Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe

Szczepionki zawierające Szczepionki zawierające

rekombinantowe antygeny białkowerekombinantowe antygeny białkowe

Szczepionki zawierające Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowerekombinantowe antygeny białkowe

Charakterystyka szczepionekCharakterystyka szczepionek

Ściśle zdefiniowany składŚciśle zdefiniowany skład Bezpieczeństwo produkcjiBezpieczeństwo produkcji• wyeliminowanie konieczności hodowli mikroorganizmów chorobotwórczych wyeliminowanie konieczności hodowli mikroorganizmów chorobotwórczych

w celu izolacji antygenów szczepionkowychw celu izolacji antygenów szczepionkowych• mikroorganizmy stosowane do produkcji antygenów rekombinantowych o mikroorganizmy stosowane do produkcji antygenów rekombinantowych o

statusie GRAS (statusie GRAS (Generally Recognized as Safe)Generally Recognized as Safe) Bezpieczeństwo stosowaniaBezpieczeństwo stosowania• brak możliwości wywołania chorobybrak możliwości wywołania choroby• niska odczynowośćniska odczynowość Wymagają stosowania adiuwantówWymagają stosowania adiuwantów Koszt produkcji uzależniony od stosowanego systemu produkcjiKoszt produkcji uzależniony od stosowanego systemu produkcji


Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnychCharakterystyka gospodarzy ekspresyjnych BakterieBakterie• dobrze scharakteryzowanedobrze scharakteryzowane• łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznychłatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych• wydajne systemy ekspresyjnewydajne systemy ekspresyjne• brak modyfikacji posttranslacyjnychbrak modyfikacji posttranslacyjnych• możliwość produkcji białek w postaci nierozpuszczalnych ciał możliwość produkcji białek w postaci nierozpuszczalnych ciał

inkluzyjnychinkluzyjnych• możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny

ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające rozpuszczalność, ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające rozpuszczalność, zwiększające immunogenność zwiększające immunogenność


Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnychCharakterystyka gospodarzy ekspresyjnych DrożdżeDrożdże• dobrze scharakteryzowanedobrze scharakteryzowane• łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznychłatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych• wydajne systemy ekspresyjnewydajne systemy ekspresyjne• trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z

genomem gospodarza genomem gospodarza • modyfikacje posttranslacyjne – tworzenie mostków disiarczkowych, modyfikacje posttranslacyjne – tworzenie mostków disiarczkowych,

glikozylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych glikozylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych • możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny

ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające immunogenność ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające immunogenność


Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnychCharakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Komórki owadzieKomórki owadzie• systemy ekspresyjne oparte na plazmidach lub bakulowirusiesystemy ekspresyjne oparte na plazmidach lub bakulowirusie• modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja inna niż w komórkach modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja inna niż w komórkach

ssaczych ssaczych • wrażliwe na zakażenia wirusowewrażliwe na zakażenia wirusowe

Komórki ssaczeKomórki ssacze• modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja, fosforylacja, przyłączanie modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja, fosforylacja, przyłączanie

kwasów tłuszczowych, tworzenie mostków disiarczkowych kwasów tłuszczowych, tworzenie mostków disiarczkowych • droga hodowladroga hodowla• stabilne produkcyjne linie komórkowe trudne do otrzymania stabilne produkcyjne linie komórkowe trudne do otrzymania


Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnychCharakterystyka gospodarzy ekspresyjnych Rośliny transgeniczneRośliny transgeniczne• manipulacje genetyczne trudne do przeprowadzeniamanipulacje genetyczne trudne do przeprowadzenia• tania produkcja tania produkcja • modyfikacje posttranslacyjnemodyfikacje posttranslacyjne• szczepienie drogą pokarmowąszczepienie drogą pokarmową• wywołanie odporności błon śluzowych wywołanie odporności błon śluzowych

Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu Bwątroby typu B

Czynnik etiologiczny – wirus HBV Czynnik etiologiczny – wirus HBV Rodzina: Rodzina: HepadnaviridaeHepadnaviridae Rodzaj: Rodzaj: OrthohepadnavirusOrthohepadnavirus Struktura: ikosaedralny nukleokapsyd Struktura: ikosaedralny nukleokapsyd

otoczony podwójną osłonką; kulisty; śr. otoczony podwójną osłonką; kulisty; śr. 42 nm42 nm

Kwas nukleinowy: DNAKwas nukleinowy: DNA Replikacja: hepatocytyReplikacja: hepatocyty Rezerwuar: człowiek Rezerwuar: człowiek


Droga przenoszenia: krew i płyny Droga przenoszenia: krew i płyny ustrojowe, w tym wydzielina szyjki ustrojowe, w tym wydzielina szyjki macicy, nasieniemacicy, nasienie

Wysoka zakaźność – nawet 0,1 Wysoka zakaźność – nawet 0,1 μμl l krwi może spowodować zakażeniekrwi może spowodować zakażenie

Hodowla w warunkach Hodowla w warunkach laboratoryjnych – nie zakaża laboratoryjnych – nie zakaża zarodków kurzych i powszechnie zarodków kurzych i powszechnie stosowanych linii komórkowych stosowanych linii komórkowych

We krwi do 1010 wirusów/ml


Ostre wirusowe zapalenie wątroby typu BOstre wirusowe zapalenie wątroby typu B Okres wylęgania 2 – 3 miesiąceOkres wylęgania 2 – 3 miesiące Początkowe objawy: złe samopoczucie, utrata apetytu, gorączkaPoczątkowe objawy: złe samopoczucie, utrata apetytu, gorączka ŻółtaczkaŻółtaczka

Wyzdrowienie (90%)

Nadostre zapalenie wątroby

(0,1%)

Zgon

Przewlekłe zakażenie (10%)

Antygenemia

brak uszkodzenia wątroby

Przetrwałe zapalenie wątroby

niewielkie uszkodzenie wątroby

Aktywne zapalenie wątroby

Marskość wątroby

Pierwotny rak wątroby


Wirusowe zapalenie wątroby typu B Wirusowe zapalenie wątroby typu B zakażenie okołoporodowezakażenie okołoporodowe

Dzieci urodzone przez matki w ostrej fazie wzw BDzieci urodzone przez matki w ostrej fazie wzw B zakażenie z ostrymi objawami chorobyzakażenie z ostrymi objawami choroby

Dzieci urodzone przez matki z przewlekłym aktywnym wzw BDzieci urodzone przez matki z przewlekłym aktywnym wzw B zakażenie bez ostrych objawów chorobyzakażenie bez ostrych objawów choroby nosicielstwo HBVnosicielstwo HBV śmierć z powodu marskości wątroby lub raka wątroby (50% chłopców, 15% śmierć z powodu marskości wątroby lub raka wątroby (50% chłopców, 15%

dziewczynek)dziewczynek)

Na świecie 200 mln nosicieli HBV

z tego 75% ulega zakażeniu podczas porodu


Antygeny wirusa HBVAntygeny wirusa HBV HBcAg – białko rdzeniaHBcAg – białko rdzenia HBeAg – białko rdzeniaHBeAg – białko rdzenia HBsAg – białko powierzchnioweHBsAg – białko powierzchniowe • tworzy zewnętrzną osłonkę wirusatworzy zewnętrzną osłonkę wirusa• nadmiar białka obecny we krwi w postaci nadmiar białka obecny we krwi w postaci

kulistych lub pałeczkowatych agregatówkulistych lub pałeczkowatych agregatów


Gen kodujący antygen HBsAg – koduje 3 polipeptydy

preS1

preS2

S


Odpowiedź immunologiczna na Odpowiedź immunologiczna na zakażenie HBVzakażenie HBV

Odpowiedź humoralnaOdpowiedź humoralna• przeciwciała anty-HBsAg (preS1, preS2 i S)przeciwciała anty-HBsAg (preS1, preS2 i S)• przeciwciała anty-HBcAgprzeciwciała anty-HBcAg• przeciwciała anty-HBeAgprzeciwciała anty-HBeAg

Odpowiedź komórkowaOdpowiedź komórkowa• limfocyty Tc limfocyty Tc


Szczepionki I generacji Szczepionki I generacji (plazmatyczne)(plazmatyczne)

Substancja czynna – białkowy Substancja czynna – białkowy antygen powierzchniowy HBsAgantygen powierzchniowy HBsAg

• białko Sbiałko S• śladowe ilości białka preS1śladowe ilości białka preS1• śladowe ilości białka preS2 śladowe ilości białka preS2 Sposób otrzymywania – izolacja ciał Sposób otrzymywania – izolacja ciał

kulistych i pałeczkowatych z krwi kulistych i pałeczkowatych z krwi bezobjawowych nosicieli HBV, bezobjawowych nosicieli HBV, inaktywacja formaldehydeminaktywacja formaldehydem

Bezpieczeństwo – ryzyko transmisji Bezpieczeństwo – ryzyko transmisji patogenów przenoszonych przez patogenów przenoszonych przez krewkrew

Nie są stosowane w Polsce


Szczepionki II generacji Szczepionki II generacji (rekombinowane)(rekombinowane)

Pierwsza szczepionka Pierwsza szczepionka zarejestrowana w 1986 r.zarejestrowana w 1986 r.

Substancja czynna – białkowy antygen Substancja czynna – białkowy antygen powierzchniowy HBsAgpowierzchniowy HBsAg

• białko Sbiałko S Sposób otrzymywania – produkcja białka Sposób otrzymywania – produkcja białka

S w komórkach drożdży S w komórkach drożdży S. cerevisiaeS. cerevisiae



Pierwszy układ ekspresyjny Pierwszy układ ekspresyjny opublikowany w 1982 r. opublikowany w 1982 r. (P. Valenzuela, A. Medina, W.J. (P. Valenzuela, A. Medina, W.J. Rutter, Nature, 289, 347 – 350)Rutter, Nature, 289, 347 – 350)

wektor ekspresyjny – pHBS-16wektor ekspresyjny – pHBS-16• autonomiczna replikacjaautonomiczna replikacja • ori ori replikacji pBR322replikacji pBR322• gen oporności na ampicylinęgen oporności na ampicylinę• ori ori replikacji plamidu 2replikacji plamidu 2μμ• gen gen trptrp11• sekwencja kodująca białko S pod sekwencja kodująca białko S pod

kontrolą promotora ADH I kontrolą promotora ADH I dehydrogenazy alkoholowej I dehydrogenazy alkoholowej I



gospodarz – gospodarz – S. cerevisiae S. cerevisiae XV610-8C XV610-8C • szczep auksotroficzny – brak zdolności do szczep auksotroficzny – brak zdolności do

wzrostu na podłożu nie zawierającym wzrostu na podłożu nie zawierającym tryptofanu tryptofanu

białko S produkowane w postaci białko S produkowane w postaci kulistych agregatówkulistych agregatów

(agregaty 1000x bardziej immunogenne (agregaty 1000x bardziej immunogenne niż pojedyncze cząsteczki białka S)niż pojedyncze cząsteczki białka S)

2 – 5 2 – 5 μμg białka z 200 ml hodowlig białka z 200 ml hodowli


Szczepionki II generacji (rekombinowane)Szczepionki II generacji (rekombinowane) Adiuwant – wodorotlenek glinuAdiuwant – wodorotlenek glinu Postać szczepionki – płynnaPostać szczepionki – płynna Temperatura przechowywania – 2-8Temperatura przechowywania – 2-8°°CC Sposób podawania – domięśniowoSposób podawania – domięśniowo Dawkowanie – 3 dawki (1 - dzień 0; 2 – po 6 tyg.; 3 – po 6 m-cach Dawkowanie – 3 dawki (1 - dzień 0; 2 – po 6 tyg.; 3 – po 6 m-cach

od pierwszego szczepienia)od pierwszego szczepienia) Skuteczność szczepionki Skuteczność szczepionki • u 95% szczepionych ochronny poziom przeciwciał po 3 dawkachu 95% szczepionych ochronny poziom przeciwciał po 3 dawkach• u 95 – 100% szczepionych skuteczna ochrona przed zachorowaniemu 95 – 100% szczepionych skuteczna ochrona przed zachorowaniem• 95% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed 95% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed

zakażeniemzakażeniem• 98% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed 98% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed

zakażeniem po podaniu szczepionki i HBIg w dniu urodzeniazakażeniem po podaniu szczepionki i HBIg w dniu urodzenia• indukuje powstanie trwałej pamięci immunologicznej indukuje powstanie trwałej pamięci immunologicznej

Narastanie stężenia i powinowactwa przeciwciał Narastanie stężenia i powinowactwa przeciwciał w cyklu szczepień przeciwko WZW typu Bw cyklu szczepień przeciwko WZW typu B


Szczepionki II generacji (rekombinowane)Szczepionki II generacji (rekombinowane) Bezpieczeństwo szczepionki – wysokieBezpieczeństwo szczepionki – wysokie• może być stosowana u kobiet ciężarnychmoże być stosowana u kobiet ciężarnych• matek karmiących piersiąmatek karmiących piersią• osób z niedoborami odporności osób z niedoborami odporności Niepożądane odczyny poszczepienneNiepożądane odczyny poszczepienne• łagodne miejscowe odczyny poszczepiennełagodne miejscowe odczyny poszczepienne• rzadko występujące odczyny ogólne – powiększenie węzłów chłonnych, rzadko występujące odczyny ogólne – powiększenie węzłów chłonnych,

wymioty, biegunka, nudności, obniżenie ciśnienia krwi, zaburzenia ze strony wymioty, biegunka, nudności, obniżenie ciśnienia krwi, zaburzenia ze strony układu nerwowegoukładu nerwowego

Przeciwwskazania do szczepieńPrzeciwwskazania do szczepień• nadwrażliwość na składniki szczepionkinadwrażliwość na składniki szczepionki• ciężkie choroby przebiegające z wysoką gorączką ciężkie choroby przebiegające z wysoką gorączką


Szczepionki II generacji (rekombinowane)Szczepionki II generacji (rekombinowane) Skuteczne w szczepieniu poekspozycyjnym – uodpornienie czynno-Skuteczne w szczepieniu poekspozycyjnym – uodpornienie czynno-

bierne (4 dawki – 0, 1, 2, 12 m-cy; HBIg równocześnie z pierwszą bierne (4 dawki – 0, 1, 2, 12 m-cy; HBIg równocześnie z pierwszą dawką szczepionki)dawką szczepionki)

Dostępne w postaci szczepionek monowalentnychDostępne w postaci szczepionek monowalentnych• Engerix B, GlaxoSmithKlineEngerix B, GlaxoSmithKline • H-B-VAX, Merck Sharp DohmeH-B-VAX, Merck Sharp Dohme Dostępne w postaci szczepionek skojarzonychDostępne w postaci szczepionek skojarzonych• Hexavac, Aventis Pasteur (błonica, tężec, krztusiec, polio, Hib, WZW B)Hexavac, Aventis Pasteur (błonica, tężec, krztusiec, polio, Hib, WZW B)• Ambirix, GlaxoSmithKline (WZW A, WZW B)Ambirix, GlaxoSmithKline (WZW A, WZW B)• Procomvax, Merck Sharp Dohme (WZW B, Hib)Procomvax, Merck Sharp Dohme (WZW B, Hib)


Szczepionki II generacji (rekombinowane)Szczepionki II generacji (rekombinowane)

Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Hansenula polymorpha Hansenula polymorpha (Hepavax Gene, Green Cross Vaccine, Korea)(Hepavax Gene, Green Cross Vaccine, Korea)

Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Pichia Pichia pastoris pastoris


Szczepionki III generacji Szczepionki III generacji (rekombinowane)(rekombinowane)

Białka S i preS2 produkowane w Białka S i preS2 produkowane w linii komórkowej CHO (Chinese linii komórkowej CHO (Chinese Hamster Ovary cells), Hamster Ovary cells), Heprecombe, Swiss Serum and Heprecombe, Swiss Serum and Vaccine Institute Vaccine Institute

Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae

Niski poziom produkcji i Niski poziom produkcji i sekrecji białeksekrecji białek

Niestabilność plazmidów Niestabilność plazmidów rekombinantowychrekombinantowych

Hiperglikozylacja białekHiperglikozylacja białek Wąski zakres Wąski zakres

metabolizowanych źródeł metabolizowanych źródeł węglawęgla

Pichia pastoris Pichia pastoris ii Hansenula polymorpha Hansenula polymorpha-- podstawowa charakterystyka biochemicznapodstawowa charakterystyka biochemiczna

P. pastorisP. pastoris H. polymorphaH. polymorpha

Źródła węgla Źródła węgla

i energiii energii

glukoza glukoza

glicerol glicerol

metanolmetanol

glukozaglukoza

glicerolglicerol

metanolmetanol

Źródła azotuŹródła azotu jony amonowejony amonowe jony amonowejony amonowe

sole kwasu sole kwasu azotowego (V)azotowego (V)

Optymalna Optymalna temperatura temperatura

wzrostuwzrostu

30 30 °°CC 37-43 37-43 °°CC

Metabolizm metanoluMetabolizm metanolu

1 – oksydaza alkoholowa, 2 – katalaza, 3 – syntaza dihydroksyacetonu, 4 - dehydrogenaza formaldehydowa, 5 – dehydrogenaza mrówczanowa, 6 - kinaza dihydroksyacetonu, 7- aldolaza fruktozo-1,6-bisfosforanu, 8 – fosfataza fruktozo- 1,6-bisfosforanu

Drożdżowe systemy ekspresyjneDrożdżowe systemy ekspresyjne

Szczepy gospodarzy Szczepy gospodarzy ekspresyjnychekspresyjnych

Wektory ekspresyjneWektory ekspresyjne• bakteryjne bakteryjne ori ori replikacjireplikacji• bakteryjny marker selekcyjnybakteryjny marker selekcyjny• sekwencja umożliwiająca sekwencja umożliwiająca

utrzymanie się wektora w utrzymanie się wektora w komórce drożdży komórce drożdży

• drożdżowy marker selekcyjnydrożdżowy marker selekcyjny• drożdżowy promotor i drożdżowy promotor i

terminator transkrypcji terminator transkrypcji

Drożdżowy wektor

ekspresyjny

PTEF1

AmpR

URA3

PHO5t

25S rDNA

ColE1 ori

Szczepy ekspresyjne Szczepy ekspresyjne Pichia pastorisPichia pastoris

SzczepSzczep FenotypFenotyp UwagiUwagi

X-33, Y-11430X-33, Y-11430 szczep dzikiszczep dziki Selekcja antybiotykowaSelekcja antybiotykowa

GS115GS115 HisHis--, Mut, Mut++ Selekcja na podłożu bez histydyny; Selekcja na podłożu bez histydyny; szybki metabolizm metanoluszybki metabolizm metanolu

KM71KM71 HisHis--, Mut, Mutss Selekcja na podłożu bez histydyny; Selekcja na podłożu bez histydyny; wolny metabolizm metanoluwolny metabolizm metanolu

SMD1168SMD1168 HisHis--, Pep4, Pep4--, Mut, Mut++ Selekcja na podłożu bez histydyny; Selekcja na podłożu bez histydyny; brak aktywności proteazy A; szybki brak aktywności proteazy A; szybki

metabolizm metanolumetabolizm metanolu

JC300JC300 AdeAde--, Arg, Arg--, His, His-- Selekcja na podłożu bez adeniny, Selekcja na podłożu bez adeniny, argininy i histydynyargininy i histydyny

JC308JC308 AdeAde--, Arg, Arg--, His, His--, , UraUra--

Selekcja na podłożu bez adeniny, Selekcja na podłożu bez adeniny, uracylu, histydyny i argininyuracylu, histydyny i argininy

Szczepy ekspresyjne Szczepy ekspresyjne Hansenula polymorphaHansenula polymorpha

SzczepSzczep FenotypFenotyp UwagiUwagi

DL-1, DL-1, NCYC495, NCYC495, CBS4732CBS4732

szczep dzikiszczep dziki Selekcja antybiotykowaSelekcja antybiotykowa

DL10DL10 LeuLeu--, Ura, Ura-- Selekcja na podłożu bez leucyny i Selekcja na podłożu bez leucyny i uracyluuracylu

uDLB11uDLB11 LeuLeu--, Ura, Ura--, Pep4, Pep4-- Selekcja na podłożu bez leucyny i Selekcja na podłożu bez leucyny i uracylu; brak aktywności proteazy A uracylu; brak aktywności proteazy A

L1L1 LeuLeu-- Selekcja na podłożu bez leucynySelekcja na podłożu bez leucyny

A11A11 AdeAde-- Selekcja na podłożu bez adeninySelekcja na podłożu bez adeniny

LR9LR9 UraUra-- Selekcja na podłożu bez uracyluSelekcja na podłożu bez uracylu

Promotory transkrypcji Promotory transkrypcji P. pastorisP. pastoris

Promotor Promotor UwagiUwagi

AOX1AOX1 (genu oksydazy (genu oksydazy alkoholowej)alkoholowej)

Indukowany metanolem; represja Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy i gliceroluw obecności glukozy i glicerolu

FLD1FLD1 (genu dehydrogenazy (genu dehydrogenazy formaldehydowej)formaldehydowej)

Indukowany metanolem i Indukowany metanolem i metyloaminą; represja w metyloaminą; represja w

obecności glukozy i gliceroluobecności glukozy i glicerolu

PEX8 PEX8 (genu kodującego białko (genu kodującego białko tworzące matrix peroksysomów)tworzące matrix peroksysomów)

Słaba aktywność w obecności Słaba aktywność w obecności glukozy; wzrost aktywności w glukozy; wzrost aktywności w

obecności metanoluobecności metanolu

GAPGAP (genu dehydrogenazy (genu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego)aldehydu 3-fosfoglicerynowego)

Konstytutywny, aktywny w Konstytutywny, aktywny w obecności glukozy i gliceroluobecności glukozy i glicerolu

YPT1 YPT1 (genu GTPazy niezbędnej w (genu GTPazy niezbędnej w sekrecji białek)sekrecji białek)

Konstytutywny, aktywny w Konstytutywny, aktywny w obecności glukozy i metanoluobecności glukozy i metanolu

Promotory transkrypcji Promotory transkrypcji H. polymorphaH. polymorpha

PromotorPromotor UwagiUwagi

MOXMOX (genu oksydazy (genu oksydazy metanolowej)metanolowej)

Indukowany metanolem; represja w Indukowany metanolem; represja w obecności glukozy; aktywny w obecności obecności glukozy; aktywny w obecności

gliceroluglicerolu

DHASDHAS (genu syntazy (genu syntazy dihydroksyacetonu)dihydroksyacetonu)


gliceroluglicerolu

FMDFMD (genu dehydrogenazy (genu dehydrogenazy mrówczanowej)mrówczanowej)


gliceroluglicerolu

AMOAMO (genu oksydazy aminowej) (genu oksydazy aminowej) Indukowany metylo- i etyloaminą; represja Indukowany metylo- i etyloaminą; represja w obecności jonów amonowychw obecności jonów amonowych

YNT1YNT1, , YNI1YNI1, , YNR1YNR1 (genów (genów kodujących białka niezbędne w kodujących białka niezbędne w

metabolizmie azotanów)metabolizmie azotanów)

Indukowane solami kwasu azotowego (V), Indukowane solami kwasu azotowego (V), represja w obecności jonów amonowych represja w obecności jonów amonowych

GAPGAP (genu dehydrogenazy (genu dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego)aldehydu 3-fosfoglicerynowego)

KonstytutywnyKonstytutywny

PMA1 PMA1 (genu ATPazy błony (genu ATPazy błony cytoplazmatycznej)cytoplazmatycznej)

KonstytutywnyKonstytutywny

Drożdżowe markery selekcyjneDrożdżowe markery selekcyjne

P. pastorisP. pastoris geny oporności na antybiotykigeny oporności na antybiotyki • gen oporności na zeocynęgen oporności na zeocynę

markery auksotroficznemarkery auksotroficzne• gengen HIS4 P. pastoris HIS4 P. pastoris lub lub S. cerevisiaeS. cerevisiae• gengen ARG4 S. cerevisiae ARG4 S. cerevisiae• gengen URA3 P. pastoris URA3 P. pastoris• gengen ADE1 P. pastoris ADE1 P. pastoris

Drożdżowe markery selekcyjneDrożdżowe markery selekcyjne

H. polymorphaH. polymorpha geny oporności na antybiotykigeny oporności na antybiotyki • gen oporności na zeocynęgen oporności na zeocynę• gen oporności na fleomycynęgen oporności na fleomycynę

markery auksotroficznemarkery auksotroficzne• gengen LEU 1.1 H. polymorpha LEU 1.1 H. polymorpha• gengen URA3 H. polymorpha URA3 H. polymorpha• gengen ADE11 H. polymorpha ADE11 H. polymorpha• gengen LEU2 S. cerevisiae LEU2 S. cerevisiae• gengen URA3 S. cerevisiae URA3 S. cerevisiae• gen gen LEU2 C. albicans LEU2 C. albicans

Sekwencje umożliwiające utrzymanie się Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdżywektora ekspresyjnego w komórce drożdży

P. pastorisP. pastoris Sekwencje umożliwiające rekombinację Sekwencje umożliwiające rekombinację

homologiczną z genomem drożdżyhomologiczną z genomem drożdży• 5’ fragment promotora 5’ fragment promotora AOX1AOX1• 5’ fragment promotora 5’ fragment promotora GAPGAP• gen gen HIS4 P. pastorisHIS4 P. pastoris

Sekwencje umożliwiające utrzymanie się Sekwencje umożliwiające utrzymanie się wektora ekspresyjnego w komórce drożdżywektora ekspresyjnego w komórce drożdży

H. polymorphaH. polymorpha Sekwencje umożliwiające rekombinację Sekwencje umożliwiające rekombinację

homologiczną wektora z genomem drożdżyhomologiczną wektora z genomem drożdży• gen gen MOX H. polymorphaMOX H. polymorpha• gen AMO gen AMO H. polymorphaH. polymorpha • gen gen LEU2 S. cerevisiaeLEU2 S. cerevisiae• gen gen URA3 S. cerevisiaeURA3 S. cerevisiae

Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację wektora w komórkach drożdżywektora w komórkach drożdży

• sekwencje ARS sekwencje ARS H. polymorphaH. polymorpha

Zewnątrzkomórkowa produkcja białekZewnątrzkomórkowa produkcja białek

Sekwencje sygnalne

obcego białka

α-faktora S. cerevisiae

kwaśnej fosfatazy

Zwiększenie poziomu sekrecji białek przez Zwiększenie poziomu sekrecji białek przez komórki drożdżykomórki drożdży

Wprowadzenie do komórek drożdży dodatkowych Wprowadzenie do komórek drożdży dodatkowych genów kodujących białka opiekuńcze obecne w genów kodujących białka opiekuńcze obecne w

retikulum endoplazmatycznymretikulum endoplazmatycznym

Foldazy Foldazy • izomerazy disulfidoweizomerazy disulfidowe

Białka opiekuńczeBiałka opiekuńcze• kalneksynakalneksyna• kalretikulinakalretikulina

Kierowanie białek do peroksysomówKierowanie białek do peroksysomów

PeroksysomyPeroksysomy Zdolne do akumulacji dużej Zdolne do akumulacji dużej

ilości białekilości białek Nie zawierają enzymów Nie zawierają enzymów

modyfikujących białkamodyfikujących białka• fosfokinazfosfokinaz• glikozylazglikozylaz• proteazproteaz

Umożliwiają produkcję Umożliwiają produkcję niezmodyfikowanych białekniezmodyfikowanych białek

Sekwencja kierująca do Sekwencja kierująca do peroksysomów peroksysomów

-Ser-Lys-Leu-COOH-Ser-Lys-Leu-COOH

peroksysomy

H. polymorpha rosnąca w pożywce z metanolem

Szczepionki przeciwko wirusowi HPV Szczepionki przeciwko wirusowi HPV (wirusowi ludzkiego brodawczaka)(wirusowi ludzkiego brodawczaka)

Silgard (MSD)Silgard (MSD)

Substancja czynna – białko L1 Substancja czynna – białko L1 czterech typów HPV (16, 18, 6 i 11)czterech typów HPV (16, 18, 6 i 11)

Adiuwant – sole glinuAdiuwant – sole glinu

Cervarix (GlaxoSmithCline)Cervarix (GlaxoSmithCline)

Substancja czynna – białko L1 Substancja czynna – białko L1 dwóch typów HPV (16 i 18)dwóch typów HPV (16 i 18)

Adiuwant – sole glinu + MPL Adiuwant – sole glinu + MPL (monofosforylowany lipid A)(monofosforylowany lipid A)

Białko L1 produkowane w drożdżach S. cerevisiae

Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe

Documents

Transcript of Szczepionki zawierające rekombinantowe antygeny białkowe