale¿¹ do nich: kinazy bia³kowe aktywowanemitogenami (mitogen activated protein kinase, MAPK),kinazy MEKK 1, 2, 3 (MAPK/ERK kinase), kinazabia³kowa Akt (Akt/Protein kinase), kinaza bia³kowaC . (protein kinase C., PKC .) [62].

Druga z dróg aktywacji NF-6B � alternatywna, do-tyczy NF-6B, które jest dimerem RelB i p52. Czynni-kami aktywuj¹cymi ten szlak, s¹ przede wszystkimcytokiny. Wymaga on dzia³ania IKK" oraz kinaz in-dukuj¹cych NF-6B (NF-6B inducing kinases, NIK).NIK katalizuje fosforylacjê IKK", które w tej postacipowoduje przekszta³cenie nieaktywnego p100 do jegoczynnej formy � p52. Kompleks RelB/p52 zostajeprzemieszczony do j¹dra komórkowego [62].

Aktywacja NF-6B przez bakterie lub ich produktyzachodzi za po�rednictwem receptorów TLR (Toll-likereceptor, TLR) klasyczn¹ drog¹ [5, 61]. TLR s¹ kon-serwatywnymi receptorami rozpoznaj¹cymi wzorzec(pattern recognition receptor, PRR), prezentowanyprzez ró¿ne drobnoustroje (pathogen-associated mi-crobial pattern, PAMP) [19].

Receptory TLR2 wi¹¿¹ siê z peptydoglikanemi lipoproteinami bakterii Gram-dodatnich, TLR4 z lipo-polisacharydem (LPS) bakterii Gram-ujemnych, TLR5rozpoznaj¹ rzêski bakteryjne, a TLR9 � niezmetylo-wany bakteryjny DNA [19, 43]. Niezale¿nie od typureceptora TLR dochodzi do ekspresji genów zale¿nychod NF-6B.

Niezbêdna dla aktywacji TLR jest obecno�æ bia³kaadaptorowego (myleoid-differentiation marker, MyD88).MyD88 posiada równie¿ dwie domeny: TIR i domenê�mierci (death domain, DD). Interakcje pomiêdzy do-menami MyD88 i TLR prowadz¹ do aktywacji kinazserynowo-treoninowych zwi¹zanych z receptorem dlaIL-1 (IL-1 RI associated protein kinases, IRAK).W wyniku szeregu procesów dochodzi do aktywacjikinazy aktywuj¹cej NF-6B (NF-6B inducing kinase,NIK), która fosforyluje i aktywuje trzy podjednostkiIKK (IKK", IKK$ i IKK(). IKK uwalniaj¹ NF-6B zjego nieaktywnego kompleksu z I6B [19].

K r a p p m a n n i wsp. [34] udowodnili, ¿e LPSpoprzez wi¹zanie siê z TLR4 wywo³uje aktywacjê


NF-6B, który z kolei reguluje aktywno�æ transkryp-cyjn¹ AP-1 (activating protein-1, AP-1).

NF-6B jest czynnikiem, który reguluje ekspresjêoko³o 150 genów. Wykazano jego anty- i proapopto-tyczne dzia³anie [37]. NF-6B ma zdolno�æ hamowaniaapoptozy, w której uczestniczy TNF-" w pierwotnychfibroblastach ludzkich i szczurzych, komórkach T Jur-kat i komórkach T24 linii ludzkiego raka pêcherza. Od-grywa równie¿ rolê w apoptozie zró¿nicowanych ma-krofagów, w któr¹ zaanga¿owane s¹ PPAR" i PPAR(.

Zidentyfikowano szereg produktów genów anty-apoptotycznych regulowanych przez NF-6B. Nale¿¹do nich m.in. inhibitory apoptozy (inhibtors of apop-tosis, IAPs), bia³kowe inhibitory kaspazy-8 (FADD-like interleukin-1$-converting enzyme-like protease,cFLIP), A1 okre�lanego te¿ jako Bfl1, czynniki zwi¹-zane z TNFR (TNFR-associated factor, TRAF) [28].

W grupie IAP wyró¿nia siê kilka rodzajów bia³ek,do których nale¿¹, m. in., komórkowe inhibitory apop-tozy (cellular inhibitor of apoptosis, cIAP), inhibitoryzwi¹zane z chromosomem X (X-linked inhibitor ofapoptosis protein, XIAP) [28]. cIAP dzia³aj¹ anty-apoptotycznie poprzez bezpo�rednie wi¹zanie siêz kaspazami efektorowymi: kaspaz¹-3 i -7, zapobie-gaj¹c aktywacji proteolitycznej prokaspazy-6 i -9.Antyapoptotyczne dzia³anie XIAP polega równie¿ nablokowaniu kaspaz-3 i -7, co uniemo¿liwia aktywacjêprokaspazy-9.

W inny sposób antyapoptotycznie dzia³aj¹ bia³kacFLIP [28]. Zawieraj¹ dwie efektorowe domeny�mierci (death efector domains, DEDs) i katalitycznienieaktywn¹ domenê podobn¹ do kaspaz. cFLIP hamu-je apoptozê poprzez dzia³anie na prokaspazê-8. Do-datkowo cFLIP oddzia³uje z TRAF2 i bia³kami dzia-³aj¹cymi z receptorami (receptor-interacting protein,RIP), które s¹ odpowiedzialne za aktywacjê JNK iIKK przez kompleks TNFR1. Aktywne bia³ko cFLIPpowoduje nasilone uwalnianie NF-6B [28].

NF-6B mo¿e wp³ywaæ na drogê apoptozy zale¿n¹od mitochondriów [28]. Poprzez oddzia³ywania z bia³-kami rodziny Bcl-2: A1 i BclXL stabilizuje b³ony mito-chondrialne i zapobiega uwalnianiu cz¹steczek cytochro-mu c. Bia³ko A1 hamuje tak¿e aktywacjê kaspazy-9.

Z badañ C l i f t o n i wsp. [9] wynika, ¿e anty-apoptotyczny mechanizm zale¿ny od aktywacji NF-6Bwykorzystuj¹ bakterie z rodzaju Rickettsia. SzczepyR. rickettsii s¹ obligatoryjnymi patogenami wewn¹trz-komórkowym, które s¹ odpowiedzialne za szereg za-ka¿eñ �ródb³onka naczyniowego.

Badania przeprowadzono na komórkach ludzkiego�ródb³onka (endothelial cells, ECs). Po zaka¿eniu ECsR. rickettsii dochodzi³o do wzrostu aktywno�ci NF-6Bw j¹drze komórkowym [9]. Zmiana aktywno�ci NF-6Bmia³a charakterystyczny � dwufazowy przebieg. Pierw-szy szczyt wzrostu aktywno�ci obserwowano po trzech

godzinach od zaka¿enia ECs, a drugi � pomiêdzy 18a 24 godzin¹. Zaobserwowano, ¿e wzrost NF-6B jestpoprzedzony zwiêkszeniem aktywno�ci IKK" i IKK$,które prowadz¹ do fosforylacji I6B", a w konsekwen-cji do jego proteolizy i uwolnienia aktywnej formyNF-6B [9]. Wyniki pomiaru poziomu mRNA dla I6B"w grupie komórek zaka¿onych by³y siedmiokrotniewy¿sze ni¿ w grupie kontrolnej. Nieznany jest czyn-nik, który aktywuje IKK.

Konsekwencj¹ aktywacji NF-6B jest zablokowanieprzekszta³cania prokaspazy-8 i -9, co hamuje kaskadêkaspaz. Badania J o s h i i wsp. [27] dowodz¹, ¿ew czasie zaka¿enia R. rickettsii dochodzi do stabiliza-cji b³on mitochondrialnych. Odpowiedzialne za to s¹bia³ka z rodziny Bcl-2 [26].

Mechanizm zwi¹zany z aktywacj¹ NF-6B zaobser-wowano tak¿e u Ehrlichia chaffeensis [84]. Jest to obli-gatoryjny patogen wewn¹trzkomórkowy, który przeby-wa w endosomach monocytów. Z h a n g i wsp. [84]przeprowadzili badania na ludzkich monocytach liniiTPH1. Zaobserwowali, ¿e zaka¿enie TPH1 E. chaf-feensis powoduje aktywacjê NF-6B oraz BCL2A1,BIRC3, IER3 i MCC1, które nale¿¹ do grupy bia³ko-wych inhibitorów apoptozy. W pierwszych 7 godzi-nach od zaka¿enia hodowli dochodzi³o do represjiantagonistów Bcl-2: BIK i BNIP3L. Prowadzi³o to doustabilizowania b³on mitochondrialnych i zatrzymaniacz¹steczek cytochromu c w obrêbie mitochondrium.Powoduje to zatrzymanie wewn¹trzkomórkowego szla-ku apoptozy. Szczepy E. chaffeensis hamuj¹ tak¿e dro-gê kinaz Janusowych (Janus kinase, JAK) i bia³kaprzekazuj¹cego sygna³y i aktywatora transkrypcji (sig-nal transducers and activators of transcription, STAT)[84]. JAK1-STAT1 s¹ hamowane we wczesnej faziezaka¿enia E. chaffeensis.

JAK-STAT pe³ni kluczow¹ rolê w sygnalizacji cy-tokinowej. JAK uczestniczy w przenoszeniu aktywa-cyjnych grup fosforowych na bia³ka STAT. AktywnySTAT jest natychmiast transportowany z cytoplazmydo j¹dra komórkowego i anga¿owany w wi¹zanieDNA, co powoduje aktywno�æ transkrypcyjn¹ odpo-wiednich genów, w zale¿no�ci od czynnika stymulu-j¹cego JAK. Ligandy dla receptorów wi¹¿¹cych JAKto: IFN-", -$, -(, IL-2, IL-7, IL-10, IL13, IL-15, ery-tropoetyna, hormon wzrostu, prolaktyna, trombopo-etyna i inne polipeptydy. Konsekwencj¹ aktywacjiJAK-STAT przekazywanie sygna³ów z zewn¹trz ko-mórki do jej j¹dra. Zaburzenia w sygnalizacji komór-kowej powoduj¹, ¿e staje siê ona mniej wra¿liwa nabod�ce apoptotyczne [84].

E. chaffeensis powoduje obni¿enie syntezy kinaz 2fosforyzuj¹cych N-koniec bia³ka Jun (c-Jun amino-terminal kinase, JNK2) podczas wczesnej fazy zaka-¿enia [84]. Brak JNK2 stabilizuje b³ony mitochon-drialne, co zapobiega przedostawaniu siê cz¹steczek


cytochromu c do cytoplazmy komórkowej. Innymdzia³aniem JNK2 jest fosforylacja bia³ka Jun, zwiêk-szaj¹ca jego aktywno�æ transkrypcyjn¹. c-Jun razemz c-Fos, jest sk³adnikiem bia³ek apoptotycznych AP-1.Zahamowanie syntezy JNK2 wywo³uje wiêc, poprzezspadek fosforylacji Jun, spadek poziomu czynnikatranskrypcyjnego AP-1 [84].

Podczas zaka¿enia E. chaffeensis dochodzi dodat-kowo do zmiany aktywno�ci niektórych cyklin i kinazbia³kowych zale¿nych od cyklin (cyclin-dependent pro-tein kinases, CDKs) [84]. We wczesnej fazie zaka¿e-nia nastêpuje obni¿enie syntezy CDC2, CDK5, CDK8i cykliny G1, które zatrzymuj¹ cykl komórkowy w fa-zie G1. W pó�nym etapie zaka¿enia wzrasta poziomcykliny E i CDC25, które odpowiadaj¹ za wej�cie ko-mórki w fazê replikacji DNA. Dochodzi do intensyw-nej proliferacji komórki.

Dzia³anie antyapoptotyczne przez NF-6B zaobser-wowali M a e d a i wsp. [42]. Szczepy Helicobacterpylori, wydzielaj¹ce bia³ka cagA kodowane przez genyzwi¹zane z wysp¹ patogenno�ci cag (cagA pathoge-nicity island, cagPAI), s¹ zdolne do aktywacji cyklinyD1, Elk-1 i bia³ka c-Fos, które s¹ zaanga¿owanew proliferacjê komórkow¹ i mog¹ odgrywaæ pewn¹rolê w karcinogenezie przez aktywacjê ERK/MAPK.Bia³ka cagA s¹ wydzielane przez IV system sekrecjibia³ek (type 4 secretion system, T4SS) [17].

Badania Ya n a i i wsp. [81] dowodz¹, ¿e szczepyH. pylori cagPAI aktywuj¹ NF-6B, które jest odpo-wiedzialne za indukcjê cIAP2. Zaobserwowano, ¿e wkomórkach ludzkiego gruczolakoraka ¿o³¹dka z liniiMKN45 dochodzi do wzrostu transkrypcji mRNA dlacIAP2. cIAP2 powoduje nasilon¹ ubikwitynacjê ka-spazy-3 i -7, co hamuje szlak apoptozy. Podanie inhibi-torów NF-6B w tych komórkach wywo³ywa³o spadekekspresji cIAP2, co jednoznacznie �wiadczy o udzialeNF-6B w szlaku antyapoptotycznym indukowanymH. pylori cagPAI.

H i r a t a i wsp. [21] wykazali, ¿e szczepy H. pyloricagPAI powoduj¹ aktywacjê w komórkach raka ¿o³¹d-ka linii AGS obu podjednostek IKK: " i $. IKK$ od-powiada za aktywacjê NF-6B, dzia³aj¹c jak kinazaI6B", natomiast IKK" � zostaje przemieszczone doj¹dra komórkowego i jest konieczne do wywo³aniaw³a�ciwej odpowiedzi zapalnej. Znamienn¹ rolê przy-pisuje siê aktywacji kinazy serynowo-treoninowejTAK1 (TGF-beta-activated kinase), która odpowiadabezpo�rednio za fosforylacjê IKK.

Z badañ prowadzonych przez O h m a e i wsp. [56]wynika, ¿e supresja apoptozy ludzkich limfocytów Bi fibroblastów zachodzi z udzia³em aktywacji alterna-tywnej drogi NF-6B. Odpowiada za to LPS H. pylori,natomiast nie jest zale¿ne od obecno�ci genu cag.

Udzia³ klasycznej drogi aktywacji NF-6B zaobser-wowano w przypadku zahamowania �mierci makrofa-

gów linii RAW 264.7 i wywodz¹cych siê ze szpikukostnego zaka¿onego E. coli [16]. Komórki gospoda-rza po fagocytozie E. coli wykazywa³y wzrost ekspre-sji Bcl-2, co stabilizuje potencja³ b³onowy mitochon-drium, wzmo¿on¹ syntezê cIAP-2 oraz blokowaniekaskady kaspaz efektorowych.

L i u i wsp. [38] zaobserwowali, ¿e pa³eczki E. coli,które wytwarzaj¹ werotoksynê 2 (Verotoxin-2, VT-2),s¹ w stanie hamowaæ spontaniczn¹ apoptozê neutrofili.W badaniach in vitro podanie inhibitora PKC powo-dowa³o zniesienie antyapoptotycznego dzia³ania VT-2,co sugeruje mechanizm zale¿ny od PKC. AktywacjaPKC mo¿e prowadziæ do uwalniania NF-6B w komór-ce gospodarza, który mo¿e byæ bezpo�rednio zaanga-¿owany w proces regulacji apoptozy komórek zaka-¿onych E. coli VT-2 [7].

Hamowanie spontanicznej apoptozy zosta³o udo-wodniono w przypadku Staphylococcus epidermidis[36]. L i l e s i wsp. [36] wyizolowali modulinê roz-puszczaln¹ w fenolu (phenol-soluble modulin, PSM).Jest to zwi¹zek syntetyzowany przez drobnoustrojeo w³a�ciwo�ciach stymulacji wytwarzania cytokin po-zapalnych. In vitro PSM hamuje spontaniczn¹ apopto-zê neutrofili i monocytów. W przypadku monocytówlinii THP-1 mechanizm tego zjawiska obejmuje akty-wacjê NF-6B [48].

Kwas lipoteicholowy S. aureus wykazuje aktyw-no�æ antyapoptotyczn¹ w stosunku do neutrofili [65].Z badañ L o t z i wsp. [40] wynika, ¿e w mechanizmindukcji genów antyapoptotycznych zaanga¿owane s¹obecne na komórce neutrofili receptory CD14 i TLR2,których aktywacja wywo³uje uwalnianie NF-6B z po³¹-czenia z inhibitorem. M o r e i l h o n i wsp. [50] wyka-zali, ¿e aktywacja genów antyapoptotycznych (BIRC3,SGK, PIM, BCL2A1) zachodzi g³ównie w przypadkuzaka¿enia komórek nab³onka oddechowego bezkomór-kowym supernatantem S. aureus, za� w mniejszymstopniu � ¿ywymi komórkami. Czynnikiem, odpowie-dzialnym za wzmo¿enie transkrypcji genów hamuj¹-cych apoptozê, jest prawdopodobnie bia³ko zwi¹zaneze �cian¹ komórkow¹, rozpuszczalne w wodzie.

Zdaniem K e m p f i wsp. [30] antyapoptotycznedzia³anie Bartonella henselae wobec komórek mono-cytarnych linii Mono Mac 6 jest zwi¹zane z aktywacj¹czynnika transkrypcyjnego NF-6B oraz ze wzrostempoziomu komórkowych inhibitorów apoptozy cIAP-1i -2 zale¿nych od NF-6B. Inhibitory apoptozy (inhi-bitor of apoptosis proteins, IAPs), do których nale¿¹cIAP-1 i -2 hamuj¹ kaspazê-3, -7, -9 [11].

Stwierdzono, ¿e hamowanie apoptozy komórek�ródb³onka naczyniowego przez bakterie B. henselaei B. quintana jest zale¿ne od IV systemu sekrecji VirB/VirD4 [63, 64]. Czynnikiem antyapoptotycznym jestbia³ko efektorowe BepA dostarczane do wnêtrza ko-mórki przez T4SS. W komórkach �ródb³onka naczy-


niowego bia³ko BepA wi¹¿e siê z b³on¹ plazmatyczn¹i powoduje wzrost wewn¹trzkomórkowego poziomucyklicznego adenozynomonofosforanu (cAMP). Zda-niem S c h m i d i wsp. [63] zwiêkszenie zawarto�cicAMP wewn¹trz komórki mo¿e wynikaæ z bezpo�red-niego wp³ywu bia³ka BepA na cyklazê adenylow¹.Mo¿e byæ tak¿e efektem oddzia³ywania z bia³kami Gzwi¹zanymi z b³on¹ plazmatyczn¹ lub te¿ z receptora-mi sprzê¿onymi z bia³kiem G reguluj¹cymi aktywno�æcyklazy. Nie wiadomo, w jaki sposób cAMP zapobie-ga apoptozie komórek �ródb³onka naczyniowego. Byæmo¿e powoduje indukcjê komórkowego inhibitoraapoptozy 2 cIAP-2 [53]. Wed³ug badaczy dzia³aniebia³ka BepA jest niezale¿ne od czynnika j¹drowegoNF-6B [63]. Byæ mo¿e odmienne wyniki w stosunkudo badañ K e m p f i wsp. [30] wynikaj¹ z zastosowa-nia ró¿nych linii komórkowych.

Jak wynika z badañ B i n n i c k e r i wsp. [4] anty-apoptotyczny wp³yw N. gonorrhoeae na komórki na-b³onkowe cewki moczowej jest zwi¹zany z udzia³emczynnika transkrypcyjnego NF-6B. Stwierdzono, ¿esk³adnik b³ony zewnêtrznej, bia³ko Por IB, powodujeaktywacjê czynnika NF-6B i wzrost ekspresji zale¿-nych od niego genów bfl-1, cox-2 i c-IAP2, którychbia³kowe produkty mog¹ hamowaæ zaprogramowan¹�mieræ komórki na drodze ró¿nych mechanizmów.Bia³ko Bfl-1 oddzia³uje z czynnikami proapoptotycz-nymi i zapobiega uwolnieniu cytochromu c z mitochon-drium [77, 85]. Nadekspresja bia³ka COX-2 powodujezale¿ny od aktywacji szlaku PI3K/Akt wzrost poziomubia³ka Mcl-1 [39] hamuj¹cego proapoptotyczny czyn-nik Bok [24]. Wykazano równie¿, ¿e bia³ko Mcl-1 mo¿ehamowaæ apoptozê powodowan¹ nadekspresj¹ c-Myc[60] oraz wi¹zaæ siê z bia³kiem Bax, powoduj¹c jegosekwestracjê [78]. Dok³adny mechanizm dzia³ania po-ryny Por IB N. gonorrohoeae nie jest w pe³ni znany.

Hamuj¹cy wp³yw bakterii z rodzajów Chlamydiai Chlamydophila na zaprogramowan¹ �mieræ ró¿nychtypów komórek mo¿e byæ zwi¹zany z czynnikiemtranskrypcyjnym NF-6B, chocia¿ istniej¹ sprzecznedoniesienia na ten temat [14, 75, 79].

Wed³ug W a h l i wsp. [75] Ch. pneumoniae indu-kuje zale¿n¹ od NF-6B ekspresjê inhibitora apoptozyc-IAP2 (cellular inhibitor of apoptosis 2) w zaka¿onychkomórkach monocytarnych Mono Mac 6. Odmiennewyniki uzyskali F i s c h e r i wsp. [14]. Zdaniem bada-czy antyapoptotyczne dzia³anie Ch. pneumoniae wobeckomórek HeLa zwi¹zane z zablokowaniem uwolnie-nia cytochromu c i zale¿nej od niego aktywacji kaspaznie wymaga udzia³u NF-6B. Równie¿ X i a o i wsp.[79] zauwa¿yli, ¿e bakterie C. trachomatis zapobiega-j¹ apoptozie zaka¿onych komórek HeLa niezale¿nieod czynnika transkrypcyjnego NF-6B. Zarówno che-miczne zablokowanie aktywacji NF-6B, jak usuniêciegenu p65 koduj¹cego ten czynnik, nie wp³ynê³o na ha-

mowanie zaprogramowanej �mierci komórek HeLa.Byæ mo¿e odmienne wyniki badañ s¹ spowodowaneu¿yciem ró¿nych linii komórkowych lub szczepówbakteryjnych.

3.2.2. Udzia³ szlaku PI3K/Akt

Z antyapoptotycznym dzia³aniem bakterii jest zwi¹-zany tak¿e szlak przeka�nikowy obejmuj¹cy 3-kina-zê fosfatydylinozytolu (phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K) oraz kinazê Akt. 3-kinaza fosfatydylinozytolujest enzymem sk³adaj¹cym siê z podjednostki katali-tycznej (P110) oraz podjednostki adaptorowej/regula-torowej (P85), aktywowanej przez receptory o aktyw-no�ci kinazy tyrozynowej (receptors tyrosine kinase,RTK) i receptory sprzê¿one z bia³kiem G (G protein-coupled receptor, GPCR). Aktywny enzym PI3K prze-kszta³ca 4,5-difosforan fosfatydylinozytolu w 3,4,5-tri-fosforan fosfatydylinozytolu [57].

Enzym Akt jest kinaz¹ serynowo-treoninow¹ na-zywan¹ tak¿e kinaz¹ bia³kow¹ B (protein kinase B,PKB). Wystêpuje u ssaków w postaci trzech izoform:Akt1 (PKB"), Akt2 (PKB$) i Akt3 (PKB(), z którychka¿da posiada N-koñcow¹ domenê PH (pleckstrin ho-mology domain), domenê �rodkow¹ kinazy oraz C-koñ-cow¹ domenê regulatorow¹. Kinaza Akt ulega prze-mieszczeniu do b³ony plazmatycznej i poprzez domenêPH oddzia³uje z 3,4,5-trifosforanem fosfatydylinozy-tolu, czego efektem jest zmiana konformacji enzymu,umo¿liwiaj¹ca aktywacjê kinazy. Aktywacja enzymuAkt wynika z fosforylacji dwu reszt aminokwasów.Dla kinazy Akt1 jest to Thr308 zlokalizowana w do-menie �rodkowej kinazy, fosforylowana przez kinazêPDK1 (phosphoinositide-dependent kinase 1, kinaza 1zale¿na od fosfoinozyny) oraz Ser473 w C-koñcowejdomenie regulatorowej, która mo¿e ulegaæ autofosfo-rylacji lub byæ fosforylowana przez inn¹ kinazê sery-now¹, np. kinazê zwi¹zan¹ z integryn¹ (integrin-linkedkinase, ILK), b¹d� PDK2 [57].

Aktywny enzym Akt wp³ywa na wiele procesówzachodz¹cych w komórce, m.in., na proliferacjê, meta-bolizm i apoptozê [57]. Kinaza Akt mo¿e zapobiegaæzaprogramowanej �mierci komórek dzia³aj¹c bezpo-�rednio na czynniki proapoptotyczne. Wykazano, ¿ehamuje zmianê konformacji bia³ka Bax i jego prze-mieszczenie do mitochondrium, co uniemo¿liwia uwol-nienie cytochromu c i aktywacjê kaskady kaspaz [80].Kinaza Akt inaktywuje proapoptotyczne bia³ko Bad[57]. Ponadto, jak wynika z badañ C a r d o n e i wsp.[8] fosforyluje kaspazê-9, co skutkuje os³abieniem jejaktywno�ci.

Antyapoptotyczne dzia³anie kinazy Akt zwi¹zanejest tak¿e z regulacj¹ czynników transkrypcyjnych kon-troluj¹cych pro- i antyapoptotyczne geny. Fosforylacja


czynników transkrypcyjnych AFX, nazywany tak¿eFOXO4 (forkhead box protein O4), FKHR (forkheadhomolog 1 rhabdomyosarcoma) i FKHRL1 (forkheadhomolog rhabdomyosarcoma like 1), nale¿¹cych dorodziny Forkhead zapobiega transkrypcji proapopto-tycznych genów koduj¹cych bia³ka FasL, IGFBP-1 orazBim. Z kolei fosforylacja i aktywacja czynnika trans-krypcyjnego CREB (cAMP-response element bindingprotein) skutkuje wzrostem ekspresji antyapoptotycz-nych genów bcl-2 i mcl-1. Kinaza Akt mo¿e tak¿efosforylowaæ i aktywowaæ kinazê I6B, indukuj¹c¹degradacjê I6B, inhibitora czynnika trasnskrypcyjne-go NF-6B. Prowadzi to do aktywacji NF-6B i trans-krypcji zale¿nych od czynnika j¹drowego genów ko-duj¹cych bia³ka Bcl-xL, inhibitory kaspaz oraz bia³koc-Myb [57]. Jak wynika z badañ B a s u i wsp. [2] en-zym Akt fosforyluje bia³ko Yap (Yes-associated prote-in) bêd¹ce koaktywatorem czynnika transkrypcyjnegop73. Ufosforylowanie proteiny Yap powoduje supresjêpo�redniczonej przez p73 transkrypcji genów koduj¹-cych bia³ka proapoptotyczne, np. Bax w odpowiedzina czynniki uszkadzaj¹ce DNA. Kinaza Akt fosfory-luje tak¿e bia³ko Mdm2 (murine double minute-2) [47],bêd¹ce ligaz¹ ubikwityny E3 [23]. Proteina Mdm2 po-woduje obni¿enie komórkowego poziomu bia³ka p53oraz zmniejszenie jego aktywno�ci transkrypcyjnej[47]. Proteina p53 jest odpowiedzialna za ekspresjêbia³ek proapoptotycznych, m.in.: B a x [49], N o x a[55] i P u m a [52].

Kinaza Akt mo¿e zapobiegaæ apoptozie poprzezregulacjê metabolizmu komórki. Fosforylacja kinazy 3syntazy glikogenu (glycogen synthase kinase 3, GSK3),enzymu zwi¹zanego z syntez¹ glikogenu w odpowiedzina wysoki poziom insuliny [10] hamuje zaprogramo-wan¹ �mieræ komórki [58].

Bakterie C. trachomatis zapobiegaj¹ zaprogramo-wanej �mierci komórek równie¿ za po�rednictwem ki-nazy fosfatydyloinozytolu PI3K. Jak wynika z badañVe r b e k e i wsp. [74] w zaka¿onych komórkach na-stêpuje aktywacja kinazy PI3K, która z kolei wp³ywana aktywacjê kinazy bia³kowej Akt. Aktywny enzymAkt fosforyluje proapoptotyczne bia³ko Bad wi¹¿¹cesiê poprzez bia³ko adaptorowe 14-3-3$ z bia³kiemIncG znajduj¹cym siê w b³onie cia³ka wtrêtowego.Odizolowanie bia³ka Bad od mitochondrium zapobie-ga stymulacji uwalniania cytochromu c. Nie wiadomo,w jaki sposób dochodzi do aktywacji kinezy PI3Kw komórkach zaka¿onych przez C. trachomatis. Zda-niem badaczy proces ten mo¿e byæ spowodowany anty-apoptotycznym czynnikiem wytwarzanym przez bakte-rie i wydzielanym do cytozolu przez III system sekrecji(type three secretion system, TTSS) [74].

Czynnikiem odpowiedzialnym za zahamowanieapoptozy komórek nab³onkowych zaka¿onych przezSalmonella Typhimurium jest bia³ko efektorowe SopB

[32], dostarczane do wnêtrza komórki przez III systemsekrecji (TTSS) [13]. Bia³ko SopB posiadaj¹ce aktyw-no�æ fosfatazy fosfatydylinozytolu [54] powodujeci¹g³¹ fosforylacjê i aktywacjê serynowo-teroninowejkinazy Akt. Ponadto, jak wynika z badañ K n o d l e ri wsp. [32] bia³ko SopB zapobiega aktywacji kaspazy-3.

Dzia³anie antyapoptotyczne pa³eczek Porphyromo-nas gingivalis jest zwi¹zane z fosforylacj¹ bia³ka Aktprzez 3-kinazê fosfatydylinozytolu (phosphatidylino-sitol 3-kinase, PI3K) [82]. Nie jest znany czynnik ak-tywuj¹cy kinazê PI3K w zaka¿onych komórkach. Byæmo¿e jest nim LPS P. gingivalis wykazuj¹cy dzia³anieantyapoptotyczne wobec neutrofili [51]. LPS tych bak-terii wi¹¿e siê z receptorem TLR2 [22]. S t r a s s h e i mi wsp. [66] opisali aktywacjê PI3K za po�rednictwemreceptora TLR2 u neutrofili.

4. Podsumowanie

Prowadzone w ostatnich latach do�wiadczenia przy-czyni³y siê do lepszego poznania wp³ywu bakterii nazaka¿one komórki. Wykazano, ¿e drobnoustroje mog¹zarówno indukowaæ, jak i hamowaæ apoptozê. Bakteriemog¹ zapobiegaæ zaprogramowanej �mierci komórekdzia³aj¹c bezpo�rednio na struktury i enzymy uczest-nicz¹ce w apoptozie takie, jak: receptory, kaspazy czymitochondria. Antyapoptotyczny wp³yw drobnoustro-jów mo¿e mieæ tak¿e charakter po�redni i byæ zwi¹zanyz aktywacj¹ szlaków przeka�nikowych zlokalizowa-nych wewn¹trz zaka¿onych komórek.

Apoptoza jest procesem maj¹cym istotne znacze-nie w patogenezie chorób wywo³anych przez bakterie.Jak wynika z przeprowadzonych badañ, hamowanieapoptozy umo¿liwia drobnoustrojom rozmna¿anie siêw zaka¿onych komórkach chroni¹c je przed dzia³a-niem uk³adu odporno�ciowego.

Mimo znacznego postêpu w badaniach nad zapro-gramowan¹ �mierci¹ komórek wiele mechanizmówantypoptotycznego dzia³ania bakterii nie zosta³o dokoñca wyja�nionych, a wiele z nich opiera siê w du-¿ym stopniu na hipotezach. Konieczne s¹ dalsze pracebadawcze, które umo¿liwi¹ dok³adne poznanie wp³ywudrobnoustrojów na zaka¿one komórki oraz pozwol¹ naopracowanie nowych metod zapobiegania i leczeniachorób wywo³anych przez bakterie.

Pi�miennictwo

1. Balcewicz-Sablinska M., Keane J., Kornfeld H., RemoldH.G.: Pathogenic Mycobacterium tuberculosis evades apop-tosis of host macrophages by release of TNF-R2, resulting ininactivation of TNF-". J. Immunol. 161, 2636�2541 (1998)

2. Basu S., Totty N.F., Irwin M.S., Sudol M., Downward J.: Aktphosphorylates the Yes-associated protein, YAP, to induceinteraction with 14-3-3 and attenuation of p73-mediatedapoptosis. Mol. Cell. 11, 11�23 (2003)


3. Beck S.C., Meyer T.F.: IgA1 protease from Neisseria gonor-rhoeae inhibits TNF"-mediated apoptosis of human mono-cytic cells. FEBS Lett. 472, 287�292 (2000)

4. Binnicker M.J., Williams R.D., Apicella M.A.: GonococcalPorin IB activates NF-6B in human urethal epithelium andincreases the expression of host antiapoptotic factors. Infect.Immun. 72, 6408�6417 (2004)

5. Bonizzi G., Karin M.: The two NF-kB activation pathwaysand their role in innate and adaptive immunity. Trends Im-munol. 25, 280�288 (2004)

6. Böhm I., Schild H.: Apoptosis: the complex scenario fora silent cell death. Mol. Imag. Biol. 5, 2�14 (2003)

7. Cameron P., Bingham D., Paul A., Pavelka M., Cameron S.,Rotondo D., Plevin R.: Essential role for verotoxin in susta-ined stress-activated protein kinase and nuclear factor kappa Bsignaling, stimulated by Escherichia coli O157:H7 in VeroCells. Infect. Immun. 70, 5370�5380 (2002)

8. Cardone M.H., Roy N., Stennicke H.R., Salvesen G.S., Fran-ke T.F., Stanbridge E., Frisch S., Reed J.C.: Regulation ofcell death protease caspase-9 by phosphorylation. Science,282, 1318�1321 (1998)

9. Clifton D.R., Rydkina E., Freeman R.S., Sahni S.K.: NF-6Bactivation during Rickettsia rickettsii infection of endothelialcells involves the activation of catalytic I6B kinases IKK"and IKK$ and phosphorylation-proteolysis of the inhibitorprotein I6B". Infect. Immun. 73, 155�165 (2005)

10. Cross D.A., Alessi D.R., Cohen P., Andjelkovich M., Hem-mings B.A.: Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insu-lin mediated by protein kinase B. Nature, 378, 785�789 (1995)

11. Deveraux Q.L., Reed J.C.: IAP family proteins � suppres-sors of apoptosis. Genes Dev. 13, 239�252 (1999)

12. Dong F., Pirbhai M., Xiao Y., Zhong Y., Wu Y., Zhong G.:Degradation of the proapoptotic proteins Bik, Puma and Bimwith Bcl-2 Domain 3 homology in Chlamydia trachomatis-infected cells. Infect. Immun. 73, 1861�1864 (2005)

13. Ehrbar K., Mirold S., Friebel A., Stender S., Hardt W.D.:Characterization of effector proteins translocated via theSPI1 type III secretion system of Salmonella Typhimurium.Int. J. Med. Microbiol. 291, 479�485 (2002)

14. Fischer S.F., Schwarz C., Vier J., Häcker G.: Characteriza-tion of antiapoptotic activities of Chlamydia pneumoniae inhuman cells. Infect. Immun. 69, 7121�7129 (2001)

15. Fischer S.F., Vier J., Kirschnek S., Klos A., Hess S., Ying S.,Häcker G.: Chlamydia inhibit host cell apoptosis by degra-dation of proapoptotic BH3-only proteins. J. Exp. Med. 200,905�916 (2004)

16. Groesdonk H.V., Schlottmann S., Richter F., Georgieff M.,Senftleben U.: Escherichia coli prevents phagocytosis-indu-ced death of macrophages via classical NF-6B signaling, a linkto T-cell activation. Infect. Immun. 74, 5989�6000 (2006)

17. Guillemin K., Salama N.R., Tompkins L.S., Falkow S.: Cagpathogenicity island-specific responses of gastric epithelialcells to Helicobacter pylori infection. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 99, 15136�15141 (2002)

18. Häcker G., Fischer S.F.: Bacterial anti-apoptotic activities.FEMS Microbiol. Lett. 211, 1�6 (2002)

19. Hayden M.S., Ghosh S.: Signaling to NF-6B. Genes Devel.18, 2195�2224 (2004)

20. Heczko U., Carthy Ch.M., O�Brien B.A., Finlay B.B.:Decreased apoptosis in the ileum and ileal Payer�s patches:a feature after infection with rabbit enteropathogenic Esche-richia coli O130. Infect. Immun. 69, 4580�4589 (2001)

21. Hirata Y., Maeda S., Ohmae T., Shibata W., Yanai A., OguraK., Yoshida H., Kawale T., Omata M.: Helicobacter pylori

induces I6B kinase " nuclear translocation and chemokineproduction in gastric epithelial cells. Infect. Immun. 74,1452�1461 (2006)

22. Hirschfeld M, Weis J.J., Toschchakov V., Salkowski C.A.,Cody M.J., Ward D.C., Qureshi N., Michalek S.M., Vogel S.N.:Signaling by Toll-Like Receptor 2 and 4 agonists results indifferential gene expression in murine macrophages. Infect.Immun. 69, 1477�1482 (2001)

23. Honda R., Tanaka H., Yasuda H.: Oncoprotein Mdm2 isa ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53. FEBS Lett.420, 25�27 (1997)

24. Hsu S.Y., Kaipia A., McGee E., Lomeli M., Hsueh A.J.: Bokis a proapoptotic Bcl-2 protein with restricted expression inreproductive tissues and heterodimerizes with selective anti-apoptotic Bcl-2 family members. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,94, 12401�12406 (1997)

25. Jin Z., El-Deiry W.S.: Overview of cell death signaling path-ways. Cancer Biol. Ther. 4, 139�163 (2005)

26. Joshi S.G., Francis Ch.W., Silverman D.J., Sahni S.K.: NF-6Bactivation suppresses host cell apoptosis during Rickettsiarickettsii infection via regulatory effects on intracellular loca-lization or levels of apoptogenic and anti-apoptotic proteins.FEMS Microbiol. Lett. 234, 333�341 (2004)

27. Joshi S.G., Francis Ch.W., Silverman D.J., Sahni S.K.: Nuc-lear Factor-6B protects against host cell apoptosis duringRickettsia rickettsii infection by inhibiting activation of apicaland effector caspases and maintaining mitochondrial inte-grity. Infect. Immun. 71, 4127�4136 (2003)

28. Karin M., Lin A.: NF-6B at the crossroads of life and death.Nature Immunol. 3, 221�227 (2002)

29. Karst A.M., Li G.: BH3-only proteins in tumorigenesis andmalignant melanoma. Cell. Mol. Life Sci. 64, 318�330 (2007)

30. Kempf V.A., Schairer A., Neumann D., Grassi G.A., LauberK., Lebiedziejewski M., Schaller M., Kyme P., Wesselborg S.,Autenrieth I.B.: Bartonella henselae inhibits apoptosis inMono Mac 6 cells. Cell. Microbiol. 7, 91�104 (2005)

31. Kim M.K., Seong S.Y., Seoh J.Y., Han T.H., Song H.J.,Lee J.E., Shin J.H., Lim B.U., Kang J.S.: Orientia tsutsuga-mushi inhibits apoptosis of macrophages by retarding intra-cellular calcium release. Infect. Immun. 70, 4692�4696 (2002)

32. Knodler L.A., Finlay B.B., Steele-Mortimer O.: The Salmo-nella effector protein SopB protects epithelial cells fromapoptosis by sustained activation of Akt. J. Biol. Chem. 280,9058�9064 (2005)

33. Koskela P., Anttila T., Bjørge T., Brunsvig A., Dillner J.,Hakama M., Hakulinen T., Jellum E., Lehtinen M., Lenner P.,Luostarinen T., Pukkala E., Saikku P., Thoresen S., Young-man L., Paavonen J.: Chlamydia trachomatis infection asa risk factor for invasive cervical cancer. Int. J. Cancer, 85,35�39 (2000)

34. Krappmann D., Wegener E., Sunami Y., Esen M., Thiel A.,Mordmuller B., Scheidereit C.: The I6B kinase complex andNF-6B act as master regulators of lipopolysaccharide-indu-ced gene expression and control subordinate activation ofAP-1. Mol. Cell. Biol. 24, 6488�6500 (2004)

35. Li L., Lorenzo P.S., Bogi K., Blumberg P.M. Yuspa S.: Pro-tein kinase Cä targets mitochondria, alters mitochondrialmembrane potential and induces apoptosis in normal andneoplastic keratinocytes when overexpressed by adenoviralvector. Mol. Cell. Biol. 19, 8547�8558 (1999)

36. Liles W.C., Thomsen A.R., O�Mahony D.S., Klebanoff S.J.:Stimulation of human neutrophils and monocytes bystaphylococcal phenol-soluble modulin. J. Leukoc. Biol. 70,96�102 (2001)


37. Lin B., Williams-Skipp Ch., Tao Y., Schleicher M.S.,Cano L.L., Duke R.C., Scheinman R.I.: NF-6B functions asboth a proapoptotic and antiapoptotic regulatory factor withina single cell type. Cell Death Differ. 6, 570�582 (1999)

38. Liu J., Akahoshi T., Sasahana T., Kitasato H., Namai R.,Sasaki T., Inoue M., Kondo H.: Inhibition of nutrophil apop-tosis by verotoxin 2 derived from Escherichia coli O157:H7.Infect. Immun. 67, 6203�6205 (1999)

39. Lin M.T., Lee R.C., Yang P.C., Ho F.M., Kuo M.L.: Cyclo-oxygenase-2 inducing Mcl-1-dependent survival mechanismin human lung adenocarcinoma CL1.0 cells. Involment ofphosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway. J. Biol. Chem.276, 48997�49002 (2001)

40. Lotz S., Aga E., Wilde I., Van Zandbergen G., Hartung T.,Solbach W., Laskay T.: Highly purified lipoteichoic acid acti-vates neutrophil granulocytes and delays their spontaneousapoptosis via CD14 and TLR2. J. Leukoc. Biol. 75, 467�477(2004)

41. £abêdzka K., Grzanka A., Izdebska M.: Mitochondriuma �mieræ komórki. Post. Hig. Med. Do�w. 60, 439�446 (2006)

42. Maeda S., Yoshida H., Mitsuno Y., Hirata Y., Ogura K.,Shiratori Y., Omata M.: Analysis of apoptotic and antiapop-totic signaling pathways induced by Helicobacter pylori.J. Clin. Pathol. Mol. Pathol. 55, 286�293 (2002)

43. Majewska M., Szczepanik M.: Rola receptorów toll-podob-nych (TLR) w odporno�ci wrodzonej i nabytej oraz ich funk-cja w regulacji odpowiedzi immunologicznej. Post. Hig. Med.Do�w. 60, 52�63 (2006)

44. Majumder P.K., Pandey P., Sun X., Cheng K., Datta R.,Saxena S., Kharbanda S., Kufe D.: Mitochondrial transloca-tion of protein kinase Cä in phorbol ester-induced cytochro-me c release and apoptosis. J. Biol. Chem. 275, 21793�21796(2000)

45. Massari P., Ho Y., Wetzler L.M.: Neisseria meningitidis po-rin PorB interacts with mitochondria and protects cells fromapoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 9070�9075 (2000)

46. Massari P., King C.A., Ho A.Y., Wetzler L.M.: NeisserialPorB is translocated to the mitochondria of HeLa cells infec-ted with Neisseria meningitidis and protects cells from apop-tosis. Cell. Microbiol. 5, 99�109 (2003)

47. Mayo L.D., Donner D.B.: A phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway promotes translocation of Mdm2 from cytoplasmto the nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 11598�11603(2001)

48. Mehlin C., Headley C.M., Klebanoff S.J.: An inflammatorypolypeptide complex from Staphylococcus epidermidis: iso-lation and characterization. J. Exp. Med. 189, 907�918 (1999)

49. Miyashita T., Reed J.C.: Tumor suppressor p53 is a directtranscriptional activator of the the human bax gene. Cell, 80,293�299 (1995)

50. Moreilhon Ch., Gras D., Hologne C., Bajolet O., Cottrez F.,Magnone V., Merten M., Groux H., Puchelle E., Barbry P.:Live Staphylococcus aureus and bacterial soluble factorsinduce different transcriptional responses in human airwaycells. Physiol. Genom. 20, 244�255 (2005)

51. Murray D.A., Wilton J.M.A.: Lipopolysaccharide from theperiodontal pathogen Porphyromonas gingivalis preventsapoptosis of HL60-derived neutrophils in vitro. Infect. Immun.71, 7232�7235 (2003)

52. Nakano K., Vousden K.H.: Puma, a novel proapoptotic geneis induced by p53. Mol. Cell. 7, 683�694 (2001)

53. Nishihara H., Kizaka-Kondon S., Insel P.A., Eckmann L.:Inhibition of apoptosis in normal and transformed intestinalepithelial cells by cAMP through induction of inhibitor of

apoptosis protein (IAP)-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100,8921�8926 (2003)

54. Norris F.A., Wilson M.P., Wallis T.S., Galyov E.E., MajerusP.W.: SopB, a protein required for virulence of Salmonelladublin, is an inositol phosphate phosphatase. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 95, 14057�14059 (1998)

55. Oda E., Ohki R., Murasawa H., Nemoto J., Shibue T., Yama-shita T., Tokino T., Taniguchi T., Tanaka N.: Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator ofp53-induced apoptosis. Science, 288, 1053�1058 (2000)

56. Ohmae T, Hirata Y., Maeda S., Shibata W., Yanai A., OguraK., Yoshida H., Kawabe T., Omata M.: Helicobacter pyloriactivates NF-6B via the alternative pathway in B lymphocy-tes. J. Immunol. 175, 7162�7169 (2005)

57. Osaki M., Oshimura M., Ito H.: PI3K-Akt pathway: its func-tions and alternations in human cancer. Apoptosis, 9, 667�676(2004)

58. Pap M., Cooper G.M.: Role of glycogen synthase kinase-3in the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt cell survival path-way. J. Biol. Chem. 273, 19929�19932 (1998)

59. Pirbhai M., Dong F., Zhong Y., Pan K.Z., Zhong G.: The se-creted protease factor CPAF is responsible for degrading pro-apoptotic BH-3-only proteins in Chlamydia trachomatis-infected cells. J. Biol. Chem. 281, 31495�31501 (2006)

60. Reynolds J.E., Yang T., Qian L., Jenkinson J.D., Zhou P.,Eastman A., Craig R.W.: Mcl-1, a member of Bcl-2 familydelays apoptosis induced by c-Myc overexpression in Chi-nese hamster ovary cells. Cancer Res. 54, 6348�6352 (1994)

61. Ruland J., Mak T.W.: Transducing signals from antigen recep-tors to nuclear factor 6B. Immunol. Rev. 193, 93�100 (2003)

62. Rutkowski R., Panacewicz S.A., Skrzydlewska E., Herma-nowska-Szpakowicz T.: W³a�ciwo�ci biologiczne czynni-ka transkrypcji j¹drowej NF-6B. Alert. Astma Immun. 10,125�131 (2005)

63. Schmid M.C., Scheidegger F., Dehio M., Balmelle-Devaux N.,Schulein R., Guye P., Chennakesava C.S., Biedermann B.,Dehio C.: A translocated bacterial protein protects vascu-lar endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathogens, 2,1083�1097 (2006)

64. Schmid M.C., Schulein R., Dehio M., Denecker G., Carena I.,Dehio C.: The VirB type IV secretion system of Bartonellahenselae mediates invasion, proinflammantory activationand antiapoptotic protection of endothelial cells. Mol. Micro-biol. 52, 81�92 ( 2004)

65. Sladek Z., Rysanek D., Ryznarova H., Faldyna M.: Neutro-phil apoptosis during experimentally induced Staphylococcusaureus mastitis. Vet. Res. 36, 629�643 (2005)

66. Strassheim D., Asehnoune K., Park J.S. Kim J.Y. Hw Q.,Richter D., Kuhn K., Mitra S., Abraham E.: Phosphoinositide3-Kinase and Akt occupy central roles in inflammatoryresponse of Toll-like receptor 2-stimulated neutrophils.J. Immunol. 172, 5727�5733 (2004)

67. Sugiyama T.: Development of gastric cancer associated withHelicobacter pylori infection. Cancer Chemother. Pharma-col. 54, 1: S12�S20 (2004)

68. Sukumaran S.K. Selvaraj S.K., Prasadarao N.V.: Inhibitionof apoptosis by Escherichia coli K1 is accompanied byincreased expression of Bcl

XL and blockade mitochondrial

cytochrome c release in macrophages. Infect. Immun. 72,6012�6022 (2004)

69. Thompson C.B.: Apoptosis in the pathogenesis and treatmentof disease. Science, 267, 1456�1462 (1995)

70. Tse S.M., Mason D., Botelho R.J., Chiu B., Reyland M.,Hanada K., Inman R.D., Grinstein S.: Accumulation of dia-


cyloglycerol in the Chlamydia inclusion vacuole: possiblerole in the inhibition of host cell apoptosis. J. Biol. Chem.280, 25210�25215 (2005)

71. Vander Heiden M.G., Chandel N.S., Li X.X., SchumackerP.T., Colombini M., Thompson C.B.: Outer mitochondrialmembrane permeability can regulate coupled respirationand cell survival. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4666�4671(2000)

72. Vander Heiden M.G., Chandel N.S., Schumacker P.T.,Thompson C.B.: Bcl-x

l prevents cell death following growth

factor withdrawal by facilitating mitochondrial ATP/ADPexchange. Mol. Cell. 3, 159�167 (1999)

73. Vander Heiden M.G., Li X.X., Gottleib E., Hill R.B., Thomp-son C.B., Colombini M.: Bcl-x

L promotes the open configu-

ration of the voltage-dependent anion channel and metabolitepassage through the outer mitochondrial membrane. J. Biol.Chem. 276, 19414�19419 (2001)

74. Verbeke P., Welter-Stahl L., Ying S., Hansen J., Häcker G.,Darville T., Ojcius D.M.: Recruitment of Bad by the Chla-mydia trachomatis vacuole correlates with host-cell survival.PLoS Pathogens, 2, 408�417 (2006)

75. Wahl C., Maier S., Marre R., Essig A.: Chlamydia pneumo-niae induces the expression of inhibitor of apoptosis 2(c-IAP2) in human monocytic cell line by an NF-kappaB-dependent pathway. Int. J. Med. Microbiol. 293, 377�381(2003)

76. Weinrauch Y., Zychlinsky A.: The induction of apoptosis bybacterial pathogens. Ann. Rev. Microbiol. 53, 155�87 (1999)

77. Werner A.B., de Vries E., Tait S.W., Bontjer I., Borst J.: Bcl-2family member Bfl-1/A1 sequesters truncated Bid to inhibitits collaboration with proapoptotic Bak and Bax. J. Biol.Chem. 277, 22781�22788 (2002)

78. Willis S.N., Chen L., Dewson G., Wei A., Naik A., FlechterJ.I., Adams J.M., Huang D.C.S.: Proapoptotic Bak is sequ-estered by Mcl-1 and Bcl-x

L but not Bcl-2, until displaced by

BH3-only proteins. Genes Devel. 19, 1294�1305 (2005)79. Xiao Y., Zhong Y., Su H., Zhou Z., Chiao P., Zhong G.:

NF-6B activation is not required for Chlamydia trachomatisinhibition of host epithelial cell apoptosis. J. Immunol. 174,1701�1708 (2005)

80. Yamaguchi H., Wang H.G.: The protein kinase PKB/Akt re-gulates cell survival and apoptosis by inhibiting Bax confor-mational change. Oncogene, 20, 7779�86 (2001)

81. Yanai A., Hirata Y., Mitsuno Y., Maeda S., Shibata W., Aka-numa M., Yoshida H., Kawabe T., Omata M.: Helicobacterpylori induces antiapoptosis through nuclear factor-6B acti-vation. J. Infect. Dis. 188, 1741�1751 (2003)

82. Yilmaz O., Jungas T., Verbeke Ph., Ojcius D.M.: Activationof the phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt pathway contributesto survival of primary epithelial cells infected with the perio-dontal pathogen Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun.72, 3743�3751 (2004)

83. Ying S., Seiffert B.M., Häcker G., Fischer S.F.: Broad degra-dation of proapoptotic proteins with the conserved Bcl-2 ho-mology domain 3 during infection with Chlamydia tracho-matis. Infect. Immun. 73, 1399�1403 (2005)

84. Zhang J.-Z., Sinha M., Luxon B.A., Yu X.: Survival strategyof obligately intracellular Ehrlichia chaffeensis: novel modu-lation of immune response and host cell cycles. Infect. Immun.72, 498�507 (2004)

85. Zhang H., Cowan-Jacob S.W., Simonen M., Greenhalf W.,Heim J., Meyhack B.: Structural basis of Bfl-1 for its inter-action with Bax and its antiapoptotic action in mammalianand yeast cells. J. Biol. Chem. 275, 11092�11099 (2000)


1. Wprowadzenie

W roku 1942 M c I n t i r e i wspó³pracownicy opi-sali cykliczne oligomery glukozy wyizolowane z po-¿ywki, w której hodowano bakterie z gatunku Agrobac-terium tumefaciens (obecnie: Rhizobium radiobacter)[32]. S¹dzono, ¿e stanowi¹ one now¹ podklasê egzo-polisacharydów. Nieco pó�niej podczas badañ nad me-tabolizmem fosfolipidów u E. coli wykazano obecno�æpodobnych zwi¹zków w peryplazmie tych bakterii.Wykazano wtedy, ¿e przemiany fosfatydyloglicerolus¹ zwi¹zane z transferem reszty sn-1-fosfogliceroluna cz¹steczkê peryplazmatycznego glukanu. W lite-raturze przyj¹³ siê skrót MDO (membrane derivedoligosaccharides) dla okre�lenia tych oligosachary-dów. Okaza³o siê, ¿e zarówno glukany wyizolowanez komórek A. tumefaciens, jak i MDO z peryplazmyE. coli podlegaj¹ regulacji osmotycznej. St¹d wywo-dzi siê ich wspólna nazwa: osmoregulowalne pery-plazmatyczne glukany (osmoregulated periplasmicglucans � OPG) [27, 34].

Obecnie przyjmuje siê, ¿e OPG s¹ powszechneu bakterii Gram-ujemnych i mieszcz¹ siê w przestrzeni

peryplazmatycznej. Przestrzeñ ta jest wype³niona ma-cierz¹ maj¹c¹ postaæ ¿elu, w której oprócz glukanówi woreczka mureinowego obecne s¹ liczne bia³ka: miê-dzy innymi enzymy, bia³ka opiekuñcze, przeno�nikisubstancji drobnocz¹steczkowych, takich jak: amino-kwasy, peptydy, cukry, witaminy, koenzymy, nukleo-tydy i jony zwi¹zków nieorganicznych. W poszcze-gólnych grupach bakterii glukany maj¹ ró¿n¹ budowê,jednak mo¿na dopatrzyæ siê pewnych cech wspólnych.S¹ to polimery D-glukozy, która mo¿e byæ dodatkowopodstawiona sk³adnikami niecukrowymi. Z regu³y resz-ty glukozy s¹ ze sob¹ po³¹czone wi¹zaniami $-gliko-zydowymi, a wi¹zania "-glikozydowe spotyka siê spo-radycznie. Glukany mog¹ stanowiæ od 5 do 20%ca³kowitej suchej masy komórki. Ich ilo�æ zale¿y odgatunku bakterii, warunków hodowli, a tak¿e od fazywzrostu komórek. Najwiêcej tych oligocukrów pow-staje w logarytmicznej fazie wzrostu hodowli. W prze-strzeni peryplazmatycznej mog¹ osi¹gaæ stê¿enie od 10do 100 mM. Czê�æ glukanów jest wydzielana do pod-³o¿a. Tutaj ich ilo�æ ró¿ni siê znacznie i zale¿y od ga-tunku bakterii, a tak¿e jest silnie uwarunkowana przezfazê wzrostu oraz czynniki otoczenia. Wydzielanie

PERYPLAZMATYCZNE $-GLUKANYBAKTERII GRAM-UJEMNYCH

Iwona Komaniecka, Adam Choma

Zak³ad Mikrobiologii Ogólnej, Instytut Mikrobiologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Sk³odowskiej,ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin, e-mail: [email protected]

Wp³ynê³o w marcu 2006 r.

1. Wprowadzenie. 2. Struktura peryplazmatycznych glukanów. 2.1. Liniowe $-(1,2)-glukany. 2.2. Cykliczne $-(1,2)-glukany(cyklosoforany). 2.3. Cykliczne $-(1,2)-glukany z jednym wi¹zaniem typu "-(1,6) w pier�cieniu. 2.4. Cykliczne $-(1,3);(1,6)-glukany. 3. Synteza peryplazmatycznych glukanów. 3.1. Biosynteza szkieletu cukrowego. 3.2. Modyfikacja oligosacharydów.3.3. Regulacja biosyntezy OPG. 4. Rola peryplazmatycznych glukanów. 5. Podsumowanie

Periplasmic $-glucans of Gram-negative bacteria

Abstract: Osmoregulated Periplasmic Glucans (OPGs) are intrinsic components of the bacterial envelope of many Proteobacteria.These oligosaccharides share several common structural characteristics: D-glucose is the sole component sugar, $-glycosidicbonds are the main type of linkages, glucans synthesis and accumulation are inversely proportional to the osmotic strength ofthe environment.

Four families of periplasmic $-glucans have been described so far: 1) linear oligosaccharides, which are branched and contain$-(1,2) and $-(1,6) linkages; 2) cyclic $-(1,2) glucans; 3) cyclic $-(1,2) glucans with one "-(1,6) linkage; 4) cyclic $-(1,3); $-(1,6)glucans. OPGs may be substituted by one or several residues such as: sn-1-phosphoglycerol, phosphoethanolamine orphosphocholine, which originate from the membrane phospholipids. Also some intermediary metabolites can serve as glucansubstituents (i.e.: acetic, methylmalonic and succinic acid O-ester). Periplasmic $-glucans may be neutral or anionic in character.Except for the role in osmoprotection, OPGs are important in virulence, symbiosis, biofilm formation and resistance to antibiotics.

1. Introduction. 2. The structure of periplasmic glucans. 2.1. Linear $-(1,2)-glucans. 2.2. Cyclic $-(1,2)-glucans (cyclosophorans).2.3. Cyclic $-(1,2)-glucans with one "-(1,6)-linkage in the ring. 2.4. Cyclic $-(1,3);(1,6)-glucans. 3. Synthesis of periplasmic glucans.3.1. Biosynthesis of sugar backbone. 3.2. Modification of oligosaccharides. 3.3. Regulation of OPG biosynthesis. 4. The role ofperiplasmic glucans. 5. Summary

S³owa kluczowe: osmoregulacja, OPG, peryplazmatyczny $-glukanKey words: osmoregulation, OPG, periplasmic $-glucan

36 IWONA KOMANIECKA, ADAM CHOMA

peryplazmatycznych glukanów na zewn¹trz komórkiwzmaga wysoka temperatura oraz osmotycznie czyn-ne sk³adniki po¿ywek. Du¿e ich stê¿enie w pod³o¿ustwierdza siê w stacjonarnej fazie hodowli.

2. Struktura peryplazmatycznych glukanów

Na podstawie budowy cz¹steczek mo¿na oligocukryte zaklasyfikowaæ do czterech grup:

1. liniowe $-(1,2)-glukany;2. cykliczne $-(1,2)-glukany;3. cykliczne $-(1,2)-glukany z jednym wi¹zaniem

typu "-(1,6);4. cykliczne $-(1,3);(1,6)-glukany.

2.1. Liniowe $-(1,2)-glukany

Do tej grupy nale¿¹ peryplazmatyczne oligocukrypochodz¹ce z komórek E. coli oraz innych enterobak-terii. Szkielet cz¹steczki najczê�ciej jest utworzonyz 8�9 reszt glukozy, choæ spotyka siê równie¿ cz¹s-teczki zbudowane z 5 a nawet 12 reszt (rys. 1A). Cz¹s-teczki glukozy w g³ównym ³añcuchu s¹ ze sob¹ po³¹-czone wi¹zaniami typu $-(1,2). Stwierdzono obecno�ælicznych odga³êzieñ przy³¹czonych wi¹zaniami $-(1,6)glikozydowymi. Charakterystyczn¹ cech¹ tej klasyperyplazmatycznych glukanów jest obecno�æ pod-stawników niecukrowych. Najczê�ciej s¹ to reszty fos-foglicerolu, fosfoetanolaminy, kwasu bursztynowegoi octowego. W zwi¹zku z tym wiêkszo�æ cz¹steczekglukanów znajduj¹cych siê w przestrzeni peryplazma-tycznej komórek E. coli ma charakter anionowy [27].Podobn¹ budowê posiadaj¹ liniowe oligocukry izo-lowane z innych bakterii nale¿¹cych do (-Proteobac-teria, jak np. Erwinia chrysanthemi (u której wystêpu-j¹ glukany zbudowane z 5�12 reszt glukozy) [13] orazPseudomonas syringae (6�13 reszt glukozy w cz¹s-teczce glukanu) [43].

2.2. Cykliczne $-(1,2)-glukany (cyklosoforany)

S¹ to oligosacharydy syntetyzowane przez bakte-rie nale¿¹ce do Rhizobiales, z rodzajów: Rhizobium,Sinorhizobium, Mesorhizobium, Agrobacterium orazBrucella [10, 12, 22, 23]. Cz¹steczki tych oligosacha-rydów s¹ cykliczne, a monomery glukozy ³¹cz¹ siêwy³¹cznie wi¹zaniami $-(1,2). Stopieñ polimeryzacjireszt glukozy (DP) jest do�æ zró¿nicowany [9]. U Rhi-zobium leguminosarum wynosi od 17 do 25, u Me-sorhizobium huakuii DP = 17�28, natomiast u Sino-rhizobium meliloti mo¿e siêgaæ nawet 40 reszt glukozyw pier�cieniu. Nie uda³o siê stwierdziæ $-(1,2)-gluka-nów o liczbie podjednostek mniejszej ni¿ 17. Prawdo-podobnie mniejsze pier�cienie przy tym typie wi¹zañ

nie s¹ energetycznie uprzywilejowane [46]. Strukturêcyklicznego $-(1,2)-glukanu przedstawiono na rys. 1B.

Pocz¹tkowo sugerowano, ¿e cykliczne $-(1,2)-glu-kany to oligocukry niemodyfikowane, a wiêc o cha-rakterze obojêtnym [33]. Okaza³o siê jednak, ¿e mog¹one ulegaæ przemianom polegaj¹cym na do³¹czeniuanionowych podstawników takich, jak sn-1-fosfogli-cerol, bursztynian, czy metylomalonian [9, 23, 35].Dominuj¹cym podstawnikiem cyklicznych glukanówu Sinorhizobium i Agrobacterium tumefaciens jestsn-1-fosfoglicerol, pochodz¹cy z czê�ci polarnej fosfa-tydyloglicerolu, bêd¹cego budulcem b³on lipidowych.Podstawnik ten jest zwi¹zany z cz¹steczk¹ glukozyw pozycji C-6 poprzez wi¹zanie fosfodiestrowe. Stwier-dzono, ¿e podczas logarytmicznej fazy wzrostu bakterii,liczne cz¹steczki cyklicznych oligomerów s¹ podsta-wiane jedn¹ do czterech reszt sn-1-fosfoglicerolu, na-tomiast w fazie stacjonarnej obserwuje siê g³ówniesyntezê glukanów obojêtnych [35].

Rys. 1. Struktury wybranych peryplazmatycznych glukanów:A) E. coli [26];B) Mesorhizobium huakuii [12];C) Ralstonia solanacearum [29];D) Azorhizobium caulinodans [27].

n � liczba reszt glukozy w pier�cieniux, y � liczba reszt glukozy po³¹czonej odpowiednio

wi¹zaniem $-(1,3) i $-(1,6)

37PERYPLAZMATYCZNE $-GLUKANY BAKTERII GRAM-UJEMNYCH

2.3. Cykliczne $-(1,2)-glukanyz jednym wi¹zaniem typu "-(1,6) w pier�cieniu

Do tej grupy zaliczane s¹ cykliczne oligosacharydywyizolowane z komórek Ralstonia solanacearum, Xan-thomonas campestris i Rhodobacter sphaeroides [42,45]. Cz¹steczki glukanu Ralstonia zawieraj¹ 13 resztglukozy w pier�cieniu, Xanthomonas wytwarza glu-kany zbudowane z 16 reszt, za� Rhodobacter z 18.W pier�cieniu oligocukrowym jedno wi¹zanie jest typu"-(1,6), a pozosta³e reszty glukozy po³¹czone s¹ wi¹za-niami typu $-(1,2) (rys. 1C). Prawdopodobnie obecno�æwi¹zania "-(1,6) powoduje wiêksze usztywnienie cz¹s-teczki polimeru w porównaniu z bardziej elastyczny-mi strukturami cyklicznych glukanów posiadaj¹cychw szkielecie wy³¹cznie wi¹zania typu $-(1,2) [30].

2.4. Cykliczne $-(1,3);(1,6)-glukany

Ta grupa obejmuje polimery, w których reszty glu-kozy s¹ ze sob¹ po³¹czone wi¹zaniami $-(1,3) i $-(1,6)-glikozydowymi. Obecno�æ takich oligosachary-dów stwierdzono u bakterii z rodzaju Bradyrhizobium,u gatunków: Azospirillum brasilense oraz Azorhizobiumcaulinodans [1, 28, 41].

Bradyrizobia syntetyzuj¹ cykliczne $-glukany za-wieraj¹ce od 10 do 13 reszt glukozy w pier�cieniu.W cz¹steczce zbudowanej z 13 reszt, dwana�cie tworzyszkielet g³ówny, natomiast trzynasta reszta jest rozga³ê-zieniem ³¹cz¹cym siê z pier�cieniem poprzez grupê OHprzy wêglu C-6 glukozy tworz¹cej wi¹zanie $-(1,3)-glikozydowe. W takim oligomerze reszty glukozy po-³¹czone wi¹zaniami $-(1,3) mog¹ byæ zgrupowanew uk³ady tripletowe, które s¹ oddzielone resztami glu-kozy po³¹czonej wi¹zaniami $-(1,6). Sekwencje zawie-raj¹ce wi¹zania typu $-(1,6), mog¹ wystêpowaæ w gru-pach: po dwie, cztery lub piêæ reszt glukozy. Cz¹steczkiglukozy tworz¹ce wi¹zanie $-(1,3) s¹ podstawionefosfocholin¹, przy³¹czon¹ do C-6 reszty glukozy. Fosfo-cholina bêd¹c podwójnym jonem (zwitter ion) powo-duje, ¿e ³adunek elektryczny glukanu zale¿y od w³as-no�ci roztworu, w którym s¹ one rozpuszczone [9, 41].

Opisane niedawno peryplazmatyczne glukany Azo-rhizobium caulinodans maj¹ budowê podobn¹ do oligo-cukrów bradyrizobiowych (rys. 1D). Stopieñ polime-ryzacji tych cyklicznych moleku³ wynosi od 10 do 13.Zdecydowan¹ wiêkszo�æ (97%) stanowi¹ cz¹steczkijedenastomerowe. Stwierdzono, ¿e w tych oligocukrachwi¹zania typu $-(1,3) mog¹ wystêpowaæ w grupachzawieraj¹cych od dwóch do siedmiu reszt glukozy,z widoczn¹ przewag¹ fragmentów z³o¿onych z trzechi czterech monomerów. W przeciwieñstwie do gluka-nów Bradyrhizobium, u Azorhizobium brak jest odga³ê-zieñ, a cz¹steczki maj¹ charakter obojêtny, nie stwierdzo-no bowiem u nich jakichkolwiek podstawników [27].

Peryplazmatyczne glukany wyizolowane z komórekAzospirillum brasilense s¹ mieszanin¹ trzech typówoligomerów. Podstawowy typ zbudowany jest z 12 resztglukozy, po³¹czonych trzema wi¹zaniami typu $-(1,3),o�mioma $-(1,6) i jednym wi¹zaniem typu $-(1,4).Drugi typ glukanu powstaje przez przy³¹czenie wi¹-zaniem "-(1,3) jednej reszty glukozy do wspomnia-nej struktury podstawowej. Trzeci typ to modyfikacjaglukanu typu drugiego. Polega ona na metylowaniu"-(1,3)-zwi¹zanej reszty glukozy w pozycji C-2 [1].

3. Synteza peryplazmatycznych glukanów

3.1. Biosynteza szkieletu cukrowego

Na podstawie analizy fenotypów mutantów nie-zdolnych do syntezy glukanów wyodrêbniono i scha-rakteryzowano szereg genów niezbêdnych w biosyn-tezie OPG.

U E. coli wykryto dwa geny tworz¹ce operonopgGH (lub mdoGH). Znajduje siê on w bezpo�rednims¹siedztwie genu pyrC, którego produkt bierze udzia³w syntezie uracylu [8, 27]. Produktem genu opgH jestbia³ko b³onowe o masie cz¹st. 97 kDa. Osiem segmen-tów transmembranowych po³¹czonych trzema d³ugimiregionami cytoplazmatycznymi tworzy kana³, s³u¿¹cydo translokacji OPG do przestrzeni peryplazmatycznej.Proces translokacji odbywa siê równolegle z biosynte-z¹ ³añcucha cukrowego [14]. Bia³ko OpgH (MdoH) jestniezbêdne do wyra¿enia aktywno�ci glukozylotrans-ferazy, katalizuj¹cej in vitro powstawanie liniowego³añcucha $-(1,2)-oligosacharydowego z UDP-glukozyjako prekursora [27]. G³ówna domena OpgH wykazujepewne podobieñstwa strukturalne z rodzin¹ 2-gliko-zylotransferaz [7].

OpgG (MdoG) jest bia³kiem peryplazmatycznymo masie cz¹st. 56 kDa, zawiera ono dwie domenyo strukturze $. Miejsce aktywne tego bia³ka enzyma-tycznego zbudowane jest z aminokwasów kwa�nychi aromatycznych, wykazuj¹c podobieñstwo struktural-ne do takich enzymów jak mutarotaza galaktozowai glukodekstranaza. OpgG wspó³pracuje z OpgH, ka-talizuj¹c proces tworzenia odga³êzieñ od g³ównegoszkieletu glukanu. Poniewa¿ prekursor do tej reakcji(UDP-glukoza) znajduje siê wy³¹cznie w cytoplazmie,to najbardziej prawdopodobne jest, ¿e rozga³êzieniamog¹ powstawaæ poprzez rearan¿acjê podjednostekglukozowych pierwotnie przy³¹czonych do liniowegoszkieletu wi¹zaniem $-(1,2)-glikozydowym. Przypusz-cza siê, ¿e po peryplazmatycznej stronie b³ony cyto-plazmatycznej OpgG wycina i przenosi reszty glukozyna tê sam¹ lub inn¹ cz¹steczkê glukanu, tworz¹c roz-ga³êzienia przy³¹czone wi¹zaniem $-(1,6)-glikozydo-wym. Podobny proces zachodzi podczas powstawania


rozga³êzieñ w cz¹steczkach glikogenu [21]. Udowod-niono, ¿e operon opgGH (mdoGH) podlega kontroliosmotycznej [7, 27].

Geny homologiczne do opgGH wyizolowano z ko-mórek Pseudomonas syringae i Erwinia chrysan-themi [7, 27]. Obecno�æ konserwatywnych sekwencjiwykazuj¹cych podobieñstwo do sekwencji opgGHstwierdzono równie¿ u innych bakterii nale¿¹cych do(-Proteobacteria. U $-Proteobacteria takie sekwencjestwierdzono w genomie Nitrosomonas europeae [27].

Bakterie Sinorhizobium meliloti posiadaj¹ dwasprzê¿one geny: ndvB i ndvA (nodule development)[9]. Gen ndvB koduje du¿e bia³ko b³onowe o masiecz¹st. oko³o 319 kDa. Aktywno�æ enzymatyczn¹ NdvBbadano in vitro. Wykazano, ¿e jedynie 60 % cz¹steczkitego bia³ka, licz¹c od koñca aminowego, jest niezbêdnedo syntezy glukanu. Produktem genu ndvA jest bia³kocytoplazmatyczne o masie cz¹st. 67 kDa. Sekwencjaaminokwasowa tego bia³ka wykazuje podobieñstwo dosk³adników systemu sekrecyjnego typu I (ABC-trans-porter), a zw³aszcza do bia³ka HlyB. Prawdopodobniebia³ko NdvA bierze udzia³ w translokacji glukanu doprzestrzeni peryplazmatycznej oraz do �rodowiska ze-wnêtrznego [44].

U Agrobacterium tumefaciens (R. radiobacter) zi-dentyfikowano podobne geny. Nazwano je chvB i chvA(chromosomal virulence). U Sinorhizobium frediistwierdzono obecno�æ genu ndvB za� u Brucella abor-tus genu cgs [26]. Wykazano, ¿e geny te mog¹ kom-plementowaæ wadliwe szlaki biosyntezy OPG u mu-tantów ndvB� S. meliloti [44]. Prawdopodobnie bia³kaNdvB i ChvB uczestnicz¹ we wszystkich etapach bio-syntezy szkieletu rozpoczynaj¹c od UDP-glukozy jakosubstratu. Do ich aktywacji wymagana jest obecno�æjonów Mg2+ i Mn2+.

Dwa sprzê¿one geny ndvB i ndvC zidentyfikowanou Bradyrhizobium japonicum. Produktem genu ndvBjest bia³ko o masie cz¹st. 102 kDa, za� genu ndvC� bia³ko o masie cz¹st. 62 kDa. Prawdopodobnie obas¹ bia³kami b³onowymi. Inaktywacja genu ndvB pro-wadzi do zahamowania syntezy OPG, natomiast gdyinaktywacji ulega gen ndvC, produkowana jest nor-malna ilo�æ OPG lecz w szkielecie reszty glukozy po-³¹czone s¹ wy³¹cznie wi¹zaniami typu $-(1,3). Nale¿ywnosiæ, ¿e bia³ko NdvB jest niezbêdne do zainicjowa-nia polimeryzacji $-(1,3) zwi¹zanych reszt glukozy.Z kolei NdvC jest odpowiedzialne za powstawaniewi¹zañ typu $-(1,6). Ostateczna forma glukanu mo¿epowstawaæ na drodze przy³¹czenia kolejnej podjed-nostki glukozowej wi¹zaniem $-(1,6), albo te¿ po-przez rearan¿acjê wi¹zañ $-(1,3) pierwotnej moleku³y[6]. Bia³ko NdvB B. japonicum nie wykazuje znacz¹-cych podobieñstw z sekwencj¹ aminokwasow¹ analo-gicznego bia³ka S. meliloti. Nale¿y ono do tej samej kla-sy glikozylotransferaz co OpgH. Natomiast gen ndvC

ma podobn¹ sekwencjê do niektórych genów dro¿d¿o-wych, bior¹cych udzia³ w metabolizmie glukanówu tych mikroorganizmów [6].

3.2. Modyfikacja oligosacharydów

Szkielet OPG jest modyfikowany poprzez przy³¹-czenie ró¿nych podstawników. Podstawniki te mog¹pochodziæ od fosfolipidów b³onowych, jak np.: fosfa-tydyloglicerol, fosfatydyloetanolamina czy fosfatydy-locholina. Mog¹ to byæ równie¿ metabolity po�rednie,np.: acetyl, bursztynian, metylomalonian, których do-norem jest odpowiedni acylo-CoA.

Stwierdzono, ¿e zarówno u E. coli jak i u S. meliloti,przenoszenie reszt fosfoglicerolu nastêpuje w prze-strzeni peryplazmatycznej [27, 33, 44]. I tak, u E. coli,wykryto gen opgB (mdoB), który koduje bia³ko b³o-nowe. Wykazano, ¿e przenosi ono resztê fosfoglice-rolu z zewnêtrznej powierzchni b³ony komórkowej nasztuczny akceptor, jakim by³a arbutyna, ale nie katali-zuje tego procesu w obecno�ci rozpuszczalnych cz¹ste-czek peryplazmatycznych glukanów. W zwi¹zku z tymwydaje siê, ¿e reszty fosfoglicerolu mog¹ byæ przy³¹-czane jedynie do cz¹steczek glukanów pozostaj¹cychjeszcze w b³onie cytoplazmatycznej. U S. meliloti zi-dentyfikowano gen cgmB, którego produkt wykazujepewne podobieñstwo do OpgB [44]. Przypisuje siê mufunkcjê przeno�nika reszt fosfoglicerolu.

Stwierdzono, ¿e w komórkach S. meliloti procesprzy³¹czania reszt bursztynianowych do OPG zachodziw przestrzeni peryplazmatycznej. W przypadku E. colinie zlokalizowano jak dot¹d miejsca, w którym zacho-dzi bursztynylacja OPG. Wykazano jedynie, ¿e niezbêd-ny do tego procesu gen opgC (mdoC) koduje bia³kozawieraj¹ce 10 transb³onowych segmentów. Wydajesiê, ¿e bia³ko to katalizuje transfer reszt bursztynianuz warstwy cytoplazmatycznej b³ony komórkowej doszkieletu glukanowego znajduj¹cego siê po stronie pe-ryplazmatycznej b³ony [29].

3.3. Regulacja biosyntezy OPG

Biosynteza peryplazmatycznych $-glukanów jestregulowana przez bakterie dwiema drogami. Pierwszaz nich to regulacja osmotyczna. OPG s¹ syntetyzo-wane obficie gdy osmolarno�æ �rodowiska jest bardzoniska (mniejsza ni¿ 100 mOsm). Gdy wzrasta powy¿ej600 mOsm, to ilo�æ OPG zmniejsza siê nawet 10-krot-nie [29]. Taki mechanizm regulacji zaobserwowanou wiêkszo�ci przebadanych dot¹d gatunków bakterii,np. u R. sphaeroides, R. solanacearum, E. chrysan-themi, E. coli. Zarówno w komórkach E. coli jakii S. meliloti obserwowano opó�nienie pomiêdzy zmia-n¹ warunków osmotycznych �rodowiska, a odpowie-dzi¹ komórki na stres osmotyczny, która objawia siê


zmian¹ stê¿enia OPG w przestrzeni peryplazmatycz-nej [15]. Przy gwa³townym obni¿eniu osmolarno�ci�rodowiska obserwuje siê stopniowy wzrost syntezyOPG, przy czym musi up³yn¹æ czas potrzebny do po-wstania kolejnej generacji, aby to stê¿enie osi¹gnê³owielko�æ charakterystyczn¹ dla gatunku. Przy gwa³-townym wzro�cie osmolarno�ci pod³o¿a synteza OPGnagle ustaje, lecz nie obserwuje siê degradacji ist-niej¹cych oligosacharydów. Rozcieñczenie nastêpujewy³¹cznie poprzez rozdzielenie wyj�ciowej puli glu-kanów do komórek potomnych [29]. Wydaje siê, ¿eregulacja biosyntezy OPG, w zale¿no�ci od gatunkubakterii, mo¿e mieæ miejsce na poziomie transkryp-cyjnym i/lub posttranskrypcyjnym � czyli albo poprzezregulacjê ekspresji genów albo aktywno�ci bia³ek.Stwierdzono, ¿e w odpowiedzi na zmianê osmolar-no�ci �rodowiska w komórkach bakteryjnych zmieniasiê stê¿enie niektórych substancji. I tak w komórkachE. coli nastêpuje akumulacja jonów K+ i glutaminianu.Pozwala to na adaptacjê do �rodowiska o umiarkowa-nie wysokiej osmolarno�ci. Natomiast przy wysokiejosmolarno�ci, bakterie te zastêpuj¹ jony potasu pod-wy¿szonym stê¿eniem innych zwi¹zków. Mog¹ to byæpoliole, np. trehaloza, aminokwasy, np. prolina, lub te¿metyloaminy, np. betaina glicynowa [31]. Zjawiskonagromadzenia w cytoplazmie takich substancji jakjony potasu czy jony glutaminianowe obserwowanorównie¿ u rizobiów oraz u Agrobacterium [36]. Rol¹tych zwi¹zków jest utrzymanie turgoru komórki. Do-wiedziono, ¿e u tych bakterii syntetaza $-(1,2)-glu-kanów jest wra¿liwa na obecno�æ jonów potasu i glu-taminianu [24].

Stê¿enie OPG w przestrzeni peryplazmatycznejmo¿e byæ monitorowane przez jedno lub kilka bia³eksensorowych [17, 18]. Sugeruje siê, ¿e wchodz¹ onew sk³ad systemu bêd¹cego wewnêtrznym licznikiemliczby podzia³ów komórkowych i po�rednio kontrole-rem gêsto�ci populacji (�quorum sensing�).

U bakterii nale¿¹cych do rodzaju Brucella i mutan-ta S. meliloti GR4 nie stwierdzono zale¿no�ci ilo�ci$-glukanów w peryplazmie od warunków �rodowiskazewnêtrznego [10, 36, 47]. U tych mikroorganizmówsyntetaza $-(1,2)-glukanów nie jest wra¿liwa na obec-no�æ jonów K+ i glutaminianu [24]. W warunkach pod-wy¿szonej osmolarno�ci �rodowiska obserwowanou S. meliloti zahamowanie procesu podstawiania cz¹s-teczek glukanu resztami anionowymi. Nale¿y wiêc s¹-dziæ, ¿e synteza OPG i modyfikowanie gotowych cz¹s-teczek to procesy niezale¿ne [24]. Prawdopodobnieodpowied� komórek na stres osmotyczny przebiegatutaj poprzez nagromadzenie innych zwi¹zków osmo-tycznie czynnych takich jak betaina glicynowa [10].

Drugim mechanizmem regulacji syntezy OPG, jakdot¹d s³abo zbadanym, jest kontrola metaboliczna,oparta na zjawisku sprzê¿enia zwrotnego (tzw. �feed-

back control�). Ten mechanizm zosta³ odkryty podczasbadañ nad szczepami E. coli niezdolnymi do syntezyOPG przy braku glukozy w po¿ywce. Po dodaniu glu-kozy do pod³o¿a nastêpowa³a szybka akumulacja glu-kanów w komórkach [27, 28]. Prawdopodobnie tenmechanizm regulacji wystêpuje równie¿ w komórkachAzorhizobium caulinodans. U tych bakterii produkcjaglukanu nie podlega regulacji osmotycznej. Zaobser-wowano jednocze�nie znaczny przyrost ilo�ci peryplaz-matycznych glukanów w komórkach podczas wzrostuw warunkach stresu osmotycznego spowodowanegododatkiem glukozy do pod³o¿a [28].

4. Rola peryplazmatycznych glukanów

Badania fenotypów mutantów bakteryjnych defek-tywnych w procesie syntezy glukanów dostarczy³y in-formacji pozwalaj¹cych na okre�lenie ich znaczeniabiologicznego. Mutanty hrpM Pseudomonas syringaeoraz mutanty chv Agrobacterium tumefaciens (R. radio-bacter) s¹ niezdolne do wywo³ania reakcji nadwra¿li-wo�ci (HR) u ro�lin [11], za� mutanty ndv S. melilotitworz¹ defektywne brodawki na korzeniach lucerny[19]. Mutacje w genie ndvB u B. japonicum powoduj¹ca³kowity brak OPG, natomiast zmiany w genie ndvCobjawiaj¹ siê powstawaniem strukturalnie odmien-nych glukanów zawieraj¹cych jedynie wi¹zania typu$-(1,3), o czym wspomniano w rozdziale 3.1. MutantyndvB maj¹ upo�ledzon¹ zdolno�æ do ruchu i do wzrostuna pod³o¿u hipoosmotycznym, a tak¿e tworz¹ nieefek-tywne, ale wyra�nie zró¿nicowane brodawki na ko-rzeniach soi, ro�linnym gospodarzu B. japonicum [5].Z kolei zaobserwowano, ¿e mutanty w genie ndvCprodukuj¹ce cykliczne glukany zawieraj¹ce wy³¹czniewi¹zania typu $-(1,3) (tzw. cyklodekakis-(1,3)-$-glu-kany), wykazuj¹ zdolno�æ do ruchu i wzrostu w wa-runkach obni¿onego ci�nienia osmotycznego na po-ziomie szczepu rodzicielskiego, ale nie s¹ zdolne donawi¹zania efektywnej symbiozy [4]. Proces bro-dawkowania jest wydatnie opó�niony, a pozbawionebakterii pseudobrodawki, zawieraj¹ komórki o pogru-bionej �cianie, zagêszczonej cytoplazmie i licznychwakuolach [6]. Na podstawie tych obserwacji wysu-niêto wniosek, ¿e odpowiednia struktura cyklicznego$-glukanu jest wa¿na dla prawid³owego przebieguinterakcji symbiotycznych oraz, ¿e glukany bakteriisymbiotycznych, oprócz swej roli osmoregulacyjnej,prawdopodobnie pe³ni¹ równie¿ inne, jeszcze bli¿ejnieokre�lone funkcje.

Wykazano, ¿e OPG wytwarzane przez bakterie B. ja-ponicum zawieraj¹ce w swej strukturze wi¹zania typu$-(1,3);(1,6) s¹ podobne strukturalnie do frakcji nie-cyklicznych $-(1,3);(1,6)-heptaglukozowych oligocuk-rów, pochodz¹cych ze �ciany komórkowej grzybowych


patogenów soi. Oligocukry te s¹ potê¿nymi aktywa-torami fitoaleksyn (g³ównie gliceoliny sojowej) [2].W przeciwieñstwie do glukanów grzybowych, cyklicz-ne $-glukany bradyrizobiów s¹ s³abymi aktywatoramiprodukcji gliceoliny. Jednocze�nie stwierdzono, ¿e$-(1,3);(1,6)-glukany B. japonicum USDA 110 wstrzy-muj¹ odpowied� obronn¹ indukowan¹ obecno�ci¹oligocukrów grzybowych [37]. Nale¿y wiêc mniemaæ,¿e cz¹steczki te funkcjonuj¹ równie¿ jako supresoryodpowiedzi obronnej gospodarza podczas inwazji ko-mórek korzenia soi przez bradyrizobia [6].

Podczas, gdy cykliczne $-(1,3);(1,6)-glukany B. ja-ponicum wydaj¹ siê byæ niezbêdne do prawid³owegoprzebiegu procesu brodawkowania, takiej zale¿no�cinie obserwuje siê w przypadku glukanów S. fredii [25].Bakterie te produkuj¹ cykliczne $-(1,2)-glukany, któreposiadaj¹ ³adunek ujemny uwarunkowany obecno�ci¹reszt fosfoglicerolu. Mutanty w genie ndvB mimo,¿e nie by³y zdolne do wytwarzania glukanu, to jednakindukowa³y aktywne, wi¹¿¹ce azot brodawki na ko-rzeniach dwóch ró¿nych odmian soi.

Z kolei badania przeprowadzone przez D y l a n� ai wsp. [16] na mutantach S. meliloti, defektywnychw syntezie $-(1,2)-glukanu, pozwoli³y stwierdziæ, ¿emutanty te nie s¹ zdolne do tworzenia efektywnychbrodawek. Powstaj¹ce pseudobrodawki s¹ ma³e, bia³ei niezasiedlone. Mutanty ndvA i ndvB S. meliloti cha-rakteryzuj¹ siê utrat¹ ruchliwo�ci, podwy¿szon¹ od-porno�ci¹ na bakteriofagi i wzrostem wra¿liwo�ci naniektóre antybiotyki. Mutanty ndv s¹ defektywnezarówno w zdolno�ci do przylegania do powierzchnikomórek ro�linnych jak równie¿ maj¹ ograniczon¹zdolno�æ do inicjacji nici infekcyjnych na korzeniachlucerny. Pseudorewertanty tych mutantów, mimo brakuzdolno�ci do syntezy peryplazmatycznego glukanu,zdolne by³y do wzrostu w warunkach obni¿onej osmo-larno�ci �rodowiska. Zaobserwowano równie¿ istotn¹poprawê zdolno�ci do przylegania lecz jednocze�nieniewielki wzrost zdolno�ci do tworzenia nici infekcyj-nych. Wysuniêto tezê, ¿e cykliczne $-(1,2)-glukanywytwarzane przez sinorizobia mog¹ funkcjonowaæjako cz¹stki sygnalne i osmoprotektanty wspieraj¹cenodulacjê, lecz nie s¹ one kluczowe dla samego pro-cesu brodawkowania [16].

Mutacje w genach opgGH E. chrysanthemi powo-duj¹ plejotropowe zmiany w fenotypie bakterii, obej-muj¹ce: nadprodukcjê egzopolisacharydów (co spra-wia, ¿e kolonie s¹ �luzowe), os³abion¹ ruchliwo�æ,wzmo¿on¹ wra¿liwo�æ na sole ¿ó³ciowe, obni¿on¹produkcjê enzymów celulolitycznych, proteolitycz-nych oraz pektynolitycznych, co w konsekwencji pro-wadzi do utraty wirulencji [13, 38]. Po�ród ró¿nychefektów obserwowanych u mutantów opg� E. chrysan-themi najwa¿niejsza wydaje siê byæ redukcja wytwa-rzania i sekrecji liazy pektynowej, pe³ni¹cej kluczow¹

rolê w wirulencji. Wydaje siê, ¿e OPG obecne w prze-strzeni peryplazmatycznej tych bakterii s¹ niezbêdnedla wzrostu na gospodarzu ro�linnym, nie tylko pod-czas samej kolonizacji ro�liny, lecz równie¿ podczasnamna¿ania siê bakterii w zmacerowanej tkance [38].

Oporno�æ E. coli na detergenty typu SDS jest zwi¹-zana z obecno�ci¹ OPG. Brak lub zahamowanie syn-tezy OPG w obecno�ci SDS prowadzi do lizy komórek.Stwierdzono, ¿e nadwra¿liwo�æ na SDS wystêpuje za-równo u mutantów w genie opgG jak i opgH. Odnoto-wano równie¿ wzrost wra¿liwo�ci na szok wywo³anyobecno�ci¹ SDS w komórkach szczepów rodzicielskichE. coli rosn¹cych w warunkach indukuj¹cych obni¿e-nie ilo�ci OPG w przestrzeni peryplazmatycznej [40].

Mutanty niezdolne do syntezy OPG wykazuj¹ plejo-tropowe zmiany w fenotypie, wynikaj¹ce z upo�ledze-nia funkcji os³on komórkowych. Mutanty A. tumefa-ciens i S meliloti o fenotypie Opg� wyra�nie s³abiejrosn¹ na pod³o¿u hipoosmotycznym [9], podczas gdywzrost podobnych mutantów E. coli czy E. chrysan-themi jest tylko lekko upo�ledzony [27]. Obserwujesiê równie¿ zmiany w chemotaksji i ruchliwo�ci, como¿e byæ konsekwencj¹ zmniejszonego poziomu syn-tezy flagelliny. Mutanty opg� E. coli maj¹ inny sk³adporyn, tzn. b³ona tych bakterii zawiera podwy¿szon¹ilo�æ OmpC. Ponadto te bakterie s¹ odporne na lizuj¹cebia³ko faga MS2 i wytwarzaj¹ zwiêkszon¹ ilo�æ kap-sularnego polisacharydu (CPS), zwanego kwasem ko-lanowym [17, 27]. Wydaje siê, ¿e aktywacja genówodpowiedzialnych za proces biosyntezy CPS mo¿e po-legaæ na wzajemnym oddzia³ywaniu pomiêdzy OPGi bia³kiem RcsC (sensorem) oraz bia³kiem RcsB (po-zytywnym regulatorem).

Peryplazmatyczne glukany s¹ zaanga¿owane w me-chanizmy osmoprotekcji, wirulencji oraz oporno�ci naantybiotyki. Odgrywaj¹ one równie¿ rolê w regulacjisyntezy EPS, który jest niezbêdny w rozwoju archi-tektury biofilmu [39]. Mikroorganizmy uorganizowa-ne w postaci biofilmu s¹ oporne na dzia³ania obronnegospodarza i terapiê antybiotykow¹. Przyk³adem niechbêd¹ biofilmy uropatogennych szczepów E. coli two-rz¹ce siê w drogach moczowych i na powierzchni cew-ników. W obrêbie powstaj¹cych ognisk infekcji obser-wuje siê wzrost oporno�ci na rutynowo stosowaneantybiotyki. Nale¿y nadmieniæ, ¿e zaka¿enia dróg mo-czowych stanowi¹ najbardziej pospolite zaka¿enia bak-teryjne wystêpuj¹ce u ludzi [20].

Peryplazmatyczne glukany to wa¿ny, integralnysk³adnik os³on zewnêtrznych bakterii Gram-ujemnych.Odgrywaj¹ one istotn¹ rolê w prze¿ywalno�ci bakteriiw ekstremalnych warunkach �rodowiska oraz podczasinterakcji bakterii z organizmami eukariotycznymi.Peryplazmatyczne glukany nios¹ce ³adunek ujemnybior¹ udzia³ w utrzymaniu potencja³u Donnana w po-przek b³ony zewnêtrznej bakterii [27]. Ponadto, wcho-


dz¹c w interakcjê z innymi sk³adnikami, takimi jak np.fosfolipidy, czy peptydoglikan, pe³ni¹ równie¿ rolêstrukturaln¹ w organizacji os³on komórkowych [3,7].OPG mog¹ funkcjonowaæ jako cz¹stki informacyjne,wra¿liwe na obecno�æ specyficznych bia³ek w prze-strzeni peryplazmatycznej [15]. Du¿e cz¹steczki cy-klicznych $-(1,2)-glukanów mog¹ tworzyæ kompleksyinkluzyjne z substancjami hydrofobowymi. Ich kon-formacja przestrzenna umo¿liwia powstanie miejsc,w których mieszcz¹ siê cz¹steczki hydrofobowe. Tecykliczne oligocukry nie s¹ degradowane przez enzy-my obecne w organizmach zwierzêcych [7, 9].

5. Podsumowanie

Osmoregulowane peryplazmatyczne glukany (OPG)s¹ istotnym sk³adnikiem os³on zewnêtrznych bakteriiGram-ujemnych. Mimo swej ró¿norodno�ci posiadaj¹one pewne cechy wspólne: jedynym sk³adnikiem cu-krowym jest D-glukoza, po³¹czona g³ównie wi¹zania-mi typu $-glikozydowego, a ich synteza i nagroma-dzenie w peryplazmie jest odwrotnie proporcjonalnedo si³y osmotycznej �rodowiska. Dotychczas opisanocztery rodziny peryplazmatycznych glukanów.

Oprócz roli w osmoprotekcji, peryplazmatyczneglukany s¹ istotne w wirulencji, w symbiozie, w trak-cie tworzenia biofilmu oraz w oporno�ci szczepów naantybiotyki.

W³a�ciwo�ci cyklicznych $-glukanów wskazuj¹drogi do ich potencjalnego zastosowania w przemy�lefarmaceutycznym i spo¿ywczym.

Pi�miennictwo

1. Altabe S.G., Talaga P., Wieruszeski J.-M., Lippens G., Ugal-de R., Bohin J.-P.: Periplasmic glucans of Azospirillum bra-silense (w:) Biological nitrogen fixation for the 21st century,red. C. Elmerich, A. Kondorosi, W. E. Newton, KluwerAcad. Publ., Dordrecht, 1998, s. 390.

2. Ayers A.R., Ebel J., Finelli F., Berger N., Albersheim P.:Host-patogen interactions. IX. Quantitative assays of elicitoractivity and characterization of the elicitor present in theextracellular medium of cultures of Phytophtora megaspermavar. sojae. Plant Physiol. 57, 751�759 (1976)

3. Banta L.M., Bohne J., Lovejoy S.D., Dostal K.: Stability ofthe Agrobacterium tumefaciens VirB10 protein is modulatedby growth temperature and periplasmic osmoadaptation.J. Bacteriol. 180, 6597�6606 (1998)

4. Bhagwat A.A., Gross K.C., Tully R.E., Keister D.L.: $-glu-can synthesis in Bradyrhizobium japonicum: characterizationof a new locus (ndvC) influencing $-(1→6)-likages. J. Bac-teriol. 178, 4635�4642 (1996)

5. Bhagwat A.A., Keister D.L.: Site-directed mutagenesis of thecyclic $-(1→3)(1→6)-glucan synthesis locus of Bradyrhi-zobium japonicum. Mol. Plant Microbe Interact. 8, 366�370(1995)

6. Bhagwat A.A., Mithöfer A., Pfeffer Ph.E., Kraus C., Spic-kers N., Hotchkiss A., Ebel J., Keister D.L.: Further studiesof the role of cyclic $-glucans in symbiosis. An ndvC mutantof Bradyrhizobium japonicum synthesises cyclodecakis-(1→3)-$-glucosyl. Plant Physiol. 119, 1057�1064 (1999)

7. Bohin J.-P.: Osmoregulated periplasmic glucans in Proteo-bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 186, 11�19 (2000)

8. Bohin J.-P., Kennedy E.P.: Mapping of a locus (mdoA) thataffects the biosynthesis of membrane-derived oligosacchari-des in Escherichia coli. J. Bacteriol. 157, 956�957 (1984)

9. Breedveld M.W., Miller K.J.: Cyclic $-glucans of members ofthe family Rhizobiaceae. Microbiol. Rev. 58, 145�161 (1994)

10. Briones G., Iñón de Iannino N., Steinberg M., Ugalde R.A.:Periplasmic cyclic 1,2-$-glucan in Brucella spp. is not osmo-regulated. Microbiology, 143, 1115�1124 (1997)

11. Cangelosi G.A., Martinetti G., Nester E.W.: Osmosensitivityphenotypes of Agrobacterium tumefaciens mutants that lackperiplasmic $-1,2-glucan. J. Bacteriol. 172, 2172�2174 (1990)

12. Choma A., Komaniecka I.: Characterisation of Mesorhi-zobium huakuii cyclic $-glucan. Acta Biochim. Polon. 50,1273�1281 (2003)

13. Cogez V., Talaga P., Lemoine J, Bohin J.-P.: Osmoregulatedperiplasmic glucans of Erwinia chrysanthemi. J. Bacteriol.183, 3127�3133 (2001)

14. Debarbieux L., Bohin A., Bohin J.-P.: Topological analysisof the membrane-bound glucosytransferase, MdoH, requiredfor osmoregulated periplasmic glucan synthesis in Escheri-chia coli. J. Bacteriol. 179, 6692�6698 (1997)

15. Dylan T., Helinski D.R., Ditta G.S.: Hypoosmotic adapta-tion in Rhizobium meliloti requires $-(1→2)-glucan. J. Bac-teriol. 172, 1400�1408 (1990)

16. Dylan T., Nagpal P., Helinski D.R., Ditta G.S.: Symbioticpseudorevertants of Rhizobium meliloti ndv mutants. J. Bac-teriol. 172, 1409�1417 (1990)

17. Ebel W., Vaughn G.J., Peters III H.K. Trempy J.E.: Inactiva-tion of mdoH leads to increased expression of colanic acidcapsular polysaccharide in Escherichia coli. J. Bacteriol.179, 6858�6861 (1997)

18. Fiedler W., Rotering H.: Properties of Escherichia coli mu-tants lacking membrane-derived oligosaccharides. J. Biol.Chem. 263, 14684�14689 (1988)

19. Geremia R.A., Cavaignac S., Zorreguieta A., Toro N., Oliva-res J., Ugalde R.A.: A Rhizobium meliloti mutant that formsineffective pseuonodules in alfalfa produces exopolysaccha-rides but fails to form $ (1�2) glucan. J. Bacteriol. 169,880�884 (1987)

20. Hanna A., Berg M., Stout V., Razatos A.: Role of capsularcolanic acid in adhesion of uropathogenic Escherichia coli.Appl. Environ. Microbiol. 69, 4474�4481 (2003)

21. Hanoulle X., Rollet E., Clantin B., Landrieu I., Ödberg-Fer-ragut C., Lippens G., Bohin J.-P., Villeret V.: Structural ana-lysis of Escherichia coli OpgG, a protein required for thebiosynthesis of osmoregulated periplasmic glucans. J. Mol.Biol. 342, 195�205 (2004)

22. Hisamatsu M.: Cyclic (1→2)-$-D-glucans (cyclosophorans)produced by Agrobacterium and Rhizobium species. Carbo-hydr. Res. 231, 137�146 (1992)

23. Hisamatsu M., Yamada T., Higashiura T., Ikeda M.: Theproduction of acidic, O-acetylated cyclosophorans (cyclic$-(1,2)-D-glucans) by Agrobacterium and Rhizobium spe-cies. Carbohydr. Res. 163, 115�122 (1987)

24. Iñón de Iannino N., Briones G., Iannino F., Ugalde R.A.:Osmotic regulation of cyclic 1,2-$-glucan synthesis. Micro-biology, 146, 1735�1742 (2000)


25. Iñón de Iannino N., Briones G., Kreiman G., Ugalde R.: Cha-racterization of the biosynthesis of $(1�2) cyclic glucan inR. fredii. $(1�2) glucan has no apparent role in nodule inva-sion of Mc Call and Peking soybean cultivars. Cell. Mol.Biol. 42, 617�629 (1996)

26. Iñón de Iannino N., Briones G., Tolmasky M., Ugalde R.A.:Molecular cloning and characterisation of cgs, the Brucellaabortus cyclic $-(1,2) glucan synthetase gene: genetic com-plementation of Rhizobium meliloti ndvB and Agrobacteriumtumefaciens chvB mutants. J. Bacteriol. 180, 4392�4400(1998)

27. Kennedy E.P., Membrane-derived oligosaccharides (periplas-mic $-D-glucans) of Escherichia coli (w) Escherichia coli andSalmonella, Cellular and Molecular Biology, red. F.C. Neid-hardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin, K.B. Low,B. Maganasik, W.S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaetcher,H.E. Umbarger, Wyd. II. A.S.M., Washington DC. 1996,s. 1064�1074.

28. Komaniecka I., Choma A.: Isolation and characterization ofperiplasmic cyclic $-glucans of Azorhizobium caulinodans.FEMS Microbiol. Lett. 227, 263�269 (2003)

29. Lacroix J.-M., Lanfroy E., Cogez V., Lequette Y., Bohin A.,Bohin J.-P.: The mdoC gene of Escherichia coli encodesa membrane protein that is required for succinylation of osmo-regulated periplasmic glucans. J. Bacteriol. 181, 3626�3631(1999)

30. Lippens G., Wieruszeski J.M., Hotvath D., Talaga P., BohinJ.-P.: Slow dynamics of the cyclic osmoregulated periplasmicglucan of Ralstonia solanacearum as revealed by hetero-nuclear relaxation studies. J. Am. Chem. Soc. 120, 170�177(1998)

31. Lucht J., Bremer E.: Adaptation of Escherichia coli to highosmolarity environments: osmoregulation of the high-affinityglycine betaine transport system proU. FEMS Microbiol. Rev.14, 3�30 (1994)

32. McIntire F.C., Peterson W.H., Riker A.J.: A polysaccharideproduced by the crown-gall organism. J. Biol. Chem. 143,491�496 (1942).

33. Miller K.J., Gore R.S., Benesi A.J.: Phosphoglycerol substi-tuents present on the cyclic $-1,2-glucans of Rhizobium meli-loti 1021 are derived from phosphatidylglycerol. J. Bacteriol.170, 4569�4575 (1988)

34. Miller K.J., Kennedy E.P., Reinhold V.N. Osmotic adapta-tion in Gram-negative bacteria: possible role for periplasmicoligosaccharides. Science, 231, 48�51 (1986)

35. Miller K.J., Reinhold V.N., Weissborn A.C., Kennedy E.P.:Cyclic glucans produced by Agrobacterium tumefaciens are

substituted with sn-1-phosphoglycerol residues. Biochim.Biophys. Acta, 901, 112�118 (1987)

36. Miller K.J., Wood J.M.: Osmoadaptation by rhizosphere bac-teria. Annu. Rev. Microbiol. 50, 101�136 (1996)

37. Mithöfer A., Bhagwat A.A., Feger M., Ebel J.: Suppressionof fungal $-glucan-induced plant defence in soybean (Glycinemax L.) by cyclic 1,3-1,6-$-glucans from the symbiont Bra-dyrhizobium japonicum. Planta, 199, 270�275 (1996)

38. Page F., Altabe S., Hugouvieux-Cotte-Pattat N., LacroixJ.-M., Robert-Baudouy J., Bohin J.-P.: Osmoregulated peri-plasmic glucan synthesis is required for Erwinia chrysan-themi pathogenicity. J. Bacteriol. 183, 3134�3141 (2001)

39. Parsek M.R., Singh P.K.: Bacterial biofilms: an emerging linkto disease pathogenesis. Annu. Rev. Microbiol. 57, 677�701(2003)

40. Rajagopal S., Eis N., Bhattacharya M., Nickerson K.W.:Membrane-derived oligosaccharides (MDOs) are essentialfor sodium dodecyl sulfate resistance in Escherichia coli.FEMS Microbiol. Lett. 223, 25�31 (2003)

41. Rolin D.B., Pfeffer P.E., Osman S.F., Szwergold R.B., Kap-pler F., Benesi A.J.: Structural studies of a phosphocholinesubstituted $-(1,3);(1,6) macrocyclic glucan from Bradyrhi-zobium japonicum USDA 110. Biochim. Biophys. Acta, 1116,215�225 (1992)

42. Talaga P., Cogez V., Wieruszeski J.M., Stahl B., Lemoine J.,Lippens G., Bohin J.-P.: Osmoregulated periplasmic glucansof the free-living photosynthetic bacterium Rhodobactersphaeroides. Eur. J. Biochem. 269, 2464�2472 (2002)

43. Talaga P., Fournet B., Bohin J.P.: Periplasmic glucans ofPseudomonas syringae. J. Bacteriol. 176, 6538�6544 (1994)

44. Wang P., Ingram-Smith C., Hadley J.A., Miller K.J.: Cloning,sequencing, and characterization of the cgmB gene of Sino-rhizobium meliloti involved in cyclic $-glucan biosynthesis.J. Bacteriol. 181, 4576�4583 (1999)

45. York W.S.: A conformational model for cyclic $-(1→2)-lin-ked glucans based on NMR analysis of the $-glucans pro-duced by Xanthomonas campestris. Carbohydr. Res. 278,205�225 (1995)

46. Zevenhuizen L.P.T.M., van Veldhuizen A. and Fokkens R.H.:Re-examination of cellular cyclic $-1,2-glucans of Rhizo-biaceae: distribution of ring sizes and degrees of glycerol--phosphate substitution. Antonie Leeuwenhoek, 57, 173�178(1990)

47. Zorreguieta, A., Cavaignac S., Geremia R. A., Ugalde R.A.:Osmotic regulation of $-(1-2)-glucan synthesis in membersof the family Rhizobiaceae. J. Bacteriol. 172, 4701�4704(1990)

POST. MIKROBIOL.,2008, 47, 1, 43� 50http://www.pm.microbiology.pl

1. Introduction

Lipases occur widely in nature but only microbiallipases constitute an important group of biotechno-logically valuable enzymes, which have become veryattractive for industrial and environmental applications.Because of a great variety of catalytic activities, easeof genetic manipulations, rapid growth of microorgan-isms on inexpensive media as well as more convenientand safer production, they are more useful than en-zymes derived from plants or animals. Moreover, mostof them can be produced in large quantities and arequite stable under non-natural conditions such as hightemperature and nonaqueous organic solvents em-ployed in many applications [54]. Microbial lipasescan be produced by fermentation of biobased materialsbut most of the commercially used lipases are pro-duced in synthetic media by recombinant strains ofbacteria, yeast and fungi [21, 56]. Particularly, bacte-ria from the genera Pseudomonas, Staphylococcus,Burkholderia, Bacillus, Micrococcus, Acinetobacter,Chromobacterium and Streptomyces have been ex-ploited for the production of these enzymes [14, 35,45, 49, 57]. The main producers of fungal lipases arespecies of filamentous fungi Aspergillus, Rhizopus,

Penicillium, Mucor, Geotrichum, Humicola and Fusa-rium. Lipases from Candida, Yarrowia and Pichiahave also been reported [4, 23, 47, 50, 56].

Microbial lipases find promising applications inorganic chemical processing, detergent formulations,synthesis of biosurfactants, the oleochemical, dairyand agrochemical industries, paper manufacture, nutri-tion, cosmetics, perfumery and biocatalytic resolutionof pharmaceuticals [21, 53]. Furthermore, novel lipaseapplications have been successfully established as a insolution to many environmental problems. For exam-ple, technologies of in vitro synthesis of biopolymersinstead of biostable and nonbiodegradable polyolefinsused as packaging materials and the synthesis ofbiofuels as an alternative source of energy have beenimplemented. Microbial lipases are also helpful in thebreakdown of fats in domestic sewage and anaerobicdigesters [24, 64].

2. Characteristics of lipases

Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3)catalyze the hydrolysis and transesterification of trigly-cerides, enantioselective synthesis, and the hydrolysis

MICROBIAL LIPASES AND THEIR SIGNIFICANCEIN THE PROTECTION OF THE ENVIRONMENT

Agnieszka Mrozik, Katarzyna Hupert-Kocurek, Bo¿ena Nowak, Sylwia £abu¿ek

Katedra Biochemii Uniwersytetu �l¹skiego ul. Jagielloñska 28, 40-032 Katowice, e-mail: [email protected]

Wp³ynê³o w lipcu 2007

1. Introduction. 2. Characteristics of lipases. 3. Applications of lipases 3.1. Leather industry 3.2. Paper and pulp manufacture. 3.3. De-tergent industry 3.4. Biodiesel production 3.5. In vitro synthesis of biodegradable polyesters 3.6. Wastewater treatment. 4. Summary

Abstract: Microbial lipases represent an extremely versatile group of enzymes that are capable of performing a variety of importantreactions. They belong to the class of serine hydrolases and act at the interface generated by a hydrophobic lipid substrate ina hydrophilic medium. Their synthesis and secretion by microorganisms is influenced by many factors like temperature, pH, ions,carbon and nitrogen sources and dissolved oxygen concentration. Microbial lipases are used in leather, detergent, pulp and paperindustry, sewage treatment, biodiesel and biodegradable polymers production and bioremediation. Due to various properties lipasesare helpful tools in biotechnology and environment protection fields.

Lipazy pochodzenia mikrobiologicznego i ich znaczenie w ochronie �rodowiska

Streszczenie: Lipazy bakterii i grzybów stanowi¹ ró¿norodn¹ grupê enzymów przeprowadzaj¹cych reakcje: hydrolizy, trans-estryfi-kacji triacylogliceroli, enancjoselektywna syntezê i hydrolizê ró¿nych estrów. Pod wzglêdem budowy nale¿¹ do klasy hydrolazserynowych i charakteryzuj¹ siê zdolno�ci¹ katalizy miêdzyfazowej, czyli przeprowadzania reakcji w uk³adach typu lipid-woda.Ró¿norodne zdolno�ci katalityczne lipaz umo¿liwiaj¹ zastosowanie ich w wielu procesach biotechnologicznych i ochronie �rodowi-ska. Enzymy te coraz czê�ciej wykorzystuje siê we wstêpnej obróbce skór, przemy�le papierniczym, w produkcji detergentówi surfaktantów, w syntezie biodegradowalnych materia³ów opakowaniowych, produkcji biopaliw jako alternatywnego �ród³a energiioraz oczyszczaniu �cieków.

1. Wstêp. 2. Charakterystyka lipaz. 3. Zastosowanie lipaz. 3.1. Przemys³ skórzany. 3.2. Produkcja papieru. 3.3. Produkcja detergentów.3.4. Biopaliwa. 3.5. Synteza in vitro biodegradowalnych poliestrów. 3.6. Oczyszczanie �cieków. 4. Podsumowanie

Key words: application, lipases, microorganismsS³owa kluczowe: mikroorganizmy, lipazy, zastosowanie

44 AGNIESZKA MROZIK, KATARZYNA HUPERT-KOCUREK, BO¯ENA NOWAK, SYLWIA £ABU¯EK

of a variety of esters. They belong to the class of ser-ine hydrolases and contain the consensus sequenceG-X1-S-X2-G as the catalytic moiety, where G= glycine,S = serine, X1 = histidine and X2 = glutamic or asparticacid. All known lipases span a molecular weight rangeof 19 to 60 kDa and exhibit a characteristic foldingpattern "/$-hydrolase fold. The core of enzymes iscomposed of a central $-pleated sheet consisting of upto eight different b strands ($1-$8) connected by up tosix " helices (A-F). Distinctive feature of the lipasesis covering of their active site by a lid-like structurecomposed of one or two a helices. The lid moves al-lowing the active site to become accessible for thesubstrate [3, 41, 59].

The majority of the microbial lipases is secretedextracellularly and does not require any cofactors.Lipases isolated from bacteria and fungi posses a widerange of properties depending on their sources withrespect to positional and fatty acid specificity, thermo-stability and pH optimum. Most of lipases attack thefatty acids at 1 or 3 carbon position of glycerol or boththe positions but not the fatty acid at the 2 position ofthe glycerol molecule. However, through random acylmigration, the 2-fatty acid monoglyceride undergoesrearrangement pushing the fatty acid to the 1 or 3 po-sition of the glycerol molecule [53].

Interestingly, under natural conditions lipases cata-lyse the hydrolysis of ester bonds at the interface be-tween an insoluble substrate phase and the aqueousphase in which the enzyme is dissolved. Kinetics oflipases cannot be described with the Michaelis-Mentenmodel since this model is valid only in the case of onehomogenous phase. The interfacial catalysis proceedsin two stages. Firstly, the physical adsorption of theenzyme at the lipid interface connected with the en-zyme activation through opening of the lid blockingthe active site takes place. Upon opening, the exposedsubstrate-binding site and the inside of the lid forma large hydrophobic patch, which is supposed to inter-act with the hydrophobic substrate interface. Secondly,the formation of the enzyme/substrate complex fol-lowed by substrate hydrolysis regenerates and releasesthe adsorbed enzyme. However, some of the lipasesdo not show interfacial activation because of shorteraminoacid sequence of the lid oligopeptide as ob-served for Burkholderia glumae or lack of this struc-ture in Bacillus subtilis lipase [5, 62, 63].

3. Applications of lipases

Enzymes are major contributors to clean industrialproducts and processes. Various industries have re-placed old processes using chemicals that have detri-mental effects on the environment and equipment with

new processes that use enzymes under less corrosiveconditions. The applications in which enzymes, amongthem lipases, are used are many and diverse.

Since most of the industrial processes in whichlipases are employed function at temperatures exceed-ing 45°C, thermal stability of lipases related to theirstructure is the most desirable characteristic. Amongfeatures stabilising enzyme structure are: low fre-quency of valine, isoleucine and threonine, many di-sulphide bonds, hydrophobic and aromatic interac-tions, ion-pair networks, increase core hydrophobicity,low level of surface amino acids prone to deamidation(Gln, Asn) and oxidation (Cys, Met) [61]. Thermosta-ble lipases stable at 55�75°C have been isolated frommany sources, including Pseudomonas fluorescens,Geobacillus sp., Kurtzmanomyces sp. I-11 [1, 26, 32,56]. Although few lipases, for example of Burkhol-deria cepacia and Pyrococcus horikoshii, are able tooperate at 90�100°C, their half-lives are reportedto be short [48, 65]. Cold-adapted lipases are largelydistributed in microorganisms existing at low tempera-tures in Antarctic, Polar and Alpine regions, deep seeand frozen food. Such enzymes probably are structur-ally modified by an increasing flexibility of the poly-peptide chain enabling an easier accomodation ofsubstrates at low temperature. A very low proportionof arginine residues as compared to lysine, a low con-tent in proline residues, a small hydrophobic core,a very small number of salt bridges and of aromatic-aromatic interactions, as well as a large proportionof arginine on protein surface make lipases active atlow temperature [25]. Cold-active enzymes exibithigher catalytic activities at low temperatures than dotheir mesophilic and thermophilic counterparts, forexample Acinetobacter sp. strain no. 6 lipase with op-timum at 20°C [58].

3.1. Leather industry

Leather industry contributes to one of the major in-dustrial pollution problems. The pollution causingchemicals are: lime, sodium sulphide, salts, solvents(trichloroethylene, white spirit, marlophen 89) andsurfactants (nonyl phenol ethoxylate, alkyl alcoholethoxylate). The formation of pollution is significantlyhigher in the pre-tanning than the post-tanning opera-tions. In order to overcome the hazards caused by thetannery effluents the use of enzymes as an alternativetool has been applied in pre-tanning operations suchas soaking, dehairing, bating, degreasing and offaltreatment [27].

Lipases are enzymes that specifically degrade fatand so cannot damage the leather itself. They hydro-lyse not only the fat on the outside of the hides andskins but also the fat inside the skin structure. Alka-

45MICROBIAL LIPASES AND THEIR SIGNIFICANCE IN THE PROTECTION OF THE ENVIRONMENT

line lipases are applied during soaking and/or limingpreferably in combination with the relevant protease.The combination of alkaline lipases and proteases ap-plied in enzyme-assisted liming process speeds up thereaction led with the standard chemicals. The roleof protease is opening up the membranes surroundingthe fat cell, making the fat accessible to the lipase. Itmakes fat more mobile and the breakdown productsemulsify the intact fat, so that in many cases properdegreasing with surfactants is not necessary. The com-position of enzymes breaks down fat and proteinaceousmatter such as dermatan sulphate, thus facilitating theopening up of the structure and removal of hair [21].

Degreasing is the next step in the leather treatment.This process is generally carried out using aqueousemulsification with detergents or by solvent extraction.It is well known that organic solvents like kerosene,petrol, perchloroethylene, trichloroethylene and sur-factants such as nonyl phenol ethoxylate are highlyunsafe and hazardous to the workers and heavily pol-lute the environment. When using lipases the originalsurfactant dosage can be reduced by at least 50% inthe case of both sheepskins and pigskins. For bovinehides lipases allow tensides to be replaced completely.Furthermore, the application of lipases, which areprojected as alternatives for solvents and detergents,allow the recovery of valuable by-products [42].

The additional advantage of using lipases is moreuniform colour and a cleaner appearance of the leathermanufactures. Moreover, good opening of the fibrestructure by lipases improves the subsequent uptakeof the waterproofing chemicals during the produc-tion of hydrophobic and waterproof and low-foggingleathers. Lipases can also be applied in an acid proc-ess, for example for pickled skin or wool-on and fur,or semiacid for wetblue.

In the last decade, the leather industry has success-fully applied commercial bioproducts containing micro-bial lipases. Among them are Forenzym SK and LM(bacterial lipases and proteases) for soaking anddehairing, Novolime (microbial lipase and proteaseblend) for liming, Forenzym BT (pancreatic tripsinand bacterial lipase and protease) for bating, Foren-zym WG-L (bacterial acid lipase), Forenzym DG (bac-terial lipase), Greasex (microbial alkaline lipase) andNovoCor A (microbial acid lipase) for degreasing [60].

3.2. Paper and pulp manufacture

Certain types of wood, especially from pines, con-tain lipophilic extractives in which resin acids,triglycerides, steryl esters, terpenes, terpenoids andwaxes constitute the major part. These compoundscause production problems in pulp and paper manu-facturing when released together with carbohydrates

and lignin into the process waters during mechanicalpulping [51]. Dispersed as colloidal droplets, rangingin size from 0,15 to 0,4 µm, and sterically stabilisedby polysaccharides, these substances cause numerousproblems in pulp and paper manufacture, includingdeposits in and on equipment, adverse effect on waterabsorption by the pulps, holes and tearing, discolora-tion and hydrophobic spots on the paper. As individualcompounds the most troublesome components ofresins are triglycerides, fatty acid esters of glycerol,because of the greatest negative effect on paper tensilestrength [33]. The presence of extractives can alsoresult in odour and taste problems in food packagingmaterials. Some of wood extractives together withorganic solvents may also be detrimental to the envi-ronment when released into the wastewaters. Currentmethods for controlling pitch include traditional me-thods such as debarking and wood seasoning beforepulping, which allow pitch to deteriorate by the actionof indigenous microorganisms, and adding talc orother chemicals to the pulp to coat the resin and deac-tivate its surface [36]. Seasoning takes a long time andoften leads to discoloration and the chemical pulpingleaves a large proportion of free sterols, fatty acids andtheir derivatives [28]. Alternatively, biological pitchcontrol by microbial pre-treatment i.e. spraying se-lected microorganisms onto wood chips or logs hasbeen developed. The drawbacks of this method arerather long treatment time and the necessary adjust-ment of conditions, as well as decreased pulp yield andpaper optical quality [6, 20].

Microbial enzymes are potential tools for pitchcontrol due to their specifity enabling new techno-logies for processing pulps and fibers. Lipases can re-duce pitch problems by lowering the triglycerides con-tent of groundwood pulp. An enzyme obtained fromCandida cylindrica, when added to the groundwoodstock chest reduced pitch problems and talc consump-tion considerably. The dosage of chemicals was re-duced, the time of seasoning of the wood was greatlyshortened, resulting in lowered bleach consumption.Additionally lipase improved pulp properties andspeeded water absorption, increased the strength andthe specific volume of the resulting paper [28].

Because enzymes adsorb rapidly on pulp fiber it isnot possible to recycle or reuse it. On the other hand,its adsorptive properties enable application at low pulpconstistencies and the enzymes remain active and at-tached during various treatments and washing stages[15]. The lipase process has been scaled-up in a 12-tonper day pulp trial and has been shown to remove 90%of the triglycerides in 3 h with stirring at 37°C. Atindustrial scale, commercial recombinant lipase ex-pressed in Aspergillus oryzae, known as Resinase(Novozymes), is used [9].


3.3. Detergent industry

Nowadays, there is a tendency to use lipases in thedetergent industry for removal of fatty residues inlaundry, dishwashers and for cleaning of clogged drains[48]. Enzymes break down soils into simpler forms thatcan easily be removed by the cleaner. The importanceof lipases in washing agents results not only from theirhigh efficiency, but also their role in environmentalprotection. Enzymes can reduce the environmental loadof detergents, are biodegradable, leave no harmfulresidues, have no negative impact on sewage treatmentprocesses and, what is more important, do not presenta risk to aquatic life. An ideal detergent enzyme shouldbe stable at high pH and temperature, effective at lowenzyme level and have broad substrate specificity.Moreover, it should withstand oxidising and chalatingagents and resist degradation caused by other enzymespresent in detergent washing formula [22].

Good candidates for detergent applications are lipa-ses produced both by bacteria and fungi. For example,bacterial lipase from Ralstonia pickettii improved theremoval of oil from cotton fabric by 24�27% as anadditive to detergent, at 40°C as washing temperature,20 min as washing time and 0.6% as detergent concen-tration. The high efficiency in olive oil removal fromcotton fabric exhibited also fungal lipases from Can-dida cylindracea and Aspergillus niger [22]. RecentlyR a t h i et al. [48] found a novel alkaline lipase syn-thesized by Burkholderia cepacia RGP-10 with pHoptimum of 11 and activity in the range of 25�100°C.The isolated lipase was highly stable towards oxidis-ing agents, alkaline proteases, both ionic and non-ionicsurfactants as well as commercial detergents whichmakes this enzyme a potential additive for detergentformulation.

The first commercial lipase introduced in 1994 byNovo Nordisk into detergent industry was Lipolaseoriginated from the fungus Thermomyces lanuginosusand expressed in Aspergillus oryzae. Lipolase TM,active and stable under alkaline conditions and overa broad temperature range, has a remarkable resistanceto proteolytic activity of commonly used detergentproteases. It has been reported that significant benefitof using Lipolase� was not revealed during a singlewash system but only after repeated wash and dry cy-cles. It resulted from the low adsorption level of theenzyme caused by the presence of surfactant moleculesrequired for dissolution of hydrolysis products inthe water phase. Additionally, application of calciumchelators keeping low calcium concentration duringthe wash cycle decreases activity of this calcium-de-pendent enzyme. The free calcium concentration can-not be increased since it decreases general detergency.Moreover, in the presence of calcium, calcium soaps

are formed that are poorly water soluble and hard toremove from the fabric. Due to this inconveniencecutinases seem to be more practical in fatty soil removal.Contrary to lipases, cutinases are able to hydrolyze inthe absence of calcium, although at a low adsorptionrate of lipolytic enzymes are also hampered by thepresence of surfactants [17].

3.4. Biodiesel production

Biodiesel has become more attractive recently be-cause of its environmental benefits and the fact that itis made from renewable resources [38]. It can be pro-duced from many vegatable oils (soybean, canola, co-conut and sunflower oils), animal fats (tallow, grease),recycled greases and used vegetable oils or algae [24].Chemically, it is a mix of monoalkyl esters of longchain fatty acids, non-flammable, non-explosive witha flash point of 150°C. Unlike petrodiesel, it is biode-gradable and significantly reduces tailpipe emissions,visible smoke, noxious fumes and odors [11].

Biodiesel is obtained during a reaction between tri-acyloglicerols in vegatable oils or fat and a monohydricalcohol such as methanol (transesterification) in thepresence of basic catalyst (NaOH or KOH) to give thecorresponding mono-alkyl esters. After the reaction,free glycerol and the residual catalyst are removed dur-ing the water washing process. Principally, methanol isused as the efficient and cheapest alcohol for trans-esterification. The same reaction using ethanol is morecomplicated, because water-free alcohol and oil withlow water content are required in order to obtain gly-cerol separation. On the other hand, ethanol derivedfrom agricultural products, is renewable and biologi-cally less objectionable in the environment [11, 55]. Sofar, all commercial biodiesel producers used alkali-cata-lyzed process for the transesterification but acid andenzyme catalysis has been also proposed lately [8, 46].

Although, the enzyme-catalyzed transesterificationprocesses are not yet commercially developed manylaboratory results have been reported. For example,S a l i s et al. [52] tested three different immobilizedlipases from Candida antarctica B, Rhizomucor mieheiand Burkholderia cepacia towards the reaction betweentriolein and short chain alcohols to produce oleic acidalkyl esters (biodiesel) in solvent free conditions. Theyobserved that secondary alcohols usually are less re-active than primary alcohols, conversely, linear andbranched primary alcohols with short alkyl chainsC2-C4 showed high reaction and conversion rate.Moreover, the mixture of linear and branched shortchain alcohols was successfully used for oleic acid es-ter synthesis. In other studies, D e n g et al. [12] usedimmobilized lipase from Candida sp. 99�125 for theproduction of biodiesel through enzymatic reaction be-


tween long-chain fatty acids and methanol in a solventsystem. Biofuel was also produced from two Nigerianlauric oils: palm kernel oil and coconut oils bytransesterification with different alcohols using PS30lipase as a catalyst. In the conversion of palm kerneloil to alkyl esters, ethanol gave the highest conversionof 72%, whereas methanol only 15%. With coconutoil, 1-butanol and iso-butanol achieved the highestconversion of 40% while only traces of methyl esterswere observed using methanol [2].

Environmental benefits of using biodiesel in com-parison to petroleum based fuels are significant.Biodiesel reduces emission of carbon monoxide byapproximately 50% and carbon dioxide by 78.5% ona net basis. It contains less aromatic hydrocarbons thancommon fuels, eliminates sulfur emissions and reducesby as much as 65% the emission of particulates (smallparticles of solid combustion products). Biodieselcauses more NOx emissions than petrodiesel but thesecontaminants can be reduced through the use of cata-lytic converters. Moreover, it has a higher catane ratingthen petrodiesel and therefore ignites more rapidlywhen injected into the engine. The limitations includethe relatively high production cost, moderate reactionyields, difficulties found during purification of the un-reacted substrates and inaccessibility of feedstocks [53].

3.5. In vitro synthesis of biodegradable polyesters

Various and relatively easily adjustable propertiesof plastics make them ideal material for a variety ofproducts and applications. However, significant amountof nonbiodegradable polymers used for packaging,sanitary and agricultural uses causes serious problemof plastic waste accumulation. One way to solve theproblem of waste management is by replacing bio-resistant synthetic polymers with biodegradable ones.Presently polyesters constitute the most attractive classof artificial polymers which, after use, can be degradedunder environmental conditions [16].

It is known that the ability of various types ofhydrolases to degrade polyesters accompany their abil-ity to synthetize polyesters, because enzymes, like othercatalysts, affect rates of reversible reactions in bothdirections. To displace the equilibrium in favor of syn-thesis rather than hydrolysis, these reactions are per-formed in non-aqueous or micro aqueous media.Moreover, the lack of sensitive cofactors, which haveto be recycled, makes hydrolases such as lipases par-ticularly attractive for organic synthesis. New strategyfor enzymatic in vitro synthesis of polyesters via no-metabolic pathways also offers a great opportunity forusing non-petrochemical renewable resources as start-ing substrates of functional polymeric materials and

thus contributes to global sustainability without deple-tion of scarce resources [31].

Taking into consideration catalytic specificity oflipases, polyester synthesis could proceed via variouspolymerization modes so called ring-opening poly-merization (ROP) of lactones or lactides, polyconden-sation of dicarboxylic acids with glycols or polycon-densation of oxyacids and their esters [30].

Ring-opening polymerization is an addition poly-merization in which an end of growing polymer chaincan react with additional cyclic monomers to propa-gate the chain. Because catalytic site of lipase is a ser-ine residue the first step is the cleavage of the lactonering to give an acyl-enzyme intermediate. Then nucleo-philic attack of water, included partly in the enzyme,onto the acyl carbon of the intermediate produceT-hydroxycarboxylic acid. In the propagation stage, theintermediate is nucleophilically attacked by the termi-nal hydroxyl group of a propagating polymer. The poly-merization of lactones is carried out mostly in bulk orin solution. The type of organic solvent seemed to bean important factor affecting polyester synthesis [30].

Among the most widely used lactones or lactides inROP are 4 to 17-membered lactones such as $-propio-lactones polymerized by Pseudomonas family lipasesand Candida cylindracea lipase [39, 43], *-valerolac-tone and g-caprolactone polymerized by commerciallyavailable lipases originated from Candida antarctica,Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia andporcine pancreas lipase [29, 44] as well as 12�17membered macrolides, for which polymerization reac-tion proceeded even in aqueous medium [30].

High molecular weight poly(g-caprolactone) is a com-mercially available biodegradable plastic. Caprolactonewas the first monomer which was reported to be sub-ject to lipase catalyzed ring-opening polymerization.In the case of crude industrial lipases such as porcinepancreas lipase, Burkholderia cepacia and Pseudo-monas fluorescens lipase, often more than 40 wt.% ofthe enzymes was required for the efficient productionof the poly(g-caprolactone), when less than 1 wt.% ofCandida antarctica lipase was enough to induce thepolymerization. Furthermore, the catalytic activity re-mained unchanged over five cycles indicating the pos-sibility of reusing this enzyme for the polymerization.Additionally, the linear polymer was obtained whenpolymerization proceeded in bulk, whereas the mainproduct obtained in organic solvents, among which tolu-ene was the most appropriate, had cyclic structure [10].

Polycondensation is a reaction leading to the propa-gation of the polymer chain by a repeated condensa-tion process proceeding with simultaneous releasingof simple molecules. The chemical catalytic processesnormally require high temperature that makes the in-corporation of thermally unstable moieties into the


products impossible. Also the preparation of linearpolymers when using monomers having multiple func-tional groups could be problematic if the protection-deprotection protocols were be applied. Owing to theenzymes, it is possible to overcome some or all ofthese difficulties due to some unique features of lipaseslike enantio-, chemo-, and regioselectivity [34].

The scale-up experiment on polymer synthesis withCandida antarctica lipase revealed that it is possible toobtain polyester from adipic acid and 1,6-hexanediol inmore than 200 kg yield. Moreover, this solvent-freesystem displayed potential as an environmentally cleanprocess owing to mild conditions and no use of organicsolvents and toxic catalysts [30].

Limiting factors for a broader use of syntheticaliphatic polyesters derived from diols and diacids aretheir poor mechanical properties and low melting tem-perature. It has been proven that the incorporation ofrigid aromatic structures into aliphatic copolyesterswas helpful for the synthesis of polymers with im-proved mechanical and thermal properties. In thisprocess there were many critical factors affecting mo-lar mass of growing polyester such as relative positionof the two functional groups on a benzene ring, the typeof diol and reduced pressure. Additionally, L i n k oet al. [37] demonstrated the inability of commerciallyavailable crude lipase of Rhizomucor miehei to propa-gate polyester chain when terephtalic acid (1,4-ben-zene dicarboxylic acid) instead of isophtalic acid(1,3-benzene dicarboxylic acid) was used as substrate.In this case, only immobilized Novozyme-435 lipase(Candida antarctica lipase) was found to be an effi-cient biocatalyst. Also the influence of different fac-tors on various multi-component copolyesters synthesisusing Novozyme-435 lipase was investigated [19]. Theresults indicated that the flexibility in the methodologypermits the enzymatic introduction of various func-tionalities in the polymeric system for any specific ap-plication for example in plant therapy for controlleddelivery of pesticides or insecticides in agriculture.

As mentioned above, the important feature of enzymecatalysis is its reversible nature depending on reactionconditions. Studies conducted with aliphatic polyesterssubjected to hydrolytic degradation by various lipaseshave shown that, under certain conditions, previouslysynthesized polymer could be decomposed to giveoligomers with fixed molecular weight. Contrary toenzymatic degradation, acid-catalyzed degradation leadsto random bond cleavage of polymer. Moreover, afterremoval of the solvent, mixture of the oligomers couldbe easily polymerized again in the presence of the samelipase. These data indicate that the lipase-dependentpolymerization and degradation processes could becontrolled by the presence or absence of the solvent,providing a new methodology of plastics recycling [30].

3.6. Wastewater treatment

Domestic and restaurant wastewaters as well aswastewater from dairies are rich in biodegradableorganic molecules and usually contain high levels oflipids and proteins. Excessive amount of oil and greasecan form oil films on water surfaces preventing thediffusion of oxygen from air into water causing prob-lems in the aeration system and leading to the devel-opment of undesirable filamentous microorganisms asThiothrix, Beggiatoa and Nocardia. Aggregates formedby oil and other particles present in wastewater cancause blockage of water drainage lines. Moreover, thesesubstances reduce the cell-aqueous phase transport ratethrough the formation of a lipid coat around biologicalflock. They also hinder flocculation and sedimentation,the reason of microbial biomass decrease. To overcomethese difficulties it is necessary to reduce the concentra-tion of fat and oils or to eliminate these materials fromwastewaters. Commonly used mechanical and physico-chemical methods of oil and grease removal are ex-pensive and low efficient while the addition of micro-bial lipases to lipid-rich wastewater before its releasedinto the environment may significantly accelerate thebiodegradation processes in wastewaters [7, 13].

Reports on the production of lipases by microorgan-isms and their potential future application for waste-water treatment have been published. Among manydescribed fungal strains producing the hydrolytic en-zymes, Penicillium restrictum is the most promising. Itwas identified as a not only lipase but also glucoamylaseand protease producer both in submerged and solidstate fermentation. Lipase activity of this strain de-pended on C/N ratio and the highest (30.3 U/g initialdry weight) was observed after 24 h of culturing in thepresence of 2% olive oil [18]. From bacterial lipolyticenzymes particularly useful is lipase of Pseudomonasaeruginosa LP602. This enzyme added to lipid-richrestaurant wastewater reduced the lipid concentrationto less than 10 mg/ml and the lipid fraction was de-graded by 70% during the first 24 h [13]. The studieson biodegradation of lipid-rich wastewater were alsoconducted using mixed bacterial consortium composedof lipase producing strains Pseudomonas aeruginosaand Acinetobacter calcoaceticus LP009LP602, andprotease and amylase producer Bacillus sp. B304. Themixed culture was very effective in lipid degradation.Whithin 12 days under aerobic conditions, lipid contentwas reduced from 20,000 mg/l to less than 20 mg/l [40].

4. Summary

Microbial lipases are currently attracting attentionbecause of their application in environmental protec-tion. Factors posing limitations include relatively high


cost of lipases production and lack of individual en-zymes with the catalytic specifities and properties re-quired in a wide variety of processes. The decreasingcost of their mass production, persistent screening fornew microorganisms and characterization of their lipo-lytic enzymes will open new ways to solve many ur-gent environmental problems.

Literature

1. Abdel-Fattah Y.: Optimization of thermostable lipase froma thermophilic Geobacillus sp. using Box-Behnen experi-mental design. Biotechnol. Lett. 24, 1217�1222 (2002)

2. Abigor R.D., Uadia P.O., Foglia T.A., Haas M.J., Jones K.C.,Okpefa E., Obibuzor J.U., Bafor M.E.: Lipase-catalysed pro-duction of biodiesel from some Nigerian lauric oils. Biochem.Soc. Trans. 28, 979�981 (2000)

3. Antczak T., Graczyk J.: Lipazy: �ród³a, struktura i w³a�ciwo�cikatalityczne. Biotechnologia, 2, 130�145 (2002)

4. Benjamin S., Pandey A.: Isolation and characterization ofthree distinct forms of lipase from Candida rugosa producedin solid state fermentation. Braz. Arch. Biol. Technol. 44,213�221 (2001)

5. Bornscheuer U.T., Bessler C., Srinivas R., Krishna S.H.:Optimizing lipases and related enzymes for efficient appli-cation. Trends Biotechnol. 20, 433�436 (2002)

6. Burnes T.A., Blanchette R.A., Farrell R.L.: Bacterial bio-degradation of extractives and patterns of bordered pit mem-brane attack in pine wood. Appl. Environ. Microbiol. 66,5201�5205 (2000)

7. Cammarota M.C., Freire D.M.G.: A review on hydrolyticenzymes in the treatment of wastewater with high oil andgrease content. Bioresour. Technol. 97, 2195�2210 (2006)

8. Canakci M., van Gerpen J.H.: Biodiesel production and ca-talysis. Trans. ASAE, 42, 1203�1210 (1999)

9. Chen S., Lin Y., Zhang Y., Wang X.H., Yang J.L.: Enzymaticpitch control at Nanping paper mill. Tappi J. 84, 44�47 (2001)

10. Córdova A., Iversen T., Hult K., Martinelle M.: Lipase-cata-lysed formation of macrocycles by ring-opening polymeri-sation of e-caprolactone. Polymer, 39, 6519�6524 (1998)

11. Demirbas A.: Biodiesel fuels from vegetable oils via cata-lytic and non-catalytic supercritical alcohol transesterific-ations and other methods: a survey. Energy Conv. Manag.44, 2093�2109 (2003)

12. Deng L., Nie K., Wang F., Tan T.: Studies on production ofbiodiesel by esterification on fatty acids by a lipase prepara-tion from Candida sp. 99�125. Chinese J. Chem. Eng. 13,529�534 (2005)

13. Dharmsthiti S., Kuhasuntisuk B.: Lipase from Pseudomonasaeruginosa LP602: biochemical properties and applicationfor wastewater treatment. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 21,75�80 (1998)

14. El Khattabi M., Van Gelder P., Bitter W., Tommassen J.: Roleof the lipase specific foldase of Burkholderia glumae asa stearic chaperone. J. Biol. Chem. 275, 26885�26891 (2000)

15. Fischer K., Messner K.: Reducing troublesome pitch in pulpmills by lipolytic enzymes. Tappi J. 75, 130�134 (1992)

16. Flieger M., Kantorová M., Prell A., Øezanka T., Votruba J.:Biodegradable plastics from renewable sources. Folia Micro-biol. 48, 27�44 (2003)

17. Flipsen J.A.C., Appel A.C.M., Van Der Hijden H.T.W.M.,Verrips C.T.: Mechanism of removal of immobilized

triacylglycerol by lipolytic enzymes in a sequential laundrywash process. Enzyme Microb. Technol. 23, 274�280 (1998)

18. Gombert A.K., Pinto A.L., Castilho L.R., Freire D.M.G.:Lipase production by Penicillium restrictum in solid-statefermentation using babassu oil cake as substrate. ProcessBiochem. 35, 85�90 (1999)

19. Gross R.A., Kalra B., Kumar A.: Polyester and polycarbonatesynthesis by in vitro enzyme catalysis. Appl. Microbiol.Biotechnol. 55, 655�660 (2001)

20. Gutierrez A., Martinez M.J., Del Rio J., Romero J., Cana-val J., Lenon G., Martinez A.T.: Fungal pretreatment ofEucalyptus wood can strongly decrease the amount oflipophilic extractives during chlorine free kraft pulping.Environ. Sci. Technol. 43, 3705�3709 (2000)

21. Hasan F., Shah A.A., Hameed A.: Industrial applications ofmicrobial lipases. Enzyme Microb. Technol. 39, 235�251(2006)

22. Hemachander C., Puvanakrishnan R.: Lipase from Ralstoniapickettii as an additive in laundry detergent formulations.Process Biochem. 35, 809�814 (2000)

23. Hiol A., Jonzo M.D., Druet D., Comeau L.: Production, pu-rification and characterization of an extracellular lipase fromMucor hiemalis f. hiemalis. Enzyme Microbiol. Technol. 25,80�87 (1999)

24. Jaeger K-E., Eggert T.: Lipases for biotechnology. Curr.Opin. Biotechnol. 13, 390�397 (2002)

25. Joseph B., Ramteke P.W., Thomas G., Shrivastava N.: Stan-dard review cold-active microbial lipases: a versatile toolfor industrial applications. Biotechnol. Mol. Biol. Rev. 2,39�48 (2007)

26. Kakugawa K., Shobayashi M., Suzuki O., Miyakawa T.:Purification and characterization of a lipase from the glyco-lipid-producing yeast Kurtzmanomyces sp. I-11. Biosci.Biotechnol. Biochem. 66, 978�985 (2002)

27. Kamini N.R., Hemachander C., Mala J.G.S., Puvanakri-shnan R.: Microbial enzyme technology as an alternative toconventional chemicals in leather industry. Curr. Sci. 76,101�107 (1999)

28. Kirk T.K., Jeffries W.: Roles for microbial enzymes in pulpand paper processing. (w:) Enzymes for pulp and paperprocessing., red. Jeffries T.W., Wiikari L., Oxford Univer-sity Press US, Washington DC, 1996

29. Kobayashi S., Takeya K., Suda S., Uyama H.: Lipase-catalyzed ring-opening polymerization of medium-sizelactones to polyesters. Macromol. Chem. Phys. 199, 1729�1736 (1998)

30. Kobayashi S., Uyama H.: In vitro polyester synthesis viaenzymatic polymerization. Curr. Org. Chem. 6, 209�222(2002)

31. Kobayashi S., Uyama H.: Enzymatic polymerization to poly-esters. (w) Polyester I � Biological systems and biotechno-logical production, red. Doi Y., Steinbüchel A., Wiley-VCH,Weinheim, 2002, t. 3a Biopolymers

32. Kojima Y., Yokoe M., Mase T.: Purification and characteri-zation of alkaline lipase from Pseudomonas fluorescensAK102. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 1564�1568 (1994)

33. Kokkonen P., Korpela A., Sundberg A., Holmbom B.:Effects of different types of lipophilic extractives on paperproperties. Nord. Pulp Pap. Res. J. 17, 382�386 (2002)

34. Kumar R., Tyagi R., Parmar V.S., Samuelson L.A., KumarJ., Watterson A.C.: Enzymatic synthesis of multi-componentcopolymers and their structural characterization. Mol.Divers. 6, 287�295 (2003)

35. Lee K-W., Bae H-A., Shin G-S., Lee Y-H.: Purification andcatalytic properties of novel enantioselective lipase from


Acinetobacter sp. ES-1 for hydrolysis of (S)-ketoprofen ethylester. Enzyme Microb. Technol. 38, 443�448 (2006)

36. Leone R., Breuil C.: Biodegradation of aspen steryl estersand waxes by two filamentous fungi with or without othercarbon sources. World J. Microbiol. Biotechnol. 15, 723�727(1999)

37. Linko Y.-Y., Lämsä M., Wu X., Uosukainen E., Seppälä J.,Linko P.: Biodegradable products by lipase biocatalysis.J. Biotechnol. 66, 41�50 (1998)

38. Ma F., Hanna M.A.: Biodiesel production: a review. Biores.Technol. 70, 1�15 (1999)

39. Matsumura S., Beppu H., Tsukada K., Toshima K.: Lipase-catalyzed ring opening polymerization of lactide. Biotechnol.Lett. 18, 1041�1046 (1996)

40. Mongkolthanaruk W., Dharmsthiti S.: Biodegradation of lipid-rich wastewater by a mixed bacterial consortium. Int. Bio-deter. Biodegr. 50, 101�105 (2002)

41. Mrozik A., Hupert-Kocurek K., £abu¿ek S.: Lipazy bakteriirodzajów Pseudomonas i Burkholderia oraz ich wyko-rzystanie w biotechnologii. Post. Mikrob. 45, 19�26 (2006)

42. Muthukumaran N., Dhar S.C.: Comparative studies on thedegreasing of skins using acid lipase and solvent with refer-ence to the quality of finished leathers. Leather Sci. 29,417�424 (1982)

43. Namekawa S., Uyama H., Kobayashi S.: Lipase-catalyzedring-opening polymerization and copolymerization of $-pro-piolactone. J. Polym. 28, 730�731 (1996)

44. Namekawa S., Suda S., Uyama H., Kobayashi S.: Lipase-catalyzed ring opening polymerization of lactones to poly-esters and its mechanistic aspects. Int. J. Biol. Macromol. 25,145�151 (1999)

45. Nawani N., Kaur J.: Purification, characterization and thermo-stability of lipase from a thermophilic Bacillus sp. J33. Mol.Cell Biochem. 206, 91�96 (2000)

46. Nelson L.A., Foglia T.A., Marmer W.N.: Lipase catalysedproduction of biodiesel. JAOCS 73, 11911195 (1996)

47. Nini L., Sarda L., Comeau L-C.. Boitard E., Dubes J-P.,Chahinian H.: Lipase-catalysed hydrolysis of short-chainsubstrates in solution and in emulsion: a kinetic study. Bio-chem. Biophys. Acta, 1534, 34�44 (2001)

48. Rathi P., Saxena R.K., Gupta R.: A novel alkaline lipase fromBurkholderia cepacia for detergent formulation. Proc. Bio-chem. 37, 187�192 (2001)

49. Rosenau F., Jaeger K-E.: Bacterial lipases from Pseudo-monas: regulation of gene expression and mechanisms ofsecretion. Biochimie, 82, 1023�1032 (2000)

50. Ruiz B., Farres A., Langley E., Masso F., Sanchez S.: Purifi-cation and characterization of an extracellular lipase fromPenicillium candidum. Lipids 36, 283�289 (2001)

51. Rundlöf M., Htun M., Höglund H., Wägberg L.: Mechanicalpulpfines of poor quality � characteristics and influence ofwhite water. J. Pulp Pap. Sci. 26, 308�316 (2000)

52. Salis A., Pinna M., Monduzzi M., Solinas V.: Biodiesel pro-duction from triolein and short chain alcohols throughbiocatalysis. J. Biotechnol. 119, 291�299 (2005)

53. Saxena R.K., Ghosh P.K., Gupta R., Davidson W.S., BradooS., Gulati R.: Microbial lipases: potential biocatalysts for thefuture industry. Curr. Sci. 77, 101�115 (1999)

54. Schmidt-Dannert C.: Recombinant microbial lipases for bio-technological applications. Bioorg. Med. Chem. 7, 2123�2130(1999)

55. Schuchardt U., Sercheli R., Vargas R.M.: Transesterification ofvegetable oils: a review. J. Braz. Chem. Soc. 9, 199�210 (1998)

56. Sharma R., Chisti Y., Benerjee U.C.: Production, purification,characterization, and applications of lipases. Biotechnol. Adv.19, 627�662 (2001)

57. Sinchaikul S., Sookkheo B., Phutrakul S., Pan F-M.,Chen S-T.: Optimization of a thermostable lipase from Bacil-lus stearothermophilus P1: overexpression, purification, andcharacterization. Protein Expr. Purif. 22, 388�398 (2001)

58. Suzuki T., Nakayama T., Kurihara T., Nishino T., Esaki N.:Cold-active lipolytic activity of psychrotrophic Acinetobactersp. strain no. 6. J. Biosci. Bioeng. 92, 144�148 (2001)

59. Svendsen A.: Sequence comparisons within the lipase family.(w) Lipases: their structure, biochemistry and applications.,red. Woolley P., Petersen S.B., Cambridge Univ. Press, Cam-bridge, 1994, s. 1�21

60. Thanikaivelan P., Rao J.R., Nair B.U., Ramasami T.: Progressand recent trends in biotechnological methods for leatherprocessing. Trends Biotechnol. 22, 181�188 (2004)

61. Turner P., Mamo G., Nordberg Karlsson E.: Potential and uti-lization of thermophiles and thermostable enzymes in bio-refining. Microb. Cell Fact. 6, 9�32 (2007)

62. van Pouderoyen G., Eggert T., Jaeger K-J., Dijkstra B.W.:The crystal structure of Bacillus subtilis lipase: a minimal a/$-hydrolase fold enzyme. J. Mol. Biol. 309, 215�226 (2001)

63. Verger R.: Interfacial activation of lipases: facts and artifacts.Trends Biotechnol. 15, 32�38 (1997)

64. Whiteley C.G., Enongene G., Pletschke B.I., Rose P., Whit-tingtonjones K.: Co-digestion of primary sewage sludge andindustrial wastewater under anaerobic sulphate reducingconditions: enzymatic profiles in a recycling sludge bedreactor. Water Sci. Technol. 48, 29�138 (2003)

65. Yan F., Yong-Goe J., Kazuhiko I., Hiroyasu I., Susumu A.,Tohru Y., Hiroshi N., Shugui C., Ikuo M., Yoshitsugu K.Thermophilic phospholipase A2 in the cytosolic frac-tion from the archaeon Pyrococcus horikoshii. JAOCS 77,1147�1152 (2000)


1. Wstêp

Rodzaj Bacillus liczy aktualnie 215 gatunków [38]z czego sze�æ blisko ze sob¹ spokrewnionych, tj. B. ce-reus sensu stricto, B. thuringiensis, B. mycoides, B. an-thracis, B. weihenstephanensis [75] i B. pseudomyco-ides [90] tworzy wydzielon¹ grupê Bacillus cereus [59].

Z obecno�ci¹ laseczek z grupy B. cereus w �rodo-wisku ¿ywno�ci, wi¹¿e siê okre�lone zagro¿enie dlazdrowia konsumenta. �rodkami spo¿ywczymi najczê�-ciej wskazywanymi jako no�nik B. cereus, w odnoto-wanych przypadkach zachorowañ wywo³anych t¹ bak-teri¹, by³y produkty zbo¿owe, makarony, ry¿, p³atki[46, 76, 91, 104, 109]. Z przypadkami zatruæ pokar-mowych na tle B. cereus ³¹czono tak¿e miêso, mleko,sosy i desery [47, 73, 77, 92, 97]. Suszone produktymleczne s¹ czêsto zanieczyszczone sporami B. cereus,a pokarmy zawieraj¹ce zarówno sk³adniki mleczne jaki zbo¿owe, takie jak pokarmy dla niemowl¹t, nios¹wiêksze ryzyko zatrucia tymi bakteriami [20].

1.1. Charakterystyka grupy Bacillus cereus

Bakteriami z grupy B. cereus, podobnie jak i przed-stawicielami rodzaju Bacillus, s¹ Gram-dodatnie, ru-chliwe, tlenowe lub wzglêdnie beztlenowe laseczki,

zdolne do wytwarzania form przetrwanych, naturalniebytuj¹ce w ziemi. Z tego �ród³a, jako zanieczyszcze-nie pierwotne lub wtórne, trafiaæ mog¹ np. na surowcero�linne i zwierzêce, do �rodowiska produkcji ¿ywno�-ci, na gotowe produkty, zarówno pochodzenia ro�lin-nego jak i zwierzêcego.

Spory bakterii z grupy B. cereus s¹ ciep³oopornea ich decymalny czas redukcji w 100°C okre�lono na2,2�5,4 min. Formy wegetatywne niektórych przedsta-wicieli grupy maj¹ zdolno�æ wzrostu w 4�5°C [30, 35].W okre�lonych warunkach delikatna obróbka cieplnamo¿e stanowiæ bodziec aktywuj¹cy spory do kie³ko-wania, zwiêkszaj¹c ryzyko zatruæ pokarmowych natym tle [68].

Sze�æ gatunków zaliczanych obecnie do grupyB. cereus cechuje znaczne podobieñstwo fenotypowe[59] i genotypowe. Zdaniem C a r l s o n i wsp. [29]podobieñstwo sekwencji 16S rRNA gatunków B. ce-reus, B. thuringiensis, B. anthracis i B. mycoides prze-kracza 99%. Ró¿nice w sekwencji rybosomalnegoRNA (16S rRNA) szczepów B. cereus, B. anthracis,B. mycoides i B. thuringiensis dotycz¹ jedynie 9 nu-kleotydów [15, 83, 84].

Podobieñstwo fenotypowe i genotypowe B. cereus,B. anthracis i B. thuringiensis, jest przyczyn¹ roz-bie¿no�ci w opiniach bakteriologów co do ich pozycji

CZYNNIKI PATOGENNO�CIBAKTERII Z GRUPY BACILLUS CEREUS

Agnieszka Bednarczyk, El¿bieta Gra¿yna Daczkowska-Kozon*

Katedra Mikrobiologii ¯ywno�ci, Wydzia³ Nauk o ¯ywno�ci i Rybactwa, Akademia Rolniczaul. P. Paw³a V/3; 71-459 Szczecin; e-mail: [email protected]

Wp³ynê³o w listopadzie 2007 r.

1. Wstêp. 1.1. Charakterystyka grupy Bacillus cereus. 2. Chorobotwórczo�æ B. cereus. 2.1. Inwazyjno�æ B. cereus. 2.2. ToksynyB. cereus i mechanizm wywo³ywania objawów chorobowych. 2.2.1. Enterotoksyny. 2.2.2. Toksyna emetyczna. 2.2.3. Toksyny innychprzedstawicieli grupy B. cereus. 2.2.4. Enzymy o charakterze toksyn. 2.3. Objawy chorobowe wywo³ywane przez Bacillus cereus.2.4. Epidemiologia infekcji i zatruæ pokarmowych na tle B. cereus. 3. Podsumowanie

Pathogenic features of bacteria from the Bacillus cereus group

Abstract: Increasing interest in Bacillus cereus group is connected with the growing number of confirmed foodborne disease casesnoted worldwide caused by the group representatives. Sporeforming and ubiquitous in nature, they can easily contaminate foodenvironment and food as such.

The Bacillus cereus group comprises 6 species, namely B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. anthracis, B. weihenstephanensisand B. pseudomycoides. However, high phenotypic and genetic resemblance makes differentiation between the species difficult.

Toxin production ability coded on plasmids makes it possible for the toxin genes to be lost within few generations. Still, closeaffinity between the species within the group makes gene transfer from one species to another possible.

1. Introduction. 1.1. The Bacillus cereus group characteristics. 2. Pathogenicity of the B. cereus group. 2.1. Invasiveness of B. cereus.2.2. Toxins produced by the B. cereus group and the mechanism of provoking disease symptoms. 2.2.1. Enterotoxins. 2.2.2. Emetictoxin. 2.2.3. Toxins of other representatives of the B. cereus group. 2.2.4. Toxin-like enzymes. 2.3. Disease symptoms caused byBacillus cereus. 2.4. Epidemiology of foodborne diseases caused by B. cereus group. 3. Summary

S³owa kluczowe: cereulid, enterotoksyny, grupa Bacillus cereus, infekcje pokarmoweKey words: cereulide, enterotoxins, foodborne diseases, the Bacillus cereus group

52 AGNIESZKA BEDNARCZYK, EL¯BIETA GRA¯YNA DACZKOWSKA-KOZON

systematycznej. Na pytanie, czy s¹ to odrêbne gatunki(opcja aktualnie obowi¹zuj¹ca) czy tylko odmianyB. cereus sensu lato nie uzyskano, jak dot¹d, jedno-znacznej odpowiedzi [100].

Jednymi z lepiej poznanych gatunków grupy Ba-cillus s¹ B. anthracis i B. thuringiensis. Ró¿ni¹ siêzjadliwo�ci¹, rodzajem produkowanych toksyn i do-celowym organizmem.

B. anthracis (laseczka w¹glika) jest czynnikiemsprawczym �miertelnej w skutkach choroby zwanejw¹glikiem. Poza prze¿uwaczami � pierwszymi zwie-rzêtami u których rozpoznano t¹ chorobê � podobnawra¿liwo�æ na B. anthracis charakteryzuje wszystkiessaki [100]. U ludzi B. anthracis wywo³ywaæ mo¿eskórn¹ odmianê w¹glika (bolesna zmiana na skórzez czarnym �rodkiem) albo powa¿n¹ infekcjê p³uc.Skutkiem wdychania spor B. anthracis s¹, pocz¹t-kowo, objawy przypominaj¹ce grypê, prowadz¹ce dopowa¿nej infekcji p³uc która, nie leczona, koñczy siêzwykle �mierci¹.

Cechy odpowiedzialne za zjadliwo�æ szczepówB. anthracis s¹ kodowane plazmidowo. Wirulentneszczepy B. anthracis s¹ no�nikiem 2 du¿ych plazmi-dów pXO1(181 kb) i pXO2 (96 kb), w których zakodo-wana jest informacja dotycz¹ca zdolno�ci do produkcjidwóch toksyn oraz otoczki zbudowanej z kwasu poli-(-D-glutaminowego [26, 100]. Egzotoksyny B. an-thracis zbudowane s¹ z 3 bia³ek: antygenu ochronnego(PA = protective antygen), czynnika letalnego LF == lethal factor) oraz czynnika obrzêku (EF = edemafactor). Toksyna letalna (PA + LF) prowadzi do wstrz¹-su anafilaktycznego, prowadz¹cego do �mierci chorychw wyniku ogólnoustrojowej odmiany w¹glika [108].

Toksyna obrzêku (PA + EF), wprowadzona podskór-nie, powoduje obrzêk.

B. thuringiensis ró¿ni od B. cereus, towarzysz¹cesporulacji, wytwarzanie kryszta³ów protoksyny (krysta-liczne bia³ko Cry) � prekursora *-endotoksyn o dzia-³aniu owadobójczym. Spory B. thuringiensis to znanybiopestycyd. Przez d³ugi czas B. thuringiensis uwa¿anyby³ wy³¹cznie za patogena owadów. Dzia³anie owado-bójcze potwierdzone zosta³o w przypadku 82 seroty-pów B. thuringiensis. Skuteczno�æ bójcza dotyczyg³ównie owadów z rzêdu Lepidoptera, Diptera i Ko-leoptera, Hymenoptera, Homoptera, Orthoptera i Mal-lophaga [70, 100]. Niektóre szczepy B. thuringiensisokaza³y siê tak¿e skuteczne w zwalczaniu komarówprzenosz¹cych malariê i ¿ó³t¹ febrê, nicieni, roztoczyi pierwotniaków [100].

Praktycznie identyczne geny 16S i 23SrRNAu B. thuringiensis i B. cereus umo¿liwiaj¹ ró¿nicowa-nie obu gatunków na podstawie identyfikacji genówkoduj¹cych *-endotoksyny [15, 16, 84, 85].

Rizoidalne kolonie na pod³o¿ach agarowych to ce-cha odró¿niaj¹ca Bacillus mycoides od innych przed-stawicieli grupy.

Bacillus weihenstephanensis jest bakteri¹ psychro-tolerancyjn¹ zdoln¹ do wzrostu w temp. <7°C. Bakte-ria ta dominowa³a w pasteryzowanym mleku przecho-wywanym w 7°C. Nieliczne szczepy produkowa³yznaczne ilo�ci toksyny NheA, wskazywanej jako jedenz g³ównych czynników toksyczno�ci B.cereus [118].Za podstawê do wydzielenia B. weihenstephanensisz grupy B. cereus uznano ró¿nice w sekwencjach 16SrRNA, 23S rRNA, regionu pomiêdzy 16S rRNA i 23SrRNA, oraz obecno�æ genów koduj¹cych bia³ka szoku

Morfologia kolonii Bia³e Bia³e / szare Rizoidalne Bia³eHemoliza + + (+) -Ruchliwo�æ + + - -Oporno�æ na penicylinê - - - +Inkluzje kryszta³owe - + - -Barwienie Gramem + (a) + + +

Katalaza + + + +Ruchliwo�æ +/- (b) +/- - (c) -Redukcja azotanów + +/- + +Rozk³ad tyrozyny + + +/- - (d)Odporno�æ na lizozym + + + +Reakcja egg-yolk + + + +

Beztlenowy rozk³ad glukozy + + + +Reakcja VP + + + +

T a b e l a ICechy ró¿nicuj¹ce w grupie B. cereus

Cecha B. cereus B. thuringiensis B. mycoides B. anthracis

a � 90 � 100% szczepów daje reakcjê dodatni¹b � 50% szczepów daje reakcjê dodatni¹c � 90 � 100% szczepów daje reakcjê ujemn¹d � wiêkszo�æ szczepów daje reakcjê ujemn¹

53CZYNNIKI PATOGENNO�CI BAKTERII Z GRUPY BACILLUS CEREUS

zimna (homolog cspA). B. weihenstephanensis mo¿ewzrastaæ w temp. +4 do +7°C, lecz nie ro�nie w +43°C� temp. typowej dla B. cereus [75]. Okre�lenie czyszczep nale¿y do B. weihenstephanensis nie zawszejest mo¿liwe wg L e c h n e r i wsp. [75], raz z uwagina obecno�æ zimnolubnych szczepów B. cereus a dwazdolno�æ wytwarzania toksyn identycznych z typowy-mi dla B. cereus [117].

B. pseudomycoides jest bakteri¹ wyró¿niaj¹c¹ siêodmienn¹ budow¹ kwasów t³uszczowych od pozosta-³ych przedstawicieli grupy B. cereus [117].

W tabeli I zestawiono cechy pozwalaj¹ce na wstêp-ne ró¿nicowanie gatunków w grupie B. cereus. Zewzglêdu na brak kompletnych danych uwzglêdnionocztery z sze�ciu gatunków nale¿¹cych do tej grupy.

Spokrewnione ze sob¹ bakterie grupy B. cereusró¿ni¹ siê w du¿ej mierze nie tyle DNA chromosomo-wym, co DNA episomalnym. Kodowane plazmidowoczynniki wirulencji B. anthracis czy produkcja *-en-dotoksyn u B. thuringiensis, mog¹ byæ utracone lub te¿przekazywane innym szczepom B. cereus podczas np.koniugacji [65, 86, 120].

2. Chorobotwórczo�æ B. cereus

Chorobotwórczo�æ bakterii grupy B. cereus jest de-terminowana produkcj¹ toksyn i enzymów o charakte-rze toksyn. G³ówne z nich to cztery typy hemolizyn,trzy typy fosfolipazy C, toksyna emetyczna i dwakompleksy enterotoksyn [50, 71, 79, 113].

Aktywno�æ hemolityczna, cytotoksyczna i martwi-cza, wzrost przepuszczalno�ci naczyñ i sekrecji p³ynówdo �wiat³a jelita cienkiego ³¹czone s¹ z dzia³alno�ci¹enterotoksyn B. cereus [2, 22, 78]. Inwazyjno�æ B. ce-reus wi¹zana jest z zewnêtrznymi strukturami komórektych bakterii, ich hydrofobowo�ci¹ lub hydrofilno�ci¹,oraz zdolno�ci¹ do adhezji i namna¿ania siê w organi-zmie cz³owieka.

2.1. Inwazyjno�æ B. cereus

Poza b³on¹ cytoplazmatyczn¹ i �cian¹ komórkow¹u niektórych szczepów grupy B. cereus wystêpuje po-nadto krystaliczna bia³kowa, po³¹czona ze struktura-mi �ciany komórkowej, warstwa powierzchniowa, tzw.warstwa S [71]. Komórki wegetatywne wydzielaj¹bia³ka warstwy S w du¿ych ilo�ciach i czasami odry-waj¹ siê one od �ciany komórkowej. Ruchliwe szcze-py grupy B. cereus posiadaj¹ u³o¿one perytrichalnierzêski, jednak¿e nie wszystkie szczepy wykazuj¹ zdol-no�æ poruszania siê (B. anthracis).

W normalnych warunkach B. cereus szybko wytwa-rza subterminalne endospory o wyd³u¿onym kszta³ciei szcz¹tkowej aktywno�ci metabolicznej, oporne na eks-

tremalne warunki �rodowiskowe (ogrzewanie, zamra-¿anie, suszenie, promieniowanie). Poza rol¹ w roz-przestrzenianiu siê B. cereus w �rodowisku, u nie-których szczepów spory stanowi¹ dodatkowy czynnikwirulencji [71]. Hydrofobowa powierzchnia spory u³a-twia im przytwierdzanie siê do komórek nab³onko-wych jelita [6] czy powierzchni roboczych stanowi¹c,m.in. powa¿ny problem w �rodowisku przetwórstwa¿ywno�ci, np. w przemy�le mleczarskim. Szczepyz grupy B. cereus wytwarzaj¹ spory o wyj¹tkowychw³a�ciwo�ciach adhezyjnych i silnej, tak¿e w porów-naniu ze sporami innych Bacillus spp., hydrofobowo�-ci [6]. Przypuszcza siê, ¿e ma to zwi¹zek z wiêksz¹zjadliwo�ci¹ szczepów.

Szczepy charakteryzuj¹ce siê du¿¹ adhezyjno�ci¹,mimo dawki infekcyjnej nie przekraczaj¹cej 5 × 104

spor (200 spor g�1 spo¿ytego pokarmu) by³y powo-dem d³u¿ej trwaj¹cych i ciê¿szych przypadków zacho-rowañ wymagaj¹cych hospitalizacji [6]. Przytwier-dzone spory, kie³kuj¹c w �rodowisku jelita cienkiego,tworz¹ formy wegetatywne produkuj¹ce enterotoksy-nê bezpo�rednio w miejscu docelowym. Hydrofobo-wo�æ uwa¿ana jest za istotny czynnik warunkuj¹cyadhezjê, jednak w niektórych przypadkach nie mo¿naprzewidzieæ zdolno�ci adhezyjnych bakterii na pod-stawie w³asno�ci hydrofobowych, gdy¿ zale¿¹ onerównie¿ od takich czynników jak sk³ad po¿ywki czyfaza wzrostu [102].

Uwa¿a siê tak¿e, ¿e bia³kowa warstwa S jest wa¿-nym determinantem hydrofobowo�ci powierzchni ko-mórek bakteryjnych. W zale¿no�ci od gatunku bakte-rie posiadaj¹ce warstwê S s¹ albo hydrofobowe albohydrofilne. W przypadku niektórych szczepów B. ce-reus opisanych przez K o t i r a n t a i wsp. [71], war-stwa S zwiêksza³a ich hydrofobowo�æ, co powodowa³olepsz¹ adhezjê komórek do kolagenu typu I, lamininy,fibronektyny i fibrynogenu w porównaniu z komórka-mi nie posiadaj¹cymi tej warstwy. Obecno�æ warstwyS jest konieczna dla efektywnej adhezji komórek bak-teryjnych do ludzkich bia³ek strukturalnych. Prawdo-podobnie warstwa S zwiêksza tak¿e oporno�æ ko-mórek wegetatywnych na napromieniowanie [71].

2.2. Toksyny B. cereus i mechanizm wywo³ywaniaobjawów chorobowych

Bacillus cereus jest zdolny do wytwarzania dwóchg³ównych typów toksyn odpowiedzialnych za zatru-cia pokarmowe, tj. enterotoksyn i toksyny emetycznej(wymiotnej).

Poza wymienionymi wy¿ej bakterie z grupy B. ce-reus mog¹ produkowaæ ró¿ne zewn¹trzkomórkowehemolizyny oraz uwa¿ane za potencjalny czynnikzjadliwo�ci enzymy o charakterze toksyn, tj. fosfoli-pazy C, cereolizynê, sfingomielinazê, cereolizynê AB,


hemolizynê II, hemolizynê BL, hemolizynê III [17] czyhemolizynê podobn¹ do cereolizyny [63].

Cereolizyna jest ciep³olabiln¹ hemolizyn¹ aktywo-wan¹ przez grupy tiolowe, wykazuj¹c¹ podobieñstwodo streptolizyny O [52]. Jest inaktywowana przez cho-lesterol, domniemany receptor b³onowy.

Tak¿e ciep³ostabilna hemolizyna II (HlyII), niszczykomórki docelowe i wywo³uje ich lizê poprzez dzia³a-nie na ich b³onê. Nie inaktywowana przez cholesteroljest rozpowszechniona w�ród bakterii grupy B. cereus,w tym B. thuringiensis [27]. Nale¿y do tzw. toksynporotwórczych $-PFT (pore forming toxins), typowychdla bakterii Gram-dodatnich. Dzia³a cytolityczne, jed-nak jej rola w wirulencji mikroorganizmu pozostajespraw¹ otwart¹ [8]. Przyk³adem tej samej grupy toksynjest hemolizyna III (Hly-III). Atakuje b³onê erytrocy-tów w formie monomeru i dopiero wiele monomerówzgromadzonych na powierzchni erytrocyta warunkujejego lizê. Jest to tzw. mechanizm wielouderzeniowy,typowy dla streptolizyny O i theta-toksyny Clostridiumperfringens [17]. Inn¹ toksyn¹ nale¿¹c¹ do tej samejgrupy toksyn jest cytotoksyna K (CytK) [81].

Sfingomielinaza, bia³ko o masie cz¹st. 34 kDa,przyczepia siê do sfingomieliny erytrocytów. Sfingo-mielinaza, wg G r a n u m i N i s s e n [50], jest czê�-ci¹ kompleksu wchodz¹cego w sk³ad enterotoksynB. cereus.

Fosfolipaza C uznawana jest za czynnik zjadliwo�ciwielu bakterii. S¹dzi siê, ¿e bierze udzia³ w niszczeniutkanki poprzez pobudzanie degranulacji ludzkich neu-trofili [123]. B. cereus produkuje trzy rodzaje fosfoli-pazy C, z których ka¿da wykazuje inny mechanizmdzia³ania. Nale¿¹ do nich hydrolaza fosfatydyloino-zytolu, hydrolaza fosfatydylocholiny i hemolitycznasfingomielinaza [52]. Hydrolaza fosfatydylo-inozytolurozszczepia fosfatydyloinozytol i pochodne glikozy-dowe fosfatydyloinozytolu, które zakotwiczaj¹ wielebia³ek do powierzchni b³ony cytoplazmatycznej [60].Hydrolaza fosfatydylocholiny hydrolizuje fosfatydylo-cholinê, fosfatydoloetanoloaminê i fosfatydyloserynê,podczas gdy sfingomielinaza wykazuje aktywno�æprzeciwko sfingomielinie [52]. Wykazano, ¿e fosfoli-paza C B. cereus indukuje produkcjê strukturalnej me-taloproteinazy (MMP) w ludzkich komórkach nab³on-kowych, szczególnie ¿elatynazy o masie cz¹steczkowej92 kDa [42] wspomagaj¹c proces leczenia poprzezdegradacjê nab³onka zainfekowanych komórek.

2.2.1. Enterotoksyny Bacillus cereus

Biegunkowy typ zatrucia pokarmowego wywo³anyB. cereus mo¿e byæ spowodowany dwoma ró¿nymibia³kowymi enterotoksynami, tj. hemolizyn¹ BL (HBL)[21] i niehemolityczn¹ enterotoksyn¹ (NHE) [78].Obie enterotoksyny sk³adaj¹ siê z trzech komponentów

bia³kowych. Wegetatywne komórki B. cereus wytwa-rzaj¹ enterotoksyny w jelicie cienkim cz³owieka, w fa-zie wzrostu logarytmicznego bakterii. Optymalna tem-peratura dla produkcji enterotoksyn to 37°C [40].Wy¿sza aktywno�æ enterotoksyczna charakteryzujeszczepy zdolne do fermentacji laktozy � wykorzystu-j¹ce j¹ jako �ród³o wêgla [47].

Termostabilna trójsk³adnikowa enterotoksyna HBLsk³ada siê z trzech komponentów bia³kowych: B, L1i L2 [22�24]. o masie cz¹steczkowej, odpowiednio,37 kDa, 38 kDa i 46 kDa. Obecno�æ wszystkich kom-ponentów jest konieczna do wywo³ania objawówchorobowych [23]. Nie wszystkie szczepy s¹ zdolnedo produkcji trzech komponentów tej enterotoksyny[121]. Ka¿da z czê�ci bia³kowych hemolizyny BLjest kodowana genomowo, a jednemu komponen-towi odpowiada jedna sekwencja DNA. Wszystkiekomponenty HBL ulegaj¹ transkrypcji z jednego ope-ronu hbl [105] z³o¿onego z hblC � koduj¹cego bia³koL2, hblD � koduj¹cego bia³ko L1, hblA � koduj¹cegobia³ko B i hblB � koduj¹cego bia³ko B� (prawdopo-dobnie substytut bia³ka B), podobnego w 73% dobia³ka B [53]. Nie wszystkie szczepy posiadaj¹ce ope-ron hbl posiadaj¹ sekwencjê hblB, szczególnie ¿eoperon hbl znajduje siê w niestabilnej czê�ci chromo-somu B. cereus [53].

Enterotoksyna HBL wykazuje dzia³anie dermone-krotyczne, wp³ywa na przepuszczalno�æ naczyñ w³oso-watych i aktywuje jelitow¹ cyklazê adenylanow¹, copowoduje sekrecjê p³ynów w jelitach (biegunkê).Jeden z modeli opisuj¹cych dzia³anie HBL sugeruje,¿e komponent B jest tym, który wi¹¿e enterotoksynêdo powierzchni komórki, za� komponenty L1 i L2 maj¹dzia³anie lityczne [21]. Ka¿dy komponent hemolizy-ny BL g. Beecher i Wong [24] ³¹czy siê z komórk¹niezale¿nie, a nastêpnie tworzy kompleks atakuj¹cyb³onê komórkow¹ co prowadzi do lizy komórki.

Niehemolityczna toksyna NHE sk³ada siê z trzechkomponentów bia³kowych ró¿nych od tych typowychdla HBL. Tymi komponentami s¹ NheA o masie cz¹st.41 kDa, NheB o masie cz¹st. 39 kDa i prawdopodob-nie NheC o masie cz¹st. 105 kDa [80]. KomponentNheA nie jest konieczny do wywo³ywania objawówchorobowych, a kombinacja dwóch z trzech kompo-nentów toksyny ma dzia³anie biologiczne. Najsilniej-sze dzia³anie wykazuj¹ jednak wszystkie trzy kompo-nenty obecne jednocze�nie [78]. Pierwotnie s¹dzono,¿e NheA regulowany jest przez plcR [53], jednak¿epó�niejsze badania wykaza³y, ¿e operon nhe u B. ce-reus zawiera trzy otwarte ramki odczytu nheA, nheBi nheC. Pierwsze dwie z nich koduj¹ dwie czê�ci tok-syny niehemolitycznej � NheA i NheB, funkcja nheCjest nieznana. PlcR jest natomiast regulatorem trans-krypcji zarówno toksyny NHE jak i HBL u B. cereusjak i B. thuringiensis [54].


Badania nad interakcj¹ miêdzy NHE i komórkamiVero pokaza³y, ¿e komponent NheC mo¿e byæ bia³-kiem ³¹cz¹cym siê z komórk¹, a pozosta³e dwa kom-ponenty prawdopodobnie nie s¹ w stanie same wi¹zaæsiê z powierzchni¹ komórki [79]. Nadal nie jest jasneczy kompleksy HBL i NHE tylko niszcz¹ b³onê plaz-matyczn¹ komórki, czy te¿ jakie� komponenty tychtoksyn dostaj¹ siê do cytozolu i wywo³uj¹ lizê komór-ki [53]. Jednak wykazano ju¿, ¿e komponent o masiecz¹st. 105 kDa (NheC) wykazuje dzia³alno�æ kolage-nazy i ¿elatynazy, co mo¿e stanowiæ czynnik zwiêk-szaj¹cy zjadliwo�æ szczepu [80].

Cytotoksyna K (CytK) wyizolowana z przypadkówzatrucia pokarmowego na tle B. cereus, by³a przy-czyn¹ zgonu trzech osób z rozpoznaniem martwicze-go zapalenie ¿o³¹dka [81]. CytK jest bia³kiem wy-kazuj¹cym toksyczno�æ w stosunku do komórek Veroi posiadaj¹cym w³a�ciwo�ci hemolityczne. SekwencjaDNA koduj¹ca cytotoksynê K wykazuje du¿e podo-bieñstwo do $-bary³kowych toksyn, w tym do "-tok-syny Staphylococcus aureus i $-toksyny typu C Clo-stridium perfringens [49, 81]. Wykryto dwa rodzajecytotoksyny K, o budowie aminokwasowej podobnejw 89%. Pierwsz¹ z nich, nazwan¹ CytK-1 charakte-ryzuje wy¿sza toksyczno�æ w stosunku do komórekssaków ni¿ CytK-2 [39]. Dane �ród³owe sugeruj¹,¿e geny cytotoksyny K s¹ bardzo rozpowszechnionew�ród ró¿nych szczepów nale¿¹cych do grupy B. ce-reus [56, 103 116].

Pierwotnie uwa¿ano, ¿e jest jeszcze enterotoksynaT (BcET) [3], brak jednak potwierdzonego przypadkuzatrucia pokarmowego wywo³anego t¹ toksyn¹. Cowiêcej, enterotoksyna T (41 kDa), w odró¿nieniu doinnych toksyn B. cereus, nie posiada peptydu sygna³o-wego i z tego wzglêdu pozostaje w peryplazmie. GenbceT jest szeroko rozpowszechniony w�ród szczepówB. cereus [52], jednak¿e wg C h o m a i G r a n u m[31] toksyna ta nie jest enterotoksyn¹, gdy¿ nie dzia³atoksycznie na komórki nab³onka jelita i nie stymulujecyklazy adenylowej do konwersji ATP do cAMP.

Podstawowymi testami diagnostycznymi u¿ywany-mi przy wykrywaniu enterotoksyn s¹: BCET-RPLA(Bacillus cereus Enterotoxin Reverse Passive Agglu-tination Test), Tecra BDE-VIA (Bacillus DiarrhoealEnterotoxin Visual Immuno Assay), oraz techniki ge-netyczne (PCR, sondy molekularne).

2.2.2. Toksyna emetyczna

Toksyna emetyczna (wymiotna), zwana cereulidem,ma formê pier�cienia zbudowanego z trzech powtórzeñczterech amino i/lub oksykwasów: [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]3. Ta struktura pier�cieniowa (dode-kadepsipeptyd) posiada masê cz¹steczkow¹ równ¹1,2 kDa i jest zbli¿ona do jonoforu potasowego walino-

mycyny [1]. Toksyna emetyczna produkowana jestpodczas stacjonarnej fazy wzrostu B. cereus i wydzie-lana do �rodowiska wzrostowego.

Podobnie jak w przypadku innych antybiotykówpeptydowych i biologicznie czynnych peptydów wy-dzielanych przez B. cereus, takich jak gramicydynaczy sulfactin, iturin, bitracyna, lichenizyna, polimyk-syna i tyrocydyna, cereulid jest produkowany przezsystem NRPS (non-ribosomal peptide synthetases)syntetaz peptydowych [64]. Ten ogromny komp-leks enzymatyczny syntetaz peptydowych, wystêpuj¹-cy u wszystkich szczepów B. cereus, jest kodowanygenomowo i wykazuje nieznaczne ró¿nice w sekwen-cji nukleotydowej u szczepów emetycznych, w porów-naniu do szczepów nie emetycznych. Toksyna eme-tyczna nie jest bezpo�rednio kodowana genowo, alesystem enzymów niezbêdny do jej syntezy zakodowa-ny jest w genomie szczepów emetycznych.

Toksyna emetyczna jest ciep³o- i kwasoodporna i niewykazuje dzia³ania antygenowego. Nie posiada punk-tu izoelektrycznego i jest stabilna w temperaturze121°C przez 90 minut i w pH od 2 do 11, a tak¿e nieulega proteolizie (oporna na dzia³anie pepsyny i tryp-syny) [4, 6, 107]. St¹d du¿e prawdopodobieñstwo, ¿edostaje siê do dolnych partii przewodu pokarmowegow formie toksycznej. Wykazuje dzia³anie hamuj¹ce naludzkie bia³e krwinki o dzia³aniu cytotoksycznym(tzw. killer cells) i tym samym mo¿e wp³ywaæ na dzia-³anie uk³adu immunologicznego. Wymioty s¹ wyni-kiem po³¹czenia toksyny emetycznej z receptorem5-HT3 i stymulacji do�rodkowego nerwu b³êdnego[2]. Cereulid jest tak¿e odpowiedzialny za hamowanieoksydacji kwasów t³uszczowych w mitochondriachhepatytów w¹trobowych, prowadz¹ce do uszkodzeniaw¹troby [82, 107].

Toksyna emetyczna produkowana jest przez szcze-py B. cereus nale¿¹ce g³ównie do serowaru H-1 (urzê-sionego), a tak¿e przez nieliczne szczepy nale¿¹ce doserowarów H-3, H-5 i H-12. Szczepy tzw. biegunkowe,nie produkuj¹ce cereulidu, to najczê�ciej przedsta-wiciele serotypów H-2, H-6, H-8, H-9 i H-10 [4, 87].

Szczepy emetyczne, wg C a r l i n i wsp. [28], niewykazuj¹ wzrostu w temperaturach poni¿ej 10°C (cowyklucza szczepy B. weihenstephanensis), za to wszyst-kie s¹ w stanie rosn¹æ w 48°C. Co wiêcej, spory szcze-pów emetycznych wykazywa³y wy¿sz¹ oporno�æ nadzia³anie temperatury 90°C i kie³kowa³y wolniej w 7°C.Szczepy emetyczne, na ogó³, odró¿nia od szczepówwywo³uj¹cych biegunkê, nieznaczna aktywno�æ he-molityczna i brak zdolno�ci do hydrolizy skrobi [97].

Jak wynika z badañ R a j k o v i c [99] ilo�æ produ-kowanej toksyny emetycznej zale¿y od szczepu B. ce-reus, sk³adu �rodowiska wzrostowego, pH �rodowiska,temperatury i dostêpu tlenu. W hodowlach wstrz¹-sanych, w przeciwieñstwie do hodowli statycznych,


toksyna emetyczna nie by³a wytwarzana. W hodow-lach statycznych produkcja toksyny mia³a miejscew 22°C i 30°C nie za� w 12°C po 24 godz. Nie obser-wowano produkcji cereulidu w pH 6.0 i du¿o szybsz¹produkcjê tej toksyny w pH 7.4 ni¿, w mniej korzyst-nym dla B. cereus, pH 6.4. Najwy¿sz¹ zdolno�æ pro-dukcji toksyny emetycznej posiada³y szczepy rosn¹cena pod³o¿u TSA, przy czym wzrost kolonii i produkcjatoksyny wykazywa³y wyra�n¹ zale¿no�æ od zawarto�citlenu. Zawarto�æ O2 <1,6%, zdaniem R a j k o v i ci wsp. [99], hamuje produkcjê toksyny emetycznej. Zda-niem innych autorów, cytowanych przez R a j k o v i ci wsp. [99], nie jest to tak oczywiste i wi¹¿e siê raczejz wyczuwaniem liczebno�ci przez bakterie (QS).

F i n l a y i wsp. [41] za optymaln¹ dla produkcjacereulidu przez B. cereus uznali temperaturê pomiê-dzy 15 a 30°C, dowodz¹c, ¿e w temperaturze 37°Cprodukcja ta jest znikoma lub ¿adna. Na tej podstawieautorzy ci uznali mo¿liwo�æ produkcji cereulide w orga-nizmie cz³owieka za ma³o prawdopodobn¹, sugeruj¹c,¿e jedynym powodem wyst¹pienia objawów wymiot-nych jest spo¿ycie toksyny ju¿ obecnej w pokarmie.

Ilo�æ toksyny emetycznej w ¿ywno�ci, która wy-wo³ywa³a wymioty, waha³a siê od 0.02 do 1,28 µg ce-reulidu g�1 [4]. Ry¿ i produkty ry¿owe s¹ �rodowi-skiem sprzyjaj¹cym wytwarzaniu cereulidu przezB. cereus. Jednocze�nie typ emetyczny zatruæ pokar-mowych, g³ównie po spo¿yciu dañ z udzia³em ry¿u,notowano najczê�ciej w Japonii [79, 91, 104].

Toksyna emetyczna dzia³a jak jonofor transportu-j¹cy jony K+ do mitochondriów zgodnie z gradientemstê¿eñ i gradientem elektrycznym. Mechanizm tenprzypomina dzia³anie walinomycyny. Dzia³anie cereu-lidu unieczynnia mitochondria, które przestaj¹ prze-prowadzaæ procesy oksydoredukcyjne, co objawia siênp. zmian¹ ruchliwo�ci plemników w obrazie mikro-skopowym [99]. St¹d te¿ do wykrywania obecno�cicereulidu stosuje siê powszechnie testy na aktywno�æwakuolityczn¹, np. testy oparte na badaniu ruchliwo�ciplemników (sperm based biosassay-boar spermato-zan motility test), metody chromatograficzne (LC-ion-trap-MS, HPLC-MS), czy techniki genetyczne oparteg³ównie na PCR [36] w tym RT PCR [45].

Szczepy emetyczne B. cereus ró¿ni¹ od pozo-sta³ych niektóre cechy biochemiczne (brak amylazy,s³aba aktywno�æ hemolityczna), inne wymagania tem-peraturowe i niewielkie ró¿nice w oporno�ci cieplnej.Szczepy emetyczne wykazuj¹ nieznacznie wy¿sz¹oporno�æ na ogrzewanie, lecz mniejsz¹ aktywno�æw niskich temperaturach [28] st¹d stanowi¹ potencjal-ne zagro¿enie w ¿ywno�ci podgrzewanej i przetrzy-mywanej w temperaturze pokojowej (restauracje,bary). ¿ywno�æ przechowywana ch³odniczo nie po-winna w przypadku tych szczepów stanowiæ zagro¿e-nia zdrowotnego.

2.2.3. Toksyny innych przedstawicieligrupy B. cereus

W grupie B. cereus szczepy B. cereus sensu strictos¹ producentami biegunkowej enterotoksyny w oko³o50%. Analiza przeprowadzona przy u¿yciu odwrotnejbiernej aglutynacji lateksowej (RPLA � reverse passi-ve latex agglutination) wykaza³a tak¿e, ¿e i B. thurin-giensis i B. mycoides s¹ zdolne do produkcji entero-toksyn [19]. Tak¿e w przypadku B. weihenstephanensisudowodniono obecno�æ genów koduj¹cych przynaj-mniej jeden z komponentów toksyn biegunowych(HBL, NHE lub CytK) [116, 118]

Badania genomu przy u¿yciu PCR i testy na cyto-toksyczno�æ dowiod³y, ¿e geny koduj¹ce kompleksytoksyn HBL i NHE s¹ szeroko rozpowszechnione nietylko u B. cereus, ale tak¿e u B. thuringiensis i B. my-coides [43, 58, 98, 101]. F l e t c h e r i L o g a n [43]prowadz¹c badania nad cytotoksyczno�ci¹ enterotok-syny znale�li jeden szczep B. anthracis wykazuj¹cys³ab¹ dzia³alno�æ cytotoksyczn¹, za� M e n d e l s o ni wsp. [86] wykryli u B. anthracis geny homologicznedo tych koduj¹cych komponent NheA toksyny NHEB. cereus. Zdaniem autorów B. anthracis jest zdolnyprodukowaæ bia³kowy komponent toksyny i ¿e nie jestto równoznaczne ze zjadliwo�ci¹ szczepu producenta.Co ciekawsze, istnieje udokumentowany przypadekinfekcji przypominaj¹cej w¹glika wziewnego z które-go wyizolowano szczep B. cereus posiadaj¹cy genytoksyny w¹glikowej [61].

Wykazano równie¿, ¿e szczepy B. licheniformis,B. megaterium, B. firmus i B. simplex produkuj¹ cie-p³ooporne toksyny, które przypominaj¹ toksynê eme-tyczn¹ B. cereus [119]. Czê�ciowe oczyszczenie tok-syn uzyskanych ze szczepów B. megaterium, B. simplexi B. firmus pokaza³o, ¿e dzia³anie tych toksyn jestpodobne do cereulidu, tj. wykazuje aktywno�æ wakuo-lityczn¹. Wszystkie nowe ciep³osta³e toksyny wykazy-wa³y du¿¹ hydrofobowo�æ, rozpuszczalno�æ w metano-lu, lecz ¿adna z nich nie by³a identyczna z cereulidem(brak reakcji ze specyficznymi primerami w PCR)[119]. Sugeruje to, ¿e nie tylko B. cereus jest czynni-kiem etiologicznym zatruæ pokarmowych. Co wiêcejzwraca uwagê na potrzebê prawid³owej identyfikacjiizolowanych szczepów.

Bacillus thuringiensis produkuje endotoksyny � bia³-ka Cry, które dzia³aj¹ specyficznie na niektóre owady[112], a tak¿e niebia³kowe egzotoksyny owadobójcze,z których najbardziej znan¹ jest $-egzotoksyna I, sta-³ocieplny i rozpuszczalny w wodzie zwi¹zek o masiecz¹steczkowej równej 701 Da, wydzielany przez oko-³o 50% szczepów B. thuringiensis [37]. Cry 1, wydzie-lana np. przez szczepy B. thuringiensis subsp. kurstaki,jest toksyczna w stosunku do rodzaju Lepidoptera(æmy i motyle), Cry 11, produkowana przez B. thurin-


giensis subsp. israelensis, jest toksyczna w stosunku doinsektów z rodzaju Diptera (muchy i komary), a Cry 3,wydzielana przez B. thuringiensis sbpsp. tenebronis,wykazuje dzia³anie przeciwko Coleoptera (¿uki) [62].Scharakteryzowano ponad 100 *-endotoksyn, z którychwiêkszo�æ wykazuje aktywno�æ insektobójcz¹. Innetoksyny wytwarzane przez B. thuringiensis stanowi¹bia³ka cytolityczne (Cyt) i nie s¹ one specyficzne prze-ciwko okre�lonym owadom, lecz wykazuj¹ tak¿e dzia-³anie hemolityczne i cytolityczne w stosunku do ko-mórek ssaczych [33]. P e r c h a t i wsp. [95] stwierdzili,¿e B. cereus tak¿e zdolny jest do wytwarzania niebia³-kowych toksyn, obok cereulidu, ró¿nych od $-egzo-toksyny I. Niektóre szczepy B. cereus produkuj¹ tak-¿e bia³kowe toksyny owadobójcze nazwane Vip [122].

Niebezpieczeñstwo stanowi intensywne spryskiwa-nie ro�lin uprawnych i warzyw dzia³aj¹cymi owado-bójczo preparatami B. thuringiensis. W sk³ad tych pre-paratów wchodzi mieszanina endospor i kryszta³ówbia³kowych toksyn, a produkty zawieraj¹ce B. thurin-giensis stanowi¹ 90% preparatów owadobójczych do-stêpnych na rynku [57]. W zwi¹zku z mo¿liw¹ obec-no�ci¹ B. thuringiensis na surowcach ro�linnych [32,102, 104], wa¿ne jest by tak¹ ¿ywno�æ przechowywaæw sposób zapobiegaj¹cy kie³kowaniu spor i wzrosto-wi tych bakterii.

Najbardziej patogennym dla ludzi przedstawicie-lem grupy B. cereus jest laseczka w¹glika � Bacillusanthracis. Letalno�æ tej bakterii zwi¹zana jest z dwomaczynnikami zjadliwo�ci � polisacharydow¹ otoczk¹,która przeciwdzia³a fagocytozie, oraz wydzielaniemtoksyny w¹glikowej, która jest cytotoksyczna g³ówniew stosunku do makrofagów. Na toksynê w¹glikow¹sk³adaj¹ siê trzy bia³ka � antygen ochronny (PA � pro-tective antigen), czynnik obrzêku (EF � endema factor)i czynnik letalny (LF � lethal factor). Bia³ka te funkcjo-nuj¹ razem doprowadzaj¹c do apoptozy zainfekowanejkomórki. Dwa zjadliwe enzymy � EF i LF, zale¿¹ odantygenu ochronnego (PA), który przenosi je do wnê-trza komórki. Ka¿de z tych bia³ek samo w sobie nie jesttoksyczne dla komórek, a kombinacja wszystkich trzechprowadzi do �miertelnych objawów w¹glika. Synergi-styczne dzia³anie trzech bia³ek prowadzi do zniszcze-nia komunikacji komórkowej i pozwala bakterii naunikniêcie dzia³ania systemu obronnego gospodarza.

Czynnik obrzêku (EF) inaktywuje neutrofile, cozapobiega fagocytozie bakterii, nadaje komórce w³a�-ciwo�ci cyklazy adenylanowej, prowadzi do zwiêksze-nia w niej cAMP co skutkuje rozregulowaniem pro-cesów wewn¹trzkomórkowych (zaburzenie transportujonów w szczególno�ci), wydzielaniem na zewn¹trzkomórki elektrolitów i utrata wody.

Czynnik LF tak¿e posiada aktywno�æ enzymatyczn¹i blokuje w komórce szlak transdukcji sygna³ów ko-nieczny do prawid³owej odpowiedzi immunologicz-nej. Obok aktywacji makrofagów pobudza je do pro-

dukcji TNF-" i interleukiny 1-$, co powoduje reakcjêzapaln¹ i szok septyczny. Atakuje równie¿ komórki�ródb³onka, powoduj¹c wyciek naczyniowy i wstrz¹shipowolemiczny spowodowany utrat¹ krwi. Zjadli-wo�æ szczepu B. anthracis jest zale¿na od wystêpowa-nia otoczki zbudowanej z kwasu poli-D-glutaminowe-go, która jest wytwarzana w organizmie gospodarza,oraz od obecno�ci toksyn. Do zaka¿enia mo¿e doj�ædrog¹ pokarmow¹, oddechow¹ lub poprzez skórê,a �ród³em zaka¿enia s¹ g³ównie zwierzêta i ich odcho-dy. Obecno�æ toksyn w¹glikowych jest kodowana plaz-midowo [55]. Zdolno�æ bakterii do wytwarzania otocz-ki jest zdeterminowana genetycznie i jest kodowanana plazmidzie pX02. Do jej wytwarzania koniecznajest ekspresja trzech genów: capB, capC i capA kodu-j¹cych enzymy zwi¹zane z b³on¹ komórkow¹ bakterii.Ekspresja tych genów regulowana jest przez oddzia³y-wanie bia³ka kodowanego na plazmidzie pX02 z pro-duktem genu atxA znajduj¹cego siê na drugim plazmi-dzie pX01. Plazmid ten determinuje syntezê toksyny.Jak widaæ synteza otoczki jest czê�ciowo sprzê¿onaz wytwarzaniem toksyn.

Udokumentowany przypadek izolacji szczepu B. ce-reus posiadaj¹cego toksynê w¹glikow¹, z przypadkuinfekcji przypominaj¹cej w¹glika wziewnego [61] mo¿esugerowaæ mo¿liwo�æ przenoszenia plazmidów miê-dzy szczepami nale¿¹cymi do grupy B. cereus.

2.2.4. Enzymy

$-laktamazy stanowi¹ przyczynê oporno�ci bakte-rii na antybiotyki $-laktamowe. U ró¿nych szczepówB. cereus zauwa¿ono trzy ró¿ne formy $-laktamaz.$-laktamaza I nale¿y do klasy A $-laktamaz i jest ze-wn¹trzkomórkow¹ penicylinaz¹ posiadaj¹c¹ serynêw miejscu aktywnym. $-laktamaza II, nale¿¹ca do kla-sy B $-laktamaz, jest aktywowana przez przy³¹czeniejonów Zn (II) i Co(II) [94]. $-laktamaza III nale¿y doklasy A lipoprotein b³onowych. Szczepy B. cereus izo-lowane z ró¿nych infekcji by³y zazwyczaj oporne naantybiotyki $-laktamowe, w tym cefalosporyny trzeciejgeneracji, ale by³y wra¿liwe na chloramfenikol, klin-damycynê, wankomycynê, ciprofloksacynê, erytromy-cynê, gentamycynê i streptomycynê [5, 33, 104,115].

Niektóre szczepy B. cereus s¹ producentami ko-lagenozy. Jej produkcja zale¿y od szczepu i pod³o¿ai jest wiêksza w warunkach beztlenowych ni¿ tleno-wych [72]. Kolagenaza degraduje rozpuszczalne i nie-rozpuszczalne formy kolagenu, ¿elatynê i bradykininêdo ma³ych peptydów.

Proteazy B. cereus pe³ni¹ prawdopodobnie rolêw infekcjach pozajelitowych. Neutralna proteaza uzy-skana ze zjadliwego szczepu B. cereus posiada³a zdol-no�ci hydrolizy hemoglobiny, albuminy i kazeiny [114].Izolowano tak¿e inne proteazy, w tym rozk³adaj¹ce ka-zeinê i insulinê zawarte w b³onie komórkowej [44].


2.3. Objawy chorobowe wywo³ywaneprzez Bacillus cereus

B. cereus jest najlepiej poznanych patogenem grupyB. cereus. Pierwsze ognisko zatrucia pokarmowego natym tle opisane zosta³o w 1906 r. przez L u b e n a u[69]. Hospitalizowano ogó³em 300 osób. No�nikiemdu¿ej liczby bakterii zidentyfikowanej wówczas jakoB. peptonificans (pó�niej zaklasyfikowanej jako B. ce-reus) by³y pulpety miêsne. B. cereus odpowiada zadwa rodzaje zatruæ pokarmowych objawiaj¹cych siêbiegunk¹ lub wymiotami. Mo¿liwe jest te¿ ³¹czne wy-st¹pienie obu typów objawów.

Tzw. typ biegunkowy zatrucia, spowodowany jestwprowadzeniem do organizmu, wraz z pokarmem,okre�lonej liczby ¿ywych komórek B. cereus (najczê�-ciej spor). Dawka infekcyjna to 103�107 cfu (colonyforming units � jednostek tworz¹cych kolonie). Cha-rakteryzuje siê zazwyczaj wodnist¹ biegunk¹ orazbólami brzucha (objawy przypominaj¹ce zatrucie natle Clostridium perfringens) pojawiaj¹cymi siê po8�16 godz. od spo¿ycia zanieczyszczonej tymi bakteria-mi ¿ywno�ci. Objawy utrzymuj¹ siê przewa¿nie od 12do 24 godz. Do rzadko�ci nale¿¹ przypadki biegunekna tym tle trwaj¹cych kilka dni. Objawy s¹ skutkiemdzia³ania enterotoksyny uwalnianej, przez zakotwiczo-ne w jelicie cienkim gospodarza komórki B. cereus.Uwalniana przy¿yciowo ciep³olabilna enterotoksyna,aktywuje jelitow¹ cyklazê adenylanow¹ powoduj¹czwiêkszon¹ sekrecjê p³ynów w jelicie gospodarza.

Produktami ³¹czonymi najczê�ciej z przypadkamizaka¿eñ pokarmowych na tym tle s¹ g³ównie produktymiêsne, zupy, warzywne, puddingi (budynie) i sosy,mleko i produkty mleczne.

Typ wymiotny zatruæ pokarmowych to efekt wpro-wadzenia do organizmu, wraz z pokarmem, wyprodu-kowanej w nim przez szczepy B. cereus toksyny eme-tycznej � cyklicznego peptydu zwanego cereulidem.Ten typ zatrucia pokarmowego charakteryzuje siê nud-no�ciami i wymiotami pojawiaj¹cymi siê po 0,5�6 godz.od spo¿ycia zanieczyszczonej cereulidem ¿ywno�ci[93] i utrzymuj¹cymi siê przez 6�24 godz. Symptomytowarzysz¹ce zatruciu na tym tle przypominaj¹ zatru-cie enterotoksyn¹ gronkowcow¹. Liczba komórekB. cereus zdolna wyprodukowaæ ilo�æ toksyny koniecz-n¹ do wywo³ania objawów okre�lana jest na 105 do108 cfu×g�1. Z uwagi na du¿e ró¿nice w ilo�ci entero-toksyny produkowanej przez ró¿ne szczepy B. cereus,nawet ¿ywno�æ zawieraj¹ca 103 cfu B. cereus g-1 mo¿eokazaæ siê niebezpieczna dla zdrowia konsumenta [53].

Produktami spo¿ywczymi odpowiedzialnymi zaten typ zatrucia pokarmowego s¹ najczê�ciej sma¿onyi gotowany ry¿, makaron, ciastka i kluski [1, 53].

Blisko spokrewniony z B. cereus B. thuringiensis,wg J a c k s o n i wsp. [66], tak¿e jest w stanie wytwa-

rzaæ enterotoksyny i powodowaæ zatrucia typu biegun-kowego. R o s e n q u i s t i wsp. [103] wskazali naznacz¹c¹ liczebnie obecno�æ B. thuringiensis g³ówniew gotowanych pokarmach skrobiowych oraz surowychwarzywach. Zdaniem tych autorów szczepy B. thurin-giensis maj¹ co najmniej jeden komponent enterotok-syny (HBL lub NHE lub te¿ obu), lecz nie s¹ zdolnedo wytwarzania toksyny emetycznej.

B. cereus, oprócz zatruæ pokarmowych, mo¿e wy-wo³ywaæ i inne schorzenia, szczególnie u osób z obni-¿on¹ odporno�ci¹, starszych, niemowl¹t, alkoholikówi narkomanów itp. Bakteriemie na tym tle nale¿¹ dorzadko�ci i s¹, w wiêkszo�ci przypadków, krótkotrwa-³e i niegro�ne.

B. cereus jest natomiast jednym z najwa¿niejszychczynników wywo³uj¹cych zaka¿enia oczu takie jak za-palenie rogówki, wewnêtrzne zapalenie oka i zapale-nie ca³ej ga³ki ocznej. D r o b n i e w s k i [33] wylicza35 przypadków powa¿nych infekcji oka, a P i n n ai wsp. [96] opisuj¹ przypadek zapalenia rogówki spo-wodowany kontaktem oka z zanieczyszczonymi B. ce-reus szk³ami kontaktowymi.

Zaka¿enia przyranne i infekcje ran powypadko-wych i pooperacyjnych s¹ powi¹zane z produkcj¹przez B. cereus czynnika HBL, czynnika przenikal-no�ci naczyniowej martwiczego zapalenia skóry [67].B. cereus jest te¿ do�æ czêst¹ przyczyn¹ infekcji ranotwartych [34]. W literaturze opisane zosta³y pojedyn-cze przypadki perforacji jelit z infekcjami spowo-dowanymi B. cereus u wcze�niaka [48], bakteriemiaz bakteryjnym zapaleniem wsierdzia spowodowanainfekcj¹ rany przez B. cereus [125], martwicza infek-cja opon mózgowych wywo³ana B. cereus u pacjentaz leukemi¹ [88], pooperacyjne zapalenie opon mózgo-wych u dwóch pacjentów wywo³ane zanieczyszcze-niem szpitalnej po�cieli [18], zapalenie opon mózgo-wych u pacjenta z przetok¹ komorow¹ [25], trzyprzypadki szoku septycznego i �pi¹czki u pacjentówz leukemi¹ [89], nag³e uszkodzenie w¹troby spowo-dowane emetycznym szczepem B. cereus [92], zapa-lenie p³uc u pacjenta z upo�ledzon¹ odporno�ci¹ [33],infekcje przewodu moczowego [110], czy wreszciemartwicze zapalenie ¿o³¹dka u pacjenta z obni¿on¹odporno�ci¹ [74].

2.4. Epidemiologia infekcji i zatruæ pokarmowychna tle B. cereus

Wed³ug danych CDC (Centre for Disease Controland Prevention) B. cereus odpowiada za mniej ni¿ 1%ogniskowych zatruæ pokarmowych w USA [9] a licz-ba odnotowywanych przypadków, rocznie, waha siêod 6 do 50. Jednak, zdaniem znawców problemu, fak-tyczna liczba przypadków zatruæ pokarmowych natym tle mo¿e byæ znacznie wiêksza.


Porównanie skali tego zjawiska w ró¿nych krajachjest utrudnione z uwagi na dobrowolny charakter takiejewidencji. Dostêpne dane dotycz¹ce Europy (Tab. II)wskazuj¹ na przewagê 1�2 ognisk zachorowañ spo-wodowanych infekcj¹ B. cereus rocznie w wiêkszo�ciporównywanych krajów w latach 1999�2000 [124].Zdecydowanie wiêcej przypadków zachorowañ na tymtle odnotowano w Holandii, Norwegii czy na Wêgrzech.Na Wêgrzech np. liczba przypadków w ognisku za-chorowañ na tle B. cereus w 2000 r. przekracza³a 40.Dane �ród³owe potwierdza³y, ¿e do zachorowañ na tymtle dochodzi³o przewa¿nie w miejscach zbiorowego¿ywienia, takich jak. restauracje, sto³ówki, hotele, itp.

W Polsce, w latach 1998�2001, 37 do 313 przy-padków bakteryjnych zatruæ pokarmowych (�rednio88 rocznie) zaklasyfikowano jako spowodowane przez�inne bakterie, w tym B. cereus i V. parahaemolyti-cus�. W kolejnych latach (2002 i 2003) liczba zacho-rowañ wywo³anych przez �inne bakterie� dotyczy³a,odpowiednio, 317 i 110 przypadków [106].

Nieliczne dostêpne dane dotycz¹ce B. cereus jakoczynnika sprawczego zatruæ pokarmowych (z wy³¹-czeniem infekcji wirusowych) dowodz¹, ¿e bakterie teodpowiada³y np. za 8.5% przypadków zachorowañw Holandii w 1991r. i 5% w Danii w latach 1990�1992[106]. Du¿o ni¿sz¹ zapadalno�æ na tym tle notowano,np. w Anglii i Walii (0,7%), Japonii (0,8%), USA(1,3%) czy Kanadzie (2,2%) [53]. W Holandii, Angliii Walii w latach 1993�2000 B. cereus by³ przyczyn¹ ok.2% ³¹cznej liczby ognisk zatruæ pokarmowych o znanejetiologii [124]. We Francji czêsto�æ zatruæ pokarmo-wych na tle B. cereus okre�la siê na 4�5%, a w StanachZjednoczonych 1�2% ogó³u odnotowanych [103].

Dane dotycz¹ce liczby ognisk/przypadków zatruæpokarmowych na tle B. cereus zg³oszonych w USA,Australii i Nowej Zelandii w latach 2001�2005, po-twierdzaj¹ niewielk¹ skalê tego zjawiska (Tab. III).Przy jednocyfrowej liczbie ognisk zachorowañ na tymtle, liczba przypadków w ognisku, w badanym okresie,rzadko przekracza³a 20. Jednocze�nie z odnotowanych

USA 5 61 7 42 2 50 6 103 3 37 [9]

Australia � � 1 37 � � 1 6 � � [11�13]

Nowa Zelandia 6 21 4 16 6 25 0 1 5* 10*

T a b e l a I I ILiczba zg³oszonych zatruæ pokarmowych na tle Bacillus cereus w latach 2001�2005 w Australii, Nowej Zelandii i USA

[9, 11�13]

Kraj2001 �ród³o

informacjiO P

* Bacillus spp.; � brak danych

OOOO PPPP

2005200420032002

Anglia i Walia 0 0 1 � 0 0

Finlandia 3 29 1 5 2 12

Francja 7 � 2 � 13 �

Holandia � � 10 31* 14 165**

Islandia 1 2 2 10 0 0

Niemcy � � 2 16 2 26

Norwegia 5 � 7 145 7 104

Polska � � 0 0 1 36

Portugalia � 3 1 7 1 6

Rosja � � 1 53 0 0

S³owenia � � 1 68 0 0

Szkocja 1 � 1 � 0 0

Szwecja 2 5 1 2 1 2

Wêgry 5 177 4 139 2 88

W³ochy 1 � 2 10 1 8

T a b e l a I ILiczba zg³oszonych zatruæ pokarmowych na tle Bacillus cereus w latach 1998�2000 [124]

Kraj1998 1999 2000

Ogniska Przypadki

* 1 przypadek choroby poza zg³oszonymi ogniskami** 3 przypadki choroby poza zg³oszonymi ogniskami choroby � brak danych

Ogniska OgniskaPrzypadki Przypadki


przypadków zachorowañ oprócz B. cereus izolowanoinnych przedstawicieli rodzaju Bacillus (Tab. III).

Typ zatruæ pokarmowych na tle B. cereus ró¿ni siêzale¿nie od kraju. W Japonii np. dominuje typ eme-tyczny, natomiast w Europie i USA s¹ to najczê�ciejinfekcje pokarmowe typu biegunkowego.

3. Podsumowanie

Wzrastaj¹ce zainteresowanie grup¹ Bacillus cereuszwi¹zane jest z coraz czêstszym izolowaniem tychbakterii ze zdiagnozowanych przypadków zachoro-wañ na tym tle.

Grupa B. cereus stanowi¹ drobnoustroje wszêdo-bylskie, sporotwórcze, a co za tym idzie, obecne w �ro-dowisku zwi¹zanym z produkcj¹, przetwórstwem ¿yw-no�ci i ¿ywno�ci¹ jako tak¹.

Grupê B. cereus reprezentuje aktualnie sze�æ gatun-ków: B. cereus sensu stricto, B. thuringiensis, B. mycoi-des, B. anthracis, B. weihenstephanensis, B. pseudomy-coides. Niewielkie ró¿nice w fenotypie przedstawicieligrupy sprawiaj¹, ¿e rozró¿nienie ich za pomoc¹ kla-sycznych metod diagnostycznych nie jest mo¿liwe. Cowiêcej, du¿e podobieñstwo dotyczy tak¿e rodzaju toksynprodukowanych zarówno przez przedstawicieli grupyB. cereus jak i rodzaju Bacillus takich jak np. B. liche-niformis, B. megaterium, B. simplex czy B. firmus.

To, ¿e rodzaj i ilo�æ wytwarzanych przez B. cereustoksyn zale¿y od warunków �rodowiskowych (tempe-ratury, pH, dostêpno�ci tlenu, sk³adników dostêpnychw �rodowisku) oraz szczepu producenta sprawia, ¿eproduktem spo¿ywczym zagra¿aj¹cym zdrowiu kon-sumenta mo¿e byæ ju¿ produkt zawieraj¹cy 103 ko-mórek lub spor w 1 g.

Zdolno�æ do produkcji niektórych toksyn kodowa-na plazmidowo, sprawia, ¿e odpowiedzialne za tak¹zdolno�æ geny mog¹ byæ utracone w ci¹gu kilku po-koleñ (B. anthracis, B. thuringiensis) lub przeniesionena inne blisko spokrewnione gatunki grupy B. cereus.Bliskie pokrewieñstwo B. cereus do B. anthracis stwa-rza mo¿liwo�æ wystêpowania szczepów B. cereus po-siadaj¹cych toksyny w¹glika. Bliskie pokrewieñstwoB. thuringiensis i B. cereus niesie ze sob¹ realne ry-zyko zatruæ pokarmowych przez B. thuringiensis.Powszechnie stosowany jako preparat owadobójczyw hodowli ro�lin, B. thuringiensis, podobnie jak inniprzedstawiciele grupy B. cereus by³ ju¿ izolowanyz przypadków zatruæ pokarmowych.

Pi�miennictwo

1. Agata N., Mori M., Ohta M., Suwan S., Ohtani I., Isobe M.:A novel dodecadepsipeptide, cereulide, isolated from Bacil-lus cereus causes vacuole formation in Hep-2 cells. FEMSMicrobiol. Lett. 121, 31�34 (1994)

2. Agata N., Ohta M., Arakawa Y., Mori M.: The bceT gene ofBacillus cereus encodes an enterotoxin protein. Microbiology,141, 983�988 (1995)

3. Agata N., Ohta M., Mori M.: Isobe M.: A novel dodecadep-sipeptide, cereulide, is an emetic toxin of Bacillus cereus.FEMS Microbiol. Lett. 129, 17�20 (1995)

4. Agata N., Ohta M., Mori M.: Production o fan emetic toxin,cereulide, is associated with a specific class of Bacilluscereus. Curr. Microbiol. 33, 67�69 (1996)

5. Alfaro D.V., Davis J., Kim S., Bia F., Bogard J.F., Briggs J.W.,Liggett P.E.: Experimental Bacillus cereus posttraumatic endo-phthalmitis and treatment with ciprofloxacin. Br. J. Ophthal-mol. 80, 755�758 (1996)

6. Andersson A., Granum P.E., Rönner U.: The adhesion of Ba-cillus cereus spores to epithelial cells might be an additionalvirulence mechanism. Int. J. Food Microbiol. 39, 93�99(1998)

7. Andersson M.A., Mikkola R., Helin J., Andersson M.C., Sal-kinoja-Salonen M.: A novel sensitive bioassay for the detec-tion of Bacillus cereus emetic toxin and related depsipeptideionophores. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1338�1342 (1998)

8. Andreeva Z.I., Nesterenko V.F., Yurkov I.S., Budarina Z.I.,Sineva E.V., Solonin A.S.: Purification and cytotoxic pro-perties of Bacillus cereus hemolysin II. Protein ExpressionPurification, 47, 186�193 (2006)

9. Anonim 1: http://www.cdc.gov/foodborneoutbreaks/outbreak_data.htm (30 maja 2007)

10. Anonim 2: http://www.hps.scot.nhs.uk/ewr/subjectsummary.aspx?subjectid=71 (30 maja 2007)

11. Anonim 3: http://www.surv.esr.cri.nz/surveillance/annual_outbreak.php?we_ objectID=127 30 maja 2007)

12. Anonim 4: http://www.surv.esr.cri.nz/surveillance/annual_surveillance.php (30 maja 2007)

13. Anonim 5: http://www.surv.esr.cri.nz/surveillance/annual_outbreak.php (30 maja 2007)

14. Asano S.-I., Nukumizu Y., Bando H., Iizuka T., Yamamoto T.:Cloning of novel enterotoxin genes from Bacillus cereusand Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 63,1054�1057 (1997)

15. Ash C., Collins M.D.: Comparative analysis of 23S ribosomalRNA gene sequences of Bacillus anthracis and emetic Bacil-lus cereus determined by PCR-direct sequencing. FEMSMicrobiol. Lett. 94, 75�80 (1992)

16. Ash C., Farrow J.A.E., Dorsch M., Stackenbrandt E., CollinsM.D.: Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacilluscereus, and related species on the basis of reverse transcrip-tase sequencing of 16S rRNA. Int. J. Syst. Bacteriol. 41,343�346 (1991)

17. Baida G.E., Kuzmin N.P.: Mechanism of action of hemoly-sin III from Bacillus cereus. Rapid report. Biochem. Biophys.Acta, 1284, 122�124 (1996)

18. Barrie D., Wilson J.A., Hoffman P.N., Kramer J.M.: Bacilluscereus meningitis in two neurosurgical patients: an investi-gation into the source of the organism. J. Infect. 25, 291�297(1992)

19. Beattie S.H., Williams H.G.: Detection of toxigenic strainsof Bacillus cereus and other Bacillus spp. with an improvedcytotoxicity assay. Lett. Appl. Microbiol. 28, 221�225 (1999)

20. Becker H., Schaller G., Von Wiese W., Terpian G.: Bacilluscereus in infant foods and dried milk products. Int. J. FoodMicrobiol. 23, 1�15 (1994)

21. Beecher D.J., MacMillan J.D.: Characterization of the com-ponents of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect. Immu-nol. 59, 1778�1784 (1991)


22. Beecher D.J., Schoeni J.L.: Wong A.C.L., Enterotoxin acti-vity of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect. Immunol.63, 4423�4428 (1995)

23. Beecher D.J., Wong A.C.L.: Improved purification and cha-racterization of hemolysin BL, a hemolytic dermonecroticvascular permeability factor from Bacillus cereus. Infect.Immunol. 62, 980�986 (1994)

24. Beecher D.J., Wong A.C.L.: Tripartite hemolysin BL fromBacillus cereus. Hemolytic analysis of component interac-tion and model for its characteristic paradoxical zone pheno-menon. J. Biol. Chem. 272, 233�239 (1997)

25. Berner R., Heinen F., Pelz K., Van Velthoven V., Sauer M.,Korinthenberg R.: Ventricular shunt infection and meningitisdue to Bacillus cereus. Neuropedriatrics, 28, 333�334 (1997)

26. Brossier F., Mock M.: Toxins of Bacillus anthracis. Toxicon,39, 1747�1755 (2001)

27. Budarina Z. I., Sinev M.A., Mayorov S.G., Tomashevski A.Y.,Shmelev I.V., Kuzmin N.P.: Hemolysin II is more characte-ristic of Bacillus thuringiensis than Bacillus cereus. Arch.Microbiol. 161, 252�257 (1994)

28. Carlin F., Fricker M., Pielaat A., Heisterkamp S., Shaheen R.,Salkinoja Salonen M., Svensson B., Nguyen-The C., Ehling-Schulz M.: Emetic toxin-producing strains of Bacillus cereusshow distinct characteristics within the Bacillus cereus group.Int. J. Food Microbiol. 109, 132�138 (2006)

29. Carlson C.R., Johansen T., Kolsto A.B.: The chromosomemap of Bacillus thuringiensis subsp. canadensis HD224 ishighly similar to that of the Bacillus cereus type strain ATCC14579. FEMS Microbiol. Lett. 141, 163�167 (1996)

30. Choma C., Clavel T., Dominguez H., Razafindramboa N.,Soumille H., Nguyenthe C., Schmitt P.: Effect of temperatureon growth characteristics of Bacillus cereus TZ415. Int.J. Food Microbiol. 55, 73�77 (2000)

31. Choma C., Granum P.E.: The enterotoxin T (BcET) fromBacillus cereus can probably not contribute to food poisoning.FEMS Microbiol. Lett. 217, 115�119 (2002)

32. Damgaard P.H., Hansen B.M., Pederson J.C., Ellenberg J.:Natural occurence of Bacillus thuringiensis on cabbagefoliage and in insects associated with cabbage crops. J. Appl.Microbiol. 82, 253�258 (1997)

33. Drobniewski F.A.: Bacillus cereus and related species. Clin.Microbiol. Rev. 6, 324�338 (1993)

34. Dubouix A., Bonnet E., Alvarez M., Bensafi H., Archam-baud M., Chaminade B., Chabanon G., Marty N.: Bacilluscereus infections in Traumatilogy-Orthopaedics Department:retrospective investigation and improvement of healthcarepractices. J. Infect. 50, 22�30 (2005)

35. Dufrenne J., Bijwaard M., te Giffel M., Beumer R., Noter-mans S.: Characteristics of some psychrotrophic Bacilluscereus isolates. Int. J. Food Microbiol. 27, 175�183 (1995)

36. Ehling-Schulz M., Fricker M., Scherer S.: Identification ofemetic toxin producing Bacillus cereus strains by a novelmolecular assay. FEMS Microbiol. Lett. 232, 189�195 (2004)

37. Espinasse S., Gohar M., Chaufaux J., Buisson C., Perchat S.,Sanchis V.: Correspondence of high levels of beta-exotoxinI and the presence of cryIB in Bacillus thuringiensis. Appl.Environ. Microbiol. 68, 4182�4186 (2002)

38. Euzéby J. P.: List of Prokaryotic names with Standing inNomenclature, http://www.bacterio.cict.fr/index.html. (2005)

39. Fagerlund A., Ween O., Lund T., Hardy S.P., Granum P.E.:Genetic and functional analysis of the cytK family of genesin Bacillus cereus. Microbiology, 150, 2689�2697 (2004)

40. Fermanian C., Lapeyre C., Fremy J.M., Claisse M.: Produc-tion of diarrheal toxin by selected strains of Bacillus cereus.J. Food Microbiol. 30, 345�358 (1996)

41. Finlay W.J., Logan N.A., Sutherland A.D.: Bacillus cereusproduces most emetic toxin at lower temperature. Lett. Appl.Microbiol. 31, 385�389 (2000)

42. Firth J.D., Putnins E.E., Larjava H., Uitto V.J.: Bacterial phos-pholipase C upregulates matrix metalloproteinase expression bycultured epithelial cells. Infect. Immun. 65, 4931�4936 (1997)

43. Fletcher P., Logan N.A.: Improved cytotoxicity assay forBacillus cereus diarrhoeal enterotoxin. Lett. Appl. Microbiol.28, 394�400 (1999)

44. Fricke B., Buchmann T., Friebe S.: Unusual chromatographicbehaviour and one-step purification of a novel membrane pro-teinase from Bacillus cereus. J. Chromatogr. A. 715, 247�258(1995)

45. Fricker M., Messelhäusser U., Busch U., Scherer S., Ehling-Schulz M.: Diagnostic real-time PCR assays for the detectionof emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borneoutbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892�1898 (2007)

46. Giffel M.C., Beumer R.R., Granum P.E., Rombouts F.M.: Iso-lation and characterisation of Bacillus cereus from pasteuri-sed milk in household refrigerators in The Netherlands. Int.J. Food Microbiol. 34, 307�318 (1997)

47. Giffel M.C., Beumer R.R., Leijendekkers S., Rombouts F.M.:Incidence of Bacillus cereus and Bacillus subtilis in foods inthe Netherlands. Food Microbiol. 13, 53�58 (1997)

48. Girish M., Ries M., Cenker M., Carbon R., Rauch R., Hof-beck M.: Intestinal perforations in a premature infant causedby Bacillus cereus. Case report. Infection, 31, 192�193 (2003)

49. Gouaux E.: "-hemolysin from Staphylococcus aureus: anarchetype of $-barrel, channel-forming toxins. J. Struct. Biol.121, 110�122 (1998)

50. Granum P.E., Anderson A., Gayther C., te Giffel M., LarsenH., Lund T., O�Sullivan K.: Evidence for a further enteroto-xin complex produced by Bacillus cereus. FEMS Microbiol.Lett. 141, 145�149 (1996)

51. Granum P.E., Lund T.: Mini review: Bacillus cereus and itsfood poisoning toxins. FEMS Microbiol. Lett. 157, 223�228(1997)

52. Granum P.E., Nissen H.: Sphingomyelinase is part of the�enterotoxin xomplex� produced by Bacillus cereus. FEMSMicrobiol. Lett. 110, 97�100 (1993)

53. Granum P.E., O�Sullivan K., Lund T.: The sequence of thenon-haemolytic enterotoxin operon from Bacillus cereus.FEMS Microbiol. Lett. 177, 225�229 (1999)

54. Granum P.E.: Bacillus cereus and its toxins. J. Appl. Micro-biol. Symp. Suppl. 76, 61S�66S (1994)

55. Green, B.D., Battisti, L., Koehler, T.M., Thorne, C.B.,Ivins, B.E.: Demonstration of a capsule plasmid in Bacillusanthracis. Infect. Immun. 49, 291�297 (1985)

56. Guinebretiere M.H., Broussolle V., Nguyen-The C.: Entero-toxigenic profiles of food-poisoning and food-borne Bacil-lus cereus strains. J. Clin. Microbiol. 40, 3053�3056 (2002)

57. Hansen B.M., Damgaard P.H., Eilenberg J., Pedersen J.C.:Bacillus thuringiensis. Ecology and environmental effects ofits use for microbial pest control. Report no. 316, (2006)Danish Environmental Protection Agency. [cyt. za: RosenquistH., Smidt L., Andersen S.R., Jenses G., Wilcks A.: Occurenceand significance of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensisin ready-to-eat food. FEMS Microbiol. Lett. 250, 129�136(2005)

58. Hansen B.M., Hendriksen N.B.: Detection of enterotoxicBacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCRanalysis. Appl. Environ. Microbiol. 67, 185�189 (2001)

59. Hansen B.M., Hendriksen N.B.: Polymerase chain reactionassay for the detection of Bacillus cereus group cells. FEMSMicrobiol. Lett. 202, 209�213 (2001)


60. Heinz D.W., Ryan M., Smith M.P., Weaver L.H., Keana J.F.,Griffith O.H.: Crystal structure of phosphatidylinositol-spe-cific phospholipase C from Bacillus cereus in complex withglycosaminyl (alpha 1�>6)-D-myo-inositol, an essentialfragment of GPI anchors. Biochemistry, 35, 9496�9504 (1996)

61. Hoffmaster A.R., Ravel J., Rasko D.A., Chapman G.D.,Chute M.D., Marston C. K., De B.K., Sacchi C.T., Fitzge-rald C., Mayer L.W., Maiden M.C., Priest F.G., Barker M.,Jiang L., Cer R.Z., Rilstone J., Peterson S.N., Weyant R.S.,Galloway D.R., Read T.D., Popovic T., Fraser C.M.: Identi-fication of anthrax toxin genes in a Bacillus cereus associa-ted with an illness resembling inhalation anthrax. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 101, 8449�8454 (2004)

62. Hofte H., Whiteley H.R.: Insecticidal crystal proteins of Ba-cillus thuringiensis. Microbiol. Rev. 53, 242�255 (1989)

63. Honda T., Shiba A., Seo S., Yamamoto J., Matsuyama J.,Miwatani T.: Identity of hemolysins produced by Bacillusthuringiensis and Bacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett. 79,205�210 (1991)

64. Horwood P.F., Burgess G.W., Oakey H.J.: Evidence fora non-ribosomal peptide synthetase production of cereulide(the emetic toxin) in Bacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett.236, 319�324 (2004)

65. Hu X., Hansen B.M., Eilenberg J., Hendriksen N.B., Smidt L.,Yuan Z., Jensen G.B.: Conjugative transfer, stability and ex-pression of plasmid encoding a cry1Ac gene in Bacillus ce-reus group strains. FEMS Microbiol. Lett. 231, 45�52 (2004)

66. Jackson S.G., Goodbrand R.B., Ahmed R., Kasatiya S.: Ba-cillus cereus and Bacillus thuringiensis isolated in a gastro-enteritis outbreak investigation. Lett. Appl. Microbiol. 21,103�105 (1995)

67. Kemmerly S.A., Pankey G.A.: Oral ciprofloxacin therapy forBacillus cereus wound infection and bacteriemia. Clin. Infect.Dis. 16, 189 (1993)

68. Kim J., Foegeding P.M.: Effects of heat-treatment, CaCl2-tre-

atment and ethanol-treat-ment on activation of Bacillus spo-res. J. Appl. Bacteriol. 69, 414�420 (1996)

69. Kniehl E., Becker A., Forster D.H.: Pseudo-outbreak of toxi-genic Bacillus cereus isolated from stools of three patientswith diarrhoea after oral administration of a probiotic medi-cation. J. Hosp. Inf. 55, 33�38 (2003)

70. Konecka E., Kaznowski A., Ziemnicka J. Ziemnicki K.:Melecular and phenotypic chracterisation of Bacillus thurin-giensis isolated during epizootics in Cydia pomonella L.J. Invertebrate Pathol. 94, 56�63 (2007)

71. Kotiranta A., Haapasalo M., Kari K., Kerosuo E., Olsen I.,Sorsa T., Meurman J.H., Lounatmaa K.: Surface structure,hydrophobicity, phagocytosis, and adherence to matrix pro-teins of Bacillus cereus cells with and without the crystallinesurface protein layer. Infect. Immunol. 66, 4895�4902 (1998)

72. Kotiranta A., Lounatmaa K., Haapasalo M.: Epidemiologyand pathogenesis of Bacillus cereus infections. Microb. Inf. 2,189�198 (2000)

73. Larsen H.D., Jørgensen K.: The occurrence of Bacillus ce-reus in Danish pasteurized milk. Int. J. Food Microbiol. 34,179�186 (1997)

74. Le Scanff J., Mohammedi I., Thiebaut A., Martin O., ArgaudL., Robert D.: Necrotizing Gastritis due to Bacillus cereus inan Immunocompromised Patient. Infection, 34, 98�99 (2006)

75. Lechner S., Mayr R., Francis K.P., Pruss B.M., Kaplan T.,Wiessner-Gunkel E., Stewart G.S., Scherer S.: Bacillusweihenstephanensis sp. nov. is a new psychrotolerant spe-cies of the Bacillus cereus group. Int. J. Syst. Microbiol. 48,1373�1382 (1998)

76. Lee P.K., Buswell J.A., Shinagawa K.: Technical report:distribution of toxigenic Bacillus cereus in rice samples mar-keted in Hong Kong. World J. Microbiol. Biot. 11, 696�698(1995)

77. Lin S., Schraft H., Odumeru J.A., Griffiths M.W.: Identifica-tion of contamination sources of Bacillus cereus in pasteuri-zed milk. Int. J. Food Microbiol. 43, 159�171 (1998)

78. Lund T., Granum P.E.: Characterization of a non-haemolyticenterotoxin complex from Bacillus cereus isolated aftera food borne outbreak. FEMS Microbiol. Lett. 141, 151�156(1996)

79. Lund T., and Granum P.E.: Comparison of biological effectof the two different enterotoxin complexes isolated fromthree different strains of Bacillus cereus. Microbiology, 143,3329�3339 (1997)

80. Lund T., De Buyser M.-L., Granum P.E.: A new cytotoxinfrom Bacillus cereus that may cause necrotic enteritis. Molec.Microbiol. 38, 254�261 (2000)

81. Lund T., Granum P.E.: The 105-kDa protein component ofBacillus cereus non-haemolytic enterotoxin (Nhe) is a me-talloprotease with gelatinolytic and collagenolytic activity.FEMS Microbiol. Lett. 178, 355�361 (1999)

82. Mahler H., Pasi A., Kramer J.M., Schulte P., Scoging A.C.,Bär W., Krähenbühl S.: Fulminant liver failure in associationwith the emetic toxin of Bacillus cereus. New Eng. J. Medi-cine, 336, 1142�1148 (1997)

83. Mantinen V., Lindstron K.: A rapid PCR-based DNA test forenterotoxic Bacillus cereus. Appl. Environment. Microbiol.64, 1634�1639 (1998)

84. Manzano M., Cocolin L., Cantoni C., Comi G.: Bacillus ce-reus, Bacillus thuringiensis and Bacillus mycoides differen-tiation using a PCR-RE technique. Int. J. Food Microbiol.81, 249�254 (2003)

85. McKilip J.L.: Prevalence and expression of enterotoxins inBacillus cereus and other Bacillus spp., a literature review.Anatonie Leeuvenhoek, 77, 393�399 (2000)

86. Mendelson I., Tobery S., Scorpio A., Bozue J., Shaffer-man A., Friedlander A.M.: The NheA component of the non-hemolytic enterotoxin of Bacillus cereus is produced by Ba-cillus anthracis but is not required for virulence. Microbial.Pathol. 37, 149�154 (2004)

87. Mikami T., Horikawa T., Murakami T., Matsumoto T., Yama-tawa A., Murayama S., Katagiri S., Shinagawa K., Suzuki M.:An improved method for detecting cytostatic toxic (emetictoxin) of Bacillus cereus and its application to food samples.FEMS Microbiol. Lett. 119, 53�58 (1994)

88. Motoi N., Ishida T., Nakano I., Akiyama N., Mitani K., HiraiH., Mazaki Y., Machinami R.: Necritizing Bacillus cereusinfection of the meninges without inflammatory reaction ina patent with acute myelogenous leukemia: a case report.Acta Neuropathol. 93, 301�305 (1997)

89. Musa M.O., Douri M.A., Khan S., Shafi T., Al Humaidh A.,Al Rasheed A.: Fulminant septicaemic syndrome of Bacilluscereus: three case reports. Case Rep. 154�156 (1999)

90. Nakamura L.K.: Bacillus pseudomycoides sp.nov. Int. J. Syst.Bacteriol. 48, 1031�1035 (1998)

91. Nichols G.L., Little C.L., Mithani V., de Louvois J.: The mi-crobiological quality of cooked rice from restaurants andtake-away premises in the United Kingdom. J. Food Prot.62, 877�882 (1999)

92. Notermans S., Dufrenne J., Teunis P., Beumer R., te Giffel M.,Peeters-Weem P.: A risk assessment study of Bacillus cereuspresent in pasteurized milk. Food Microbiol. 14, 143�151(1997)


93. Ombui J.N., Schmieger H., Kaliko M.M., Arimi S.M.: Ba-cillus cereus May produce two or more diarrheal entero-toxins. FEMS Microbiol. Lett. 149, 245�248 (1997)

94. Orellano E,G., Girardini J.E., Cricco J.A., Ceccarelli E.A.,Vila A.J.: Spectroscopic characterization of bionuclear metalsite in Bacillus cereus $-lactamase II. Biochemistry 37,10173�10180 (1998)

95. Perchat S., Buisson C., Chaufaux J., Sanchis V., Lereclus D.,Gohar M.: Bacillus cereus produces several nonproteinace-ous insecticidal exotoxins. J.Invert.Path. 90, 131�133 (2005)

96. Pinna A., Sechi L.A., Zanetti S., Usai D., Delogu G., Cap-puccinelli P., Carta F.: Bacillus cereus keratitis associatedwith contact lens wear. Ophthalm. 108, 1830�1834 (2001)

97. Pirhonen T.I., Andersson M.A., Jääskeläinen E.L., Salkino-ja-Salonen M.S., Honkanen-Buzalski T., Johansson T.M.-L.:Biochemical and toxic diversity of Bacillus cereus in pastaand meat dish associated with a food poisoning case. FoodMicrobiol. 22, 87�91 (2005)

98. Prüss B.M., Dietrich R., Nibler B., Märtlbauer E., Scherer S.:The hemolytic enterotoxin HBL is broadly distributed amongspecies of Bacillus cereus group. Appl. Environment. Micro-biol. 65, 5436�5442 (1999)

99. Rajkovic A., Uyttendaele M., Deley W., Van Soom A., Rijs-selaere T., Debevere J.: Dynamics of boar semen motilityinhibition on a semi-quantitative measurement of Bacilluscereus emetic toxin (cereulide). J. Microbiol. Meth. 65,525�534 (2006)

100. Rasko D.A., Altherr M. R., Han C. S., Ravel J.: Genomicsof the Bacillus cereus group of organisms. FEMS Micro-biol. Rev. 29, 303�329 (2005)

101. Rivera A.M.G., Granum P.E., Priest F.G.: Common occur-rence of enterotoxin genes and enterotoxicity in Bacillusthuringiensis. FEMS Microbiol. Lett. 190, 151�155 (2000)

102. Rosenberg E., Brown D.R., Demain A.L.: The influence ofgramicidin S on hydrophobicity of germinating Bacillusbrevis spores. Arch. Microbiol. 142, 51�54 (1985)

103. Rosenquist H., Smidt L., Andersen S.R., Jensen G.B.,Wilcks A.: Occurrence and significance of Bacillus cereusand Bacillus thuringiensis in ready-to-eat food. FEMSMicrobiol. Lett. 250, 129�136 (2005)

104. Rusul G., Yaacob N.H.: Prevalence of Bacillus cereus inselected foods and detection of enterotoxin using TECRA-VIAand BCET-RPLA. Int. J. Food Microbiol. 25, 131�139 (1995)

105. Ryan P.A., Macmillan J.M., Zilinskas B.A.: Molecular clo-ning and characterization of the genes encoding the L

1 and

L2 components of hemolysin BL from Bacillus cereus.

J. Bacteriol. 179, 2551�2556 (1997)106. Sadkowska-Todys M., Stefanoff P., £abuñska E.: Zatrucia

i zaka¿enia pokarmowe w Polsce w 2003 r. Przegl. Epide-miol. 59, 269�279 (2005)

107. Sakurai N., Koike K.A., Rie Y., Hayashi H.: The rice culturefiltrate of Bacillus cereus isolated from emetic-type foodpoisoning causes mitochondrial swelling in HEp-2 Cell.Microbiol. Immunol. 38, 277�343 (1994).

108. Salyers A.A., Whitt D. D.: Mikrobiologia. Ró¿norodno�æ,chorobotwórczo�æ i �rodowisko. PWN, Warszawa 2003,442�445

109. Sarrías J.A., Valero M., Salmerón M.C.: Enumeration, iso-lation and characterization of Bacillus cereus strains fromSpanish raw rice. Food Microbiol. 19, 589�595 (2002)

110. Sato K., Ichiyama S., Ohmura M., Takashi M., Agata N.,Ohta M., Nakashima N.: A case of urinary tract infectioncaused by Bacillus cereus. J. Infect. 36, 247�248 (1998)

111. Schmidt K.: WHO Surveillance Programme for Control ofFoodborne Infections and Intoxications in Europe. SixthReport 1990�1992. Federal Institute for Health Protectionof Consumers and Veterinary Medicine, Berlin 1995

112. Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J.,Feitelson J., Zeigler D.R., Dean D.H.: Bacillus thuringiensisand its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev.62, 775�806 (1998)

113. Shinagawa K., Konuma H., Sekita H., Sugii S.: Emesis ofrhesus monkeys induced by intragastric administration withthe HEp-2 vacuolation factor (cereulide) produced byBacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett. 130, 87�90 (1995)

114. Sierecka J.K.: Purification and partial characterization ofa neutral protease from a virulent strain of Bacillus cereus.Int. J. Biochem. Cell Biol. 30, 579�595 (1998)

115. Steen M.K., Bruno-Murtha L.A., Chaux G., Lazzar H., Ber-nard S., Sulis C.: Bacillus cereus endocarditis: report ofa case and review. Clin. Infect. Dis. 14, 945�946 (1992)

116. Stenfors L. P., Mayr R., Scherer S., Granum P.E.: Patho-genic potential of fifty Bacillus weihenstephanensis strains.FEMS Microbiol. Lett. 215, 47�51 (2002)

117. Stenfors L.P., Granum P.E.: Psychrotolerant species from theBacillus cereus group are not necessarily Bacillus weihen-stephanensis. FEMS Microbiol. Lett. 197, 223�228 (2001)

118. Svensson B., Monthán A., Guinebretière M-H., Nguyen-The Ch., Christiansson A.: Toxin production potential andthe detection of toxin genes among strains of the Bacilluscereus group isolated along the dairy production chain. Int.Dairy J. 17, 1201�1208 (2007)

119. Taylor J.M.W., Sutherland A.D., Aidoo K.E., Logan N.A.:Heat-stable toxin production by strains of Bacillus cereus,Bacillus firmus, Bacillus megaterium, Bacillus simplex,Bacillus licheniformis. FEMS Microbiol. Lett. 242, 313�317(2005)

120. Van der Auwera G. A., Timmery S., Hoton F., Mahillon J.:Plasmid exchanges among members of the Bacillus cereusgroup in foodstuffs. Int. J. Food Microbiol. 113, 164�172(2007)

121. Veld in�t P.H., Ritmeester W.S., Delfgou-van Asch E.H.M.,Dufrenne J.B., Wernars K., Smit E., van Leusden F.M.:Detection of genes encoding for enterotoxins and determi-nation of the production of enterotoxins by HBL blood pla-tes and immunoassays of psychrotrophic strains of Bacilluscereus isolated from pasteurized milk. Int. J. Food Micro-biol. 64, 63�70 (2001)

122. Warren G.W., Koziel M.G., Mullins M.A., Nye G.J., Carr B.,Desai N.M., Kostichka K., Duck N.B., Estruch J.J.: Novelpesticidal proteins and strains. USA Patent No. WO96/10083(1996)

123. Wazny T.K., Mumman N., Styrt B.: Degranulation of hu-man neutrophils after exposure to bacterial phospholipaseC. European J. Clin. Infect. Dis. 9, 830�832 (1990)

124. WHO, Surveillance Programme for Control of FoodborneInfection and Intoxications in Europe, 8th report 1993�1998and 1999�2000 (2000)

125. Zabransky R.J.: Bacillus cereus septicemia with probableendocarditis. Clin. Microbiol. Newslett. 20, 176�178 (1998)


1. Wstêp

Kosmetyki i �rodki higieniczne pozwalaj¹ na utrzy-manie czysto�ci, przyjemnego zapachu oraz odpowied-niego wygl¹du ludzkiego cia³a. Powszechno�æ stoso-wania tych �rodków sprawia, ¿e ich jako�æ ma bardzodu¿e znaczenie dla zdrowia konsumentów. O jako�cikosmetyków decyduje w równym stopniu bezpo�red-ni efekt ich stosowania, jak i potencjalna obecno�æczynników niepo¿¹danych, g³ównie zanieczyszczeñmikrobiologicznych i chemicznych. Szczególnie nie-bezpieczne s¹ ska¿enia mikrobiologiczne, które mog¹byæ powodem wielu problemów zwi¹zanych g³ówniez ich negatywnym wp³ywem na zdrowie ludzi.

Generalnie, produkty kosmetyczne mo¿na podzie-liæ na kilka grup. Pierwsz¹ stanowi¹ codzienne �rodkihigieniczne, jak: myd³a, szampony, ¿ele do k¹pieli,

pasty do zêbów czy p³yny do p³ukania jamy ustnej.Mimo, ¿e zazwyczaj nie s¹ one produkowane w ste-rylnych warunkach, z uwagi na wysok¹ zawarto�æ�rodków aktywnych wystêpuj¹ce w nich mikroorga-nizmy maj¹ niewielk¹ szansê na namna¿anie siê orazsyntezê toksycznych metabolitów. W sk³ad drugiejgrupy wchodz¹ produkty dzia³aj¹ce ³agodz¹co, nawil-¿aj¹co, nadaj¹ce elastyczno�æ oraz regeneruj¹ce po-wierzchniê skóry i b³on �luzowych, jak balsamy i kre-my do cia³a oraz oliwki dla dzieci i niemowl¹t. �rodkite zawieraj¹ substancje od¿ywcze, co w po³¹czeniuz beztlenowymi warunkami sprzyjaæ mo¿e prolifera-cji potencjalnie niebezpiecznych beztlenowców. Trze-cia grupa to szeroko rozumiane kosmetyki kolorowestosowane w celu poprawy estetyki oraz ukryciu nie-wielkich defektów skórnych. Zaliczyæ tu mo¿emy pro-dukty o ogromnej ró¿norodno�ci, takie jak: tusze do

SKA¯ENIA MIKROBIOLOGICZNESUROWCÓW I PRODUKTÓW KOSMETYCZNYCH

Katarzyna Beata Obrêbska1, Agnieszka Szczyg³a1, Marzena Matejczyk1,2

1 Zak³ad Nauk Biologicznych, Wy¿sza Szko³a Kosmetologii i Ochrony Zdrowiaul. Krakowska 9, 15-875 Bia³ystok, [email protected]

2 Zak³ad Biologii Sanitarnej i Biotechnologii, Wydzia³ Budownictwa i In¿ynierii �rodowiskaPolitechnika Bia³ostocka, ul. Wiejska 45 A, 15-351 Bia³ystok

Wp³ynê³o w pa¿dzierniku 2007 r.

1. Wstêp. 2. Ska¿enia mikrobiologiczne zwi¹zane z produkcj¹ kosmetyków. 3. Ska¿enia mikrobiologiczne zwi¹zane z u¿ywaniemkosmetyków. 4. Konsekwencje ska¿enia mikrobiologicznego produktów kosmetycznych. 5. Priorytety w produkcji kosmetykóworaz normy mikrobiologiczne

Microbiological contamination of raw materials and cosmetic products

Abstract: Cosmetics and hygienical products are used world-wide to improve human hygiene, skin condition and body appearance.Their quality is influenced by their chemical composition, active components and the presence of bacteria, protozoa and fungi.To avoid microbiological contamination, strict norms and procedures have been elaborated including Good Manual Practise (GMP)and Hazard Analysis Critical Control Points (HACCP). In spite of them, contamination takes place both, during production and theuse of cosmetic products. Bacteria and fungi in cosmetics come from raw materials like water, milk, essential oils and plant tissues ororiginate from biofilms formed in production lines as re-contamination. The most frequently found microbes are enterobacteria,staphylococci, Pseudomonas aeruginosa, and sporeforms of Clostridium spp. and Bacillus spp. These contaminants in high number,noted in mascara, eye-shadows, shampoos or body lotions, could be the reason of corneal ulcer, toxic syndromes and skin infections.Moreover, proliferation of microbes leads to spoilage problems and to the shortening of the �best before� period. The best wayto avoid most of the problems connected with microbiological contamination is proper selection of good-quality raw materials,efficient disinfection and biofilm elimination as well as and applying the GMP procedures and HACCP rules in the factories.Education of consumers and proper storage and use of cosmetic and hygienical products are also very important.

1. Introduction. 2. Microbiological contamination during the production of cosmetics. 3. Microbiological contamination connectedwith the use of cosmetics products. 4. Microbiological consequences of microbial contamination in cosmetic products. 5. Prioritiesof cosmetics production in relation to microbiological norms

S³owa kluczowe: mikrobiologia kosmetyków, ska¿enia mikrobiologiczneKey words: cosmetics microbiology, microbiological contamination

P U B L I K A C J E M E T O D Y C Z N E I S T A N D A R D Y

66 KATARZYNA BEATA OBRÊBSKA, AGNIESZKA SZCZYG£A, MARZENA MATEJCZYK

rzês, pomadki do ust, podk³ady, cienie do powiek,korektory, pudry itp. Ich charakter chemiczny, konsy-stencja i czêsto nik³a zawarto�æ wody sprawia, ¿e s¹nieodpowiednim medium do rozwoju bakterii i grzy-bów. Niemniej mo¿na oczekiwaæ wystêpowania w nichprzetrwalników tlenowych laseczek z rodzaju Bacil-lus oraz zarodników grzybów. Z uwagi na ogromn¹ró¿norodno�æ warunków produkcji i stosowania ko-smetyków oraz �rodków higienicznych, ich producen-ci napotykaj¹ na liczne problemy dotycz¹ce zapewnie-nia odpowiedniej jako�ci tych wyrobów. W ostatnimdziesiêcioleciu obserwuje siê wzrost �rodków finan-sowych przeznaczonych na badania naukowe w tymzakresie, bowiem presja ze strony konsumentów orazcoraz ostrzejszych wymogów prawnych zmusza wy-twórców do nieustannego doskonalenia procesu pro-dukcji i podnoszenia jako�ci wyrobów.

Ska¿enie mikrobiologiczne, wynikaj¹ce z obecno�-ci mikroorganizmów w surowcach oraz urz¹dzeniachprodukcyjnych, a tak¿e z kontaktu gotowego ju¿ pro-duktu z drobnoustrojami mo¿e prowadziæ do powa¿-nych i niebezpiecznych dla zdrowia cz³owieka konse-kwencji. Nadmierna proliferacja komórek bakteryjnychmo¿e skutkowaæ obni¿eniem jako�ci produktu, coprzejawia siê np. zmianami konsystencji, barwy czynieprzyjemnym zapachem [25]. Dodatkowo, metabo-lity bakteryjne oraz przetworzone substancje aktywnew kosmetykach oddzia³ywuj¹c na wra¿liw¹ skórê pro-wadz¹ czêsto do reakcji alergicznych b¹d� lokalnychstanów zapalnych. Wreszcie kontakt potencjalnie cho-robotwórczych bakterii ze skór¹ czy b³onami �luzo-wymi mo¿e skutkowaæ rozwojem typowych stanówchorobowych [3, 4]. Znane s¹ przypadki powa¿nychpowik³añ zdrowotnych zwi¹zanych z zastosowaniemkosmetyków ska¿onych bakteriologicznie. Najbardziejdrastycznymi przyk³adami s¹: uszkodzenie wzrokubêd¹ce konsekwencj¹ zastosowania tuszu do rzês za-wieraj¹cego Pseudomonas sp., owrzodzenie rogówkipo dotkniêciu powierzchni oka szczoteczk¹ do rozpro-wadzania tuszu, miejscowe zapalenie skóry wywo³aneprzez Klebsiella pneumoniae obecne w kremie do r¹k.Konieczno�æ zabezpieczenia siê przed podobnymizagro¿eniami doprowadzi³a do ustalenia norm postê-powania w czasie produkcji kosmetyków. Zaleconou¿ywanie bezpiecznych dla konsumenta �rodków kon-serwuj¹cych oraz odpowiednich opakowañ utrudnia-j¹cych dostêp mikroorganizmów do kosmetyków [26].Jednocze�nie okre�lono szereg czynników sprzyjaj¹-cych przedostawaniu siê mikroorganizmów do kosme-tyków w czasie ich produkcji. Obecnie w przemy�lekosmetycznym obowi¹zuj¹ zasady dobrej praktykiwytwórczej, w skrócie � GMP (ang. � Good Manufac-turing Practice). Aktualne wytyczne GMP zawartew dyrektywie UE 2003/15/CE maj¹ sprawiæ, ¿e pro-dukty kosmetyczne odpowiedniej jako�ci s¹ wytwa-

rzane i testowane zgodnie z normami wspólnymi dlawszystkich krajów Unii Europejskiej [6]. Polska rów-nie¿ posiada krajowe normy standaryzuj¹ce jako�æ wy-twarzanych kosmetyków i �rodków higienicznych. S¹one okre�lone dla poszczególnych grup produktów, np.:myd³a, szampony i odp³atnie dostêpne w Internecie[http://pin.atr.bydgoszcz.pl/index.aspx?plik=i_kata-log_seg]. Dziêki odpowiedniemu pozyskiwaniu i dobo-rowi surowców, ich przetwarzaniu oraz przechowy-waniu, gotowe kosmetyki powinny byæ wolne m.in.od drobnoustrojów takich jak: Staphylococcus aureus,Streptococcus pyogenes, Enterococcus sp., Clostridiumperfringens, C. tetani, Pseudomonas aeruginosa, przed-stawicieli rodziny Enterobacteriaceae oraz grzybówz rodzaju Candida, Aspergillus czy Trichophyton [16].

Aktualne zalecenia nakazuj¹, aby wszelkie normyzwi¹zane z produkcj¹, pakowaniem, dystrybucj¹ i hand-lem kosmetykami w ca³ej UE by³y identyczne. Kon-sumentom za� nale¿y u�wiadamiaæ, ¿e poprzez swojeniektóre dzia³ania mog¹ mieæ niekorzystny wp³yw najako�æ zakupionego produktu.

2. Ska¿enia mikrobiologiczne zwi¹zanez produkcj¹ kosmetyków

Ka¿dy etap wytwarzania produktów, pocz¹wszy odpozyskiwania surowców, przez ich przetwarzanie,pakowanie i dystrybucjê obarczony jest potencjalnymryzykiem kontaminacji mikrobiologicznej. Ró¿norod-ne substancje, w zale¿no�ci od ich sk³adu chemicznegooraz zasobno�ci w wodê stwarzaj¹ odmienne warunkido wzrostu drobnoustrojów. Zazwyczaj bezwodne,syntetyczne substancje chemiczne (sztuczne oleje,woski i t³uszcze oraz zwi¹zki powierzchniowo czynne)s¹ wolne od zanieczyszczeñ, b¹d� zawieraj¹ tylko nie-liczne mikroorganizmy, które z uwagi na warunki nies¹ w stanie rozmna¿aæ siê. Takie surowce mog¹ byæbezpiecznie przechowywane przez stosunkowo d³ugiokres w fabrykach bez obaw zwi¹zanych z pogorsze-niem ich jako�ci. Jednak ich przetwarzanie, wzboga-canie w sk³adniki pochodzenia naturalnego i wodê po-woduje, ¿e sytuacja zmienia siê gwa³townie. Sk³adnikipochodzenia naturalnego czêsto zawieraj¹ ró¿norod-ne mikroorganizmy, zazwyczaj charakterystyczne dla�róde³ pozyskiwanych materia³ów. Efektem tego jestzró¿nicowana jako�æ mikrobiologiczna kosmetykóww zale¿no�ci od mikroflory surowców naturalnych.

Do najczê�ciej stosowanych w produktach kosme-tycznych i higienicznych sk³adników nale¿y woda.Mo¿e ona m.in. zawieraæ potencjalnie niebezpiecznepa³eczki z rodziny Enterobacteriaceae. Istniej¹ wytycz-ne okre�laj¹ce jako�æ wody. Przyk³adowo, wed³ug dy-rektywy Unii Europejskiej nr 98/83/EC [14] w wodziekonsumpcyjnej nie mog¹ wystêpowaæ takie patogeny,

67SKA¯ENIA MIKROBIOLOGICZNE SUROWCÓW I PRODUKTÓW KOSMETYCZNYCH

jak Enterococcus sp., E. coli czy C. perfringens zarów-no w formie wegetatywnej jak i przetrwalnikowej [35].Woda technologiczna, stosowana do procesów produk-cyjnych czy te¿ czyszczenia instalacji niejednokrotniezawiera liczne bakterie i zarodniki grzybów. W ostat-nich latach pojawi³y siê doniesienia wskazuj¹ce nawystêpowanie w wodzie spo¿ywczej niebezpiecznychorganizmów jak pierwotniaki: Cryptosporidium par-vum, Giardia sp., oraz bakterie: Aeromonas sp., Helico-bacter pylori, Legionella pneumophila, Pseudomonasaeruginosa i Mycobacterium sp. [20, 31, 33, 38].Zgodnie z nowoczesnymi trendami w kosmetologii,coraz wiêkszego znaczenia nabiera woda pochodz¹caze specyficznych miejsc, na przyk³ad bagien, lodow-ców czy gor¹cych �róde³. Mo¿e ona zawieraæ licznesk³adniki od¿ywcze oraz regulatory wzrostu [15]. Jejzastosowanie niesie ze sob¹ ryzyko wprowadzeniabakterii o unikalnych w³a�ciwo�ciach, jak skrajnaciep³ooporno�æ czy zdolno�æ do proliferacji na bardzoubogich mediach [22].

W produkcji kosmetyków czêsto wykorzystywanes¹ surowce ro�linne i zwierzêce. Do produkcji peelin-gów stosuje siê rozdrobnione ³upiny kokosów czyorzecha w³oskiego, kryszta³y cukru i soli. Jako sub-stancje ³agodz¹ce, zapachowe, nawil¿aj¹ce i regene-ruj¹ce w p³ynach do k¹pieli, ¿elach pod prysznic czyszamponach do w³osów zastosowanie znajduj¹ sokilub wyci¹gi ro�linne (na przyk³ad rumianek, sza³wia,pokrzywa, nagietek) oraz mleko. ¯adna z tych sub-stancji nie jest wolna od bakterii. Szczególnie ³atwomo¿emy spotkaæ przedstawicieli tlenowych sporulu-j¹cych laseczek z rodzaju Bacillus. Udowodniono, ¿ew mleku powszechnie wystêpuje Bacillus cereus sensulato, grupa sze�ciu szeroko rozpowszechnionychw przyrodzie gatunków, które mog¹ m.in. wywo³ywaæu ludzi zatrucia pokarmowe oraz okazjonalnie owrzo-dzenia skóry, zaka¿enia ran, zapalenia przyzêbia [2,11, 30]. Zagro¿enie staje siê tym bardziej realne, ¿ewszystkie laseczki s¹, dziêki wytwarzaniu endospor,bardzo oporne na wysok¹ temperaturê. Bacillus spo-rothermodurans wytrzymuje ogrzewanie w tempera-turze 100°C przez 30 minut [28]. Wiele szczepów Ba-cillus sp. zachowuje tak¿e zdolno�æ do namna¿ania wtemperaturach ni¿szych ni¿ 10°C wytwarzaj¹c w tychwarunkach liczne enzymy powoduj¹ce rozk³ad sub-stancji organicznych, na przyk³ad lecytynazy i inne.Równie¿ wystêpowanie Gram-ujemnych bakterii psy-chrotroficznych, takich jak: pa³eczki jelitowe, przedsta-wiciele rodzaju Pseudomonas czy Aeromonas stanowipotencjalne niebezpieczeñstwo. Mog¹ one prowadziædo problemów w przechowywaniu i wykorzystywaniuposzczególnych sk³adników [12].

Ogromny wp³yw na jako�æ substancji wykorzysty-wanych w produkcji �rodków kosmetycznych i higie-nicznych maj¹ warunki i sposób ich pozyskiwania. Nie-

w³a�ciwe zbieranie surowców, ich suszenie, t³oczeniesoku komórkowego czy przygotowywanie ekstraktówmog¹ prowadziæ do nadmiernego nagromadzenia mi-kroorganizmów. Fragmenty ro�linne mog¹ ulegaæ ple�-nieniu podczas przechowywania. Staj¹ siê pó�niej �ród-³em zarodników grzybów ple�niowych, zawieraj¹ ró¿netoksyny. Jest to przedmiotem kolejnego istotnego prob-lemu zwi¹zanego z ochron¹ mikrobiologiczn¹ kosme-tyków, a mianowicie wykrywaniem i eliminacj¹ �róde³kontaminacji w samym zak³adzie przemys³owym.

Zgodnie z raportem Agencji Ochrony �rodowis-ka Stanów Zjednoczonych (2002) sama instalacja dooczyszczania wody, gdzie swobodnie namna¿aj¹ siêzasiedlaj¹ce j¹ bakterie, mo¿e byæ �ród³em ska¿eniawody. Równie¿ inne urz¹dzenia, szczególnie rury,zbiorniki, filtry i odstojniki tworz¹ dobre warunki doformowania biofilmów przez niektóre bakterie. Dziêkispecyficznej budowie �cian i otoczek komórkowych,liczne gatunki Bacillus sp. ³atwo przylegaj¹ do stalo-wych i szklanych powierzchni pokrywaj¹c je cienk¹,trudn¹ do usuniêcia b³on¹ [8, 23, 24]. Tak¿e wszelkiepunkty bezodp³ywowe, gdzie dochodzi do gromadze-nia siê ró¿nych substancji stanowi¹ doskona³e miejscedo namna¿ania siê drobnoustrojów i formowania przeznie b³on biologicznych. Przyk³adem tego mo¿e byæprodukcja ¿ywno�ci, gdzie wykazano, ¿e pasteryzators³u¿¹cy do obróbki cieplnej p³ynów oraz urz¹dzeniado nape³niania by³y �ród³em ska¿enia mikrobiologicz-nego [7, 30]. Dlatego te¿ odpowiednie procedury de-zynfekcji, w³a�ciwa konstrukcja urz¹dzeñ produkcyj-nych oraz stosowanie zasad dobrej praktyki wytwórczejjest niezwykle wa¿ne dla dobrej jako�ci produktu koñ-cowego. Brak elementów, w których dochodzi³oby doakumulacji materii, instalowanie odp³ywów pozwalaj¹-cych usun¹æ pozosta³e resztki cieczy, elementy ³atwew demonta¿u i czyszczeniu pozwalaj¹ minimalizowaæopisane ryzyko. Producenci winni zwróciæ szczególn¹uwagê na przestrzeganie zasad higieny nie tylko w za-k³adach produkuj¹cych ostateczny produkt, a równie¿przy obróbce poszczególnych komponentów oraz przypakowaniu produktów kosmetycznych. Nale¿y do³o-¿yæ wszelkich starañ, aby zminimalizowaæ mo¿liwo�æzanieczyszczenia koñcowego produktu mikroorganiz-mami. Mo¿e to zagroziæ zdrowiu konsumenta, a tak¿eznacznie obni¿yæ jako�æ i trwa³o�æ kosmetyku.

3. Ska¿enia mikrobiologiczne zwi¹zanez u¿ywaniem kosmetyków

W momencie otwarcia opakowania produkty ko-smetyczne nara¿one s¹ na nowe �ród³a potencjalniepatogennych mikroorganizmów, które dla uproszcze-nia i lepszego zrozumienia nazywamy �rodowiskiemkonsumenckim. Pojêcie to okre�la bardzo ró¿norodne


warunki, w jakich kosmetyki i �rodki higieniczne s¹powszechnie u¿ytkowane. Aby w pe³ni u�wiadomiæzagro¿enie, nale¿y przeanalizowaæ warunkami domo-wego przechowywania i stosowania kosmetyków.

Liczne �rodki do pielêgnacji cia³a przetrzymywanes¹ w ³azience. Panuj¹ce tam warunki, z uwagi na wil-goæ i wysok¹ temperaturê stwarzaj¹ dogodne warunkido rozwoju bakterii i grzybów ple�niowych. Mog¹one z kolei ³atwo penetrowaæ do produktów kosme-tycznych, szczególnie tych, których opakowanie nieogranicza ca³kowicie kontaktu produktu ze �rodo-wiskiem zewnêtrznym. Taka sytuacja stawia przedproducentami liczne wyzwania i zmusza do stosowa-nia szeregu konserwantów, �rodków grzybo- i bak-teriobójczych ograniczaj¹cych wzrost niepo¿¹danychdrobnoustrojów [21].

�rodki do pielêgnacji cia³a stosujemy równie¿ w in-nych miejscach. W czasie wakacji nieod³¹cznym atry-butem pla¿owicza jest olejek, krem b¹d� emulsja doopalania, zazwyczaj z filtrem promieni UV. To kolejnyprzyk³ad sytuacji, w której czêsto dochodzi do konta-minacji ró¿nych kosmetyków. Bardzo ³atwo do nasze-go produktu dostaj¹ siê wtedy mikroskopijne ilo�cipiasku i kurzu unosz¹cego siê w powietrzu. Wykazano,¿e w czasie dwutygodniowych wakacji emulsja do opa-lania, pomimo stosowania zgodnie z zaleceniami produ-centa, ulega znacznemu ska¿eniu mikrobiologicznemu.Kolejne badania, wykonane po rocznym przechowywa-niu i ponownym stosowaniu w okresie urlopu wykaza-³y, ¿e ilo�æ drobnoustrojów w takim produkcie zbli¿a³asiê do poziomu 1000 cfu/g produktu, co mo¿e skutko-waæ niebezpiecznymi dla zdrowia konsekwencjami [26].

Czynnikiem, który dodatkowo sprzyja ska¿eniu ko-smetyków jest flora fizjologiczna skóry konsumentów,szczególnie d³oni. D¹¿y siê wiêc do maksymalnegoograniczenia kontaktu r¹k z kosmetykiem w opako-waniu. Wygodnym i skutecznym sposobem jest stoso-wanie opakowañ posiadaj¹cych odpowiedni¹ pompkêlub dozownik, jaki znamy na przyk³ad z myde³ w p³y-nie oraz niektórych markowych kremów i balsamów.Skóra ma wówczas kontakt wy³¹cznie z pobieran¹porcj¹ kosmetyku, nie ma natomiast mo¿liwo�ci ska-¿enia pozosta³ej czê�ci produktu [5]. Inn¹ wa¿n¹ spra-w¹, na któr¹ nale¿y zwróciæ uwagê, jest wielko�æ opa-kowania. Im wiêksza porcja specyfiku, tym d³u¿szyczas jego stosowania, a tym samym okres, w którymmikroorganizmy mog¹ siê w nim namna¿aæ [26]. Tak¿estosowanie tego samego opakowania produktu kosme-tycznego przez kilka osób jednocze�nie mo¿e negatyw-nie wp³ywaæ na jego jako�æ. Wi¹¿e siê to z ogromn¹ró¿norodno�ci¹ flory fizjologicznej ludzi oraz natural-nych populacji drobnoustrojów, nawet blisko ze sob¹spokrewnionych.

Bior¹c pod uwagê wy¿ej analizowane uwarunko-wania uwa¿a siê, ¿e najbardziej nara¿one na ska¿enie

zwi¹zane ze stosowaniem s¹ kosmetyki zawieraj¹cewodne emulsje olejów, bogate w t³uszcze, witaminyi sole mineralne, w du¿ych opakowaniach i stosowanerównocze�nie przez kilka osób. Niestety, w�ród kon-sumentów panuje niska �wiadomo�æ tego zagadnienia.Producenci kosmetyków powinni skupiæ wiêksz¹ uwa-gê na propagowanie w�ród klientów zasad w³a�ciwegostosowania i przechowywania kosmetyków. Wszyscypowinni�my mieæ �wiadomo�æ, ¿e niew³a�ciwie prze-chowywane i u¿ywane kosmetyki, podobnie jak arty-ku³y spo¿ywcze, ulegaj¹ zepsuciu i mog¹ byæ przy-czyn¹ ró¿nych chorób. Z uwagi na powy¿sze zjawiskaUnia Europejska w marcu 2005 roku wyda³a odpo-wiednie przepisy dotycz¹ce miêdzy innymi okresu, jakimo¿e min¹æ od chwili otwarcia danego produktu doup³ywu terminu jego przydatno�ci do u¿ycia [6, 25].

4. Konsekwencje ska¿enia mikrobiologicznegoproduktów kosmetycznych

Wystêpowanie drobnoustrojów w produktach kos-metycznych jest rzecz¹ powszechn¹. Chocia¿ przyjmu-je siê, ¿e kosmetyki nie musz¹ byæ sterylne, to jednakobecno�æ bakterii i grzybów jest w nich niewskazana,szczególnie mikroflory potencjalnie chorobotwórczej.Pierwszym efektem namna¿ania siê bakterii i wzrostuich aktywno�ci metabolicznej jest zmiana w³a�ciwo�ciska¿onego produktu. Mo¿e ona przejawiaæ siê w zmia-nach konsystencji, zapachu, struktury, koloru i sk³a-du chemicznego [25]. Egzokomórkowe wydzielanielipaz, proteaz czy lecytynaz, spotykane miêdzy innymiw przypadku B. cereus powoduje rozk³ad sk³adnikówod¿ywczych dodawanych do kremów, balsamów orazod¿ywek. Jak wykazali B e h r a v a n i wsp. [47] dogatunków licznie zasiedlaj¹cych kosmetyki nale¿¹,oprócz Bacillus sp. tak¿e inne Gram-dodatnie bakterie.Najwiêksze zagro¿enie stwarza S. aureus. Gatunekten, nale¿¹cy do naturalnej flory bakteryjnej skóryi b³on �luzowych cz³owieka, spotykany jest czêstow balsamach i kremach do cia³a [29]. Z uwagi na zró¿-nicowan¹ patogenezê zwi¹zan¹ z wydzielaniem tok-syn o charakterze superantygenów oraz szeregu enzy-mów mo¿e stanowiæ powa¿ne zagro¿enie zdrowotne.Potencjalne niebezpieczeñstwo wi¹¿e siê przedewszystkim z wnikaniem bakterii do uszkodzonej mi-krourazami skóry lub na powierzchniê oka, na przy-k³ad przy aplikacji tuszu do rzês. Zaka¿enie S. aureusmo¿e doprowadziæ do przypadków zespo³u wstrz¹sutoksycznego (ang. TSS � toxic shock syndrome) lubzespo³u oparzonej skóry noworodków (ang. staphylo-coccal skalded skin syndrome � dermatitis exfoliativaneonatorum Ritter) zwi¹zanych ze stosowaniem ska-¿onego gronkowcem z³ocistym kremu do cia³a. Cho-roba objawia siê rozleg³ymi pêcherzami, intensywnym


z³uszczaniem siê naskórka i ods³anianiem skóry w³a�-ciwej na du¿ych przestrzeniach (tzw. zespó³ Rittera)lub powstawaniem mniej rozleg³ych zmian pod posta-ci¹ liszajca pêcherzykowego czy wysypki rumienio-wej [1]. Obecno�æ innych gronkowców: Staphylo-coccus warneri, S. epidermidis opisano w myd³ach,szamponach i p³ynach do k¹pieli [6]. WystêpowanieS. epidermidis w kosmetykach i �rodkach higienicz-nych mo¿e byæ zwi¹zane z wtórnym zanieczyszcze-niem produktu w zak³adzie wytwórczym. Bakterie teposiadaj¹ du¿¹ zdolno�æ tworzenia biofilmu, trudnegodo usuniêcia w trakcie produkcji [10].

Dzieci oraz osoby z obni¿on¹ odporno�ci¹ s¹szczególnie podatne na skutki uboczne zwi¹zane zeska¿eniem kosmetyków i produktów kosmetycznych.Wyj¹tkowo drastyczny przypadek �mierci czworgadzieci wskutek infekcji bêd¹cej efektem stosowaniatalku dla niemowl¹t zawieraj¹cego endospory beztle-nowych bakterii Clostridium tetani opisa³ w 1946 rokuT r e m e w a n [32]. Równie¿ dzieci by³y ofiarami po-wa¿nej infekcji P. aeruginosa na oddziale noworod-kowym. Dochodzenie epidemiologiczne wykaza³o, ¿e�ród³em zaka¿enia by³ zanieczyszczony bakteriamikrem do r¹k stosowany przez personel oddzia³u [3].P. aeruginosa, niekiedy ³¹cznie z K. pneumoniae izo-lowany jest czêsto z kosmetyków kolorowych, takichjak tusze do rzês czy cienie do powiek [9, 17, 27].Czêsto P. aeruginosa s¹ odpowiedzialne za gro�neinfekcje oka, jak owrzodzenie rogówki i g³êbokiezaka¿enie rogówki [27, 37]. Wystêpowanie innegogatunku z tego rodzaju, Pseudomonas putida wykrytow �rodkach stosowanych do k¹pieli [6]. Dok³adnebadania testerów cieni do powiek ró¿nych marek wy-kaza³y obecno�æ Micrococcus sp., Corynebacteriumsp., Actinetobacter oraz Moraxella sp., Neisseria sp.oraz gronkowców [9]. Szampon do w³osów mo¿e byænatomiast �ród³em chorobotwórczych bakterii Serra-tia marcescens, Citrobacter freundii, Enterobacter sp.czy Klebsiella sp. [5]. Powy¿sze przyk³ady obecno�ciw kosmetykach bakterii Gram-ujemnych, uwa¿anychza rzadziej wywo³uj¹ce infekcje skórne powinny bu-dziæ uzasadniony niepokój [29, 36]. ObserwacjeB e h r a v a n a i wsp. z 2000 r., wskazuj¹, ¿e wpraw-dzie znaczna czê�æ fabrycznie nowych, nieotwieranychkosmetyków zawiera E. coli oraz P. aeruginosa, towraz z u¿ywaniem tych produktów odsetek ska¿onychopakowañ, podobnie jak i ilo�æ bakterii na jednostkêmasy produktu drastycznie wzrasta. Niezwykle wa¿nyjest wiêc rodzaj opakowania. Dowiedziono, ¿e pro-dukty w opakowaniach z dozownikami, które wyklu-czaj¹ kontakt substancji ze �rodowiskiem zewnêtrz-nym s¹ znacznie bezpieczniejsze i mniej podatne naska¿enia w trakcie stosowania [5].

Grzyby do�æ powszechnie wystêpuj¹ w ca³ej gamieopisywanych produktów kosmetycznych. Wystêpowa-

nie Candida albicans, Aspergillus niger, Aspergillusfunigatus oraz Penicillum sp. stwierdzono w kremie dor¹k [18, 21] natomiast w cieniach do powiek obecno�ædro¿d¿y [9]. Grzyby, szczególnie ple�niowe, generalnieodpowiadaj¹ za obni¿anie jako�ci produktów, w wyj¹t-kowych przypadkach mog¹ stawaæ siê przyczyn¹ scho-rzeñ. U pacjenta poddanego immunosupresji opisanoprzypadek grzybicy skórnej wywo³anej przez Paecilo-myces lilacinus pochodz¹cy z balsamu do cia³a [19].

Powy¿sze przyk³ady niebezpieczeñstw zwi¹zanychz obecno�ci¹ drobnoustrojów w �rodkach pielêgnacyj-nych i upiêkszaj¹cych podkre�laj¹ celowo�æ odpo-wiedniego kszta³towania �wiadomo�ci konsumentóworaz sta³e dbanie o jako�æ wytwarzanych produktów.W³a�ciwe przechowywanie i stosowanie powinno wte-dy uchroniæ nas zarówno przed zepsuciem siê kosme-tyków jak i przykrymi konsekwencjami u¿ycia pro-duktów ska¿onych.

5. Priorytety w produkcji kosmetykóworaz normy mikrobiologiczne

W produkcji kosmetyków do zadañ priorytetowych,oprócz zapewnienia odpowiedniego dzia³ania produk-tu, nale¿y dba³o�æ o czysto�æ chemiczn¹ i mikrobiolo-giczn¹. Aby u³atwiæ wytwórcom osi¹gniêcie w³a�ci-wej jako�ci, opracowano system kontroli krytycznychpunktów produkcji oznaczany skrótem HACCP (ang.Hazard Analysis Critical Control Points). Procedurata, obowi¹zuj¹ca miêdzy innymi w przemy�le spo¿yw-czym, farmaceutycznym i kosmetycznym sk³ada siêz siedmiu podstawowych zasad, których przestrzeganieminimalizuje ryzyko wyprodukowania i wprowadzeniado obiegu wadliwego lub zanieczyszczonego �rodka.Kluczowym warunkiem wdro¿enia tego systemu jestprzeprowadzenie analizy wszystkich potencjalnych za-gro¿eñ dla ca³ego szlaku produkcji i dystrybucji orazokre�lenie krytycznych punktów kontroli, czyli miejsc,w których nale¿y podj¹æ szczególne �rodki ostro¿no�ciz uwagi na najwy¿sze ryzyko ska¿enia surowców lubgotowego produktu. Nastêpnie opracowuje siê odpo-wiednie normy i z³o¿ony system kontroli jako�ciuwzglêdniaj¹cy CCP, a tak¿e okre�la postêpowaniew przypadku stwierdzenia przekroczenia dopuszczal-nych zakresów ska¿enia w poszczególnych punktachkontroli. Aby system dzia³a³ poprawnie, koniecznajest równie¿ odpowiednia metodyka weryfikuj¹ca jegofunkcjonowanie.

W USA stosowne normy, dotycz¹ce w szczegól-no�ci gatunków wska�nikowych, przede wszystkimE. coli, P. aeruginosa, Salmonella sp. i S. aureus, s¹zawarte w odpowiedniku naszej Farmakopei � UnitedStates Pharmacopeia [34]. W Wielkiej Brytanii The Co-smetics, Toiletery & Perfumery Association okre�li³o


maksymalne dopuszczalne ilo�ci bakterii w produk-tach kosmetycznych przeznaczonych do stosowaniana skórze wra¿liwej (skóra dzieci, okolice oczu) napoziomie 100 cfu/g produktu, podczas gdy w pozosta-³ych kosmetykach poziom ska¿enia mikrobiologicz-nego nie mo¿e przekraczaæ 1000 cfu/g produktu [26].Europejska Farmakopea zawiera szczegó³owe wytycz-ne, dotycz¹ce g³ównie rodziny Enterobacteriaceae[13]. Odpowiednie przepisy, zawarte w dyrektywieUE 2003/15/CE wyda³a te¿ Unia Europejska. Ich skut-kiem jest, miêdzy innymi okre�lenie wska�nika PAO(ang. Period After Opening) czyli czasu od otwarciakosmetyku do momentu, kiedy jego ska¿enie mikro-biologiczne osi¹gnie poziom stwarzaj¹cy zagro¿eniedla konsumentów. Okres ten wyra¿any jest w miesi¹-cach (�M�) i umieszczany na opakowaniu. Je�li wiêcokres PAO dla danego produktu wynosi 1 rok to naopakowaniu bêdzie widnieæ napis 12 M. [25].

Wszystkie powy¿sze zalecenia, podobnie jak wy-tyczne Dobrej Praktyki Produkcyjnej (ang. Good Ma-nufacture Practice � GMP) oraz Dobrej Praktyki Higie-nicznej (ang. Good Higiene Practice � GHP) maj¹na celu niedopuszczenie do obrotu towarów, którychjako�æ stwarza³aby realne zagro¿enie dla konsumen-tów. Jednak pomimo wprowadzenia licznych �rod-ków zapobiegawczych czy stosowania konserwantóworaz �rodków bakterio- i grzybobójczych nie mamy,jako konsumenci pe³nej gwarancji, ¿e kosmetyki,które nabywamy s¹ pod wzglêdem mikrobiologicznymzupe³nie bezpieczne. �wiadomo�æ klientów w tymzakresie odgrywa niebagateln¹ rolê, gdy¿ nawet naj-lepsze normy i zasady produkcji nie chroni¹ przedskutkami rekontaminacji produktów w trakcie ichstosowania. Tak wiêc, z uwagi na potencjalne zagro-¿enia zwi¹zane z wykorzystywaniem ska¿onych pro-duktów zarówno wytwórcy jak i u¿ytkownicy musz¹zachowaæ czujno�æ i rozs¹dek. Takie postêpowaniesprawi, ¿e kosmetyki bêd¹ zawsze kojarzyæ siê tylkoz pozytywnymi odczuciami.

Pi�miennictwo

1. Aly R.: Staphylococcal infections (w:) Atlas of Infections ofthe Skin, red. R. Aly, H.I. Maybach, Churchill Livingstone,New York, 1999, s. 115�122

2. Bartoszewicz M., �wiêcicka I., Buczek J.: Cereulidyna i en-terotoksyny Bacillus cereus sensu lato. Med. Wet. 62, 28�31(2006)

3. Becks V., Lorenzoni N.: Pseudomonas aeruginosa outbreakin a neonatal intensive care unit: a possible link to contami-nate hand lotion. Am. J. Inf. Contr. 23, 396�398 (1995)

4. Behravan, J., Bazzaz F., Malaekeh P.: Survey of bacterio-logical contamination of cosmetic creams in Iran. Int. J. Der-matol. 44, 482�485 (2005)

5. Brannan D., Dille J.: Type of closure prevents microbial conta-mination of cosmetics during consumer use. Appl. Environ.Microbiol. 56, 1476�1479 (1990)

6. Campana R., Scesa C., Patrone V., Vittoria E., Baffone W.:Microbiological study of cosmetic products during their useby consumers: health risk and efficacy of preservative sys-tems. Lett. Appl. Microbiol. 43, 301�306 (2006)

7. Christiansson A., Bertilsson J., Svensson B.: Bacillus cereusspores in raw milk: factors affecting the contamination of milkduring the grazing period. J. Dairy Sci. 82, 305�314 (1999)

8. Davey M.E., O�Toole G.A.: Microbial biofilms: from ecologyto molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847�867(2000)

9. Dawson N.L., Reinhardt D.J.: Microbial flora of in-use, dis-play eye shadow testers and bacterial challenges of unusedeye shadows. Appl. Environ. Microbiol. 42, 297�302 (1981)

10. Deighton M.A., Borland R., Capstick J.A.: Virulence of Sta-phylococcus epidermidis in a mouse model: significance ofextracellular slime. Epidemiol. Infect. 117, 267�280 (1996)

11. Drobniewski F.A.: Bacillus cereus and related species. Clin.Microbiol. Rev. 6, 324�38 (1993)

12. Eneroth A., Christiansson A., Brendehaug J., Molin G.: Criti-cal contamination sites in the production line of pasteurisedmilk, with reference to the psychrotrophic spoilage flora. Int.Diary J. 8, 829�834 (1998)

13. European Pharmacopeia Secretariat; European Pharmaco-peia. Strasbourg, France:. 1998

14. European Union. Council Directive 98/83/EC of 3 Novem-ber 1998 on the quality of water intended for human con-sumption. Off. J. Eur. Commun. L. 330, 32�54 (1998)

15. Falkinham III J.O., Norton C.D., LeChevallier M.W.: Fac-tors influencing numbers of Mycobacterium avium, Myco-bacterium intracellulare and other mycobacteria in drinkingwater distribution systems. Appl. Environ. Microbiol. 67,1225�1231 (2001)

16. Heinzel M. Antimicrobial and preservative efficiency (w:)Cosmetic controlled efficacy studies and regulations, red. P.Elsner , H.F. Merk, H.I. Maibach, Springer Verlag, Stuttgart,1999, s. 275�290

17. Hitchins A.D., Tran T.T., McCarron J.E.: Microbiologicalmethods for cosmetics (w) Bacteriological Analytical Manualred. G.J. Jackson, R.I. Merker, R. Bandler, 8th edn. RevisionA, 1998 Chapter 23

18. Hugbo P.G., Onyekweli A.O., Igwe I.: Microbial contamina-tion and preservative capacity of some brands of cosmeticcreams. Trop. J. Pharm. Res. 2, 229�234 (2003)

19. Itin P., Frei R., Lautenschlager S., Buechner S., Surber C.,Gratwohl A., Widmer A.: Cutaneous manifestation of Paecilo-myces lilacinus infection induced by a contaminated skinlotion in patients who are severely immunosuppressed. J. Am.Acad. Dermatol. 39, 401�409 (1998)

20. Leclerc H., Schwartzbrod L., Die-Cas E.: Microbial agentsassociated with waterborne diseases. Crit. Rev. Microbiol.28, 371�409 (2003)

21. Linter K., Genet V.: A physical method for the preservationof cosmetic products. Int. J. Cosmet. Sci. 20, 103�115 (1998)

22. Livanainen E.K., Martikainen P.J., Räisänen M.L., KatilaM.L.: Mycobacteria in boreal coniferous forest soils. FEMSMicrobiol. Lett. 23, 355�364 (1997)

23. Mah T.F.C., O�Toole G.A.: Mechanisms of biofilm resistan-ce to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9, 34�39 (2001)

24. Martiny A.C., Jørgensen T.M., Albrechtsen H.J., Arvin E.,Molin S.: Long-term succession of structure and diversity ofa biofilm formed in a model drinking water distribiuton sys-tem. Appl. Environment. Microbiol. 69, 6899�6907 (2003)

25. Orus P., Leranoz S.: Current trends in cosmetic microbiology.Int. Microbiol. 8, 77�79 (2005)

26. Perry B.: Cosmetic microbiology. Microbiol. Today 28,185�187 (2001)


27. Reaid, F.R., Wood, T.O.: Pseudomonas corneal ulcer: thecausative role of contaminated eye cosmetics. Arch. Ophathal-mol. 97, 1640�1641 (1979)

28. Scheldeman P., Pil A., Herman L., De Vos P., Heyndrickx M.:Incidence and diversity of potentialy higly heat resistant spo-res isolated at dairy farms. Appl. Environment. Microbiol. 71,1480�1494 (2005).

29. Sugeng M.W., Ang P., Tan H.H., Goh C.L.: Characteristicsof bacterial skin infections in children compared to adults ata tetriary dermatologic center. Int. J. Drematol. 38, 582�586(1999)

30. Svensson B., Ekelund K., Ogura H., Christiansson A.: Cha-racterisiation of Bacillus cereus isolated from milk silo tanksat eight different dairy plants. Int. Dairy J. 14, 17�27 (2004)

31. Szewzyk U., Szewzyk R., Manz W., Schleifer K.H.: Micro-bilogical safety of drinking water. Annu. Rev. Microbiol. 54,81�127 (2000)

32. Tremewan H.C.:Tetanus neonatorium in New Zealand. N.Z.Med. J. 45, 312�313 (1946)

33. Theron J., Cloete T.E.: Emerging waterborne infections: con-tributing factors, agents and detection tools. Crit. Rev. Mi-crobiol. 28, 1�26 (2002)

34. United States Pharmacopeia Convencion, Rockville, MD:US Pharmacopeia (2006)

35. Vaerewijck M.J., Huys G., Palomino J.C., Swings J., Por-taels F.: Mycobacteria in drinking water distribution systems:ecology and significance for human health. FEMS Microbiol.Rev. 29, 911�934 (2005)

36. Webster G.F.: Gram-negative infections: folliculitis, toe web,others (w) Atlas of Infections of the Skin 3rd edn, red.R. Aly, H.I. Maibach. Churchill Livingstone, New York,1999, s.133�138

37. Wilson, L.A., Ahearn D.G.: Pseudomonas-inducted cornealulcers assiociated with contaminated eye mascaras. Am.J. Opthalmol. 97, 112�119 (1977)

38. World Health Organization (WHO); Microbial fact sheets(w) Guidelines for drinking-water quality � 3rd edn. vol. 1(Recommendations), pp. 221�295. WHO, Geneva. (2004)

INFORMACJA DLA AUTORÓW PRAC DRUKOWANYCHw �Postêpach Mikrobiologii�

Uprzejmie informujemy PT Autorów PM, i¿ zgodnie z decyzj¹ Zarz¹du G³ównego Polskiego TowarzystwaMikrobiologów z dnia 6 lutego 2007 roku zmianie ulegn¹ zasady przyjmowania prac do druku w naszym pi�mie.Autorzy manuskryptów proszeni s¹ od zeszytu numer 1/2008 o wnoszenie op³at za ka¿dy artyku³ (250 PLN) nakonto Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów:

Bank BPH S.A. 53 1060 0076 0000 3200 0105 5596

Dotychczasowa instrukcja opisana w INFORMACJI DLA AUTORÓW (Post. Mikrobiol., 2007, 46,73�75 i 79�80) pozostaje bez zmian.

Op³atê mo¿na wnosiæ indywidualnie, wtedy dowód wp³aty jest warunkiem uruchomienia procedury wy-dawniczej. W przypadku op³aty przelewem (instytucja, fundacja itp.) Autorzy korzystaj¹cy z tej formy p³atno�cis¹ zobowi¹zani do z³o¿enia u Sekretarza Redakcji wraz z manuskryptem pisemnego zobowi¹zania siê dobezzw³ocznej op³aty za publikacjê po otrzymaniu faktury VAT.

Na adres siedziby Zarz¹du PTM: 00-725 Warszawa ul. Che³mska 30/34 nale¿y przesy³aæ zg³oszenia przygo-towanych do publikacji artyku³ów wraz z danymi do wystawienia faktury VAT (NIP, nazwa i adres instytucjilub osoby fizycznej) faksem (022) 841-29 49 lub drog¹ pocztow¹. Do zg³oszenia nale¿y do³¹czaæ informacjezawieraj¹ce tytu³ pracy i nazwisko autora korespondencyjnego oraz ewentualnie kopiê dowodu wp³aty.

Otrzymanie przez Redakcjê pracy wraz z kopi¹ potwierdzenia wp³aty lub zobowi¹zaniem zap³aty jest wa-runkiem uruchomienia procedury wydawniczej.

W przypadku nie przyjêcia przez Redakcjê do druku pracy zwrot op³aty wraz z korekt¹ faktury dokonanybêdzie przez ksiêgowo�æ PTM.

I N F O R M A C J E, K O M U N I K A T Y, R E C E N Z J E

Od Redakcji

Uprzejmie informujê, i¿ znaczna czê�æ 2-go zeszytu Postêpów Mikrobiologii w roku 2008 zosta³a oddana dodyspozycji Komitetu Naukowego XXVI Zjazdu Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów. W zeszycie tym dru-kowane bêd¹ streszczenia zjazdowe planowanych referatów plenarnych.

Redakcja PM przeprasza za mo¿liwo�æ opó�nienia druku zakwalifikowanych ju¿ do publikacji prac przys³a-nych wcze�niej do Redakcji.

Jerzy Hrebenda Redaktor Naczelny

INSTRUKCJA DLA AUTORÓW PRAC PUBLIKOWANYCHW SUPLEMENTACH DO KWARTALNIKA POSTÊPY MIKROBIOLOGII

W celu u³atwienia publikowania w jednym miejscu artyku³ów o podobnej problematyce, Postêpy Mikrobiologiiwydawaæ bêd¹ w formie suplementów, nastêpuj¹ce prace naukowe:

1. Referaty z sesji plenarnych Zjazdów naukowych, Konferencji naukowych oraz Sympozjów organizowanychstaraniem Zarz¹du G³ównego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów oraz Komitetu Mikrobiologii PolskiejAkademii Nauk. Manuskrypt pojedynczego referatu nie powinien przekraczaæ 25-ciu stron i powinien byæ przy-gotowany wg Informacji dla Autorów Postêpów Mikrobiologii. Ca³o�æ materia³ów przygotowanych do jednegosuplementu nie mo¿e przekraczaæ 150 stron maszynopisu.

2. Streszczenia przyjêtych przez organizatorów referatów oraz doniesieñ prezentowanych na ww. Zjazdach nauko-wych, Konferencjach oraz Sympozjach. Streszczenie nie powinno przekraczaæ jednej strony maszynopisu i koñ-czyæ siê nie wiêcej jak trzema pozycjami cytowanego pi�miennictwa.

W suplemencie nie bêd¹ publikowane oryginalne prace do�wiadczalne prezentowane na ww. Zjazdach naukowych.Prace te po odpowiednim przygotowaniu, zgodnie z instrukcj¹ dla autorów, mo¿na przesy³aæ do Redakcji PolishJournal of Microbiology (Acta Microbiologica Polonica) lub innego czsopisma naukowego.

Autorzy lub zamawiaj¹cy suplement ponosz¹ pe³ny koszt jego opracowania oraz wydania. Mo¿liwy jest drukczterech suplementów rocznie. Poniewa¿ materia³y przeznaczone do suplementu nie s¹ opracowywane oraz nie podle-gaj¹ ocenie Zespo³u Redakcyjnego Postêpów Mikrobiologii, zamawiaj¹cy suplement, tj. osoba upowa¿niona przezZarz¹d G³ówny Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów lub Komitet Mikrobiologii PAN, bierze ca³kowit¹ odpowie-dzialno�æ za redakcjê oraz warto�æ merytoryczn¹ suplementu. Wydanie suplementu powinno byæ poprzedzone jegoakceptacj¹ przez Zespó³ Redakcyjny Postêpów Mikrobiologii.

Redakcja nie ponosi odpowiedzialno�ci za tre�æ reklam i og³oszeñ

Oferta Reklamy

Postêpy Mikrobiologii udostêpni¹ w ka¿dym numerze kilka stron (³¹cznie z wewnêtrznymi stronami ok³adek)reklamie.

Pismo nasze dociera co kwarta³ do kilku tysiêcy odbiorców. S¹ w�ród nich specjali�ci ró¿nych dziedzin mikrobio-logii, pracuj¹cy jako nauczyciele wy¿szych uczelni, szkó³ �rednich oraz pracownicy naukowi instytutów badawczych,biotechnolodzy oraz lekarze. Du¿¹ grupê naszego pisma stanowi¹ studenci.

Cena og³oszenia czarno-bia³ego wewn¹trz numeru wynosi:1/2 strony 250,� z³ca³a strona 500,� z³Proponujemy równie¿ og³oszenia kolorowe � cena do uzgodnienia.

Teksty opracowanych graficznie reklam proszê sk³adaæ na adres Redakcji Postêpów Mikrobiologii, 02-007 War-szawa, ul. Oczki 3, tel. 628 08 22.


Postêpy Mikrobiologii zamieszczaj¹ artyku³y przegl¹doweze wszystkich dziedzin mikrobiologii nie drukowane w innychczasopismach oraz w dziale Nowo�ci Wydawniczych recenzjenowych ksi¹¿ek z zakresu mikrobiologii i nauk pokrewnych,które ukazuj¹ siê w Polsce. Artyku³y drukowane w PostêpachMikrobiologii nie mog¹ byæ bez zgody Redakcji publikowanew innych periodykach.

1. Sposób przygotowania manuskryptu.1.1. TekstPrace nale¿y przysy³aæ do Sekretariatu Redakcji w postaci

elektronicznego zapisu tekstu w edytorze Microsoft Word do-wolnej edycji w wersji PL na dyskietkach komputerowych (3,5�1,44 MB), na p³ytach CD lub DVD. Do dyskietki powinny byædo³¹czone 2 egz. tekstu artyku³u ca³kowicie zgodnego z zapi-sem elektronicznym. Objêto�æ pracy nie powinna przekraczaæwraz z pi�miennictwem i ilustracjami 30 stron maszynopisu.Maszynopis powinien byæ jednostronny (wielko�æ czcionki 12,odstêp pomiêdzy wierszami 1,5), z numeracj¹ stron. Po tytu³achwydzielonych nie nale¿y stawiaæ kropek. Na oddzielnej stronie(strona tytu³owa) nale¿y podaæ tytu³ pracy, pod nim w pe³nymbrzmieniu imiona i nazwiska autorów, spis tre�ci (tytu³y po-szczególnych rozdzia³ów) oraz kilka (nie wiêcej jak piêæ) s³ówkluczowych (keywords). Tytu³ pracy i spis tre�ci nale¿y pow-tórzyæ w jêzyku angielskim. S³owa kluczowe mog¹ b¹d� nie po-jawiaæ siê w tytule pracy � nale¿y je podaæ w porz¹dku alfabe-tycznym. Praca powinna koñczyæ siê krótkim podsumowaniem,zawieraj¹cym najistotniejsze elementy tre�ci. Na oddzielnej stro-nie nale¿y do³¹czyæ krótkie streszczenie pracy w jêzyku angiel-skim (maksymalnie 250 s³ów). Tekst pracy powinien byæ zgodnyz zaleceniami szczegó³owymi Redakcji.

Przes³ane do redakcji prace winny byæ napisane poprawn¹polszczyzn¹. Redakcja rekomenduje P.T. Autorom S³ownik Po-prawnej Polszczyzny (red. Witold Doroszewski, Halina Kurkow-ska, Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa,1998) jako po-moc w redagowaniu tekstu. Jakkolwiek Postêpy Mikrobiologiis¹ polskojêzyczne, nie wyklucza siê druku prac, napisanych poangielsku.

1.2. IlustracjeTabele i rysunki (po dwa egz., o rozmiarze nie przekraczaj¹-

cym 26,5 cm × 18 cm) winny byæ wykonane starannie (dok³adnekrycie) czarnym tuszem na kalce technicznej lub w formie wy-druku z drukarki laserowej lub atramentowej. Fotografie (po dwaegz.) nale¿y sporz¹dzaæ na b³yszcz¹cym papierze, najlepiej w for-macie 13 cm×18 cm. Materia³y te nale¿y za³¹czyæ oddzielnie. Nienale¿y pozostawiaæ w maszynopisach wolnych miejsc na rysunkii zdjêcia, a tylko na kopii zaznaczyæ miejsce, w którym powinnybyæ umieszczone, np. tab. 1, rys. 1. Liczbê rysunków i tabel nale-¿y ograniczyæ do istotnie niezbêdnej ilo�ci. Te same wskazówkiodnosz¹ siê do pojedynczych wzorów chemicznych. Ka¿da tabe-la powinna byæ oznaczona kolejnym numerem rzymskim orazmieæ nag³ówek opisuj¹cy jej tre�æ. Na osobnej kartce nale¿y za³¹-czyæ spis z obja�nieniami jakie powinny siê znale�æ pod rysunka-mi lub z uwag¹ �obja�nienia w tek�cie�. Podpisy pod wykresami,rysunkami, zdjêciami nale¿y umie�ciæ na osobnej stronie.

1.3. Pi�miennictwoCytowan¹ literaturê (Pi�miennictwo) nale¿y wpisaæ oddziel-

nie jako ostatnie strony maszynopisu, wymieniaj¹c pozycjew kolejno�ci alfabetycznej. W wykazie powinny byæ podane ko-lejno: liczba porz¹dkowa, nazwisko autora, pierwsze literyimion, nazwiska wspó³autorów pracy i pierwsze litery ich imion(w kolejno�ci podanej w cytowanej pracy), pe³ny tytu³ cytowa-nej pracy, skrócony tytu³ czasopisma, tom, strona, i rok wydania(w nawiasach).

Dla cytowanych wydawnictw nieperiodycznych nale¿y po-daæ kolejno: nazwisko i pierwsze litery imion autora, lub wspó³-autorów, tytu³ dzie³a, wydawnictwo, miejsce i rok wydania.W przypadku odwo³ywania siê do artyku³u w pracy zbiorowejnale¿y dodatkowo podaæ tytu³ tej pracy oraz nazwisko jej re-daktora, wydawnictwo, miejsce wydania, rok, tom oraz na koñcustronê, np.

Portnoy D. A., Sun A. N., Bielecki J. E., Escape from thephagosome and cell-to-cell spread of Listeria monocytoge-nes (w) Microbial Adhesion and Invasion, red. M. Hook, L.�witalski, Springer Verlag, New York, 1991, s. 86.W przypadku gdy liczba wspó³autorów pracy przekracza 10,

nale¿y podaæ nazwiska i inicja³y pierwszego oraz ostatniegowspó³autora a nastêpnie dodaæ uwagê i wsp. np.

Tomb J.F., J.C. Venter i wsp.: The complete genome sequenceof the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature 338,539�543 (1997)(wy¿ej cytowana praca jest dzie³em 42 autorów)Powo³ywanie siê w tek�cie na pozycje cytowanej literatury

nastêpuje przez wymienienie liczby porz¹dkowej w nawiasachnp. (10). Ilo�æ cytowañ w pi�miennictwie nie mo¿e przekraczaæ100 pozycji.

1.3.1. Pi�miennictwo danych cytowanychz sieci internetowej

Cytowanie danych z sieci internetowej mo¿e jedynie doty-czyæ informacji pochodz¹cych z prac oryginalnych zamieszcza-nych w sieci przez uznane w �rodowisku naukowym oraz recen-zowane czasopisma. Redakcja bêdzie równie¿ uznawaæ cytacjeinformacji ze �róde³ autoryzowanych przez uznane w �rodowi-sku autorytety z dziedziny nauk przyrodniczych. Warunkiemkoniecznym przy u¿yciu informacji ze strony internetowej jestsprawdzenie i aktualizacja zapisu informacyjnego na stronieWEB w dniu wysy³ania maszynopisu. W przypadku niew³a�ci-wego adresu i niemo¿liwo�ci odtworzenia informacji z siecikomputerowej, prace bêd¹ zwracane autorom. Cytowanie infor-macji publikowanej na stronach sieci internetowej powinno wy-gl¹daæ nastêpuj¹co:

14. XYZ Website 14 listopada 2004 roku (online), nazwiskowydawcy, je�li jest znane, http://cbx.iou.pgr. (10 Pa�dziernika2004 roku, data ostatniego sprawdzenia adresu). Cytowanieksi¹¿ek powinno zawieraæ szczegó³owe dane o wydawnictwie.Cytacje prac oryginalnych przesy³anych poprzez sieæ kompute-row¹ powinna zawieraæ nastêpuj¹ce dane:

Nazwisko autora, inicja³y imion, data przyjêcia pracy, tytu³pracy. Nazwa czasopisma, numer: strony (je�li s¹ dostêpne) (on-line), adres internetowy, data potwierdzenia wa¿no�ci adresu.

INFORMACJA DLA AUTORÓW

76 INFORMACJA DLA AUTORÓW

1.3.2. Elektroniczne wersje ilustracjiRedakcja Postêpów Mikrobiologii akceptuje ilustracje za-

chowane w formatach: TIFF, JPG lub EPS. Wszystkie grafikinale¿y przesy³aæ w 100% wymiarze bez konieczno�ci skalowa-nia. Minimalna rozdzielczo�æ stosowana w ilustracjach powinnawynosiæ 300 dpi dla zdjêæ szarych i kolorowych, 600 dpi dlaliter i 1200 dpi dla linii w wykresach. Grafiki kolorowe nale¿yzachowywaæ w formacie CMYK. Dane s¹ przyjmowane na stan-dardowych mediach takich jak dyskietki (3,5 cala), p³yty CDlub DVD. Przes³ane dyski lub dyskietki nie bêd¹ zwracane auto-rom. Zalecana przez redakcjê kompresja informacji to ZIP lubRAR. W celu szczegó³owej informacji proszê wysy³aæ zapyta-nie przez e-mail na adres [email protected].

2. Prawo autorskieW przypadku reprodukcji w pracy cudzych rysunków lub tabel

� nawet w formie zmodyfikowanej � b¹d� cytowania fragmentówcudzego tekstu, Autorzy Postêpów Mikrobiologii przed przys³a-niem tych materia³ów do Redakcji s¹ zobowi¹zani do uzyskaniapisemnej zgody od Autorów oryginalnych prac i Wydawnictwa(z której materia³y te pochodz¹) na ich reprodukcjê. Cytowanytekst powinien byæ wyra�nie oznaczony w odpowiednim miejscumanuskryptu, za� u do³u strony powinna byæ zamieszczona infor-macja dotycz¹ca pochodzenia cytatu oraz uzyskanej zgody naprzedruk. Za�wiadczenia wraz z informacj¹ którego rysunku,tabeli lub cytatu dotycz¹, nale¿y przes³aæ wraz z manuskryptemprzeznaczonej do publikacji pracy. Uprzejmie zawiadamiamy,i¿ Autorów PM obowi¹zuje sk³adanie wraz z manuskryptem�O�wiadczenia dotycz¹cego praw Autorskich� oraz �O�wiadcze-nia dotycz¹cego konfliktów interesów�. Za³¹czenie ww. doku-mentów jest warunkiem uruchomienia procedury wydawniczej.

3. Zalecenia szczegó³owe*3.1. Nazewnictwo drobnoustrojówNale¿y stosowaæ dwucz³onowe nazwy zawieraj¹ce nazwê

rodzajow¹ oraz gatunkow¹ (np. Escherichia coli). Nazwy ro-dzajowe mog¹ byæ u¿yte same tj. bez nazwy gatunkowej, nato-miast nie mo¿na u¿yæ samych tylko nazw gatunkowych. Gdy wpracy podaje siê pierwszy raz nazwê gatunku, musi ona sk³adaæsiê z pe³nych wyrazów, przy ponownym u¿yciu tej nazwy, po-daje siê tylko pierwsz¹ literê nazwy rodzajowej (zawsze du¿¹ )oraz nazwê gatunkow¹ w pe³nym brzmieniu np. E. coli. Nazwygatunku, rodziny, rzêdu, klasy, dzia³u oraz królestwa nale¿y pisaækursyw¹. Informacje szczegó³owe dotycz¹ce pisowni oraz pra-wid³owego nazewnictwa (zgodnego z wymogami wspó³czesnejsystematyki ) � przyjête przez Redakcjê Postêpów Mikrobiologii,za instrukcj¹ ASM � mo¿na znale�æ w Instructions to Authors,J. Bacteriol. Jan. 1999.

Zgodnie z propozycjami WHO � Collaborating Centre forReference and Research on Salmonella (�Antigenic Formulas ofthe Salmonella Serovars� (M.Y. Popoff and L. Le Minor, WHOCollaborating Centre for Reference and Research on Salmonella,Institut Pasteur, Paris, France, 1997) and �Identification and Sero-typing of Salmonella and an Update of the Kaufmann-WhiteScheme� (A.C. McWhorter-Murlin and F.W. Hickman-Brenner,Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga.) dorodzaju Salmonella nale¿¹ tylko dwa gatunki tj. S. entericai S. bongori � pierwszy z nich podzielony zosta³ na 6 podgatun-ków. Stosowane dotychczas zwyczajowe nazwy, nie posiadaj¹cestatusu taksonomicznego, takie jak serotyp, typ serologiczny,zosta³y zast¹pione nazw¹ serowaru (w oryginale serovar, sv.).Nazwê serowaru nale¿y pisaæ du¿¹ liter¹ oraz prostym pismem

(np. Typhi, Paratyphi B, Typhimurium itp.). Zgodnie z po-wy¿szym, nazwê pierwszego podgatunku rodzaju Salmonellamo¿na zapisaæ: S. enterica subsp. enterica sv. Typhimurium lubSalmonella subsp. I. sv. Typhimurium, b¹d� po prostu, Salmo-nella Typhimurium.

3.2. Nomenklatura genetycznaW³a�ciwo�ci genetyczne szczepu opisywane s¹ w terminach

fenotypu oraz genotypu. Fenotyp opisuje obserwowane w³a�ci-wo�ci organizmu. Genotyp okre�la genetyczn¹ strukturê organiz-mu, zwykle odnosi siê do szczepu dzikiego. Ww. okre�lenia s¹ bli-¿ej obja�nione w pracy Demerec i wsp. Genetics 54 61: 76, 1966.(a) Fenotypowe okre�lenie w³a�ciwo�ci organizmu stosuje siê

gdy zmutowane loci nie zosta³y zidentyfikowane oraz zmapo-wane. Mo¿e byæ tak¿e u¿yte w przypadku, gdy identyfikujesiê produkt genu np. bia³ko OmpA. Zapis fenotypu zasadni-czo sk³ada siê z trzech liter, nie mo¿na ich pisaæ kursyw¹,pierwsza litera powinna byæ zawsze du¿¹ liter¹. Preferujesiê u¿ycie liczb rzymskich lub arabskich dla oznaczania bli�-niaczych fenotypów np. Pol1, Pol2, Pol3 itd. Typ dziki mo¿nazapisaæ dodatkowym oznaczeniem plus (Pol+); w odró¿nieniudo tego oznaczenie minus okre�laæ bêdzie fenotyp mutanta(Pol�). Czasami pewne charakterystyczne w³a�ciwo�ci orga-nizmu mo¿na zapisaæ u¿ywaj¹c liter np. (StrS ).

(b) Genotypowe oznaczenia s¹ podobne do fenotypowych � wobu przypadkach stosuje siê zestaw trzech liter; genotyppisze siê zawsze ma³ymi literami oraz kursyw¹ (np. ara, his,rps.). Promotor, terminator oraz operator oznacza siê litera-mi p, t oraz o (np. lacZp, lacZt, lacZo;. Bachman i Low;Microbiol. Rev. 44, 1�56, 1980).

(c) Typ dziki alleli mo¿na zaznaczyæ wpisuj¹c dodatkowe ozna-czenie plus nad oznaczeniem genu np. ara+, his+, nie ozna-cza siê natomiast zmutowaych alleli znakiem minus.

(d) Miejsca mutacji oznacza siê poprzez wstawiania liczbykolejnych izolacji (liczby alleli) po symbolu zmutowanegolocus (np. araA1, araA2 itp.). W przypadku, gdy tylko jednotakie locus istnieje, lub gdy nie wiadomo w którym kolej-nym locus mutacja powsta³a � po oznaczeniu genu wstawiasiê my�lnik w miejscu du¿ej litery oznaczaj¹cej locus, za�dalej podaje siê liczbê izolacji (np. ara-23).

(e) Zapis genotypu mo¿e byæ wzbogacony innymi oznaczeniamijak plus, dla typu dzikiego czy minus dla mutanta � mo¿nawprowadziæ oznaczenia okre�laj¹ce mutacje jak np. mutacjaAmber (Am), mutant termowra¿liwy (Ts), mutant konstytu-tywny (Con), mutant wra¿liwy na niskie temperatury (Cs),bia³ko hybrydowe (Hyb) np. araA230(Am), his D21(Ts).Wprowadzanie innych wzbogaceñ powinno byæ poprzedzo-ne w tek�cie odpowiednim wyja�nieniem.

(f) Dodatkowe oznaczenia mog¹ te¿ byæ u¿yte w przypadkukonieczno�ci rozró¿nienia tego samego genu znajduj¹cego siêw ró¿nych organizmach lub szczepach tego samego gatunkunp. hisE.coli lub hisK-12. Dodatkowe oznaczenia stosuje siêrównie¿ dla rozró¿nienia pomiêdzy genetycznymi elemen-tami o tej samej nazwie np. promotory operonu gln; glnA1i glnA2.

(g) Delecjê oznacza siê symbolem, D usytuowanym przed zde-lecjonowanym genem lub regionem np. D trpA432, D (aroP-aceE)419, lub D his(dhuA hisJ hisQ)1256. Fuzjê genów arai lac mo¿na przedstawiæ w ten sam sposób � F (ara-lac)1256.Podobnie F (araB� -lacZ+)(Hyb) oznacza, ¿e fuzja nast¹pi³apomiêdzy genami araB a lacZ. Inwersja jest oznaczana na-stêpuj¹co IN (rrnD-rrnE)1. Insercjê genu his E. coli do plaz-midu pSC101 w pozycji 0 zasad (0kb) zapisuje siê nastêpu-j¹co pSC101 W (Okb::K-12hisB)4.Oznaczenie obecno�ci episomu polega na podaniu jego sym-

boli w nawiasie po nazwie szczepu rodzicielskiego np. W3110/F�8(gal+).

* fragmenty instrukcji dla autorów czasopism wydawanychprzez American Society for Microbiology � wykorzystywaniew P.M. za zgod¹ Journals Departments ASM.

77INFORMACJA DLA AUTORÓW

3.3. Skróty nazw chemicznychNie wymagaj¹ dodatkowych wyja�nieñ skróty nazw, takich jak:

� nazwy miar i wag regulowanych przez Systeme Interna-tional dc Unites (SI), ogólnie akcetowane jednostki takiejak bp, kb, Da, masa cz¹st., m. cz¹st.

� skróty nazw chemicznych takich jak: DNA, cDNA, RNA,cRNA, RNaza, DNaza, rRNA, mRNA, tRNA; AMP, ADP,ATP, dATP,ddATP, GTP itp.,

� ATPaza, dGTPaza itp. NAD+, NADH, NADPH, NADP+,poly(A), poly(dT) itp.,

� nazwy powszechnie stosowanych technik biologii mole-kularnej np. PCR, SDS-PAGE, nazwy ogólnie znanychlinii komórkowych np. HeLa, J774

� nazwy jednostek biologicznych; PFU ( jednostka formo-wania ³ysinek), CFU (jednostka formowania kolonii),MIC ( minimalne stê¿enia hamuj¹ce wzrost), itp.

Nowe zasady kszta³towania nomenklatury endonukleaz re-strykcyjnych oraz metylotransferaz zosta³y opublikowane wNucleic Acids Research 2003, 31: 1805�1812. Przy pisaniu pracprosimy o korzystanie z zawartych tam informacji.

3.4. Pisownia danych numerycznychStandardowe jednostki metryczne s¹ stosowane dla okre�la-

nia d³ugo�ci, wagi i objêto�ci. W przypadku przedstawiania tychwarto�ci oraz molarno�ci nale¿y stosowaæ przedrostki m, µ, noraz p dla warto�ci 10�3, 10�6, 10�9 oraz 10�12. Temperaturê na-le¿y przedstawiaæ tylko w stopniach Celsjusza np. 37°C.

3.5. Pisownia substancji znakowanych izotopamiJe�li wyznakowana jest pojedyncza cz¹steczka w zwi¹zku

chemicznym nale¿y nazwê tego zwi¹zku zapisaæ w nastêpuj¹cysposób 14CO2, 3H2O, H2

35SO4. Taki sam sposób zapisu stosuje

siê gdy radioaktywna cz¹steczka nie wystêpuje w naturalnejformie wyznakowanego zwi¹zku np. 32S-ATP lub gdy symbolizotopu zwi¹zany jest z niespecyficzn¹ nazw¹ zwi¹zku np. 14Caminokwasy, 3H-liganty itp. W przypadku niektórych specyficz-nych zwi¹zków chemicznych mo¿na stosowaæ nawiasy kwa-dratowe obejmuj¹ce symbole radioaktywnej cz¹steczki przednazw¹ chemiczn¹ zwi¹zku np. [14C] mocznik, L-[metylo-14C]metionina, [g�32P] ATP.

4. Uwagi dodatkoweRedakcja zastrzega sobie mo¿liwo�æ dokonywania skrótów

i poprawek nie wp³ywaj¹cych na tre�æ pracy. W przypadkukonieczno�ci wprowadzenia zmian w tre�ci odsy³a siê autorowijeden egzemplarz pracy oraz dyskietkê w celu dokonania popra-wek. Adresy instytucji, w których pracuj¹ autorzy (adres pocz-towy oraz e-mail) nale¿y podawaæ w maszynopisie pracy po pi�-miennictwie. Prace nie odpowiadaj¹ce wymaganiom Redakcjibêd¹ odsy³ane autorom bez rozpatrzenia merytorycznego. W ra-zie nie przyjêcia pracy do druku Redakcja zwraca dyskietkê orazjeden egzemplarz wydruku, drugi zatrzymuje u siebie. Za datêwp³ywu przyjmuje siê dzieñ otrzymania pracy w formie zgodnejz instrukcj¹ dla autorów. Autorzy otrzymuj¹ bezp³atnie 15 odbi-tek pracy. Za prace opublikowane w Postêpach Mikrobiologiinie przewiduje siê honorariów autorskich. Prace nale¿y nadsy³aæna adres sekretarza naukowego redakcji:

Dr Bohdan Jerzy Staro�ciakZak³ad Mikrobiologii FarmaceutycznejAkademia Medycznaul. Oczki 302 - 007 Warszawatel. (22) 628-08-22 lub 621-13-51

O�wiadczenie dotycz¹ce praw Autorskich

1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .(nazwisko/a i imiê/ona autora/ów � proszê podkre�liæ autora korespondencyjnego)

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Adres Autorów: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tytu³ pracy: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2. O�wiadczenie (proszê wype³niæ a lub b)(a) O�wiadczam. i¿ w mojej/naszej pracy przeznaczone do opublikowania rysunki oraz tabele, s¹ oryginalne tzn. zosta³y wymy�lo-

ne i zaprojektowane przez autorów przedk³adanego Redakcji manuskryptu. W pracy nie ma cytatów z obcej publikacji.

(b) O�wiadczam, i¿ uzyska³em/li�my zgodê Autorów na reprodukcjê rysunków nr:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,

zamieszczonych w* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .O�wiadczam, i¿ uzyska³em/li�my zgodê Autorów na reprodukcjê tabel nr: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,zamieszczonych w* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .O�wiadczam, i¿ uzyska³em/li�my zgodê Wydawnictwa na reprodukcjê rysunków nr: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .zamieszczonych w*: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .O�wiadczam, i¿ uzyska³em/li�my zgodê Wydawnictwa na reprodukcjê tabel nr: . . . . . . . ,zamieszczonych w*: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

(* podaæ bibliografie prac oryginalnych, z których reprodukowane bêd¹ rysunki lub tabele)Do O�wiadczenia za³¹czam oryginalne zezwolenia reprodukcji w liczbie: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , Rysunków: . . . . . . . . . . . . . . . . ,tabel: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , cytowanego tekstu: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .(miejsce i data)

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .(miejsce i data)

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .(podpis korespondencyjnego autora)

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .(podpis korespondencyjnego autora)

78 INFORMACJA DLA AUTORÓW

Spis tre�ci

Profesor dr hab. n. farm. Wanda Wo�niak-Parnowska (1928�2007) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3D. K m i e c i a k, S. D ê b i c k i � Rola wirusa JC w patogenezie chorób nowotworo-

wych i zaburzeñ zwi¹zanych z os³abieniem odporno�ci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5T. D z i e c i ¹ t k o w s k i, A. R o l a, A. M i d a k - S i e w i r s k a � Adenowirusowe

zaka¿enia ludzi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15A. R e � l i ñ s k i, J. K w i e c i ñ s k a, E. G o s p o d a r e k � W³a�ciwo�ci antyapopto-

tyczne bakterii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23I. K o m a n i e c k a, A. C h o m a � Peryplazmatyczne $-glukany bakterii Gram-

-ujemnych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35A. M r o z i k, K. H u p e r t - K o c u r e k, B. N o w a k, S. £ a b u ¿ e k � Lipazy pocho-

dzenia mikrobiologicznego i ich znaczenie w ochronie �rodowiska . . . . . . . . . . . . . . . 43A. B e d n a r c z y k, E. G. D a c z k o w s k a - K o z o n � Pathogenic features of bacteria

from the Bacillus cereus group . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

Publikacje metodyczne i standardy

K. B. O b r ê b s k a, A. S z c z y g ³ a, M. M a t e j c z y k � Ska¿enia mikrobiologicznesurowców i produktów kosmetycznych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

Informacje, komunikaty, recenzje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73Instrukcja dla autorów . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

Contents

Professor Wanda Wo�niak-Parnowska (1928�2007) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3D. K m i e c i a k, S. D ê b i c k i � Role of the JC virus in the pathogenesis of cancer

diseases and disorders associated with compromised immunity . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5T. D z i e c i ¹ t k o w s k i, A. R o l a, A. M i d a k - S i e w i r s k a � Adenoviral infec-

tions in humans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15A. R e � l i ñ s k i, J. K w i e c i ñ s k a, E. G o s p o d a r e k � Bacterial antiapoptotic

properties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23I. K o m a n i e c k a, A. C h o m a � Periplasmic $-glucans of Gram-negative bacteria 35A. M r o z i k, K. H u p e r t - K o c u r e k, B. N o w a k, S. £ a b u ¿ e k � Microbial

lipases and their significance in the protection of the environment . . . . . . . . . . . . . . . 43A. B e d n a r c z y k, E. G. D a c z k o w s k a - K o z o n � Pathogenic features of bacteria

from the Bacillus cereus group . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

Methods and standards

K. B. O b r ê b s k a, A. S z c z y g ³ a, M. M a t e j c z y k � Microbiological contamina-tion of raw materials and cosmetic products . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

Information, new reports, books reviews . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73Instruction to authors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

tom 47 zeszyt 1 rok 2008 · 2017-03-02 · RADA REDAKCYJNA JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski),...

Documents

Transcript of tom 47 zeszyt 1 rok 2008 · 2017-03-02 · RADA REDAKCYJNA JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski),...