9.10.2009r. WICZENIA 1 Techniki histologiczne(technika parafinowa, celloidynowa, mroeniowa)

Technika parafinowa1. Pobieranie materiau Przy pobieraniu materiau naley zwrci uwag na dwie zasadnicze sprawy: fragment pobranej tkanki powienien by stosunkowo niewielki (do celw mikroskopii wietlnej przynajmniej jeden wymiar nie powinien przekracza 5 mm, a do celw mikroskopii elektronowej 1 mm), aby zapewni dobr i moliwie szybk penetracj pynw stosowanych w dalszych etapach procedury (utrwalacz, pyny odwadniajce i porednie); przy pobraniu wikszego fragmentu naley go przed utrwaleniem pokroi na mniejsze kawaki; jeeli materia pochodzi od uprzednio zabitego zwierzcia laboratoryjnego, pobranie materiau powinno si odby za ycia lub natychmiast po mierci zwierzcia, aby zapobiec zmianom rozkadowym w tkankach. Z tego samego powodu, jeeli po pobraniu materiau trzeba go gdzie przetransportowa, naley uy do tego celu pojemnika z lodem. 2. Utrwalanie materiau Utrwalanie materiau ma na celu: natychmiastowe zatrzymanie procesw metabolicznych w komrkach i tkankach, przede wszystkim poprzez denaturacj enzymw. Mona w ten sposb zapobiec zmianom autolitycznym, czyli samostrawieniu komrek przez ich wasne enzymy lizosomowe, oraz wtrnym zmianom rozkadowym i gnilnym wywoanym przez obecne w materiale lub zawleczone z zewntrz bakterie; zwizanie i wytrcenie (precypitacj) niektrych zawartych w tkankach substancji rozpuszczalnych, co zapobiega ich pniejszej dyfuzji i umoliwia uwidocznienie; wstpne utwardzenie materiau i zwikszenie jego odpornoci na dziaanie odczynnikw uywanych w dalszych etapach procedury; niekiedy rwnie popraw optycznego zrnicowania tkanki poprzez wywoanie w niej reakcji chemicznych uatwiajcych pniejsze barwienie. Niewtpliwie najistotniejsze znaczenie maj trzy pierwsze cele utrwalania i prawie wszystkie utrwalacze speniaj zawarte w pierwszych trzech punktach warunki. Umoliwiaj one zachowanie w utrwalonym materiale struktury moliwie najbardziej zblionej do naturalnej struktury ywych komrek i tkanek. Rodzaje utrwalaczy Utrwalanie moemy podzieli na chemiczne i fizyczne. Do utrwalaczy chemicznych nale (w nawiasach podano najczciej stosowane stenia): aldehydy: formaldehyd (aldehyd mrwkowy, formalina - 2-10%), aldehyd glutarowy (1,5-6,0%), akroleina (10%); alkohole: etylowy i metylowy (50-100%); ketony: aceton (50-100%); kwasy organiczne i nieorganiczne: kwas octowy (50-100%), kwas pikrynowy (1%), kwas chromowy (2%), kwas taninowy (1%); zwizki metali cikich: chlorek rtci (sublimat - 5-7%), dwuchromian potasu (2,5-5,0%), czterotlenek osmu (0,5-2,0%) Utrwalacze chemiczne podzieli mona na proste i zoone. Utrwalacze proste (czyli jednoskadnikowe): - kwasy mineralne i organiczne (kwas chromowy, kwas octowy, kwas pikrynowy, kwas trjchlorowy) - formalina 10% rozkada glikogen, nie rozkada tuszczy) - alkohol etylowy 70% (rozpuszcza tuszcze, nie rozpuszcza glikogenu) - alkohol metylowy - aceton - sole metali cikich

Utrwalacze zoone, bdce mieszanin dwch lub kilku utrwalaczy prostych oraz niekiedy innych substancji. Do najczciej stosowanych utrwalaczy zoonych nale np.: utrwalacz Bouina (kwas pikrynowy i octowy, formalina), utrwalacz Susa (chlorek rtci, chlorek sodu, kwas trjchlorooctowy, kwas octowy lodowaty, formalina, woda destylowana) utrwalacz Carnoya (alkohol etylowy, chloroform i kwas octowy), utrwalacz Zenkera (sublimat, chlorek rtci, dwuchromian potasu, siarczan sodu, woda destylowana, kwas octowy, siarczan sodu). Rozpuszczalnikiem w roztworach utrwalaczy moe by woda, bufory o okrelonym pH i sile jonowej, a w niektrych przypadkach rwnie alkohole. Utrwalanie fizyczne polega na oddziaywaniu na materia mikrofalami lub promieniowaniem jonizujcym. 3. Pukanie materiau w wodzie W przypadku wikszoci utrwalaczy okrelony jest maksymalny czas utrwalania. Przeduenie tego czasu moe spowodowa niekorzystne zmiany strukturalne w komrkach i tkance. Dlatego te proces utrwalania przerywa si poprzez wypukanie utrwalacza z materiau. W zalenoci od rodzaju planowanych bada mikroskopowych (rutynowa mikroskopia wietlna, histochemia, mikroskopia elektronowa) pukanie przeprowadza si bd w wodzie (najlepiej biecej), bd w buforach, ktre suyy uprzednio jako rozpuszczalnik dla utrwalacza. Jeeli uyto alkoholowego (bezwodnego) roztworu utrwalacza, pukanie przeprowadza si w kilku zmianach alkoholu o nieco wyszym steniu. 4. Odwadnianie Po utrwaleniu materiau, dalsze etapy procedury uzalenione s od rodzaju docelowego preparatu mikroskopowego. W przypadku rozmazw, rozgniotw czy hodowli, mona od razu przystpowa do barwienia. Jeeli natomiast chcemy uzyska skrawki o przydatnej w mikroskopii bardzo niewielkiej gruboci, pokrojenie materiau jest moliwe jedynie pod warunkiem jego naleytego utwardzenia. Im ciesze maj by skrawki, tym twardszy musi by krojony materia. W procesie odwadniania zastpujemy wod obecn w tkance alkoholem lub acetonem. Proces ten polega na przeprowadzeniu materiau przez szereg wodnych roztworw tych substancji o stopniowo wzrastajcych steniach (np. 50, 70, 80, 90%) a do dwch zmian bezwodnego (absolutnego) alkoholu lub acetonu. Odwadniania dokonuje si w szczelnie zamknitych naczyniach - jest to szczeglnie istotne podczas ostatniego etapu tej procedury, gdy zwaszcza absolutny alkohol jest niezwykle higroskopijny i z atwoci chonie wod z powietrza. 5. Przeprowadzenie materiau przez pyny porednie: benzen, toluen, ksylen I i II, chloroform Odwodnionego materiau zazwyczaj nadal nie mona zatopi, gdy substancja, ktr chcemy go przepoi, nie rozpuszcza si rwnie w alkoholu czy acetonie. Istnieje zatem konieczno wstpnego przepojenia tkanki pynem, ktry rozpuszczaby si zarwno w odwadniaczu, jak i w rodowisku uytym do zatapiania. Pyny takie nosz nazw pynw porednich, bowiem porednicz pomidzy odwadnianiem a zatapianiem. Dopiero po dokadnym przepojeniu materiau pynem porednim mona rozpocz jego zatapianie. W przypadkach, gdy materia zatapia si w rodowiskach polarnych, nie jest konieczne ani odwadnianie, ani przepajanie pynem porednim. 6. Umieszczenie w parafinie ciekej (pocztkowo w parafinie o topliwoci poniej 50oC, pniej w parafinie o topliwoci powyej 50oC) Uywajc parafiny do utwardzania materiau przed jego skrojeniem wykorzystuje si fakt, i w temperaturze pokojowej parafina jest substancj sta, natomiast po stosunkowo nieznacznym ogrzaniu przechodzi w stan pynny. W pierwszym etapie umieszcza si materia w roztworze pynu poredniego i parafiny (1:1) w temperaturze 37C. Pozwala to na wstpne wprowadzenie parafiny do tkanki. Nastpnie materia przeprowadza si przez 2 lub 3 zmiany czystej parafiny, aby usun ze nawet ladowe resztki pynu poredniego, ktrego obecno wpynaby niekorzystnie na wasnoci materiau podczas krojenia.

W rutynowej technice histologicznej uywa si kilku odmian parafiny rnicych si twardoci i temperatur topnienia (im wysza twardo, tym wysza temperatura topnienia: od 45C dla parafiny bardzo mikkiej do 60C dla bardzo twardej). Proces przepajania parafin odbywa si w cieplarce, w temperaturze o kilka stopni wyszej od temperatury topnienia uytej parafiny. Czas przepajania jest zaleny od rodzaju tkanki (jej twardoci, spoistoci, itp.) oraz od rozmiarw zatapianego materiau i wynosi od kilku godzin do kilku dni. Skonstruowano urzdzenia (tzw. procesory tkankowe), w ktrych cay proces od odwodnienia materiau do jego przepojenia parafin odbywa si automatycznie. S one wykorzystywane w pracowniach wykonujcych szczeglnie due iloci preparatw mikroskopowych (np. due pracownie histopatologiczne). 7. Formowanie bloczkw Po zakoczeniu procesu zatapiania materia wkada si do specjalnych foremek, zalewa pynn parafin i szybko ozibia, np. przez zanurzenie w zimnej wodzie. Parafina zestala si i tak uzyskany bloczek mona nastpnie przyci do podanego ksztatu i rozmiarw za pomoc ostrego noa. Przy rwnoczesnym opracowywaniu wikszej iloci materiaw niezbdne jest odpowiednie oznakowanie bloczkw. Najprociej mona to zrobi przez woenie do foremki niewielkiego paska papieru zawierajcego symbol danego materiau w ten sposb, aby po zestaleniu parafiny oznakowany fragment paska wystawa poza bloczek. 8. Krojenie przy pomocy mikrotomw Do krojenia skrawkw histologicznych su przyrzdy zwane mikrotomami. Kady mikrotom skada si z czterech podstawowych czci: noa mikrotomowego, stolika przedmiotowego, na ktrym montuje si skrawany bloczek, mechanizmu skrawania oraz mechanizmu regulujcego grubo skrawkw. W zalenoci od typu konstrukcyjniego, czci ruchom moe by albo stolik, albo (rzadziej) n. Istnieje kilka typw mikrotomw: mikrotom rotacyjny, najpowszechniejszy, w ktrym obrotowy ruch korby przeksztacany jest w posuwistozwrotny ruch stolika wzgldem noa; mikrotom wahadowy, w ktrym obrotowy lub wahadowy ruch uchwytu jest przekazywany systemem dwigni na stolik przedmiotowy, wykonujcy ruch wahadowy (po wycinku koa); mikrotom saneczkowy, w ktrym stolik wraz z uchwytem przesuwa si ruchem posuwisto-zwrotnym wzdu prowadnic, a n jest nieruchomy (lub odwrotnie). Nowoczesne mikrotomy czsto wyposaone s w napd elektryczny oraz ukady elektroniczne umoliwiajce regulacj szybkoci skrawania, automatyczne dosuwanie nowo zaoonego bloczka do noa, itp. 9. Uoenie skrawka materiau na szkieku podstawowym Przy krojeniu materiau zatopionego w parafinie tworzy si tzw. wstga, zoona z kolejnych (seryjnych) skrawkw zlepionych ze sob krawdziami. Uywane obecnie mikrotomy pozwalaj na uzyskanie skrawkw parafinowych o gruboci 2-10 m. Skrawki takie mona przechowywa dowolnie dugo bd w formie wstgi, bd po ich uprzednim naklejeniu na szkieka podstawowe. Naklejenie skrawka parafinowego na szkieko podstawowe wymaga jego rozprostowania, gdy podczas krojenia skrawki mocno si faduj. W celu rozprostowania skrawka umieszcza si go na powierzchni wody ogrzanej do ok. 40C - dziaaj na wwczas siy napicia powierzchniowego wody, a parafina staje si mikka. Po podoeniu szkieka pod rozprostowany skrawek wyjmuje si go z wody, a skrawek "przykleja" si do powierzchni szka. Naklejone skrawki suszy si przez ok. godzin w temperaturze 37C, co powoduje mocne przywarcie wci mikkiej parafiny skrawka do szkieka podstawowego. W przypadku niektrych materiaw oraz pewnych procedur wicych si z intensywnym dziaaniem chemicznym na skrawek (np. utlenianie) lub z gwatownymi zmianami rodowiska (szybkie odwadnianie) skrawki mog jednak odkleja si od szkieka podstawowego. Zapobiega si temu przez pokrycie szkieka przed naklejeniem skrawka cienk warstw roztworu albumin lub poli-L-lizyny. 10. Odparafinowanie przeprowadzenie przez pyny porednie 11. Nawadnianie przeprowadzenie przez szereg alkoholi o malejcych steniach: 96%, 80%, 70%, 50% 12. Barwienie W histologii uywane s przede wszystkim wodne (rzadziej alkoholowe) roztwory barwnikw. Przepojone niepolarn parafin skrawki nie zabarwi si, gdy czsteczki barwnika w wodnym rodowisku s

"odpychane" przez parafin. Dlatego z takich skrawkw trzeba najpierw usun parafin (przez zanurzenie w ksylenie lub innym rozpuszczalniku organicznym), a nastpnie przeprowadzi przez szereg roztworw alkoholu o coraz niszych steniach (nawadnianie, odwrotno odwadniania), aby w kocu przenie je do czystej wody. Barwienie: a) naturalne - hematotoksylina (niebieski), - karmin (czerwony) b) sztuczne syntetyczne Najpopularniejsz metod barwienia jest wykorzystanie barwnikw kwanych (eozyna, floksyna, oran G) i zasadowych (hematoksylina, bkit metylenowy, safranina). Barwienie ma tu charakter reakcji zobojtniania: barwniki kwane wi si z tymi strukturami komrkowymi i tkankowymi, ktre wykazuj odczyn zasadowy (struktury kwasochonne), jak np. biaka cytoplazmatyczne, wkna kolagenowe, itp., natomiast barwniki zasadowe wi si ze strukturami wykazujcymi odczyn kwany (struktury zasadochonne), jak np. chromatyna jdrowa (obecno DNA), czy rejony cytoplazmy bogate w rybosomy (obecno RNA). W najpowszechniej stosowanym barwieniu przegldowym z uyciem hematoksyliny i eozyny, jdra komrkowe wybarwiaj si hematoksylin na granatowo, a cytoplazma eozyn na czerwono. W komrkach zawierajcych liczne rybosomy, cytoplazma barwi si na kolor fioletowy (efekt naoenia barwy czerwonej i niebieskiej). Technik barwienia mona podzieli na barwienie progresywne, w ktrym przerywamy proces barwienia w momencie uzyskania podanej intensywnoci koloru, oraz barwienie regresywne, w ktrym tkank rozmylnie przebarwiamy, a nastpnie stosujc odpowiednie roztwory odbarwiajce doprowadzamy do wymaganego nasilenia barwy. Moe si rwnie zdarzy, e podczas barwienia progresywnego - zwaszcza kilkoma rnymi barwnikami - dojdzie wbrew naszej woli do przebarwienia preparatu i trzeba zmniejszy intensywno koloru. Traktowanie zabarwionego preparatu roztworami odbarwiajcymi nosi nazw rnicowania i przeprowadza si go oczywicie pod kontrol mikroskopu. Do rnicowania su - w zalenoci od rodzaju uytego barwnika - roztwory alkoholi, kwasw, a take substancji o waciwociach utleniajcych. 13. Nawadnianie 14. Zamykanie szkiekiem nakrywkowym za pomoc balsamu kanadyjskiego. Po zabarwieniu i wypukaniu preparat jest praktycznie gotowy do analizy mikroskopowej - naley go jednak zabezpieczy przed niekorzystnym wpywem otoczenia (uszkodzenia mechaniczne, wysychanie, utlenianie niektrych barwnikw). Do tego celu suy tzw. zamykanie preparatw, czyli umieszczenie ich pomidzy szkiekiem podstawowym a nakrywkowym i wypenienie przestrzeni pomidzy oboma szkiekami substancj, ktra powinna spenia dwa podstawowe warunki: powinna posiada taki sam wspczynnik zaamania wiata jak szko (w celu uniknicia uginania i rozpraszania promieni wietlnych na pograniczu rodowisk o rnej charakterystyce optycznej); powinna w temperaturze pokojowej hermetycznie i trwale spaja oba szkieka. Oba warunki najlepiej speniaj niepolarne ywice - albo naturalne (balsam kanadyjski), albo syntetyczne (DPX, Malinol, XAM, Entellan). Poniewa ywice te s rozpuszczalne jedynie w rozpuszczalnikach organicznych, zabarwione preparaty musz by poddane ponownemu odwodnieniu (tym razem szybkiemu, gdy dusze przetrzymywanie w roztworach alkoholi odbarwia preparaty) i zanurzone w toluenie lub ksylenie (tzw. przewietlanie). Dopiero wwczas preparaty mona pokry kropl ywicy i naoy szkieko nakrywkowe. Po wysuszeniu (przez kilka godzin, w temperaturze ok. 60-80C) oba szkieka s ze sob cile i hermetycznie spojone, i tak przygotowany preparat zachowuje swe wasnoci optyczne nawet przez kilkadziesit lat. W sytuacji, gdy potrzebne jest natychmiastowe zamknicie preparatu po barwieniu (np. blakncy barwnik), lub gdy preparatu nie mona podda odwodnieniu i przewietleniu (w niektrych reakcjach histochemicznych barwny produkt rozpuszcza si w alkoholu lub rozpuszczalnikach organicznych), stosuje si mniej trwae, wodne rodowiska zamykajce, ktre cakowicie speniaj tylko pierwszy z dwch wymienionych powyej warunkw. S to np.: el glicerolowy (roztwr glicerolu i elatyny), glicerol w soli

fizjologicznej, roztwr gumy arabskiej i sacharozy, alkohol poliwinylowy. rodowiska te nie zapewniaj duszej trwaoci preparatu (ok. miesica); aby j poprawi, mona dodatkowo uszczelni obrzea szkieka nakrywkowego szybko schncym lakierem. Zalety metody parafinowej: niskie koszty preparaty s bardzo trwae, mog by przechowywane przez wiele lat powstaj cienkie skrawki 5-7 mikrometrowe stosunkowo krtki czas trwania procedury (1-3 dni od momentu pobrania materiau do otrzymania preparatw). Wady metody parafinowej: stosowanie wysokiej temperatury (50-60C), powodujcej inaktywacj enzymw i obkurczanie si niektrych tkanek; konieczno uywania rozpuszczalnikw organicznych powodujcych wypukiwanie z materiau tuszczw (lipidw); konieczno dodatkowego przygotowania skrawkw do barwienia (p. dalej). kruszenie si i rozwarstwianie skrawkw przy materiaach twardych lub o niejednorodnej strukturze; znaczne trudnoci przy krojeniu skrawkw o duej powierzchni.

Technika mroeniowaTechnika mroeniowa polega na utwardzeniu materiau biologicznego poprzez jego zamroenie mona zatem materia pokroi na odpowiednio cienkie skrawki bez uprzedniego zatopienia go w substancjach utwardzajcych i bez zoonej procedury przygotowawczej (odwadnianie, pyny porednie). Technika mroeniowa ma szereg istotnych zalet: jest krtkotrwaa: przy maksymalnie uproszczonej procedurze czas od pobrania materiau do wykonania preparatu nadajcego si do ogldania pod mikroskopem nie przekracza kilkunastu minut. Wykorzystuje si to np. podczas operacyjnych badaniach histopatologicznych; zachowuje w materiale biologicznym wszystkie skadniki chemiczne - rwnie lipidy, ktre ulegaj wypukaniu podczas zatapiania w parafinie, celoidynie czy niepolarnych ywicach; przebiega w niskiej temperaturze, ktra zapobiega denaturacji biaek, zachowuje aktywno enzymw wewntrzkomrkowych i blokuje procesy autolityczne. Dwie ostatnie zalety sprawiaj, e technika mroeniowa jest szeroko stosowana w histochemii i immunocytochemii. Wady: powstaj grube skrawki, ktre si ami skrawki nie nadaj si do przechowywania

Preparaty histologiczne:- totalne (pooone na szkieko cae fragmenty tkanek lub narzdw - zazwyczaj s to wypreparowane warstwy cian wewntrznych przewodw (np. warstwa miniowa cewy pokarmowej), w ktrych bada si przestrzenny ukad wkien nerwowych lub sieci naczyniowych. Taki preparat musi by wystarczajco cienki, aby mogo przeze przechodzi wiato) - izolowane - mechanicznie - chemicznie - enzymatycznie - rozmazy (wykonywane z pynw ustrojowych, w ktrych obecne s wolno zawieszone komrki (krew, punktat szpiku krwiotwrczego, pyn mzgowo-rdzeniowy, pyny wysikowe), a take z zawiesin komrkowych uzyskanych w badaniach biochemicznych. Kropl takiego pynu rozprowadza si na szkieku podstawowym w taki sposb, aby zawarte w nim komrki utworzyy pojedyncz warstw. W diagnostyce histopatologicznej wykonuje si rozmazy z materiau pobranego ze luzwek (jama ustna, nosowo-gardowa, pochwa) oraz z wydzielin (wydzielina oskrzelowa)) - skrawki (uzyskane przez pokrojenie materiau na cienkie "plasterki"z narzdw miszowych, odwapnionych koci)

- szlify kostne.(uzyskane przez zeszlifowanie tkanek twardych (zmineralizowanych) na bardzo cienkie pytki)