SekwencjonowanieSekwencjonowanieSekwencjonowaniewczoraj i dziś

Sekwencjonowaniewczoraj i dziśjj

dr hab. Beata Krawczyk

Katedra Mikrobiologii PG

Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

CelCel sekwencjonowaniasekwencjonowaniaCel Cel sekwencjonowaniasekwencjonowania

dostarcza wielu cennych informacji o strukturze i funkcji genów,  

znajomość pełnej sekwencji DNA badanych organizmów umożliwia zrozumienie molekularnych mechanizmów ich f k j i i l jifunkcjonowania i ewolucji

umożliwia szukanie mutacji

• Naukowcy zakończyli sekwencjonowanie pełnego genomu neandertalczyka, wymarłego około 30 tys. lat temu bliskiego y , y g y g

krewniaka człowieka

• Zgodnie z przewidywaniami genomy ł i k i d l k

Archeologia molekularna -Historia człowieka

człowieka i neandertalczyka są w 99,5% identyczne (człowieka i

szympansa - w 98%).

http://migg.wordpress.com/2006/11/16/neandertalczyk-powraca/

Pochodzenie człowieka

Analiza fragmentów jądrowego i mitochondrialnego DNA ze

szczątków paleontologicznych i ą p g yarcheologicznych pozwala badać

pochodzenie człowieka

http://migg.files.wordpress.com/2007/03/101371_journalpbio0020340g005-m.jpg

Historia rozwoju metod sekwencjonowania DNA

19531953 ‐ opracowanie modelu podwójnej helisy DNA przez Jamesa Watsona i19531953 opracowanie modelu podwójnej helisy DNA przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka19721972 ‐ opracowanie sposobów izolacji materiału do dalszych badań. Rozwój technologii rekombinacji umożliwiający izolację dowolnych fragmentów DNA i ich g j ją y ję y greplikację. 19771977 ‐ Allan Maxam i Walter Gilbert ogłaszają publikację pt.: Sekwencjonowanie DNA przez chemiczną degradację. W tym samym czasie Sanger opublikował też metodę sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną enzymatycznie. 19801980 ‐ Fred Sanger i Walter Gilbert otrzymali Nagrodę Nobla. 1982 ‐ utworzono Gen bank ‐ publicznie dostępną bazę danych sekwencji DNA Andre Marion i Samuel Eletr utworzyli firmę Applied Biosystems, która w tym okresie zdominowała automatyczne sekwencjonowanie DNA 19821982 ‐ Akiyoshi Wada zbudował roboty sekwencyjne dla firmy Hitachi. 19841984 ‐ kompletna sekwencja wirusa Epstein‐Barr, 170 kb. 1997 1997 ‐ zsekwencjonowano 5Mb genom bakterii. 20012001, 15 lutego ‐ Konsorcjum HUGO opublikowało sekwencję genomu ludzkiego w N tNature. 2001,2001, 16 lutego ‐ firma Celera Genomics opublikowała sekwencję genomu ludzkiego w Science. 

MetodaMetoda MaxamaMaxama GilbertaGilberta (1977)(1977)Metoda Metoda MaxamaMaxama‐‐GilbertaGilberta (1977)(1977)

• Polega na użyciu związków chemicznych do specyficznegoPolega na użyciu związków chemicznych do specyficznego rozczepienia DNA

• Przeprowadza się 4 niezależne reakcje, w których wykorzystuje się 4 różne odczynniki specyficzne dla poszczególnych zasad:

1. reakcja „G” – DMS piperydyna

2 reakcja G+C” kwas mrówkowy piperydyna2. reakcja „G+C  ‐ kwas mrówkowy, piperydyna

3. reakcja „T+C” – hydrazyna, piperydyna

4. reakcja „C” – hydrazyna + NaCl, piperydyna    j „ y y , p p y y

Metoda Sangerametoda terminacji wydłużania łańcuchametoda terminacji wydłużania łańcucha

(tzw. metoda dideoksy) 

Wykorzystuje polimerazę DNA, która ma zdolność do syntezy wiernej, komplementarnej kopii jednoniciowego DNA matrycowego

oraz

używa 2’3’dideoksynukleotydów jako substratówużywa 2 3 dideoksynukleotydów jako substratów 

Enzymy używane w Enzymy używane w sekwencjonowaniusekwencjonowaniupowinny charakteryzować się: powinny charakteryzować się: 

1. wysoką procesywnością

2. brakiem aktywności egzonukleazy 5’→3’2. brakiem aktywności egzonukleazy 5 →3

3. Brakiem  aktywności egzonukleazy 3’→5’ 

Enzymem wykorzystywanym do reakcji wydłużania startera początkowo był fragment polimerazy DNA Klenowa (brak aktywności egzonukleolitycznej5’ 3’)Fragment Klenowa polimerazy z E.coli zastąpiono naturalną lub modyfikowaną polimerazą DNA z fagaT7T7wprowadzenie dideoksynukleotydów jest mniej zakłócone przez lokalne sekwencje nukleotydów,zakłócone przez lokalne sekwencje nukleotydów,  prążki o wyrównanej intensywności 

Z t i li t fil j b kt ii• Zastosowanie polimerazy z termofilnej bakterii Thermus aquaticus (Taq DNA polimeraza)

• ‐ pozwala na prowadzenie reakcji terminacji• ‐ pozwala na prowadzenie reakcji terminacjiłańcucha w temperaturze 65‐70°C, co minimalizuje artefakty spowodowane II‐go rzędową strukturą DNA

• Tabor i Richardson w 1995r zamienili resztę f l l i T DNA li tfenyloalaniny Taq DNA polimerazy na resztę tyrozyny (termostabilny enzym sekwencyjny nie rozróżnia dideoksynukleotydów odrozróżnia dideoksynukleotydów od deoksynukleotydów).

MatrycaMatryca w postaciw postaci ssss DNADNAMatryca Matryca w postaci w postaci ssss DNADNA

• DNA sklonowany na wektorze plazmidowym

• DNA sklonowany na wektorze M13wektorze M13DNA sklonowany na wektorze M13wektorze M13

• DNA sklonowany na fagmidzie

• Zastosowanie PCRPCR do otrzymania jednoniciowego DNAj g

produkty PCR do produkty PCR do sekwencjonowaniasekwencjonowania

Matryca DNA

B

DNAPCR z jednym biotynylowanymstarterem

BBiotynylowany produkt PCR

B

Wychwycenie przez streptawidynę sprzężoną z

streptawidyna

B P M Pp y ę p ę ą

kuleczkami magnetycznymiParamagnetic

particle

B P M PS k j i

Denaturacja alkaliczna

Sekwencjonowanieobu nici DNA

Starter wyznacza Starter wyznacza sekwencjonowanysekwencjonowany region na matrycowym DNAregion na matrycowym DNA

1.1. Starter Starter uniwersalny uniwersalny (do amplifikacji fr. o dł. 750 pz) 

DNA przeznaczone do sekwencjonowania może być wklonowany w jedno ze zgrupowanych miejsc klonowania w 

i i l kt ó M13 ii

DNA wektora 

regionie lac wektorów M13 serii mpco pozwala na używanie ciągle tego samego startera, ułatwia również izolację pojedynczych nici DNA do sekwencjonowania

3’ 5’DNA wektora  DNA wstawki 

sekwencjonowania

2 Startery wewnętrzne2 Startery wewnętrzne2. Startery wewnętrzne 2. Startery wewnętrzne 

3’ 5’

DetekcjaDetekcjaDetekcja Detekcja Ż• Żel sekwencyjny 6‐20%; 

• 7 molarny mocznik (zapobiega tworzeniu się struktur II d h) d ż d i l ść d i ł j d i i hrzędowych): duża rozdzielczość, rozdział jednoniciowych

(zdenaturowanych) fragmentów DNA

• elektroforeza przebiega przy natężeniu prądu wystarczającym• elektroforeza przebiega przy natężeniu prądu wystarczającym do podgrzania żelu do ok.70°C, co przeciwdziała powstawaniu II rz. struktur.           

• Autoradiografia

• Nieizotopowe metody identyfikacji: chemiluminescencyjne,Nieizotopowe metody identyfikacji: chemiluminescencyjne, chromogeniczne, fluorogeniczne

W mieszaninie reakcyjnej powstaje zbiór częściowo zsyntetyzowanych cząsteczek z których każda zawiera  taki sam koniec 5’, ale różni się długością od strony końca 3’strony końca 3 .

Rys. T.A. Brown „Genomy” PWN 2001

Automatyczne Automatyczne sekwencjonowaniesekwencjonowanie z wykorzystaniem z wykorzystaniem dideoksyrybonukleotydówdideoksyrybonukleotydów znakowanych fluorescencyjnieznakowanych fluorescencyjniedideoksyrybonukleotydówdideoksyrybonukleotydów znakowanych fluorescencyjnie znakowanych fluorescencyjnie 

(1987 (1987 rr ProberProber i i wspwsp.).)

Wydruk z sekwenatora, sekwencja w postaci serii szczytów, z których każdy p y , y yodpowiada innemu nukleotydowi 

Rys. T.A. Brown „Genomy” PWN 2001

NoweNowe sekwenatorysekwenatoryNowe Nowe sekwenatorysekwenatory

• Rozdział w kapilarach, a nie w żelu poliakryloamidowym

• 96 kanałów – 96 sekwencji (2 godziny); 1000 sekwencjowań w i d bciągu doby

S k j iS k j i kli S ikli S i 19921992•• SekwencjonowanieSekwencjonowanie cykliczne Sears i cykliczne Sears i wspwsp. 1992. 1992

• Wyróżnia się dwiema cechami, których nie ma metoda tradycyjna:tradycyjna:

materiałem wyjściowym jest dsDNA (np. produkty PCR)

i k i ś i kl i d k j inie ma konieczności klonowania przed sekwencjonowaniem

wystarcza niewielka ilość DNA

Produkt PCR + wyznakowany starter +dNTP + polimeraza TaqPreparatywny PCR –namnożenie wybranego f ż i fi h

Mieszanina reakcyjna

fragmentu genu przy użyciu pary specyficznych starterów

d DNAyj

Zamiast startera barwnikami fl j i ż k ćddATP1 starter

dsDNA

ddATPddATP ddTTPddTTP ddCTPddCTP ddGTPddGTP

asymetryczny PCR (liniowy)

fluorescencyjnymi  można wyznakować dideoksynukleotydy

ddATP1 starter

ddA

Sekwencjonowanie cykliczne‐denaturacja

ł i 20 45

asymetryczny PCR (liniowy)ddA

ddA

ddA‐przyłączanie startera‐wydłużanie startera‐terminacja

20‐45 cykli

Denaturacja produktów

Elektroforeza i odczyt sekwencjiPorównywanie z sekwencjąz dostępnych baz danych takich jak GenBankGenBank i EMBLi EMBL. 

PirosekwencjonowaniePirosekwencjonowaniePirosekwencjonowaniePirosekwencjonowanie

ATACCTATAAC------

GG A ------

1 ATACCTATAAC------

GG A ------

1

Polimeraza DNA

+ dNTP

PPi +APS 2Polimeraza DNA

+ dNTP

PPi +APS 2+ dNTP sulfurylaza

ATP

+ 34 apyraza

+ dNTP sulfurylaza

ATP

+ 34 apyraza +lucyferaza

34

Lucyferyna oxylucyferyna

apyraza +lucyferaza

34

Lucyferyna oxylucyferyna

apyraza

dNDPs + dNMPs + fosforan

i

ADP + AMP + fosforan

dNDPs + dNMPs + fosforan

i

ADP + AMP + fosforanEtap 1: w obecności enzymów (polimerazy DNA, apyrazy, lucyferazy, sulfurylazy ATP) i substratów (adenozyno 5’-fosfosiarczanu APS i D-lucyferyny), sekwencyjny starter jest przyłączany do matrycy DNA uzyskanej w wyniku PCR i wydłużany przez polimerazę DNA. Podczas inkorporacji każdego z nukleotydów, nieorganiczny pirofosforan PPi jest usuwany w równomolarnych ilościach. Etap 2: w obecność APS, sulfurylaza ATP odwraca PPi do ATP. Etap 3: wytworzone ATP na etapie 2 jest wykorzystywane przez lucyferazę do katalizy konwersji lucyferyny do oxylucyferyny, która emituje światło w ilości proporcjonalnej do ilości zużytego ATP. Etap 4. Podczas reakcji polimeryzacji, apyraza degraduje niewintegrowane dNTP. Apyraza również degraduje nadmiar ATP wytworzonych z wyniku działania sulfurylazy ATP.

Pi k j iPi k j iPirosekwencjonowaniePirosekwencjonowaniestarter

Matrycowy DNA

starter

dATP degradacja

dTTP degradacja

dGTP Chemiluminescencja = G

dCTP degradacja

dATPChemiluminescencja =

GA

GGATATTG

Dodawanie nukleotyduDodawanie nukleotydu

P kł d i k jPrzykład pirogramu sekwencyjnego. 

Podczas postępu w syntezie DNA, wydłużana jest nić komplementarna. Software produkuje piki na grafie zwanym pirogramem. Jest on proporcjonalny do ilości wbudowanych dNTP podczas syntezy. Na rycinie poka ano pr kłado ą sek encję docelo ą GGATATTG W żs e piki pr pier s m G i dr gim Tpokazano przykładową sekwencję docelową ‐ GGATATTG. Wyższe piki przy pierwszym G i drugim T świadczą, że mamy podwójne G i T. Software automatycznie dodaje kontrole, aby ocenić jakość matrycy. W tym pirogramie, dwie reszty cytozyny reprezentują taka kontrolę. Jeżeli matrycowe DNA jest skontaminowane to obserwuje się piki na tych resztach. E: enzym; S: substrat. j ę p y y

Kolekcja izolatów

Izolacja DNA

Amplifikacja PCR fragmentów genów 400‐500 pz

Sekwencjonowanie (dideoxy)

Kolekcja danych

Określenie sekwencji nukleotydowej

Zgromadzenie danych sekwencji nukleotydowychAnaliza 

Profile alleliczne i identyfikacja typu sekwencji (ST)

Przydział ST do kompleksu klonalnego

Nowe sekwencjealleli 

i weryfikacja ST

danych

Analiza S k jiBadanie populacji Badania epidemiologiczne Sekwencji 

ML

Diagram badawczy MLSTDiagram badawczy MLST

• Sekwencje nukleotydowe dla każdego z fragmentów genu są traktowane 

jako allele, tworząc profil alleliczny, czy typ sekwencji ST (ang. Sequence

Type) dla badanego szczepu. 

• Izolaty o tym samym profilu allelicznym są zaliczane do tej samej grupy y y y p y ą j j g py

klonalnej. 

• Wariantem metody MLST jest sekwencjonowanie wielu regionów między• Wariantem metody MLST jest sekwencjonowanie wielu regionów między‐

genowych. Pozwala to na osiągnięcie wyższego stopnia zróżnicowania niż 

dk k ó d b lw przypadku sekwencjonowania genów podstawowego metabolizmu 

komórkowego.  

Multilocus Sequence Typing (MLST) dla S.aureus

Chromosomalne DNA

Amplifikacja wewnętrznychfragmentów siedmiu „house‐keeping genes”p g g

Sekwencja 7 fragmentówarcC        aroE        glp gmk pta tpi yqiL 

Każda różnica w sekwencji w danym locus daje różną liczbę alleli

Liczba alleli MLST loci daje alleliczny profil izolatów

Porównuje się profile alleliczne izolatów z centralna bazą danych na internecie www.mlst.net

MLSTMLSTMLSTMLSTMaiden M C J, Bygraves J A, Feil E, Morelli G, Russell J E, Urwin R, Zhang Q, Zhou J, Zurth K, Caugant D A, Feavers I M, Achtman M and Spratt B G (1998) Multilocus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 3140‐3145 

Urwin R, Maiden MC. (2003) Multi‐locus sequence typing: a tool for global id i l T d Mi bi l O t 11(10) 479 87epidemiology. Trends Microbiol. Oct;11(10):479‐87.

David M. Aanensen* and Brian G. Spratt (2005) The multilocus sequence typing network: mlst net Nucleic Acids Research Vol 33typing network: mlst.net Nucleic Acids Research, Vol. 33,

Maiden MC. Multilocus sequence typing of bacteria.Annu Rev Microbiol. 2006;60:561‐882006;60:561‐88