Struktura chromatyny rejonu - Strona Wydziału Biologii UW · Struktura chromatyny rejonu...

Praca magisterska

Struktura chromatyny rejonu promotorowego genu CTA1 drożdży

Saccharomyces cerevisiae

Takao Ishikawa

Uniwersytet Warszawski

2003

Struktura chromatyny rejonu promotorowego genu CTA1 drożdży

Saccharomyces cerevisiae

Takao Ishikawa

Praca magisterska wykonana

pod kierunkiem dr. hab. Jana Fronka

Zakład Biologii Molekularnej Instytut Biochemii, Wydział Biologii

Uniwersytet Warszawski

2003

Serdecznie dziękuję

dr. hab. Janowi Fronkowi za opiekę, życzliwość, cierpliwość i zawsze konstruktywne rady

mgr Urszuli Bulkowskiej

dr Joannie Trzcińskiej-Danielewicz za życzliwość i praktyczne rady

Agacie Jacewicz

za nieocenioną pomoc w pracy laboratoryjnej

wszystkim pracownikom i studentom Zakładu Biologii Molekularnej

za stworzenie wspaniałej atmosfery pracy

Spis treści

1. Streszczenie...................................................................................................................1 2. Wstęp.........................................................................................................................2 3. Założenia i cel pracy................................................................................................13 4. Materiały i metody...................................................................................................14 Informacje ogólne....................................................................................................14 Szczepy Saccharomyces cerevisiae wykorzystywane do doświadczeń.....14 Pojemność stosowanych kolb Erlenmeyera i objętość hodowli........................15 Badanie aktywności promotora genu CTA1 za pomocą genu reporterowego.................16 Konstrukcja genu reporterowego oraz wektory.................................................16 Otrzymywanie DNA plazmidowego z bakterii.................................................17 Transformacja S.cerevisiae i selekcja transformantów......................................18 Pożywki użyte do regulacji aktywności genu CTA1.........................................19 Hodowla S.cerevisiae.........................................................................................19 Schemat doświadczenia.....................................................................................21 Sporządzenie ekstraktów...................................................................................22 Oznaczenie poziomu aktywności promotora genu CTA1..................................23 Oznaczanie stężenia białka w otrzymanym ekstrakcie........................23 Oznaczanie aktywności β-galaktozydazy............................................24 Obliczanie aktywności właściwej β-galaktozydazy............................25 Analiza statystyczna............................................................................26 Badanie struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1.......................................27 Pożywki użyte w części doświadczenia dotyczącej ustalania struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1....................................................28 Hodowla S.cerevisiae.........................................................................................28 Izolacja jąder komórkowych S.cerevisiae i trawienie chromatyny nukleazą z micrococcus i DNazą I.......................................................................................30 Usuwanie komponentów białkowych z preparatu chromatyny i uzyskanie oczyszczonego DNA.........................................................................................33 Elektroforeza DNA w żelu agarozowym mająca na celu sprawdzenie jakości preparatu............................................................................................................34 Analiza produktów trawienia DNazy I i nukleazy z Micrococcus....................35 Trawienie endonukleazą restrykcyjną MboI......................................................35

Elektroforeza DNA w żelu agarozowym preparatów gotowych do przeniesienia na membranę......................................................................................................36 Przenoszenie DNA z żelu agarozowego na membranę.....................................36 Znakowanie sondy do hybrydyzacji..................................................................37 Hybrydyzacja typu Southern.............................................................................38 Autoradiografia..................................................................................................39 5. Wyniki.........................................................................................................................40 Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 i kinetyka indukcji............................40 Komórki z plazmidem episomalnym Hodowla w logarytmicznej fazie wzrostu.........................................................45 Komórki z plazmidem episomalnym Hodowla w fazie stacjonarnej............................................................................46 Komórki z plazmidem integracyjnym Hodowla w logarytmicznej fazie wzrostu.........................................................47 Komórki z plazmidem integracyjnym Hodowla w fazie stacjonarnej............................................................................48 Reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1..........................51 Ustalenie miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepie kontrolnym (MHY501α)...................................................................................53 Analiza miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepie pip2.........56 Analiza miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepach adr1 i oaf1 w warunkach represji i derepresji genu CTA1...................................................58 Próba porównania położenia miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepach MHY501α, adr1, oaf1 i pip2 w warunkach derepresji genu CTA1..................................................................................................................60 Analiza miejsc nadwrażliwych na DNazę I w szczepie kontrolnym (MHY501α) i szczepie oaf1 w warunkach indukcji genu CTA1............................................61 6. Dyskusja.....................................................................................................................63 Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 i kinetyka indukcji..............63 Reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1............69 7. Podsumowanie...........................................................................................................72 8. Literatura...................................................................................................................73

1

1. Streszczenie

Gen CTA1 kodujący katalazę A występującą w peroksysomach drożdży

Saccharomyces cerevisiae podlega trójpoziomowej regulacji ekspresji zależnej od

dostępnego źródła węgla. Ważną rolę w regulacji genu CTA1, a także innych genów

peroksysomalnych, odgrywają czynniki transkrypcyjne Oaf1p i Pip2p. Ich rola w

indukcji genów peroksysomalnych nie została jednak jednoznacznie wyjaśniona. W

derepresji, a prawdopodobnie także w indukcji genu CTA1 bierze również udział

czynnik transkrypcyjny Adr1p, regulujący transkrypcję wielu genów podlegających,

podobnie jak gen CTA1, represji glukozowej.

Badano wpływ wymienionych czynników transkrypcyjnych na ekspresję genu

CTA1 śledząc poziom indukcji genu CTA1 przy użyciu wprowadzonej do komórek

S.cerevisiae konstrukcji będącej fuzją obszaru promotora genu CTA1 z genem

reporterowym, a także analizując strukturę nukleosomową rejonu promotora badanego

genu w warunkach represji, derepresji i indukcji.

Przeprowadzone badania sugerują, iż istotną rolę w procesie indukcji genu

CTA1 pełni czynnik transkrypcyjny Oaf1p, natomiast czynniki transkrypcyjne Pip2p i

Adr1p wydają się nie pełnić istotnej roli w indukcji genu CTA1.

Uzyskane wyniki wskazują na subtelną reorganizację struktury chromatyny

zachodzącą podczas indukcji w rejonie promotora genu CTA1. Nie zaobserwowano

natomiast istotnych zmian struktury chromatyny w procesie derepresji genu CTA1. Jak

dotąd nie udało się jednoznacznie określić wpływu poszczególnych czynników

transkrypcyjnych na strukturę chromatyny rejonu promotora badanego genu.

2

2. Wstęp

W każdym organizmie żywym informacja genetyczna zawarta jest w kwasie

deoksyrybonukleinowym (DNA). We wszystkich organizmach jest odpowiedzialna za

rozmaite procesy życiowe, ponadto w organizmach wielokomórkowych odpowiada ona

także za proces rozwojowy, prowadzący do ukształtowania dojrzałego organizmu z

zygoty powstałej w wyniku zapłodnienia.

Organizmy żyjące dzieli się na prokarionty i eukarionty. Jedną z

najważniejszych cech różniących te dwie grupy jest rozmieszczenie DNA w komórce. U

prokariontów DNA znajduje się w cytoplazmie, w przeciwieństwie do eukariontów,

których materiał genetyczny znajduje się w jądrze komórkowym. Warto tutaj

wspomnieć, że komórka eukariotyczna jest tworem wysoce uporządkowanym.

Występuje w niej wiele wyspecjalizowanych struktur zbudowanych z błon lipidowych,

których funkcje są ściśle zdefiniowane. Można do nich zaliczyć m.in. jądro komórkowe

przechowujące materiał genetyczny, siateczkę śródplazmatyczną będącą m.in. miejscem

syntezy białek, aparat Golgiego odpowiedzialny za transport i sekrecję odpowiednich

białek i peroksysomy, w których przede wszystkim zachodzą procesy związane z

detoksykacją komórki.

Funkcje jądra komórkowego nie ograniczają się do fizycznej izolacji materiału

genetycznego. Jest to miejsce, w którym przebiega transkrypcja oraz różne procesy

prowadzące do powstania ostatecznej cząsteczki mRNA transportowanej następnie do

cytoplazmy, gdzie zachodzi translacja. Fakt, że istnieje bariera oddzielająca materiał

genetyczny wprowadza dodatkowy etap umożliwiający regulację wyrażania informacji

genetycznej.

3

DNA w jądrze komórki eukariotycznej występuje w skondensowanej formie

związany z silnie konserwowanymi ewolucyjnie białkami histonowymi, tworząc

chromatynę. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny jest nukleosom,

zbudowany z oktameru histonowego składającego się z histonów H2A, H2B, H3 i H4

oraz fragmentu DNA o długości 146pz [1, 2]. Taki kompleks DNA i białek histonowych

kondensując dalej tworzy tzw. włókno 30nm będące kolejnym stopniem upakowania

materiału genetycznego. Włókna 30nm uważa się za najczęściej występującą formę

chromatyny w jądrze niedzielącej się komórki. Warto przy tym wspomnieć, że w

procesie kondensowania chromatyny bierze udział również histon H1, który wiąże się z

DNA łączącym poszczególne nukleosomy [3]. W dzielących się komórkach dalsza

kondensacja chromatyny ostatecznie prowadzi do powstania chromosomów

metafazowych będących najsilniej skondensowaną formą materiału genetycznego.

Histony H2A, H2B, H3 i H4 wchodzące w skład rdzenia nukleosomu mają

identyczny schemat budowy charakteryzujący się silnie zasadową częścią rdzeniową

tych białek oraz ogonami nie przyjmującymi konkretnych struktur przestrzennych.

Domena rdzeniowa histonów, ze względu na swoje właściwości fizyczne, bardzo

efektywnie oddziałuje z DNA umożliwiając wspomnianą wcześniej jego kondensację

[4]. Część ogonowa histonów ulega różnym modyfikacjom posttranslacyjnym:

acetylacji [5], fosforylacji [6], metylacji [7] i ubikwitynylacji [8, 9]. Uważa się, że

enzymy modyfikujące reszty aminokwasowe tego rejonu mają ułatwiony dostęp dzięki

brakowi zwartych i zdefiniowanych struktur przestrzennych. Modyfikacje

posttranslacyjne ogonów histonowych pełnią istotną rolę w regulacji stopnia

kondensacji chromatyny. Acetylacja powoduje obniżenie ładunku pozytywnego

histonów i osłabia oddziaływanie DNA z tymi białkami, a w konsekwencji powoduje

4

rozluźnienie struktury chromatyny [10]. Jednak modyfikacje te nie służą jedynie

regulacji struktury chromatyny. Hipoteza kodu histonowego zakłada, że pewne

kombinacje modyfikacji posttranslacyjnych mogą powodować selektywną indukcję lub

represję niektórych obszarów genoforu [11].

Niewątpliwie formowanie chromatyny służy kondensacji DNA, ale jej funkcje,

jak wcześniej wspomniano, nie ograniczają się jedynie do fizycznego zmniejszenia

długości nici DNA. Dzięki badaniom prowadzonym w ciągu ostatnich kilkunastu lat

okazało się, że chromatyna pełni także funkcje regulujące transkrypcję genów, ponadto

bierze ona udział w wielu procesach komórkowych związanych z DNA, takich jak

naprawa czy rekombinacja [12].

Często spotykany w ostatnich latach termin „epigenetyka” definiuje się jako

„dziedziczne zmiany ekspresji genów niezależne od sekwencji nukleotydowej DNA”

[13]. Mechanizmy epigenetycznej regulacji transkrypcji genów uważa się zatem za

niezależne w sposób bezpośredni od sekwencji nukleotydowej DNA. Głównymi

mechanizmami takiej regulacji transkrypcji genów jest metylacja DNA i

posttranslacyjne modyfikacje ogonów histonów powodujące reorganizację struktury

chromatyny [14]. Obszary DNA, które uległy metylacji są zwykle nieaktywne

transkrypcyjnie [13], znajduje to potwierdzenie również w przypadku wyciszenia

transkrypcji genów w jednej z kopii chromosomów X u samic ssaków [15]. Metylacja

DNA i modyfikacje ogonów histonów są ze sobą powiązane w słabo jak dotąd poznany

sposób. Istnieje jednak kilka przykładów wskazujących na związek tych zjawisk.

Jednym z nich jest Neurospora crassa. W organizmie tym stwierdzono, iż do metylacji

DNA konieczna jest metylacja określonych reszt aminokwasowych w obrębie ogonów

histonowych [16]. Istnieje również głęboki związek między metylacją DNA i

5

deacetylacją histonów. Badania wykazały, że metylacja DNA jest znacznikiem

rozpoznawanym przez deacetylazy histonów, które przeprowadzają deacetylację

ogonów histonów znajdujących się w nukleosomach w danym rejonie [17]. Powoduje

to kondensację DNA i ogólną represję transkrypcji genów. Natomiast regulacja

transkrypcji genów w drodze reorganizacji struktury chromatyny opiera się, najogólniej

rzecz biorąc, na przesuwaniu nukleosomów i modulowaniu dostępności określonych

sekwencji promotorowych dla czynników transkrypcyjnych i maszynerii

transkrypcyjnej. W tym przypadku, podobnie jak w przypadku metylacji, stwierdzono

głęboki związek z modyfikacjami posttranslacyjnymi ogonów histonowych. Okazało się

bowiem, że rekrutacja kompleksów reorganizujących strukturę chromatyny, takich jak

Swi/Snf, uzależniona jest od acetylacji ogonów histonowych przeprowadzonej przez

acetylazy histonowe [18, 19]. Wszystkie przedstawione przykłady wskazują na to, że

mechanizmy epigenetycznej regulacji transkrypcji genów mają silne powiązania.

Znanych jest wiele genów, których aktywność transkrypcji regulowana jest

przez zmianę rozmieszczenia nukleosomów w rejonie promotorowym. Pod tym

względem dokładnie poznano m.in. geny z grupy GAL (białka umożliwiające

wykorzystanie galaktozy) [20, 21] i PHO (fosfataza kwaśna oraz białka regulatorowe)

[22], gen ADH2 (dehydrogenaza alkoholowa II) [23, 24, 25] i gen TOP1

(topoizomeraza I) [26]. Wszystkie te badania zostały przeprowadzone na drożdżach

piekarniczych Saccharomyces cerevisiae. Jest to najprostszy dobrze poznany organizm

eukariotyczny, a łatwość manipulacji genetycznych i znajomość pełnej sekwencji

nukleotydowej jego genomu czyni go bardzo atrakcyjnym organizmem modelowym do

różnych badań. Ponadto posiada on wiele wspólnych cech z wyższymi organizmami

eukariotycznymi. Można wśród nich wymienić m.in. ogólne zasady organizacji

6

struktury chromatyny, modyfikacje posttranslacyjne histonów i obecność kompleksów

zmieniających strukturę chromatyny w sposób zależny od ATP [27]. Warto jednak

pamiętać o szczególnych cechach S.cerevisiae. Genom S.cerevisiae jest niezwykle mały

i prawie w całości aktywny transkrypcyjnie, podczas gdy w genomach wyższych

organizmów eukariotycznych jedynie niewielka jego część ulega transkrypcyji [28].

Niektóre obszary metabolizmu komórkowego również są nieco odmienne w

S.cerevisiae. Przykładem tego może być β-oksydacja, która zachodzi wyłącznie w

peroksysomach [29]. To organellum pełni więc istotną rolę w degradacji kwasów

tłuszczowych w komórkach drożdżowych, a dzięki temu S.cerevisiae staje się

atrakcyjnym organizmem do prowadzenia badań nad tymi procesami.

Podobnie jak w przypadku genów z grupy GAL i genu ADH2, geny

peroksysomalne są regulowane przez warunki środowiska zewnętrznego. Zarówno dla

genów z grupy GAL i genu ADH2, jak i dla genów peroksysomalnch jest nim źródło

węgla. Geny z grupy GAL ulegają transkrypcji, gdy w środowisku znajduje się

galaktoza [20], natomiast gen ADH2 jest aktywowany przez etanol lub brak glukozy

[23]. W obu przypadkach regulacja jest dwupoziomowa (represja i derepresja). Sytuacja

staje się bardziej skomplikowana w przypadku genów peroksysomalnych [30]. Kiedy w

środowisku jest dostatecznie wysokie stężenie glukozy, która jest dla S.cerevisiae

najdogodniejszym źródłem węgla, geny peroksysomalne ulegają represji [31]. Wynika

to z faktu, iż w warunkach optymalnych komórka nie przeprowadza biogenezy

peroksysomów. Derepresja tych genów jest powodowana obecnością związków

niefermentowalnych, takich jak etanol. W stanie derepresji geny te ulegają transkrypcji,

ale na bardzo niskim poziomie. Dopiero w środowisku bogatym w kwasy tłuszczowe

geny peroksysomalne ulegają pełnej indukcji [32]. Można zatem stwierdzić, że jest to

7

regulacja trójpoziomowa.

Geny peroksysomalne można podzielić na dwie grupy: geny kodujące białka

odpowiedzialne za proliferację peroksysomów i geny kodujące enzymy katalizujące

reakcje chemiczne zachodzące w peroksysomach. W przypadku S.cerevisiae do

pierwszej grupy zalicza się około 20 genów PEX [33]. Fakt, iż mutacje genów

ortologicznych u człowieka powodują choroby genetyczne, takie jak syndrom

Zellwegera [34], wyraźnie wskazuje na to, że są to geny kodujące białka odgrywające

istotne role w podstawowym metabolizmie komórki. Do drugiej grupy zalicza się takie

geny jak CTA1 (katalaza A) [35], POX1 (oksydaza acyloCoA), ECI1 (izomeraza

enoiloCoA), FOX2 (kompleks β-oksydacji) i FOX3 (tiolaza 3-oksoacyloCoA) [36].

Obok enzymów degradujących kwasy tłuszczowe, w peroksysomach występują także

enzymy przeprowadzające detoksykację komórki. Wśród nich szczególnie istotną rolę

wydaje się pełnić katalaza A kodowana przez gen CTA1, która jest odpowiedzialna za

utylizację cząsteczki H2O2 powstającej m.in. w procesie rozkładu kwasów tłuszczowych

w peroksysomach.

Transkrypcja genu CTA1 jest regulowana nie tylko przez źródło węgla, ale

także przez tlen oraz hem [37]. Zarówno hodowla S.cerevisiae w warunkach

beztlenowych, jak i brak hemu powodują znaczne obniżenie poziomu mRNA genu

katalazy A. Podobny sposób regulacji dotyczy także innych genów, ale w przypadku

genu CTA1 obecność hemu nie znosi zahamowania transkrypcji spowodowanego

hodowlą w warunkach beztlenowych. Jest to cecha wyróżniająca gen CTA1 spośród

innych genów regulowanych przez tlen i hem. Poziom ekspresji genu CTA1 nie zmienia

się także pomimo zmiany poziomu Hap1p, czynnika transkrypcyjnego zależnego od

hemu [38]. Jest to zaskakujące, ponieważ w rejonie promotorowym genu CTA1

8

stwierdzono obecność sekwencji wykazującej duży stopień podobieństwa do sekwencji

wiążącej Hap1p i można było się spodziewać wpływu tego białka na poziom ekspresji

genu CTA1 [35]. Wydaje się więc prawdopodobne, że istnieje niepoznany jeszcze

mechanizm regulujący transkrypcję genu CTA1 przy udziale tlenu i hemu.

Jak wcześniej wspomniano, regulacja transkrypcji genu CTA1 zależna od

dostępnego źródła węgla jest trójpoziomowa, a jej mechanizm jest dużo lepiej poznany

w porównaniu z mechanizmem regulacji przy udziale tlenu i hemu. Zidentyfikowane

zostały sekwencje nukleotydowe w rejonie promotora genu CTA1, z którymi wiążą się

odpowiednie białka regulujące transkrypcję tego genu, m.in. Oaf1p, Pip2p i Adr1p.

Funkcje niektórych z tych białek nie zostały jednak jednoznacznie określone.

Sekwencja nukelotydowa ORE Fragment sekwencji

promotora genu CTA1 CGGCTTTAACAAATATAAACTCCG

Konsensus CGGNNNTNA(N.....9 - 12)CCG

Tab. 2-1 Porównanie sekwencji ORE występującej w rejonie od -209 do -185 promotora genu CTA1 z

konsensusem tej sekwencji. Zaadaptowano z [39].

Charakterystyczną sekwencją nukleotydową występującą w rejonie

promotorów genów regulowanych przez kwasy tłuszczowe jest ORE (oleate response

element) [39]. Sekwencja ta odpowiedzialna jest za wiązanie białek aktywujących

transkrypcję wielu genów peroksysomalych, w tym także genu CTA1. W przypadku

tego genu, sekwencja ORE występuje w rejonie od -209 do -185 (numerem 1

oznaczono początek sekwencji nukleotydowej kodującej Cta1p) [35]. Tuż obok

znajduje się inna istotna sekwencja nukleotydowa biorąca udział w regulacji

transkrypcji genu CTA1. Jest to sekwencja UAS1 (upstream activating sequence type 1)

9

występująca w rejonie od -184 do -156 [40]. Jest ona miejscem wiązania białka

odpowiedzialnego za derepresję genu CTA1 [32].

Stosunkowo dobrze poznana została rola czynników transkrypcyjnych Oaf1p,

Pip2p i Adr1p w regulacji transkrypcji genu CTA1. Pip2p zostało opisane również jako

Oaf2p [41]. Porównanie Oaf1p i Pip2p wykazało około 40% homologię sekwencji

aminokwasowych, szczególnie wysoką w części N-końcowej tych białek, gdzie

znajdują się motywy „palców cynkowych” (Zn2Cys6) odpowiedzialne za wiązanie tych

białek z sekwencją ORE [42, 43, 44]. Białka te wydają się wiązać z sekwencją ORE

jako heterodimer Oaf1p-Pip2p [43, 45, 46], jednak istnieją badania sugerujące

możliwość wiązania się homodimeru (Oaf1p)2 z sekwencją ORE przy braku Pip2p [39,

45]. Niedobór Pip2p może być spowodowany różnicą w ekspresji genów kodujących te

białka. W przeciwieństwie do genu OAF1 wyrażanego konstytutywnie, transkrypcja

genu PIP2 jest aktywowana przez kwasy tłuszczowe, a w rejonie promotorowym genu

PIP2 występuje sekwencja ORE [45]. Niektóre prace sugerują jednak konieczność

występowania heterodimeru Oaf1p-Pip2p do indukcji genu CTA1 [43, 45, 46], tak więc

mechanizm aktywacji transkrypcji tego genu wymaga dalszych badań.

Adr1p jest czynnikiem transkrypcyjnym aktywującym transkrypcję genów

związanych z wykorzystywaniem niefermentowalnych źródeł węgla, takich jak etanol,

glicerol czy kwasy tłuszczowe, kiedy stężenie glukozy w pożywce jest zbyt niskie [31].

Pod jego kontrolą jest wiele genów kodujących enzymy związane z metabolizmem

niefermentowalnych źródeł węgla, w tym gen CTA1 [41]. Adr1p wiąże się z sekwencją

UAS1 występującą w rejonie od -184 do -156 genu CTA1 i pełni istotną rolę w

derepresji tego genu [32]. Niektóre prace sugerują także udział tego białka w indukcji

genu CTA1 [32, 47]. Istnieje jednak praca, która stwierdza brak oddziaływania między

10

Adr1p i sekwencją ORE [32]. Wydają się więc niezbędne dalsze badania mające na celu

wyjaśnienie mechanizmu ewentualnej indukcji genu CTA1 przez Adr1p§.

CTA1 ORE UAS1

Oaf1p P ip2p Adr1p

Oaf1p Oaf1p

lub

Indukcja Derepresja

?

-209 -185 -184 -156 +1

Ryc. 2-1 Schemat rejonu promotora genu CTA1. Zaznaczono istotne sekwencje nukleotydowe biorące udział w

regulacji tego genu oraz oddziałujące z nimi białka.

Regulacja genów związanych z wykorzystaniem niefermentowalnych źródeł

węgla może również być kontrolowana na wyższym poziomie. W procesie tym biorą

udział takie białka jak Snf1p i Glc7p [47, 48]. Snf1p jest kinazą białkową działającą

wydajnie w warunkach niskiego stężenia glukozy w komórce. Aktywna forma Snf1p

fosforyluje wcześniej wspomniany czynnik transkrypcyjny Adr1p i umożliwia jego

działanie jako aktywatora transkrypcji genów związanych z wykorzystywaniem

niefermentowalnych źródeł węgla. Glc7p zaś jest fosfatazą białkową aktywną w

warunkach wysokiego stężenia glukozy w komórce i działając na Adr1p uniemożliwia

§ W ostatnim czasie stwierdzono, że ekspresja genu PIP2 jest zależna od Adr1p [66]. W sugerowanej przez

niektórych autorów indukcji genu CTA1 przez Adr1p może więc pośredniczyć gen PIP2. Nie poznano jednak

ewentualnego mechanizmu indukcji genu CTA1 przez Adr1p.

11

jego działanie jako czynnika transkrypcyjnego [48]. Można stwierdzić, że Adr1p pełni

rolę swoistego „przełącznika” odpowiednich genów, w tym genu CTA1, włączającego

lub wyłączającego transkrypcję w zależności od stężenia glukozy w środowisku

zewnętrznym.

Istnieje inny, równie ważny mechanizm regulacji transkrypcji genów, który

najprawdopodobniej jest zaangażowany także w regulację transkrypcji genu CTA1. Jest

nim reorganizacja struktury chromatyny. Czasowe wyłączenie syntezy histonu H4 w

specjalnie skonstruowanym szczepie S.cerevisiae spowodowało aktywację transkrypcji

ok. 15% genów zawartych w genomie [49]. Jako przyczynę tego zjawiska podano

niemożność formowania poprawnej struktury chromatyny spowodowaną brakiem

histonu H4, a w konsekwencji ogólne rozluźnienie chromatyny. W ten sposób białka

inicjujące transkrypcję genów uzyskują łatwiejszy dostęp do istotnych w tym procesie

sekwencji nukleotydowych. Wśród genów, w których nastąpiła aktywacja transkrypcji

znajduje się również gen CTA1. Może to świadczyć o tym, że istnieje związek struktury

chromatyny i regulacji transkrypcji genu CTA1. Jednak rozluźnienie struktury

chromatyny może powodować również zmiany poziomu ekspresji innych genów,

których produkty wpływają na transkrypcję genu CTA1, tak więc może to być jedynie

efekt pośredni.

Dzięki stosunkowo dobrze poznanym wpływom czynników transkrypcyjnych

oraz prawdopodobnemu udziałowi struktury chromatyny w regulacji ekspresji genu

CTA1, gen ten wydaje się atrakcyjnym modelem do badań nad wpływem struktury

chromatyny na ekspresję genów. Pełne poznanie mechanizmów regulacji transkrypcji

genów w komórkach S.cerevisiae powinno ułatwić także zrozumienie podobnych

procesów w innych organizmach. Dzięki temu możliwe będzie dokładne poznanie

12

mechanizmów rozwoju organizmu, przyczyn wielu chorób, metod ich leczenia i innych

zagadnień związanych z wyrażaniem informacji genetycznej.

13

3. Założenia i cel pracy

Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 regulowana jest w zależności

od dostępnego źródła węgla. Mechanizm ten został dość dobrze poznany, jednak rola

niektórych czynników transkrypcyjnych biorących udział w regulacji transkrypcji genu

CTA1 nie została jednoznacznie wyjaśniona. Nie została także poznana kinetyka

indukcji genu CTA1.

Prawdopodobna natomiast jest regulacja aktywności transkrypcji genu CTA1

przez reorganizację struktury chromatyny. Jednak do tej pory nie zostały

przeprowadzone badania mające na celu stwierdzenie udziału tego mechanizmu w

regulacji transkrypcji genu CTA1.

Celem tej pracy było:

• Ustalenie wpływu nieobecności czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p

na regulację aktywności transkrypcyjnej genu CTA1.

• Zbadanie kinetyki indukcji genu CTA1.

• Wykazanie udziału reorganizacji struktury chromatyny w regulacji aktywności

transkrypcyjnej genu CTA1 oraz wpływu czynników transkrypcyjnych Adr1p,

Oaf1p i Pip2p na reorganizację struktury chromatyny.

14

4. Materiały i metody

Informacje ogólne

Jeżeli nie zaznaczono inaczej, stosowano odczynniki cz.d.a. z firm: Sigma,

POCh i Merck.

Szczepy Saccharomyces cerevisiae wykorzystywane do doświadczeń

Symbol szczepu

Symbol usuniętej

ORF

Nazwa usuniętego

genu Genotyp

MHY501α MATα; his3-∆200; leu2-3; 112 ura3-52 trp1-1 BY4742 MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; ura3∆0 Y10355

oaf1 YAL051w OAF1

BY4739; MATα; leu2∆0; lys2∆0; ura3∆0; YAL051w::kanMX4

Y11660 pip2

YOR363c PIP2 BY4742; MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; ura3∆0; YOR363c::kanMX4

Y13575 adr1

YDR216w ADR1 BY4742; MATα; his3∆1; leu2∆0; lys2∆0; ura3∆0; YDR216w::kanMX4

Wszystkie wyżej wymienione szczepy pochodzą z EUROSCARF (European

Saccharomyces cerevisiae archive for functional analysis) z wyjątkiem szczepu

MHY501α, który został opisany w [50].

15

Pojemność stosowanych kolb Erlenmeyera i objętość hodowli

Pojemność kolby Objętość hodowli 100ml 25ml 250ml 50ml lub 75ml 2000ml 500ml

16

Badanie aktywności promotora genu CTA1 za pomocą genu

reporterowego

Badanie aktywności promotora genu CTA1 prowadzono przy użyciu

wprowadzonej do komórek S.cervisiae konstrukcji będącej fuzją natywnego obszaru

promotora genu CTA1 z genem kodującym β-galaktozydazę. Po sporządzeniu ekstraktu

z odpowiednich hodowli S.cerevisiae oznaczano zawartość białka oraz aktywność

β-galaktozydazy niżej opisanymi metodami. Obliczona w sposób niżej opisany

aktywność właściwa β-galaktozydazy jest pośrednią miarą aktywności transkrypcyjnej

promotora genu CTA1.

Konstrukcja genu reporterowego oraz wektory

Doświadczenie prowadzono przy użyciu genu reporterowego będącego fuzją

obszaru promotorowego genu CTA1 z S.cerevisiae (sekwencja nukleotydowa od -819 do

+3, numerem 1 oznaczono początek sekwencji nukleotydowej kodującej Cta1p) i

sekwencji genu lacZ z Escherichia coli kodującej β-galaktozydazę. Ten gen fuzyjny

został wprowadzony na wektor episomalny i integracyjny. Wektor episomalny,

pochodna plazmidu YEp357 [51], niesie ori 2µ i dzięki temu występuje w komórce w

wielu kopiach. Wektor integracyjny zaś występuje w komórce w jednej kopii i jest

pochodną plazmidu YIp357, który integruje z genomem w locus URA3 [51]. Oba

plazmidy niosą marker uracylowy przydatny w selekcji transformantów drożdżowych,

ponadto oba plazmidy są bifunkcyjne, funkcjonują zarówno w komórkach S.cerevisiae

17

jak i E.coli. Plazmidy te zostały zaprojektowane, wykonane i udostępnione przez dr. M.

Skonecznego z Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie. Plazmid episomalny

i integracyjny nazwano odpowiednio p149 i p150.

Otrzymywanie DNA plazmidowego z bakterii

Plazmidy udostępnione przez dr. M. Skonecznego znajdowały się w

komórkach E.coli XL-1 Blue MRF’ (∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1

supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F’ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)]). Plazmidowy

DNA został wyizolowany metodą lizy alkalicznej [52]. Dodatkowo do buforu, w

którym zawieszano bakterie, dodano RNazęA (Sigma) do końcowego stężenia

0,5mg/ml.

W celu identyfikacji otrzymanych plazmidów część wyizolowanego preparatu

poddano trawieniu endonukleazami restrykcyjnymi EcoRI/BamHI i ApaI/BamHI

(Fermentas), a następnie przeprowadzono elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym.

Uzyskano fragmenty DNA zgodne z oczekiwanymi na podstawie map restrykcyjnych

tych plazmidów (elektroforetogramów nie przedstawiono).

Plazmid integracyjny został poddany trawieniu endonukleazą restrykcyjną

ApaI (Fermentas), której jedyne miejsce rozpoznawane znajduje się w obrębie genu

URA3. W ten sposób plazmid integracyjny został przygotowany do transformacji i

integracji z genomem S.cerevisiae w locus genu URA3.

18

Transformacja S.cerevisiae i selekcja transformantów

W celu wprowadzenia plazmidów p149 i p150 do wszystkich wyżej

wymienionych szczepów S.cerevisiae, zastosowano metodę wysokowydajnej

transformacji drożdży [53]. S.cerevisiae szczepiono na pożywkę YPD2% (1% ekstrakt

drożdżowy, 1% pepton, 2% glukoza) i inkubowano w 300C z wytrząsaniem

(250obr./min.) przez noc. Po sprawdzeniu gęstości hodowli (liczenie komórek w

komorze Bürkera), przeszczepiano odpowiednią objętość hodowli w ten sposób, aby w

nowej pożywce YPD2% (obj. 50ml) gęstość hodowli wynosiła 5·106komórek/ml.

Prowadzono hodowlę w 300C z wytrząsaniem (250obr./min.) do momentu uzyskania

gęstości hodowli 2·107komórek/ml. Hodowlę wirowano następnie przy 3000g przez

5min., płukano wodą i zawieszano w 1,0ml 100mM octanu litu. Po wirowaniu w

mikrowirówce i usunięciu supernatantu zawieszano osad komórek w 100mM octanu

litu tak, aby objętość końcowa wynosiła 500µl. Do 50µl w ten sposób przygotowanych

komórek S.cerevisiae dodawano 350µl buforu do transformacji (240µl PEG3350 (50%

w/v), 36µl 1M octanu litu, 15µl ssDNA (10mg/ml), 59µl wody) oraz ok. 1µg DNA

plazmidowego. Po dokładnym wymieszaniu mieszaninę inkubowano w 300C przez

30min., a następnie poddawano szokowi cieplnemu w 420C przez 30min. Poprzez

wirowanie w mikrowirówce usuwano bufor do transformacji, a osad komórek

zawieszano w 300µl wody. Całość zawiesiny komórek wysiewano na szalkę z pożywką

ω02% (0,67% YNB (zestaw soli mineralnych i witamin, ang. Yeast Nitrogen Base

without Aminoacids, Difco), 2% glukoza) zawierającą odpowiednie uzupełnienia

aminokwasów (10-50µg/ml), ale bez uracylu, ponieważ selekcja transformantów

opierała się na zniesieniu wymagania uracylu do wzrostu.

19

Pożywki użyte do regulacji aktywności genu CTA1

Represja Derepresja Indukcja ω010% ω0EtOH ω0Kw.Ol. 0,67% YNB 10% glukoza

0,67% YNB 0,5% glukoza 2% etanol

0,67% YNB 0,5% kwas olejowy

Hodowla S.cerevisiae

Dzień 1

Odpowiedni szczep drożdży S.cerevisiae szczepiono na pożywkę ω02% (obj.

50ml) i hodowano w 300C z wytrząsaniem (250obr./min.) przez noc do osiągnięcia

wartości OD600=2,5-3,0 (fazy stacjonarnej).

Dzień 2

Z hodowli założonej w dniu poprzednim szczepiono do pożywek ω010% (obj.

50ml) i ω0EtOH (dwie hodowle o obj. 75ml), odpowiednio po 100-400µl i 1,0-6,0ml

hodowli. Zaszczepione pożywki umieszczano w takich samych warunkach. Hodowle

prowadzono przez noc.

Dzień 3

Hodowle z poprzedniego dnia prowadzono do momentu osiągnięcia wartości

OD600=1,5 (logarytmiczna faza wzrostu) i OD600=2,5 (faza stacjonarna). Po osiągnięciu

planowanych wartości OD600, z hodowli prowadzonych w pożywce ω010% sporządzano

20

ekstrakt (w sposób niżej opisany), natomiast dwie identyczne hodowle prowadzone w

pożywce ω0EtOH o objętości 75ml w pożywce mieszano ze sobą uzyskując w ten

sposób 150ml hodowli. Po rozdzieleniu hodowli na 6 porcji po 25ml, poddawano je

wirowaniu (5000g, 2min.), następnie po usunięciu pożywki w sterylnych warunkach

przenoszono komórki do pożywki ω0Kw.Ol w porcjach po 25ml. Z jednej z sześciu tak

przeszczepionych hodowli sporządzano ekstrakt natychmiast po przeszczepieniu, a

pozostałe pięć hodowli umieszczano w 300C i prowadzono hodowlę z wytrząsaniem

(250obr./min.) przez 3, 6, 9, 12 i 24 godziny. Po hodowli prowadzonej przez określony

czas sporządzano ekstrakt.

Hodowle mające na celu indukcję genu CTA1 przeszczepiano po osiągnięciu

planowanej wartości OD600 w pożywce ω0EtOH, ponieważ komórki S.cerevisiae nie

dzielą się w pożywce ω0Kw.Ol.

Opisana procedura oraz schemat hodowli S.cerevisiae (Ryc. 4-1) dotyczą

pełnego doświadczenia mającego na celu zbadanie zarówno procesu indukcji, jak i

procesu derepresji genu CTA1. W dalszej części pracy zostaną jednak przedstawione

wyłącznie wyniki dotyczące procesu indukcji badanego genu.

21

Ryc. 4-1 Schemat hodowli S.cerevisiae prowadzonych w celu sporządzania ekstraktów drożdżowych, w których

następnie oznaczano aktywność promotora genu CTA1 mierząc aktywność β-galaktozydazy. Linią przerywaną

zaznaczono część doświadczenia, której wyniki zostaną przedstawione w dalszej części pracy.

ω02%

50ml

ω010% 50ml

do OD600=1,5

ω010% 50ml

do fazy

stacjonarnej

ω0EtOH 2 x 75ml

do OD600=1,5

ω0EtOH 2 x 75ml

do fazy stac.

ω0Kw.Ol. 6 x 25ml

ω0Kw.Ol. 6 x 25ml

Ekstrakt

Ekstrakt po

hodowli

przez 3, 6,

9,12 i 24h

Zaraz po

przeszczep.

ekstrakt

Zaraz po

przeszczep.

ekstrakt

Ekstrakt po

hodowli

przez 3, 6,

9,12 i 24h

Ekstrakt

22

Sporządzenie ekstraktów

Hodowlę poddawano wirowaniu przy 5000g przez 2min., w 40C. Osad

komórek uzyskany w wyniku wirowania zawieszano w 25ml sterylnej wody w celu

usunięcia resztek pożywki. Komórki następnie poddawano wirowaniu jak wcześniej, a

uzyskany osad komórek zawieszano w 400µl (dla hodowli o obj. 25ml) lub 800µl (dla

hodowli o obj. 50ml) 50mM buforu potasowo-fosforanowego (50mM KPi pH7,0). Do

zawiesiny dodawano równą objętość szklanych kulek (∅0,45-0,50mm), a następnie

zamrażano w -200C. Na tym etapie przechowywano uzyskane komórki od kilku dni do

miesiąca. Po rozmrożeniu w temperaturze pokojowej komórki rozbijano przez

sześciominutowe wytrząsanie na mikrowstrząsarce typu vortex w temperaturze 40C. W

celu usunięcia nierozbitych komórek i reszt ścian komórkowych, uzyskany homogenat

poddawano wirowaniu przy 10000g przez 5min. w 40C. Otrzymaną w supernatancie

frakcję cytoplazmatyczną wykorzystywano bezpośrednio do oznaczeń stężenia białka

oraz aktywności β-galaktozydazy.

Stosowane podczas sporządzania ekstraktów szklane kulki płukano przed

użyciem w stężonym kwasie solnym. Po ok. 4 godzinach przemywano wodą

doprowadzając do pH7, a następnie suszono przez 3 godziny w 1800C.

23

Oznaczenie poziomu aktywności promotora genu CTA1

A. Oznaczanie stężenia białka w otrzymanym ekstrakcie

Oznaczanie przeprowadzano metodą Bradford [54], zgodnie z niniejszym

schematem. Do oznaczeń używano odczynnika Bradford z firmy Sigma.

Próba

kontrolna 1ml H2O 1ml odczynnika

Bradford Próba

oznaczana 990µl H2O + 10µl ekstraktu rozcieńczonego

2x lub 5x w 50mM KPi 1ml odczynnika

Bradford

Po dodaniu odczynnika Bradford próby pozostawiano na 10min., a następnie

oznaczano spektrofotometrycznie przy długości fali 595nm. Rozcieńczenia

ekstraktu dobierano tak, aby odczyt spektrofotometryczny mieścił się w przedziale

0,2-0,7. Każdy ekstrakt oznaczano w dwóch powtórzeniach, a stężenie białka w

ekstrakcie obliczano na podstawie uśrednionych wartości z dwóch pomiarów.

Podstawę obliczeń stężenia białka stanowiła krzywa wzorcowa wykonana przy

użyciu roztworu albuminy o stężeniu 1mg/ml. Roztwór ten rozcieńczano wodą tak,

aby uzyskać stężenia albuminy 1,67µg/ml, 3,33µg/ml, 5,0µg/ml, 10µg/ml, 15µg/ml i

20µg/ml. Wszystkie wymienione roztwory albuminy oznaczano w dwóch

powtórzeniach i odczyty uśredniano, podobnie jak w przypadku oznaczenia stężenia

białka w próbach. Dla każdej nowej butelki odczynnika Bradford sporządzano nową

krzywą wzorcową.

24

B. Oznaczanie aktywności β-galaktozydazy

Oznaczanie aktywności β-galaktozydazy prowadzono wg [55] przy użyciu

o-nitrofenylogalaktopiranozydu (ONPG). Związek ten rozkładany jest przez

β-galaktozydazę na galaktozę i barwny o-nitrofenol.

Do 800µl buforu Z (60mM NaH2PO4, 40mM Na2HPO4, 10mM KCl, 1mM

MgSO4, pH7,0) dodawano 50µl ekstraktu odpowiednio rozcieńczonego w 50mM

KPi. W próbie kontrolnej zamiast ekstraktu dodawano 50mM KPi. Przygotowaną

próbkę inkubowano w 300C przez 5min. Następnie dodawano 160µl 0,4% ONPG

(substrat do reakcji, rozpuszczony w 50mM Tris-HCl, pH8) i inkubowano w takich

samych warunkach, mierząc czas inkubacji, do uzyskania widocznego gołym okiem

jasno żółtego zabarwienia. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 400µl 1M węglanu

sodu i umieszczano w lodzie.

Oznaczanie zawartości o-nitrofenolu prowadzono spektrofotometrycznie przy

długości fali 420nm.

Oznaczenie aktywności β-galaktozydazy dla każdego ekstraktu prowadzono w

dwóch powtórzeniach. Następnie wyniki pomiaru spektrofotometrycznego

uśredniano w celu prowadzenia dalszych obliczeń. Czas trwania reakcji wahał się od

3 do 46min., natomiast rozcieńczenia ekstraktów od 1 do 500 razy. Różnice

zarówno w czasie reakcji, jak i w rozcieńczeniu ekstraktu wynikają z poziomu

aktywności β-galaktozydazy w poszczególnych ekstraktach.

Reakcja ta jest liniowa w czasie i w stosunku do rozcieńczeń ekstraktu [56].

25

C. Obliczanie aktywności właściwej β-galaktozydazy

Aktywność właściwą β-galaktozydazy obliczano stosując następujący wzór

matematyczny:

tvpluAx

⋅⋅⋅⋅⋅

=ε

gdzie:

x aktywność właściwa β-galaktozydazy [µmol·mg-1·min-1]

A wartość absorbancji przy długości fali 420nm

u całkowita objętość, w której prowadzono reakcję. W stosowanym

układzie doświadczalnym wartość ta wynosiła 1,41 [ml]

ε współczynnik absorbancji o-nitrofenolu przy długości fali 420nm.

Wartość współczynnika wynosi 0,0045 [µM-1·cm-1]

l grubość kuwety. W doświadczeniu używano kuwet o grubości 1 [cm]

p stężenie białka w ekstrakcie [mg/ml]

v objętość nierozcieńczonego ekstraktu dodana do reakcji [ml]

t czas trwania reakcji [min.]

26

Na podstawie otrzymanych wyników dla każdego szczepu, w logarytmicznej

fazie wzrostu oraz w fazie stacjonarnej, obliczano względny poziom indukcji

promotora genu CTA1, wyrażany następującym wzorem:

0h) (Kw.Ol. EtOH

xhKw.Ol.

Akt.Akt.

gdzie:

Akt.Kw.Ol. xh aktywność β-galaktozydazy po x godzinach hodowli w

warunkach indukcji (gdzie x = 3, 6, 9, 12 lub 24 godziny)

Akt.EtOH (Kw.Ol. 0h) aktywność β-galaktozydazy w warunkach derepresji (wartości

uzyskane dla ekstraktów sporządzanych z komórek tuż po ich

przeniesieniu do pożywki ω0Kw.Ol.)

D. Analiza statystyczna

W celu sprawdzenia istotności statystycznej różnic poziomu indukcji genu

CTA1 między szczepem kontrolnym i szczepami badanymi przeprowadzono test

sprawdzający równość wariancji oraz dwustronny test t Studenta różnic między

średnimi przy różnych wariancjach. W obu testach za próg istotności statystycznej

przyjęto wartość p=0,055.

27

Badanie struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1

Przy badaniu struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1 stosowano

metodę pośredniego znakowania końców [57, 58, 59]. Wyizolowane jądra komórkowe

poddawano trawieniu nukleazą z Micrococcus i DNazą I o różnych stężeniach. Po

zakończeniu reakcji odbiałczano DNA i przecinano wyczerpująco odpowiednio dobraną

endonukleazą restrykcyjną. Wybrano endonukleazę restrykcyjną, która nie ma miejsca

cięcia w obszarze, którego strukturę chromatyny analizowano, ale tnącą DNA w pobliżu

tego obszaru. W przypadku genu CTA1 dogodną endonukleazą restrykcyjną jest MboI,

która ma miejsce cięcia zarówno po stronie 5', jak i 3' obszaru promotorowego CTA1.

Po trawieniu enzymem restrykcyjnym DNA poddaje się elektroforezie w żelu

agarozowym, przenosi na filtr i po denaturacji hybrydyzuje z krótką, wyznakowaną

radioaktywnie sondą o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji

zlokalizowanej blisko miejsca działania użytej endonukleazy restrykcyjnej. Z sondą

hybrydyzują odcinki DNA o różnej długości, jednak jeden ich koniec jest zawsze ten

sam, powstały w wyniku trawienia endonukleazy restrykcyjnej. Natomiast drugi koniec

powstaje w wyniku trawienia nukleazą z Micrococcus lub DNazą I. Miejscem działania

nukleazy z Micrococcus jest DNA znajdujący się między nukleosomami, nie chroniony

przez oktamery histonowe. Zatem długości hybrydyzujących odcinków określają

odległość miejsc wrażliwych na użytą nukleazę od miejsca cięcia MboI, a co za tym

idzie, rozmieszczenie nukleosomów w badanym rejonie chromatyny. W przypadku

działania DNazą I można zidentyfikować tzw. miejsca nadwrażliwe. Są one jednak

często w innym miejscu niż miejsca wrażliwe na nukleazę z Micrococcus. Substratem

dla DNazy I są miejsca na nici DNA o zmienionej strukturze przestrzennej. DNaza I

28

atakuje miejsca te nawet wtedy, gdy znajdują się one na nukleosomach. Interesujący jest

również fakt, iż miejsca te są charakterystyczne dla obszarów promotorowych i często

odpowiadają miejscom wiązania czynników transkrypcyjnych [60, 61].

Pożywki użyte w części doświadczenia dotyczącej ustalania struktury

chromatyny w rejonie promotora genu CTA1

Hodowlę mającą na celu odświeżenie i namnożenie komórek S.cerevisiae

prowadzono w pożywce pełnej YPD2%, następnie hodowle przeszczepiano na pożywki

zapewniające regulację aktywności promotora genu CTA1.

Represja Derepresja Indukcja YPD10% YPDE YPO 1% ekstrakt drożdżowy 1% pepton 10% glukoza

1% ekstrakt drożdżowy 1% pepton 0,5% glukoza 2% etanol

1% ekstrakt drożdżowy 1% pepton 0,5% kwas olejowy

Hodowla S.cerevisiae

Dzień 1

Odpowiedni szczep drożdży S.cerevisiae szczepiono na pożywkę YPD2% (obj.

25ml) i hodowano w 300C z wytrząsaniem (250obr./min.) przez noc do osiągnięcia

wartości OD600=9,0-10,0 (fazy stacjonarnej).

29

Dzień 2

Niewielką objętość hodowli (300µl-900µl) założonej poprzedniego dnia

szczepiono do trzech kolb z pożywką YPD10% (represja) i sześciu kolb z pożywką

YPDE (derepresja i indukcja) o objętości 500ml. Pożywki te uzupełniano

streptomycyną i ampicyliną (odpowiednio 40µg/ml i 30µg/ml). Zaszczepione pożywki

umieszczano w takich samych warunkach i prowadzono hodowle przez noc.

Dzień 3

Hodowlę z poprzedniego dnia prowadzono do momentu osiągnięcia OD600=2,5

(logarytmiczna faza wzrostu). Po osiągnięciu planowanej wartości OD600 hodowle z

trzech kolb z jednakową pożywką łączono, a następnie prowadzono izolację jąder

komórkowych (represja i derepresja) lub przenoszono do pożywki YPO (indukcja). W

tym przypadku poddawano hodowlę wirowaniu przy 3000g przez 5min. w temperaturze

pokojowej. Następnie osad komórek przenoszono sterylnie do trzech kolb z pożywką

YPO (obj. 500ml). Hodowlę prowadzono w 300C z wytrząsaniem (250obr./min.) przez

noc.

Dzień 4 (dotyczy tylko hodowli prowadzonej w warunkach indukcji genu CTA1)

Po trwającej 24 godziny hodowli w pożywce YPO rozpoczynano izolację jąder

komórkowych.

Hodowlę mającą na celu indukcję genu CTA1 przeszczepiano po osiągnięciu

planowanej wartości OD600 w pożywce YPDE, ponieważ komórki S.cerevisiae nie

dzielą się w pożywce YPO.

30

Wartości OD600 wskazujące na osiągnięcie przez hodowlę odpowiedniej fazy

wzrostu różnią się w zależności od stosowanej pożywki. Przy hodowli prowadzonej w

pożywce minimalnej ω0 (stosowana w części dotyczącej oznaczenia aktywności

właściwej β-galaktozydazy) wartość OD600=2,5 odpowiada najczęściej fazie

stacjonarnej, w pożywce pełnej YPD wartość ta jednak odpowiada logarytmicznej fazie

wzrostu.

Izolacja jąder komórkowych S.cerevisiae i trawienie chromatyny

nukleazą z Micrococcus i DNazą I

Izolację jąder przeprowadzano metodą wirowania w gradiencie gęstości fikolu

lizatu sferoplastów otrzymanych w wyniku traktowania komórek drożdży zymoliazą

[22]. Hodowlę o odpowiedniej wartości OD600 poddawano wirowaniu przy 3000g przez

5min. w temperaturze pokojowej. Osad komórek zawieszano w równej objętości wody*

i wirowano w takich samych warunkach. Następnie osad zawieszano w 60ml roztworu

1* (20mM EDTA pH7,4, 0,7M β-merkaptoetanol) i umieszczano w 300C. Po inkubacji

trwającej 30min. wirowano zawiesinę komórek przy 3000g przez 5min. w temperaturze

pokojowej. Po zawieszeniu osadu komórek w 50ml 1M sorbitolu*, wirowano jak

wcześniej. Uzyskany osad komórek zawieszano w 20ml roztworu 2* (1M sorbitol, 5mM

β-merkaptoetanol) i przenoszono do kolbki o pojemności 100ml, którą umieszczano w

* Symbolem tym oznaczono roztwory, do których dodawano glukozę do stężenia 5% (w/v) w przypadku

otrzymywania jąder komórkowych z hodowli prowadzonych w pożywce YPD10%. Dodatek ten służył utrzymaniu

stanu represji glukozowej.

31

inkubatorze z wytrząsaniem (300C, 200obr./min.). Następnie dodawano 10-20mg

zymoliazy 100T z Arthrobacter luteus (Seikagaku) zawieszonej w 1ml 50mM KPi

pH7,5 i prowadzono inkubację przez ok. 35min. Stopień strawienia ściany komórkowej

S.cerevisiae oceniano na podstawie obserwacji w mikroskopie świetlnym wykorzystując

właściwości sferoplastów (komórek pozbawionych ściany komórkowej), które

rozpadają się w wodzie na skutek ciśnienia osmotycznego. Po pobraniu niewielkiej

objętości z zawiesiny komórek umieszczano ją w wodzie oraz 1M sorbitolu i

porównywano obraz obu zawiesin. Po stwierdzeniu braku sferoplastów w wodzie

przystępowano do dalszego etapu procedury. W zależności od stopnia strawienia ściany

komórkowej, czas trawienia zymoliazą 100T przedłużano do półtorej godziny

prowadząc obserwację mikroskopową co 15min.

Procedurę otrzymania jąder komórkowych z S.cerevisiae po uzyskaniu

sferoplastów prowadzono w 40C. Sferoplasty wirowano przy 3600g przez 10min.,

uzyskany osad zawieszano w 15ml 1M sorbitolu*. Zawiesinę poddawano wirowaniu w

takich samych warunkach, uzyskując osad sferoplastów gotowych do lizy. Sferoplasty

zawieszano w 100ml roztworu do lizy* (18% ficoll 400 (Pharmacia Fine Chemicals),

20mM KPi pH6,8, 0,25mM EGTA, 0,25mM EDTA, 1mM MgCl2, 1mM PMSF) i

homogenizowano ręcznie w lodzie przy pomocy homogenizatora typu

Pottera-Elvehjema. Homogenat poddawano wirowaniu przy 2500g przez 5min.,

następnie supernatant przenoszono do nowych probówek i wirowano przy 30000g przez

25min (15749obr./min. w wirówce Beckman J-30I Avanti z rotorem JA30.50Ti).

Połowę uzyskanego w ten sposób osadu jąder S. cerevisiae zawieszano w 15ml buforu

do DNazyI* (15mM Tris pH7,4, 75mM NaCl, 3mM MgCl2, 0,05mM CaCl2, 1mM

β-merkaptoetanol), a drugą połowę w 15ml buforu do nuklezay z Micrococcus* (15mM

32

Tris pH8,0, 50mM NaCl, 1,4mM CaCl2, 0,2mM EGTA, 0,2mM EDTA, 5mM

β-merkaptoetanol). Zawiesinę jąder wirowano przy 2500g przez 5min. Osad jąder

zawieszano ponownie w 15ml odpowiedniego buforu i wirowano w takich samych

warunkach. Uzyskany w ten sposób osad jąder zawieszano w 2ml odpowiedniego

buforu. Następnie w celu ustalenia zawartości DNA w otrzymanych preparatach

wprowadzano po 5µl zawiesiny jąder do 2ml roztworu do pomiaru stężenia DNA (1%

SDS, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl, pH7,5). Zawartość DNA w

preparatach ustalano spektrofotometrycznie przy długości fali 260nm. W przypadku

uzyskania odczytów większych niż A260=240 dla nierozcieńczonych preparatów

(A260=0,6 dla preparatu 400 razy rozcieńczonego przy pomiarze) rozcieńczano je

odpowiednim buforem do wartości A260=240, natomiast przy odczytach większych niż

A260=24 dla nierozcieńczonych preparatów (A260=0,06 dla preparatu 400 razy

rozcieńczonego przy pomiarze) rozcieńczano je odpowiednim buforem do wartości

A260=24 (procedura ustalona empirycznie przez dr Joannę Trzcińską-Danielewicz).

Rozcieńczone preparaty dzielono na 6 porcji i poddawano trawieniu DNazą I

(Calbiochem, stężenie końcowe 0,01-2,0U/ml z roztworu 2,2U/µl w wodzie) i nukleazą

z Micrococcus (Sigma, stężenie końcowe 0,00033-2,43U/ml z roztworu 0,2U/µl w

50mM Tris-HCl pH8,0, 0,05mM CaCl2, 20% glicerol) w 370C przez 20min. Reakcję

zatrzymywano przez dodanie buforu STOP 5x (12,5mM Tris pH7,5, 0,375M NaCl,

37,5mM EDTA, 0,75% SDS) do końcowego stężenia 1x. Do preparatów dodawano

proteinazę K (Sigma) do stężenia końcowego 5,0-10µg/ml i inkubowano przez noc w

370C.

33

W stosowanej metodzie bardzo trudno było przewidzieć zawartość DNA w

uzyskanym preparacie na podstawie pomiarów wartości A260 oraz wynikających z nich

obliczeń, ponieważ zaobserwowano brak zależności liniowej między wartością A260 a

zawartością DNA w preparacie. Na podstawie licznych doświadczeń stwierdzono, że

przyjęty sposób postępowania zapewnia poprawną ocenę zawartości DNA w preparacie

i dlatego stosowano go w celu uzyskania odpowiedniego stężenia DNA. Ponadto

dzielono preparaty na 6 porcji, które następnie poddawano działaniu DNazy I lub

nukleazy z Micrococcus o różnym stężeniu. Umożliwiało to późniejszy wybór

preparatów o odpowiednim stopniu strawienia, które poddawano dalszej analizie.

Usuwanie komponentów białkowych z preparatu chromatyny i

uzyskanie oczyszczonego DNA

Do preparatów po trawieniu proteinazą K dodawano równą objętości fenolu

nasyconego 1M Tris-HCl pH8,0. Po energicznym wstrząsaniu wirowano w

mikrowirówce w temperaturze pokojowej. Zbierano fazę wodną do nowej probówki.

Czynność powtarzano dwukrotnie. Następnie dodawano równą objętości chloroformu i

wstrząsano energicznie. Preparat poddawano wirowaniu w mikrowirówce w

temperaturze pokojowej, a do zebranej fazy wodnej dodawano RNazę A do końcowego

stężenia 50-100µg/ml i inkubowano w 370C przez 2 godziny. Po inkubacji

przeprowadzano ekstrakcję DNA dwukrotnie fenolem i chloroformem, w taki sam

sposób jak opisano wcześniej. Po ekstrakcji chloroformem dodawano równą objętość

izopropanolu i wytrącano DNA w -200C w ciągu 30min. Preparat wirowano przy

34

14500obr./min. w 40C w celu uzyskania osadu wytrąconego DNA. Osad płukano w

200µl 70% etanolu. Po wirowaniu i usunięciu 70% etanolu, osad DNA osuszano przez

15min. DNA rozpuszczano w 100µl wody.

Elektroforeza DNA w żelu agarozowym mająca na celu sprawdzenie

jakości preparatu

Przygotowywano żel agarozowy o stężeniu 2% w buforze TAE (40mM

Tris-octan, 1mM EDTA, pH7,2). Elektroforezie poddawano 5µl każdego preparatu

DNA wraz z barwnikiem OrangeG. Elektroforezę w żelu agarozowym o długości 10cm

prowadzono przy napięciu 80V przez ok. półtorej godziny do momentu dotarcia

barwnika naniesionego wraz z preparatem do końca żelu. Następnie żel przenoszono do

roztworu bromku etydyny (0,5µg/ml) na 15min. w celu zabarwienia DNA, który

obserwowano na transiluminatorze UV. Fotografię żelu agarozowego wykonywano

aparatem fotograficznym Polaroid DS34 z filmem Studio B/W o czułości ISO3000 tej

samej firmy (czas ekspozycji 1s, wartość przesłony 4,5). Na podstawie

elektroforetogramu wybierano preparaty do dalszej analizy. Odrzucano zarówno

preparaty o zbyt niskim, jak i zbyt wysokim stopniu strawienia.

35

Analiza produktów trawienia DNazy I i nukleazy z Micrococcus

Trawienie endonukleazą restrykcyjną MboI

Całość wybranego preparatu poddawano trawieniu endonukleazą restrykcyjną

MboI (Fermentas) w 370C przez noc. Dodawano 4µl endonukleazy restrykcyjnej MboI

(10U/µl) w celu przeprowadzenia wyczerpującego trawienia. Reakcję zatrzymywano,

zgodnie z zaleceniami producenta, przez umieszczenie preparatu w 650C na 20min.

Następnie wytrącano DNA 96% etanolem w -200C w ciągu 30min. W celu uzyskania

osadu DNA, preparat poddawano wirowaniu przy 14500obr./min. w 40C. Osad płukano

Numer ścieżki

elektroforetogramu Nazwa enzymu

Stężenie enzymu

w próbce (U/ml)

1 0,025

2 0,05

3 0,1

4 0,2

5 0,4

6

DNaza I

0,8

7 0,00033

8 0,001

9 0,003

10 0,009

11 0,027

12

Nukleaza z

Micrococcus

(MNaza)

0,081

Ryc. 4-2 Elektroforetogram preparatu DNA uzyskanego ze szczepu pip2 hodowanego w pożywce YPDE,

następnie poddanego trawieniu DNazą I i MNazą o różnych stężeniach. Do dalszej analizy wybrano preparaty

ze ścieżek 3, 4 i 5 (po trawieniu DNazą I) oraz 8, 9 i 10 (po trawieniu MNazą). Elektroforezie poddawano 1/20

obj. każdej próbki.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

DNaza I MNaza

36

w 200µl 70% etanolu. Po wirowaniu i usunięciu 70% etanolu, osad DNA osuszano

przez 15min. Następnie rozpuszczano DNA w 100µl wody.

Elektroforeza DNA w żelu agarozowym preparatów gotowych do

przeniesienia na membranę

Przygotowywano żel agarozowy o stężeniu 2% w buforze TAE. Elektroforezie

poddawano 15-25µl preparatu DNA wraz z 3-5µl barwnika OrangeG. Do skrajnych

kieszonek nanoszono 2µl wskaźnika wielkości (DNA bakteriofaga φX174 poddany

trawieniu endonukleazą restrykcyną HaeIII, Fermentas) wraz z 20µl roztworu

barwników (60% glicerol, 0,09% błękit bromofenolowy, 0,09% cyjanol ksylenu, 60mM

EDTA, Fermentas). Barwniki te migrowały z ruchliwością odpowiadającą odcinkom

DNA o długości 300pz i 4000pz. Elektroforezę w żelu o długości ok. 16cm prowadzono

przy napięciu 20V przez 18-20 godzin do momentu dotarcia błękitu bromofenolowego

do końca żelu. Następnie żel przenoszono do roztworu bromku etydyny na 15min. w

celu zabarwienia DNA, który obserwowano na transiluminatorze UV. Fotografię żelu

agarozowego wykonywano w sposób opisany wcześniej.

Przenoszenie DNA z żelu agarozowego na membranę

DNA z żelu agarozowego przenoszono na membranę metodą elektrotransferu.

Z żelu odcinano skrajne ścieżki, 1,0-1,5cm części dolnej, a także fragment żelu

37

znajdujący się powyżej studzienek. Następnie wycinano membranę nylonową

(Zeta-probe, Amersham) odpowiadającą wymiarom przyciętego żelu agarozowego oraz

dwa kawałki bibuły Whatman 3 nieco większe niż żel agarozowy. Wyciętą membranę,

bibuły i gąbki z aparatu do elektrotransferu nawilżano w buforze 0,5x TBE (45mM

Tris-boran, 1mM EDTA, pH8,0) i usuwano wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie

układano poszczególne elementy w następującej kolejności: [katoda] - gąbka - bibuła -

żel agarozowy (wierzchnią stroną do bibuły) - membrana - bibuła - gąbka - [anoda].

Przy układaniu poszczególnych elementów obficie polewano je buforem 0,5x TBE i

rolowano bagietką usuwając w ten sposób pęcherzyki powietrza. Przygotowaną

„kanapkę” następnie umieszczano w aparacie do elektrotransferu wypełnionym buforem

0,5x TBE. Procedurę elektrotransferu przeprowadzano przy napięciu 10V przez 18

godzin w 40C. Następnie w celu utrwalenia membrany z DNA umieszczano ją stroną

DNA do góry na bibule Whatman 3 nasączonej 0,4M roztworem wodorotlenku sodu. Po

10min. płukano membranę dwukrotnie buforem SSC 2x (0,3M NaCl, 0,03M cytrynian

sodu, pH7,0). Wilgotną membranę zawijano w folię spożywczą i przechowywano w

-200C.

Znakowanie sondy do hybrydyzacji

Sondy do hybrydyzacji znakowano radioaktywnie metodą losowych starterów

stosując Megaprime DNA Labelling System (Amersham) i fragment Klenowa

polimerazy I DNA, zgodnie z instrukcją producenta. Ilość matrycowego DNA sondy,

którą poddawano znakowaniu oceniano przeprowadzając elektroforezę w żelu

38

agarozowym. Umieszczano ok. 25ng matrycowego DNA sondy (ilość odpowiadająca

dobrze widocznemu prążkowi na elektroforetogramie) wraz z 5µl starterów w probówce

typu Eppendorf i przeprowadzano denaturację matrycowego DNA w 1000C w ciągu

5min. Następnie przygotowywano mieszaninę składników pozwalających na

znakowanie sondy, dodając po 4µl nieznakowanych dCTP, dGTP i dTTP, 5µl buforu do

reakcji, 2U fragmentu Klenowa i 5µl [α-32P]dATP (3000Ci/mmol, Amersham)

doprowadzając objętość wodą do 50µl. Reakcję znakowania prowadzono w 370C przez

10min., następnie zatrzymywano przez dodanie 5µl roztworu 0,2M EDTA, 10mg/ml

tRNA z E.coli i wytrącano DNA dodając 100µl 96% EtOH, a następnie umieszczając w

-200C na 30 min. Preparat poddawano wirowaniu w mikrowirówce (14500obr./min.,

temp. pokojowa, 10min.). Przed użyciem sondę rozpuszczano w 500µl buforu do

hybrydyzacji (patrz niżej) i denaturowano przez podgrzanie do 1000C na 5 min.

Używano sondy o sekwencji nukleotydowej całkowicie zgodnej z rejonem od

+68 do +366 sekwencji nukleotydowej genu CTA1 (długość sondy wynosi 298pz,

numerem 1 oznaczono pierwszy nukleotyd, który ulega translacji). Matrycowy DNA

sondy został namnożony metodą PCR przez dr Joannę Trzcińską-Danielewicz.

Hybrydyzacja typu Southern

Do pojemnika do hybrydyzacji (zakręcane, grubościenne szklane fiolki o

pojemności 200ml) wkładano membranę zwiniętą stroną DNA do wewnątrz, a następnie

wlewano ok. 15ml buforu do hybrydyzacji o składzie 0,5M bufor sodowo-fosforanowy

39

(NaPi), 7% SDS, 1mM EDTA, pH7,5 i prowadzono prehybrydyzację w 650C przez 1-3

godziny. Następnie do pojemnika wprowadzano całość zdenaturowanej sondy i

prowadzono hybrydyzację przez 12-18 godzin w takich samych warunkach. Po

hybrydyzacji, dokładnie zlewano bufor do hybrydyzacji wraz z niezwiązaną sondą, a

następnie membranę płukano w 650C:

• dwa razy po 10min. w 0,2M NaPi, 1% SDS, pH7,5

• dwa razy po 10min. w 0,1M NaPi, 1% SDS, pH7,5

• dwa razy po 5min. w 0,04M NaPi, 0,1% SDS, pH7,5.

W zależności od wielkości i liczby filtrów za każdym razem używano od 50 do

150ml roztworu do płukania. Po przeprowadzonych płukaniach sprawdzano sygnał

membrany przy użyciu licznika Geigera-Müllera.

Autoradiografia

Membranę po hybrydyzacji umieszczano w kasecie wraz z filmem

rentgenowskim i prowadzono ekspozycję w -700C przez 1-7 dni. Stosowano filmy

XS-1N (Foton) oraz BioMax MS (Kodak). W przypadku silnego sygnału (powyżej

50cps) nie stosowano ekranów wzmacniających, natomiast do membran ze słabym

sygnałem (poniżej 10cps) używano filmu BioMax MS wraz z ekranem wzmacniającym

o tej samej nazwie. W przypadku nieco silniejszego sygnału stosowano ekran

wzmacniający Cronex Lightning-Plus (Dupont) wraz z filmem XS-1N. Filmy

wywoływano standardową metodą, a następnie fotografowano cyfrowym aparatem

fotograficznym Olympus C-200.

40

5. Wyniki

1. Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 i kinetyka

indukcji

Analizę aktywności transkrypcyjnej genu CTA1 prowadzono wykorzystując

układ reporterowy będący fuzją promotora genu CTA1 i bakteryjnego genu lacZ

kodującego β-galaktozydazę. Konstrukcja została wprowadzona, zarówno do szczepu

kontrolnego (BY4742, dzikiego pod względem badanych czynników transkrypcyjnych),

jak i do szczepów adr1, oaf1 i pip2, na dwóch plazmidach: episomalnym

(występującym w komórce w kilkudziesięciu kopiach) i integracyjnym (występującym

w komórce w jednej kopii). Hodowle będące w stanie derepresji genu CTA1 w

logarytmicznej fazie wzrostu oraz w fazie stacjonarnej przeszczepiano do pożywki z

kwasem olejowym, który indukuje transkrypcję m.in. genu CTA1. Z części hodowli

przygotowywano ekstrakt natychmiast po przeszczepieniu (ekstrakt ten reprezentował

wyjściowy poziom aktywności promotora genu CTA1 w stanie derepresji), natomiast

resztę hodowli w pożywce z kwasem olejowym prowadzono przez 3, 6, 9, 12 i 24

godziny, a następnie sporządzano ekstrakt. Przygotowane ekstrakty wykorzystywano do

oznaczenia aktywności właściwej β-galaktozydazy, która jest pośrednią miarą

aktywności transkrypcyjnej promotora genu CTA1.

Pomiaru dokonywano dla ekstraktów przygotowanych z każdego szczepu

transformowanego odpowiednim plazmidem, w obu fazach wzrostu, w stanie derepresji

genu CTA1 i po upływie odpowiedniego czasu hodowli w warunkach indukcji tego genu.

41

Każdy ekstrakt oznaczano w dwóch powtórzeniach i wyliczano średnią. Dla każdego

szczepu eksperyment powtarzano co najmniej trzy razy. Z nieznanych powodów

wartości aktywności właściwej β-galaktozydazy w powtórzeniach doświadczenia

wykonanych dla jednego szczepu znacznie się różniły. Podobne zjawisko

zaobserwowali także inni badacze [38, 41]. Ponieważ obliczanie wartości średnich z tak

rozbieżnych wyników nie byłoby poprawne, wyniki dotyczące aktywności właściwej

β-galaktozydazy po odpowiednim czasie indukcji genu CTA1 przeliczano w stosunku do

aktywności w warunkach derepresji, a otrzymaną wartość określano jako względny

poziom indukcji (Tab. 5-P). Z niewyjaśnionych również powodów, niektóre wyniki

pomiarów odbiegały znacznie od ogólnej tendencji indukcji lub spójnych powtórzeń

doświadczenia dotyczącego jednego szczepu. W takim przypadku odrzucano ten punkt

jako niewiarygodny i nie brano pod uwagę przy wyliczaniu średniej.

Razem z wykresami pokazującymi względny poziom indukcji w funkcji czasu

hodowli w pożywce z kwasem olejowym, podano także tabele zawierające dane

liczbowe z poszczególnych powtórzeń doświadczenia, na podstawie których obliczano

wartości średnie względnego poziomu indukcji oraz wartości odchylenia standardowego

przedstawione na wykresach (wartości odchylenia standardowego podano również w

tabelach).

42

Bezwzględne wartości aktywności właściwej β-galatozydazy uzyskane w dwóch doświadczeniach

Aktywność właściwa β-galatozydazy [µmol·mg-1·min-1]

Czas hodowli z kw. olej. [godziny]

Symbole Doświadczenie 1 Doświadczenie 2

0 A 0,06 0,043 X3 1,22 0,626 X6 4,97 1,709 X9 4,91 2,0512 X12 6,43 4,3124 X24 11,70 6,17

Względny poziom indukcji

Względny poziom indukcji Czas hodowli z kw. olej. [godziny]

Symbole Doświadczenie 1 Doświadczenie 2

0 A/A 1 13 X3/A 20 176 X6/A 80 469 X9/A 79 5612 X12/A 104 11824 X24/A 189 168

Tab. 5-P Przykład opracowania wyników przedstawionych w postaci bezwzględnych wartości aktywności

β-galatozydazy. Wyniki te wydają się dość rozbieżne, jednak po przeliczeniu na względny poziom indukcji stają się

porównywalne.

Przedstawione w przykładzie wartości pochodzą z wyników uzyskanych dla szczepu oaf1 z plazmidem

integracyjnym z hodowli w logarytmicznej fazie wzrostu.

43

Legenda Wykresy:

BY4742 (szczep kontrolny) adr1 oaf1 pip2

Przedstawiono wykresy z połączonymi linią prostą punktami, odpowiadającymi

wyliczonym wartościom aktywności właściwej β-galaktozydazy. Nie musi to dokładnie

odzwierciedlać rzeczywistego przebiegu procesu, zwłaszcza pomiędzy punktami

przedstawiającymi wartości względnego poziomu indukcji po 12 i 24 godzinach

hodowli. Takie wykresy są jednak bardziej czytelne niż wykresy słupkowe.

Pionowymi liniami oznaczono wartości odchylenia standardowego w danym punkcie.

Wartości odchyleń standardowych umieszczono w tabelach z danymi liczbowymi.

Tabele z danymi liczbowymi:

W poszczególnych kolumnach tabeli umieszczono wartości względnego poziomu

indukcji uzyskane w niezależnych eksperymentach, dotyczące jednego szczepu

transformowanego odpowiednim plazmidem.

Kursywą zaznaczono wartości pominięte przy obliczaniu wartości średnich z powodu

znacznego odstępstwa od ogólnej tendencji indukcji genu CTA1 i spójnych powtórzeń

eksperymentu dotyczącego jednego szczepu.

44

b/p - brak pomiaru

b/d - brak danych spowodowany niemożnością obliczenia wartości odchylenia

standardowego wynikającą ze zbyt małej liczby przeprowadzonych pomiarów

* - symbolem tym oznaczono istotną statystycznie różnicę między poziomem indukcji

w szczepie pozbawionym jednego z trzech badanych czynników transkrypcyjnych w

stosunku do wyniku pomiaru szczepu kontrolnego, na podstawie przeprowadzonego

dwustronnego testu t Studenta różnicy między średnimi przy różnych wariancjach

(poziom istotności p=0,055). Symbol ten umieszczono zarówno w tabelach z danymi

liczbowymi, jak i przy odpowiednich punktach na wykresach.

Numer doświadczenia Szczep

BY4742 1 2 3 4 5 6 Odchylenie standardowe

3h 1 21 26 15 35 127 6

6h 1 136 115 37 115 317 10

9h 5 223 277 76 287 237 27

12h 18 265 493 52 303 550 121

24h 77 815 1059 20 566 776 175

Numer doświadczenia

Szczep adr1 1 2 3 4

Odchylenie standardowe

3h 16 30 25 42 9

6h 96 50 103 268 24

9h* b/p 100 191 149 37

12h b/p b/p b/p 299 b/d

24h* 237 211 272 278 27


Szczep oaf1 1 2 3


3h 15 29 9 8

6h* 62 58 30 14

9h* 63 128 34 14

12h* 77 97 52 18

24h* 227 209 91 9


Szczep pip2 1 2 3


3h 63 33 31 15

6h 72 184 101 47

9h* 143 136 108 15

12h* 232 164 215 29

24h* 289 421 492 84 Tab. 5-1 Wartości względnego poziomu indukcji uzyskane w kolejnych powtórzeniach doświadczenia wraz z

wartościami odchylenia standardowego

Komórki z plazmidem episomalnym Hodowle w logarytmicznej fazie wzrostu

0

200

400

600

800

1000

1200

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27

Czas hodowli z kwasem olejowym [godziny]

Wzg

lędn

y po

ziom

indu

kcji

Ryc. 5-1 Przebieg indukcji promotora genu CTA1 pod wpływem kwasu olejowego

1

* *

* * * * *

*

*


BY4742 1 2 3 4 5 6 Odchylenie standardowe

3h 4 65 23 34 33 63 17

6h 11 296 141 115 25 223 71

9h 31 468 138 182 160 452 147

12h 73 494 304 176 188 512 145

24h 148 530 395 274 167 550 112


Szczep adr1 1 2 3 4


3h 41 55 26 67 15

6h 73 197 21 109 52

9h b/p 171 50 138 17

12h b/p b/p b/p 120 b/d

24h* 102 172 65 169 45


Szczep oaf1 1 2 3


3h 57 45 28 12

6h* 177 67 63 2

9h 121 126 88 17

12h* 756 96 73 11

24h* 211 88 75 6


Szczep pip2 1 2 3


3h 31 69 48 16

6h 55 161 95 44

9h 67 223 133 33

12h* 89 205 109 10

24h* 102 206 110 4 Tab. 5-2 Wartości względnego poziomu indukcji uzyskane w kolejnych powtórzeniach doświadczenia wraz z


Komórki z plazmidem episomalnym Hodowla w fazie stacjonarnej

0

100

200

300

400

500

600

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27


Wzg

lędn

y po

ziom

indu

kcji


1

*

* * * *

*


BY4742 1 2 3 4 Odchylenie standardowe

3h 72 52 7 69 9

6h 129 228 13 223 45

9h 378 143 49 304 98

12h 414 232 75 394 81

24h 459 294 148 340 69


Szczep adr1 1 2 3 4


3h 49 38 44 52 5

6h 121 98 80 142 24

9h 150 204 193 377 87

12h 214 158 286 335 68

24h 345 b/p b/p 493 74


Szczep oaf1 1 2 3


3h* 20 35 17 8

6h 80 b/p 46 17

9h 79 306 56 12

12h* 104 372 118 7

24h* 189 264 168 10


Szczep pip2 1 2 3


3h 59 58 54 2

6h 128 112 128 8

9h 181 159 169 9

12h 216 238 294 33

24h 292 265 332 28 Tab. 5-3 Wartości względnego poziomu indukcji uzyskane w kolejnych powtórzeniach doświadczenia wraz z


Komórki z plazmidem integracyjnym Hodowla w logarytmicznej fazie wzrostu

0

100

200

300

400

500

600

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27


Wzg

lędn

y po

ziom

indu

kcji


1 *

*

*


BY4742 1 2 3 4 Odchylenie standardowe

3h 32 71 24 22 4

6h 60 169 20 83 11

9h 105 119 92 43 11

12h 122 129 102 50 11

24h 167 165 124 77 20


Szczep adr1 1 2 3 4


3h 48 34 41 34 6

6h 62 60 81 76 9

9h 75 76 111 60 18

12h 70 b/p 101 78 13

24h 95 b/p 125 66 24


Szczep oaf1 1 2 3


3h 28 46 21 4

6h 86 145 72 7

9h 91 271 125 17

12h 112 134 123 9

24h 107 199 131 39


Szczep pip2 1 2 3


3h 73 38 53 14

6h 217 106 b/p b/d

9h 223 129 189 39

12h 208 118 135 39

24h 235 227 148 39 Tab. 5-4 Wartości względnego poziomu indukcji uzyskane w kolejnych powtórzeniach doświadczenia wraz z


Komórki z plazmidem integracyjnym Hodowla w fazie stacjonarnej

0

50

100

150

200

250

300

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27


Wzg

lędn

y po

ziom

indu

kcji


1

49

Indukcja genu CTA1 w komórkach S.cerevisiae znajdujących się w

logarytmicznej fazie wzrostu pokazuje tendencję wzrostową przez 24 godziny po

przeniesieniu do pożywki z kwasem olejowym, niezależnie od plazmidu, którym

transformowano komórki drożdży (Ryc. 5-1 i Ryc. 5-3). Wyjątkiem jest szczep

kontrolny z plazmidem integracyjnym i szczep adr1 z plazmidem episomalnym, w

których po 12 godzinach hodowli nie obserwuje się wzrostu poziomu indukcji genu

CTA1. Odmienną sytuację można zaobserwować w drożdżach znajdujących się w fazie

stacjonarnej, w których, z wyjątkiem szczepu kontrolnego z plazmidem episomalnym,

wzrost poziomu indukcji genu CTA1 trwa jedynie 9 godzin (Ryc. 5-2 i Ryc. 5-4). Przez

następne 15 godzin hodowli w warunkach indukcji aktywność transkrypcyjna

promotora genu nie wzrasta w sposób znaczący.

W hodowlach znajdujących się w logarytmicznej fazie wzrostu wszystkie

szczepy pozbawione jednego z trzech badanych czynników transkrypcyjnych wykazują

obniżoną zdolność indukcji genu CTA1 w porównaniu do szczepu kontrolnego.

Szczególnie niski poziom indukcji można zaobserwować w szczepie oaf1

transformowanym plazmidem episomalnym (Ryc. 5-1), dla którego już po 6 godzinach

hodowli w pożywce z kwasem olejowym można zauważyć istotne statystycznie

obniżenie stopnia indukcji.

Przebieg indukcji genu CTA1 w komórkach S.cerevisiae transformowanych

plazmidem episomalnym znajdujących się w fazie stacjonarnej (Ryc. 5-2) wyraźnie

różni się od wyników uzyskanych dla hodowli drożdży znajdujących się w

logarytmicznej fazie wzrostu (Ryc. 5-1). W fazie stacjonarnej wszystkie trzy szczepy

pozbawione jednego z trzech czynników transkrypcyjnych wykazują obniżoną w

równym stopniu zdolność indukcji genu CTA1, a szczep oaf1 nie wyróżnia się w żaden

50

sposób na tle dwóch pozostałych badanych szczepów drożdży.

Niespodziewane wyniki uzyskano w hodowlach S.cerevisiae

transformowanych plazmidem integracyjnym, przeniesionych do pożywki z kwasem

olejowym w fazie stacjonarnej (Ryc. 5-4). Nie zaobserwowano znaczącej różnicy

między szczepem kontrolnym i szczepami badanymi (adr1 i oaf1), zaś szczep z

usuniętym genem czynnika transkrypcyjnego Pip2p wykazywał wyższy stopień

indukcji genu CTA1 przez cały czas trwania hodowli w pożywce z kwasem olejowym.

Różnica ta nie była jednak istotna statystycznie.

Warto zaznaczyć, iż nawet w szczepach wykazujących obniżony w stosunku do

szczepu kontrolnego poziom indukcji genu CTA1, w wyniku przeniesienia drożdży do

warunków indukcji aktywność promotora tego genu zwiększała się od 100 do 200 razy.

51

2. Reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora

genu CTA1

Analizę struktury chromatyny rejonu promotora genu CTA1 prowadzono w

drożdżach hodowanych do wczesnej logarytmicznej fazy wzrostu w trzech warunkach:

represji, derepresji i indukcji. Następnie izolowano jądra komórkowe i analizowano

strukturę chromatyny stosując metodę pośredniego znakowania końców. Podobnie jak

w omawianej wcześniej analizie aktywności transkrypcyjnej promotora genu CTA1

przeprowadzonej przy pomocy genu reporeterowego, strukturę chromatyny badano w

szczepach adr1, oaf1 i pip2, a także w szczepie kontrolnym MHY501α (dzikim pod

względem badanych czynników transkrypcyjnych). Odcinki DNA powstałe w wyniku

trawienia chromatyny poddawano elektroforezie w żelu agarozowym, następnie po

przeniesieniu DNA na membranę przeprowadzano hybrydyzację typu Southern z

odpowiednią sondą znakowaną radioaktywnie i poddawano autoradiografii. Porównując

prążki widoczne na autoradiogramie można uzyskać informacje o rozmieszczeniu

nukleosomów i miejscach wrażliwych na działanie DNazy I w badanym rejonie, a także

o zmianach ich położenia w zależności od warunków w których prowadzono hodowlę i

w zależności od badanego szczepu.

Jednak pełny obraz zmian zachodzących w strukturze chromatyny w rejonie

promotora genu CTA1 można uzyskać dopiero po przeprowadzeniu elektroforezy

preparatów ze wszystkich badanych szczepów we wszystkich warunkach hodowli

(represji, derepresji i indukcji) na jednym żelu agarozowym. Jest to istotne, ponieważ

tylko w ten sposób można dokonać rozdziału fragmentów DNA z równą ruchliwością

umożliwiającą porównanie wykrytych sondą fragmentów DNA na jednym filmie

52

rentgenowskim. Umożliwia to jednoznaczne stwierdzenie wzajemnego położenia

wykrytych fragmentów DNA.

Do chwili obecnej nie przeprowadzono elektroforezy wszystkich preparatów na

jednym żelu agarozowym, tak więc zostaną przedstawione jedynie cząstkowe wyniki

porównań niektórych szczepów i warunków hodowli.

Legenda

Czarne strzałki wskazują prążki wykrywane we wszystkich ścieżkach autoradiogramu,

natomiast czerwone strzałki wskazują prążki pojawiające się lub znikające w niektórych

ścieżkach. Różowe strzałki wskazują prążek o długości 1906pz powstający w wyniku

trawienia endonukleazą restrykcyjną MboI.

53

A. Ustalenie miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepie

kontrolnym (MHY501α)

W celu zbadania możliwości udziału

reorganizacji struktury chromatyny w regulacji

aktywności promotora genu CTA1, ustalono miejsca

wrażliwe na nukleazę z Micrococcus w szczepie

kontrolnym. Na autoradiogramie można zauważyć

zarówno fragmenty DNA wykrywane we wszystkich

trzech ścieżkach (A3, A8, A9 i A10), jak i wykrywane

jedynie w niektórych warunkach hodowli. Prążek A2

nie jest widoczny w preparacie izolowanym z hodowli

w pożywce z kwasem olejowym, podobnie jak prążki

A5 i A7. Odwrotna sytuacja przedstawia się dla prążka

A6. Jest on widoczny w warunkach indukcji, jednak nie

jest wykrywany ani w warunkach represji, ani derepresji.

Podobną tendencję można zauważyć dla prążka A4.

Na podstawie prezentowanego autoradiogramu,

a także opierając się na analogicznych danych

uzyskanych przy zastosowaniu innej sondy do

hybrydyzacji, nie przedstawionych w niniejszej pracy,

Trzcińska-Danielewicz i wsp. ustalili pozycje miejsc

wrażliwych na nukleazę z Micrococcus, a także miejsc

nadwrażliwych na DNazę I w rejonie promotora genu CTA1 (Ryc. 5-5) [62].

Kw. olej.

EtOH

Glc

A1

A2

A3

A4 A5 A6 A7

A8

A9

A10

MHY501α

54

Ryc. 5-5 Schemat rejonu promotora genu CTA1 wraz z zaznaczonymi miejscami nadwrażliwymi na DNazę I oraz

wrażliwymi na nukleazę z Micrococcus (MNaza). Zaznaczono także położenie sekwencji nukleotydowych sond

molekularnych, którymi wykrywano fragmenty DNA w stosowanej metodzie pośredniego znakowania końców.

Numerem +1 oznaczono pierwszy nukleotyd, który ulega translacji. Zaadaptowano z [62].

Najwyraźniejszy prążek wykrywany we wszystkich trzech ścieżkach (prążek

A1) jest fragmentem DNA o długości 1906pz, który powstaje w wyniku trawienia

endonukleazą restrykcyjną MboI. Fragmenty te są największe wśród wykrywanych

sondą molekularną, ponieważ nie uległy trawieniu nukleazą z Micrococcus lub DNazą I.

Fragment DNA o długości 1906pz jest więc wykrywany we wszystkich

przeprowadzanych eksperymentach niezależnie od badanego szczepu S.cerevisiae i

warunków hodowli, z której zostały wyizolowane jądra komórkowe. Brak na

autoradiogramach prążków większych niż 1906pz świadczy natomiast o tym, że

trawienie endonukleazą restrykcyjną MboI było wyczerpujące. Jest to warunek

konieczny do uzyskania wiarygodnych wyników przy zastosowaniu metody

790990

1 50-80-226-365-490

-669

-645

-1541AUG

-125

+366

DNazaI

--Kw. olej.

-195 -145

DNazaI

-

Glc

-310AUG UGA

-1794 RMS1 CTA1

+1

5’ 3’

MNaza

-156

-515

-546-708

-700

MNaza

Sonda 5’ Sonda 3’

EtOH

MboIMboI

55

pośredniego znakowania końców.

Wszystkie fragmenty DNA migrujące podczas elektroforezy szybciej niż

wspomniany fragment o długości 1906pz powstają w wyniku trawienia z jednej strony

nukleazą z Micrococcus lub DNazą I, z drugiej zaś strony endonukleazą restrykcyjną

MboI.

Dzięki analizie struktury chromatyny w badanych szczepach S.cerevisiae i

ewentualnych jej zmian w stosunku do szczepu kontrolnego będzie możliwe

potwierdzenie lub wykluczenie udziału poszczególnych czynników transkrypcyjnych

Adr1p, Oaf1p i Pip2p w reorganizacji struktury chromatyny rejonu promotora genu

CTA1.

56

B. Analiza miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepie

pip2

Podobnie jak w przypadku szczepu

kontrolnego, w szczepie pip2 również można zauważyć

prążki wykrywane we wszystkich ścieżkach, jak i te

pojawiające się jedynie w niektórych ścieżkach. Do

prążków wykrywanych we wszystkich ścieżkach można

zaliczyć prążki B1 (identyczny z prążkiem A1), B2,

B4-B6, B10-B14, B16-B18. Prążek B3 nie jest

wykrywany w preparacie wyizolowanym z hodowli

prowadzonej w pożywce z kwasem olejowym, podobnie

jak prążek B8. Natomiast prążki B9 i B15 są

wykrywane jedynie w preparacie wyizolowanym z

komórek hodowanych w warunkach indukcji genu

CTA1. Prążek B7 również najwyraźniej widoczny jest w

prepracie wyizolowanym z hodowli w pożywce z

kwasem olejowym, jednak w przypadku tego prążka jest

on widoczny, choć słabiej, także w preparatach

wyizolowanych z hodowli w stanie represji i derepresji

genu CTA1.

Po analizie autoradiogramów (również nie

przedstawionych w niniejszej pracy) ustalono niektóre

miejsca działania nukleazy z Micrococcus w rejonie

Kw. olej.

EtOH

Glc

B1

B2

B3 B4

B5 B6

B7 B8

B9 B10 B11

B12

B13

B14 B15

B16

B17

B18

pip2

57

promotora genu CTA1. Pozycja -220 (prążek B13) i +70 (prążek B17) są miejscami

działania nukleazy z Micrococcus we wszystkich badanych warunkach. Pozycja -150

(prążek B15) jest natomiast miejscem działania nukleazy z Micrococcus występującym

jedynie w warunkach indukcji genu CTA1. Obserwacje te odpowiadają obrazowi ze

szczepu kontrolnego (Ryc. 5-5). Ustalone pozycje miejsc działania nukleazy z

Micrococcus są obarczone stosunkowo dużym błędem. Można jednak stwierdzić, że w

rejonie promotora genu CTA1 zachodzą zmiany w strukturze chromatyny w szczepie

pozbawionym czynnika transkrypcyjnego Pip2p podobne do obserwowanych w

szczepie kontrolnym.

58

C. Analiza miejsc wrażliwych na nukleazę z Micrococcus w szczepach

adr1 i oaf1 w warunkach represji i derepresji genu CTA1

Jak wynika z autoradiogramów

przedstawionych w punktach A i B, układ

wykrywanych fragmentów DNA w preparatach

wyizolowanych z warunków represji i derepresji jest

bardzo podobny. Tak też jest w przypadku

porównania szczepów adr1 i oaf1 w warunkach

represji i derepresji. Wyraźne różnice pojawiają się

jedynie w dwóch miejscach. Są to prążki C6 i C8

wykrywane tylko w szczepie oaf1 w warunkach

represji. Warto także zauważyć, że w szczepie

pozbawionym czynnika transkrypcyjnego Adr1p nie

występują żadne zmiany w układzie wykrywanych

prążków między komórkami hodowanymi w

warunkach represji i derepresji. Pod tym względem

szczep ten różni się od szczepu oaf1, w którym

można zauważyć kilka zmian w układzie

wykrywanych prążków między komórkami hodowanymi w pożywce z glukozą i w

pożywce z etanolem.

Prążki C6 i C8 wykrywane jedynie w szczepie oaf1 w warunkach represji mają

EtOH

Glc

EtOH

Glc

adr1 oaf1

C1 C2

C3

C4 C5 C6 C7

C8 C9

C10

C11

C12

C13

C14

59

długość ok. 1000pz i wskazują na zmiany zachodzące w pobliżu pozycji -650 (licząc od

pierwszego nukleotydu ulegającego translcji). Są to dosyć odległe miejsca od rejonu

promotora genu CTA1 i wydaje się, że nie mają one dużego znaczenia w regulacji

aktywności transkrypcyjnej badanego promotora.

60

D. Próba porównania położenia miejsc wrażliwych na nukleazę z

Micrococcus (MNazę) w szczepach MHY501α, adr1, oaf1 i pip2 w

warunkach derepresji genu CTA1

Porównanie autoradiogramów z

preparatami pochodzącymi ze

wszystkich badanych szczepów

hodowanych w stanie derepresji genu

CTA1 umożliwiło wstępne

zidentyfikowanie prążka obecnego we

wszystkich szczepach z wyjątkiem

szczepu kontrolnego (prążek D1). Inne

prążki zaznaczone kolorem czarnym

wydają się występować we wszystkich

badanych szczepach.

Analiza przeprowadzona w ten

sposób obarczona jest dużym błędem

spowodowanym różną ruchliwością

rozdzielanych fragmentów DNA w

oddzielnych żelach agarozowych, a

także różną intensywnością sygnału

sondy używanej do hybrydyzacji.

Pozwala ona jednak na porównanie

układów wykrywanych prążków i umożliwia wykrycie prążków pojawiających się tylko

w określonym szczepie lub w określonych warunkach hodowli.

MNaza

pip2

oaf1

adr1

MH

Y501α

EtOH

MNaza

D1

D1

MboI-MboI

1906pz

61

E. Analiza miejsc nadwrażliwych na DNazę I w szczepie kontrolnym

(MHY501α) i szczepie oaf1 w warunkach indukcji genu CTA1

Zmiany w układzie wykrywanych fragmentów DNA

są nieliczne. Prążki E3 i E6 są widoczne jedynie w preparacie

wyizolowanym ze szczepu pozbawionego czynnika

transkrypcyjnego Oaf1p. Jednak inne fragmenty DNA są

wykrywane w obu szczepach S.cerevisiae.

Oaf1

MH

Y501α

E1

E2

E3

E4

E5 E6

E7

E8

Kw. olej.

62

Analiza przedstawionych autoradiogramów sugeruje, że w przypadku genu

CTA1 reorganizacja struktury chromatyny nie jest procesem szczególnie ważnym dla

indukcji tego genu. Z przedstawionych w punkcie A oraz B autoradiogramów wynika,

iż w warunkach represji i derepresji struktura chromatyny rejonu promotora genu CTA1

jest bardzo podobna (potwierdza to także autoradiogram przedstawiony w punkcie C),

natomiast drobne, choć wyraźne zmiany zachodzą przy indukcji tego genu.

Jak wcześniej wspomniano, pełny obraz dotyczący reorganizacji struktury

chromatyny badanego rejonu można poznać jedynie przez przeprowadzenie

elektroforezy wszystkich preparatów na jednym żelu agarozowym. Bardzo trudne zatem

jest przypisanie poszczególnych prążków wykrytych przez autoradiografię do miejsc

działania nukleazy z Micrococcus i DNazy I na podstawie kilku oddzielnych

autoradiogramów. Konieczna więc będzie kontynuacja badań w celu jednoznacznego

wyjaśnienia roli czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p w procesie

reorganizacji chromatyny rejonu promotora genu CTA1.

Jednak opierając się na przedstawionych wynikach można stwierdzić, że w

rejonie promotora genu CTA1 zachodzi subtelna reorganizacja struktury chromatyny

przy udziale badanych czynników transkrypcyjnych i ma ona związek m.in. z indukcją

genu CTA1.

63

6. Dyskusja

1. Aktywność transkrypcyjna promotora genu CTA1 i kinetyka

indukcji

Metoda wykorzystująca pomiary aktywności β-galaktozydazy jest metodą

pośrednią i może służyć jedynie do ustalenia przybliżonego poziomu aktywności

transkrypcyjnej promotora genu CTA1. Przeprowadzenie jednak eksperymentu w kilku

niezależnych od siebie powtórzeniach i uzyskanie w nich istotnych statystycznie różnic

w stosunku do szczepu kontrolnego (BY4742) pozwala na formułowanie wniosków

dotyczących udziału czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p oraz ich roli w

indukcji badanego genu.

Kinetyka indukcji genu CTA1 szczepów transformowanych plazmidem

episomalnym znajdujących się w logarytmicznej fazie wzrostu jest liniowa. Tendencję

tę można zauważyć zarówno w szczepie kontrolnym, jak i w szczepach oaf1 i pip2.

Jedynie w szczepie adr1 nie obserwuje się wzrostu poziomu indukcji genu CTA1

między 12 i 24 godziną hodowli w pożywce z kwasem olejowym. Te same szczepy

wykazują nieco inną kinetykę indukcji genu CTA1, kiedy w chwili przenoszenia do

warunków indukcji znajdują się w fazie stacjonarnej. W tym przypadku poziom

indukcji genu CTA1 wzrasta liniowo tylko do 9 godziny hodowli. Osiągnięty poziom

indukcji utrzymuje się aż do 24 godziny hodowli. Wyjątkiem tutaj jest szczep kontrolny,

w którym poziom indukcji genu CTA1 wzrasta przez cały czas trwania hodowli w

warunkach indukcji. Obserwowany przyrost względnego poziomu indukcji z upływem

64

czasu staje się jednak mniejszy. Podobną kinetykę indukcji zaobserwowano już

wcześniej [38]. W tym przypadku również, pomimo znacznie niższej wartości

względnego poziomu indukcji (wynoszącej ok. 70), wzrost względnego poziomu

indukcji był liniowy przez 24 godziny hodowli. Wartości te mogą się różnić z powodu

odmiennego układu doświadczalnego, jednak obserwowane zjawiska mają bardzo

podobną charakterystykę w postaci liniowego wzrostu aktywności genu CTA1.

Indukcja genu CTA1 w szczepach transformowanych plazmidem

integracyjnym przedstawia się podobnie. W logarytmicznej fazie wzrostu, poza

szczepem kontrolnym nie wykazującym wzrostu poziomu indukcji między 12 i 24

godziną hodowli, można uznać, że poziom indukcji wzrasta liniowo przez cały czas

trwania hodowli. Natomiast w fazie stacjonarnej w żadnym z badanych szczepów nie

obserwuje się wyraźnych zmian w poziomie indukcji genu CTA1 po 9 godzinie trwania

hodowli w warunkach indukcji.

Zahamowanie wzrostu poziomu indukcji genu CTA1 w hodowlach będących w

chwili przenoszenia do warunków indukcji w fazie stacjonarnej może wynikać z

ogólnej represji transkrypcji. W komórkach znajdujących się w tej fazie wzrostu

obserwuje się zahamowanie istotnych procesów komórkowych takich jak transkrypcja

[63] i translacja [64, 65]. Możliwe jest więc zahamowanie syntezy białek

odgrywających ważną rolę m.in. w procesie indukcji genu CTA1, a także

β-galaktozydazy będącej kluczowym białkiem w stosowanej metodzie. W przypadku

zahamowania syntezy β-galaktozydazy nie jest możliwe śledzenie rzeczywistej

aktywności transkrypcyjnej promotora genu CTA1.

W szczepie oaf1 transformowanym zarówno plazmidem episomalnym, jak i

plazmidem integracyjnym, w logarytmicznej fazie wzrostu hodowli można zauważyć, iż

65

poziom indukcji genu CTA1 jest wyraźnie niższy w porównaniu do szczepu kontrolnego,

natomiast szczep pip2 transformowany zarówno plazmidem episomalnym, jak i

plazmidem integracyjnym wykazuje podobny do szczepu kontrolnego poziom indukcji

badanego genu. Wyniki te sugerują, iż konieczny jest udział czynnika transkrypcyjnego

Oaf1p do pełnej indukcji genu CTA1. Wysoce prawdopodobne jest więc formowanie

homodimeru (Oaf1p)2 w szczepie pip2, w którym poziom indukcji jest porównywalny

do szczepu kontrolnego. Obserwacje te są zgodne z wcześniej wysuwanymi hipotezami

[39, 45]. Jednak na podstawie przedstawionych wyników nie jest możliwe stwierdzenie,

czy formowanie homodimeru (Oaf1p)2 jest zjawiskiem występującym powszechnie w

indukcji genu CTA1. Istnieje bowiem możliwość, iż homodimer (Oaf1p)2 tworzy się

jedynie w warunkach niedoboru Pip2p. Warto również zauważyć, że pomimo

obniżonego poziomu indukcji genu CTA1 w szczepie oaf1, aktywność promotora tego

genu wzrasta 100-200 razy po trwającej 24 godziny hodowli w pożywce z kwasem

olejowym. Wartość ta wynosi 25-50% w porównaniu do względnego poziomu indukcji

obserwowanego w szczepie kontrolnym. Być może w warunkach braku Oaf1p tworzy

się homodimer (Pip2p)2, który jednak dużo słabiej indukuje gen CTA1 w porównaniu do

homodimeru (Oaf1p)2 lub heterodimeru Oaf1p-Pip2p tworzącego się w szczepie

kontrolnym.

W jednej z przeprowadzonych wcześniej prac [39] zaobserwowano wartość

względnego poziomu indukcji genu CTA1 wynoszącą ok. 4 w szczepie kontrolnym oraz

ok. 2 w szczepie pozbawionym czynnika transkrypcyjnego Oaf1p (obliczenia własne

wg danych z [39]). Wartości te są dużo mniejsze od zaobserwowanych w niniejszej

pracy, jednak stosunek względnego poziomu indukcji w szczepie kontrolnym do

wartości w szczepie pozbawionym czynnika transkrypcyjnego Oaf1p wynosi ok. 2 (4/2).

66

Wartość tę można uznać za porównywalną z obserwowaną w niniejszej pracy (ok. 4

(400/100) w hodowlach, w których zanotowano istotne statystycznie różnice), jeżeli

weźmie się pod uwagę znaczne różnice w stosowanym układzie doświadczalnym [39].

Znaczne różnice w wartościach względnego poziomu indukcji uzyskane w

niniejszej pracy w porównaniu do wcześniejszych prac mogą wynikać nie tylko z

odmiennego układu doświadczalnego (szczepy, plazmidy, metody badania), ale także

niekompletnej derepresji genu CTA1. W celu uzyskania warunków derepresji różne

zespoły badawcze prowadzą hodowlę S.cerevisiae stosując pożywki o stężeniu glukozy

wynoszącym 0% [39], 0,1% [38], 0,3% [42] lub 0,5% [46] uzupełnione zwykle

etanolem lub glicerolem do końcowego stężenia wynoszącego 2%. W pożywce o

stężeniu glukozy wynoszącej 0% komórki S.cerevisiae dzielą się bardzo rzadko,

ponadto często powoduje ona wcześniejsze przejście komórek do fazy stacjonarnej

(wyników nie przedstawiono). Stosowanie pożywki z 0,5% glukozą mogło jednak

opóźnić rozpoczęcie procesu derepresji. Może ona zatem, przy stosowaniu pożywki o

zbyt wysokim stężeniu glukozy, zachodzić dopiero po przeniesieniu komórek drożdży

do pożywki z kwasem olejowym. W takiej sytuacji obserwowany wzrost poziomu

aktywności promotora genu CTA1 jest wynikiem zarówno derepresji, jak i indukcji tego

genu.

Pomimo dużego podobieństwa stosowanych w badanich metod, istnieją także

odmienne wyniki [56] od uzyskanych w niniejszej pracy. W wymienionej pracy szczepy

adr1 i pip2 w logarytmicznej fazie wzrostu charakteryzują się wyższą wartością

względnego poziomu indukcji genu CTA1 w porównaniu do szczepu kontrolnego.

Wyniki te wydają się jednak mało wiarygodne, ponieważ oparte są na jednym

przeprowadzonym doświadczeniu. Natomiast we wspomnianej pracy, podobnie jak w

67

niniejszej, zaobserwowano niższą wartość względnego poziomu indukcji w hodowlach

przeszczepianych w fazie stacjonarnej.

Czynnik transkrypcyjny Adr1p wydaje się nie mieć wpływu na indukcję genu

CTA1 w hodowlach znajdujących się w logarytmicznej fazie wzrostu. Poziom indukcji

badanego genu obserwowany w szczepie adr1 transformowanym zarówno plazmidem

episomalnym, jak i plazmidem integracyjnym nie odbiega zasadniczo od poziomu

indukcji obserwowanego w szczepie kontrolnym. Interesujący jest jednak związek

ekspresji genu PIP2 i Adr1p [66], ponieważ wysoce prawdopodobny jest wpływ Adr1p

na liczbę cząsteczek Pip2p w komórce. Jeżeli jednak za indukację genu CTA1

odpowiedzialny jest homodimer (Oaf1p)2, ani brak Pip2p, ani brak Adr1p nie powinien

mieć wpływu na poziom indukcji genu CTA1. Uzyskane w doświadczeniu wyniki wraz

z prawdopodobnym wpływem Adr1p na ekspresję genu PIP2 przemawiają za

przyjęciem takiej hipotezy, która jest także zgodna z wcześniej wysuwanymi hiptezami

[39, 45].

Stosowany w doświadczeniu plazmid episomalny, jak wcześniej wspomniano,

występuje w komórce w kilkudziesięciu kopiach. Brak wyraźnych różnic w wynikach

uzyskanych w przeprowadzonych doświadczeniach przy użyciu identycznych szczepów

transformowanych plazmidem episomalnym i integracyjnym wskazują więc na dużą

liczbę cząsteczek czynników transkrypcyjnych biorących udział w indukcji genu CTA1

w komórce. Kiedy w komórce jest mała liczba cząsteczek czynników transkrypcyjnych,

w plazmidzie integracyjnym występującym w jednej kopii w komórce wysycenie

sekwencji nukleotydowej promotora genu trwa krócej w porównaniu do plazmidu

episomalnego. Jeśli jednak w komórce jest duży nadmiar liczby cząsteczek czynników

transkrypcyjncyh, w obu plazmidach wysycenie sekwencji nukleotydowej promotora

68

genu CTA1 powinno w przybliżeniu zajmować tyle samo czasu. Uzyskane wyniki, jak

wcześniej wspomniano, sugerują więc występowanie dużego nadmiaru liczby

cząsteczek cznników transkrypcyjnych biorących udział w indukcji genu CTA1.

Obserwacja ta również sugeruje, iż istotnym czynnikiem transkrypcyjnym w

omawianym procesie jest Oaf1p, którego gen wyrażany jest konstytutywnie [45]. Jeśli

czynnik transkrypcyjny Pip2p byłby białkiem koniecznym do indukcji genu CTA1,

wysycenie sekwencji nukleotydowej promotora w plazmidzie episomalnym nastąpiłoby

dużo później w porównaniu do plazmidu integracyjnego, ponieważ gen PIP2

indukowany jest w podobny sposób jak gen CTA1 [45, 66]. Z ostatniej pracy wynika

również, iż ekspresja genu PIP2 jest zależna od czynnika transkrypcyjnego Adr1p [66],

którego gen podlega, podobnie jak gen CTA1 i PIP2, represji glukozowej [68]. Skutki

syntezy cząsteczek Pip2p wcześniej byłyby obserwowane w komórkach z plazmidem

integracyjnym. Brak różnic w kinetyce indukcji genu CTA1 wskazuje zatem na główną

rolę czynnika transkrypcyjnego Oaf1p w omawianym procesie.

69

2. Reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora

genu CTA1

Obecnie szeroko wykorzystywaną metodą analizy struktury chromatyny jest

metoda oparta na łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) pozwalająca na ustalenie

pozycji nukleosomów z dokładnością do jednego nukleotydu [67]. Wystarczającą

jednak dokładność do wstępnego zbadania struktury chromatyny w celu potwierdzenia

lub wykluczenia udziału czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p i Pip2p w procesie

reorganizacji struktury chromatyny zachodzącym w rejonie promotora genu CTA1

zapewnia stosowana w niniejszej pracy metoda pośredniego znakowania końców [57,

58, 59].

Z wcześniej wykonanej w Zakładzie Biologii Molekularnej pracy wiadomo, że

w rejonie promotora genu CTA1 zachodzi reorganizacja struktury chromatyny zależna

od dostępnego źródła węgla [62]. Uzyskane w niniejszej pracy wyniki potwierdzają tę

obserwację.

Czynnik transkrypcyjny Adr1p jest dobrze poznanym czynnikiem

transkrypcyjnym pod względem reorganizacji struktury chromatyny. Adr1p wiąże się z

sekwencją UAS1 w rejonie promotora genu ADH2 i powoduje destabilizację

nukleosomu uniemożliwiającego dostępu białkom biorącym udział w procesie

transkrypcji do sekwencji TATA-box znajdującej się w rejonie promotora tego genu [23].

Analogiczne działanie Adr1p w rejonie promotora genu CTA1 wydaje się

prawdopodobne, ponieważ sekwencja UAS1 występuje również w rejonie promotora

genu CTA1 [40]. Brak wyraźnych różnic w układzie wykrywanych prążków w stanie

70

represji i derepresji zarówno w szczepie kontrolnym, jak i w szczepie oaf1 i pip2 (w

których funkcjonuje gen ADR1) może jednak świadczyć o tym, że w procesie derepresji

nie zachodzi reorganizacja struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1. Brak

różnicy w układzie wykrywanych prążków w stanie represji i derepresji w szczepie

pozbawionym Adr1p również potwierdza tę hipotezę.

Podobnie jak w szczepie kontrolnym, w szczepie pip2 wyraźne zmiany

struktury nukleosomowej rejonu promotora zachodzą w warunkach indukcji genu CTA1.

Zmiany te, na podstawie przeprowadzonej wstępnej analizy, wydają się odpowiadać

zmianom obserwowanym w szczepie kontrolnym. Istnieje więc możliwość, iż czynnik

transkrypcyjny Pip2p nie bierze czynnego udziału w reorganizacji struktury chromatyny

rejonu promotora genu CTA1.

Zarówno w świetle analizy aktywności promotora genu CTA1 przeprowadzonej

przy użyciu genu reporterowego, jak i na podstawie wcześniejszych prac [39, 45]

najbardziej interesującym czynnikiem transkrypcyjnym wydaje się Oaf1p. Niestety do

chwili obecnej udało się jedynie przeprowadzić analizę struktury chromatyny w

warunkach represji i derepresji, a więc wtedy, kiedy Oaf1p raczej nie powinien

oddziaływać z promotorem genu CTA1. Podobnie jak w szczepie kontrolnym i szczepie

pip2, nie zaobserwowano wyraźnych zmian w strukturze chromatyny. Możliwe, że

przeprowadzenie analizy preparatu wyizolowanego ze szczepu oaf1 hodowanego w

warunkach indukcji genu CTA1 przyniesie interesujące wyniki dotyczące udziału tego

czynnika transkrypcyjnego w badanym procesie.

Koniec sekwencji nukleotydowej genu RMS1 występującego obok genu CTA1

oddalony jest od pierwszego nukleotydu ulegającego translacji w genie CTA1 jedynie o

310pz (Ryc. 5-5). Część obszaru regulatorowego genu CTA1 może więc leżeć w rejonie

71

sekwencji kodującej genu RMS1. Uzasadniona jest zatem obawa, iż zmiany ekspresji

genu RMS1 mogłyby wpływać na strukturę chromatyny, która następnie może mieć

wpływ na aktywność promotora genu CTA1. Gen RMS1 jest jednak wyrażany

konstytutywnie, a rozluźnienie struktury chromatyny spowodowane brakiem histonu H4

nie wpływa na jego aktywność transkrypcyjną [49]. Zmiany struktury chromatyny

zachodzące w rejonie promotora genu CTA1 są więc z dużym prawdopodobieństwem

związane ze zmianami aktywności promotora genu CTA1. Obserwowane w czasie

indukcji genu CTA1 zmiany struktury chromatyny w obrębie genu RMS1 mogą być

jedynie spowodowane przesunięciem nukleosomu w rejonie promotora genu CTA1.

Może to wymuszać przesunięcia kolejnych nukleosomów, m.in. w obrębie genu RMS1.

72

7. Podsumowanie

W niniejszej pracy ustalono kinetykę indukcji genu CTA1 zarówno w szczepie

kontrolnym drożdży S.cerevisiae, jak i w szczepach pozbawionych jednego z

czynników transkrypcyjnych Adr1p, Oaf1p lub Pip2p. Wzrost wartości względnego

poziomu indukcji jest liniowy we wszystkich badanych szczepach i nie zaobserwowano

żadnych cech wyróżniających któryś ze szczepów na tle innych.

Obserwacje względnego poziomu indukcji sugerują, iż czynnik transkrypcyjny

Oaf1p odgrywa ważną rolę w procesie indukcji genu CTA1. Pozostałe z badanych

czynników transkrypcyjnych wydają się mieć mniejszy wpływ na proces indukcji tego

genu.

Reorganizacja struktury chromatyny jest związana z regulacją aktywności

transkrypcyjnej genu CTA1. Uzyskane wyniki sugerują, iż ten mechanizm jest wyraźnie

związany z indukcją tego genu. W celu zidentyfikowania odpowiedzialnych za ten

proces czynników transkrypcyjnych potrzebne są dalsze badania. Przeprowadzenie

elektroforezy preparatów ze wszystkich szczepów hodowanych w trzech warunkach

regulacji genu CTA1 (represja, derepresja i indukcja) na jednym żelu agarozowym

pozwoli porównać pozycje nukleosomów w poszczególnych szczepach z dużą

wiarygodnością. W ten sposób przeprowadzona analiza najprawdopodobniej

doprowadzi do poznania czynnika transkrypcyjnego związanego z reorganizacją

struktury chromatyny w rejonie promotora genu CTA1.

73

8. Literatura 1. Kornberg RD

Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science 1974 May 24;184(139):868-71

2. Kornberg RD, Thomas JO Chromatin structure; oligomers of the histones. Science 1974 May 24;184(139):865-8

3. Wolffe AP Chromatin: Structure and Function. Academic Press Limited (1995)

4. Arents G, Moudrianakis EN Topography of the histone octamer surface: repeating structural motifs utilized in the docking of nucleosomal DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1993 Nov 15;90(22):10489-93

5. Turner BM, Franchi L, Wallace H Islands of acetylated histone H4 in polytene chromosomes and their relationship to chromatin packaging and transcriptional activity. J Cell Sci 1990 Jun;96 ( Pt 2):335-46

6. Cyert MS, Thorner J Putting it on and taking it off: phosphoprotein phosphatase involvement in cell cycle regulation. Cell 1989 Jun 16;57(6):891-3

7. Bannister AJ, Zegerman P, Partridge JF, Miska EA, Thomas JO, Allshire RC, Kouzarides T Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 2001 Mar 1;410(6824):120-4

8. Goldknopf IL, French MF, Daskal Y, Busch H A reciprocal relationship between contents of free ubiquitin and protein A24, its conjugate with histone 2A, in chromatin fractions obtained by the DNase II, Mg++ procedure. Biochem Biophys Res Commun 1978 Oct 16;84(3):786-93

9. Goldknopf IL, Wilson G, Ballal NR, Busch H Chromatin conjugate protein A24 is cleaved and ubiquitin is lost during chicken erythropoiesis. J Biol Chem 1980 Nov 25;255(22):10555-8

74

10. Hong L, Schroth GP, Matthews HR, Yau P, Bradbury EM Studies of the DNA binding properties of histone H4 amino terminus. Thermal denaturation studies reveal that acetylation markedly reduces the binding constant of the H4 "tail" to DNA. J Biol Chem 1993 Jan 5;268(1):305-14

11. Strahl BD, Allis CD The language of covalent histone modifications. Nature 2000 Jan 6;403(6765):41-5

12. Workman JL, Kingston RE Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annu Rev Biochem 1998;67:545-79

13. Wolffe AP, Matzke MA Epigenetics: regulation through repression. Science 1999 Oct 15;286(5439):481-6

14. Jaenisch R, Bird A Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet 2003 Mar;33 Suppl:245-54

15. Mohandas T, Shapiro LJ, Sparkes RS Reactivation of an inactive human X chromosome: evidence for X inactivation by DNA methylation. Science 1981 Jan 23;211(4480):393-6

16. Tamaru H, Selker EU A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa Nature 2001 Nov 15;414(6861):277-83

17. Irvine RA, Lin IG, Hsieh CL DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Mol Cell Biol 2002 Oct;22(19):6689-96

18. Belotserkovskaya R, Berger SL Interplay between chromatin modifying and remodeling complexes in transcriptional regulation. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1999;9(3-4):221-30

19. Hassan AH, Neely KE, Workman JL Histone acetyltransferase complexes stabilize swi/snf binding to promoter nucleosomes. Cell 2001 Mar 23;104(6):817-27

75

20. Lohr D Chromatin structure and regulation of the eukaryotic regulatory gene GAL80. Proc Natl Acad Sci U S A 1993 Nov 15;90(22):10628-32

21. Lohr D, Lopez J GAL4/GAL80-dependent nucleosome disruption/deposition on the upstream regions of the yeast GAL1-10 and GAL80 genes. J Biol Chem 1995 Nov 17;270(46):27671-8

22. Almer A, Hörz W Nuclease hypersensitive regions with adjacent positioned nucleosomes mark the gene boundaries of the PHO5/PHO3 locus in yeast. EMBO J 1986 Oct;5(10):2681-7

23. Verdone L, Camilloni G, Di Mauro E, Caserta M Chromatin remodeling during Saccharomyces cerevisiae ADH2 gene activation. Mol Cell Biol 1996 May;16(5):1978-88

24. Verdone L, Cesari F, Denis CL, Di Mauro E, Caserta M Factors affecting Saccharomyces cerevisiae ADH2 chromatin remodeling and transcription. J Biol Chem 1997 Dec 5;272(49):30828-34

25. Di Mauro E, Kendrew SG, Caserta M Two distinct nucleosome alterations characterize chromatin remodeling at the Saccharomyces cerevisiae ADH2 promoter. J Biol Chem 2000 Mar 17;275(11):7612-8

26. Rubbi L, Camilloni G, Caserta M, Di Mauro E, Venditti S Chromatin structure of the Saccharomyces cerevisiae DNA topoisomerase I promoter in different growth phases. Biochem J 1997 Dec 1;328 ( Pt 2):401-7

27. Perez-Martin J Chromatin and transcription in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Rev 1999 Jul;23(4):503-23

28. White CL, Suto RK, Luger K Structure of the yeast nucleosome core particle reveals fundamental changes in internucleosome interactions. EMBO J 2001 Sep 17;20(18):5207-18

29. Kunau WH, Dommes V, Schulz H β-oxidation of fatty acids in mitochondria, peroxisomes, and bacteria: a century of continued progress. Prog Lipid Res 1995;34(4):267-342

76

30. Veenhuis M, Mateblowski M, Kunau WH, Harder W Proliferation of microbodies in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 1987 Jun;3(2):77-84

31. Gancedo JM Yeast carbon catabolite repression. Microbiol Mol Biol Rev 1998 Jun;62(2):334-61

32. Filipits M, Simon MM, Rapatz W, Hamilton B, Ruis H A Saccharomyces cerevisiae upstream activating sequence mediates induction of peroxisome proliferation by fatty acids. Gene 1993 Sep 30;132(1):49-55

33. Distel B, Erdmann R, Gould SJ, Blobel G, Crane DI, Cregg JM, Dodt G, Fujiki Y, Goodman JM, Just WW, Kiel JA, Kunau WH, Lazarow PB, Mannaerts GP, Moser HW, Osumi T, Rachubinski RA, Roscher A, Subramani S, Tabak HF, Tsukamoto T, Valle D, van der Klei I, van Veldhoven PP, Veenhuis M. A unified nomenclature for peroxisome biogenesis factors. J Cell Biol 1996 Oct;135(1):1-3

34. Brul S, Westerveld A, Strijland A, Wanders RJ, Schram AW, Heymans HS, Schutgens RB, van den Bosch H, Tager JM. Genetic heterogeneity in the cerebrohepatorenal (Zellweger) syndrome and other inherited disorders with a generalized impairment of peroxisomal functions – a study using complementation analysis. J Clin Invest 1988 Jun;81(6):1710-5

35. Cohen G, Rapatz W, Ruis H Sequence of the Saccharomyces cerevisiae CTA1 gene and amino acid sequence of catalase A derived from it. Eur J Biochem 1988 Sep 1;176(1):159-63

36. Gurvitz A, Hamilton B, Ruis H, Hartig A Peroxisomal Degradation of trans-Unsaturated Fatty Acids in the Yeast Saccharomyces

cerevisiae J Biol Chem 2001 Jan 12;276(2):895-903

37. Hortner H, Ammerer G, Hartter E, Hamilton B, Rytka J, Bilinski T, Ruis H Regulation of synthesis of catalases and iso-1-cytochrome c in Saccharomyces cerevisiae by glucose, oxygen and heme. Eur J Biochem 1982 Nov;128(1):179-84

77

38. Skoneczny M, Rytka J Oxygen and haem regulate the synthesis of peroxisomal proteins: catalase A, acyl-CoA oxidase and Pex1p in the yeast Saccharomyces cerevisiae; the regulation of these proteins by oxygen is not mediated by haem. Biochem J 2000 Aug 15;350 Pt 1:313-9

39. Karpichev IV, Small GM Global regulatory functions of Oaf1p and Pip2p (Oaf2p), transcription factors that regulate genes encoding peroxisomal proteins in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 1998 Nov;18(11):6560-70

40. Cheng C, Kacherovsky N, Dombek KM, Camier S, Thukral SK, Rhim E, Young ET Identification of potential target genes for Adr1p through characterization of essential nucleotides in UAS1. Mol Cell Biol 1994 Jun;14(6):3842-52

41. Simon M, Adam G, Rapatz W, Spevak W, Ruis H The Saccharomyces cerevisiae ADR1 gene is a positive regulator of transcription of genes encoding peroxisomal proteins. Mol Cell Biol 1991 Feb;11(2):699-704

42. Rottensteiner H, Kal AJ, Filipits M, Binder M, Hamilton B, Tabak HF, Ruis H Pip2p: a transcriptional regulator of peroxisome proliferation in the yeast Saccharomyces

cerevisiae. EMBO J 1996 Jun 17;15(12):2924-34

43. Karpichev IV, Luo Y, Marians RC, Small GM A complex containing two transcription factors regulates peroxisome proliferation and the coordinate induction of β-oxidation enzymes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 1997 Jan;17(1):69-80

44. Luo Y, Karpichev IV, Kohanski RA, Small GM Purification, identification, and properties of a Saccharomyces cerevisiae oleate-activated upstream activating sequence-binding protein that is involved in the activation of POX1. J Biol Chem 1996 May 17;271(20):12068-75

45. Rottensteiner H, Kal AJ, Hamilton B, Ruis H, Tabak HF A heterodimer of the Zn2Cys6 transcription factors Pip2p and Oaf1p controls induction of genes encoding peroxisomal proteins in Saccharomyces cerevisiae. Eur J Biochem 1997 Aug 1;247(3):776-83

78

46. Baumgartner U, Hamilton B, Piskacek M, Ruis H, Rottensteiner H Functional analysis of the Zn2Cys6 transcription factors Oaf1p and Pip2p. Different roles in fatty acid induction of beta-oxidation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 1999 Aug 6;274(32):22208-16

47. Simon M, Binder M, Adam G, Hartig A, Ruis H Control of peroxisome proliferation in Saccharomyces cerevisiae by ADR1, SNF1 (CAT1, CCR1) and SNF4 (CAT3). Yeast 1992 Apr;8(4):303-9

48. Young ET, Kacherovsky N, Van Riper K Snf1 protein kinase regulates Adr1 binding to chromatin but not transcription activation. J Biol Chem 2002 Oct 11;277(41):38095-103

49. Wyrick JJ, Holstege FC, Jennings EG, Causton HC, Shore D, Grunstein M, Lander ES, Young RA Chromosomal landscape of nucleosome-dependent gene expression and silencing in yeast. Nature 1999 Nov 25;402(6760):418-21

50. Chen P, Johnson P, Sommer T, Jentsch S, Hochstrasser M Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell 1993 Jul 30;74(2):357-69

51. Myers AM, Tzagoloff A, Kinney DM, Lusty CJ Yeast shuttle and integrative vectors with multiple cloning sites suitable for construction of lacZ fusions. Gene 1986;45(3):299-310

52. Sambrook J, Maniatis T, Fritsch EF Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)

53. Gietz RD, Woods RA Transformation of yeast by lithium acetate / single-strandedcarrier DNA / polyethylene glycol method. Methods Enzymol 2002;350:87-96

54. Bradford MM A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976 May 7;72:248-54

79

55. Guarente L Yeast promoters and lacZ fusions designed to study expression of cloned genes in yeast. Methods Enzymol 1983;101:181-91

56. Solińska M Analiza aktywności transkrypcyjnej promotora genu CTA1 Saccharomyces cerevisiae. Praca magisterska wykonana w Zakładzie Biologii Molekularnej Wydziału Biologii UW (2002)

57. Wu C The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature 1980 Aug 28;286(5776):854-60

58. Wu C Analysis of hypersensitive sites in chromatin. Methods Enzymol 1989;170:269-89

59. Nedospasov SA, Shakhov AN, Georgiev GP Analysis of nucleosome positioning by indirect end-labeling and molecular cloning. Methods Enzymol 1989;170:408-20

60. Keene MA, Corces V, Lowenhaupt K, Elgin SC DNase I hypersensitive sites in Drosophila chromatin occur at the 5' ends of regions of transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Jan;78(1):143-6

61. Sledziewski A, Young ET Chromatin conformational changes accompany transcriptional activation of a glucose-repressed gene in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Jan;79(2):253-6

62. Trzcińska-Danielewicz J, Bulkowska U, Fronk J Struktura nukleosomowa promotora genu CTA1 Saccharomyces cerevisiae Plakat prezentowany na XXXVI zjeździe Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, Poznań (2000)

63. Choder M A general topoisomerase I-dependent transcriptional repression in the stationary phase in yeast. Genes Dev 1991 Dec;5(12A):2315-26

64. Fuge EK, Braun EL, Werner-Washburne M Protein synthesis in long-term stationary-phase cultures of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 1994 Sep;176(18):5802-13

80

65. Boucherie H Protein synthesis during transition and stationary phases under glucose limitation in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 1985 Jan;161(1):385-92

66. Rottensteiner H, Wabnegger L, Erdmann R, Hamilton B, Ruis H, Hartig A, Gurvitz A Saccharomyces cerevisiae PIP2 mediating oleic acid induction and peroxisome proliferation is regulated by Adr1p and Pip2p-Oaf1p. J Biol Chem 2003 May 14 (w chwili opracowywania spisu literatury dostępna była jedynie wersja elektroniczna, PMID: 12748191)

67. Venditti P, Costanzo G, Negri R, Camilloni G ABFI contributes to the chromatin organization of Saccharomyces cerevisiae ARS1 B-domain. Biochim Biophys Acta 1994 Nov 22;1219(3):677-89

68. Blumberg H, Hartshorne TA, Young ET Regulation of expression and activity of the yeast transcription factor ADR1. Mol Cell Biol 1988 May;8(5):1868-76

Struktura chromatyny rejonu - Strona Wydziału Biologii UW · Struktura chromatyny rejonu...

Documents

Transcript of Struktura chromatyny rejonu - Strona Wydziału Biologii UW · Struktura chromatyny rejonu...