1

Pracownia studencka

Zakładu Analizy Środowiska

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII

Ćwiczenie nr 3

Rola wiązań specyficznych i niespecyficznych w mechanizmie

rozdzielania związków o właściwościach zasadowych

na fazach odwróconych RP-HPLC

KURS: Zastosowanie chromatografii cieczowej w chemii i ochronie środowiska

Gdańsk, 2016

2

1. Wstęp teoretyczny

1.1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa w normalnym i odwróconym układzie faz

W zależności od polarności faz wyróżnia się chromatografię w normalnym (ang. NP

– normal phase) i w odwróconym układzie faz (ang. RP – reversed phase). Porównanie tych dwóch

układów przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1. Porównanie układu faz normalnych i odwróconych

Cechy układów Układ faz normalnych Układ faz odwróconych

Polarność fazy stacjonarnej wysoka niska

Polarność fazy ruchomej niska-średnia średnia-wysoka

Typowa faza ruchoma heptan/CHCl3 CH3OH/H2O

Kolejność wymywania jako pierwszy wymywany jest

związek najmniej polarny

jako pierwszy wymywany jest

związek najbardziej polarny

Wzrost retencji substancji

rozpuszczonych

zmniejszenie polarności fazy

ruchomej

zwiększenie polarności fazy

ruchomej

Przez normalny układ faz rozumiemy układ, w którym faza stacjonarna jest bardziej

polarna niż faza ruchoma. Mechanizm rozdzielania analitów w NP-HPLC jest oparty

na procesach adsorpcyjnych. Tak jak w innych technikach chromatografii cieczowej, rozdzielenie

w NP-HPLC następuje w wyniku konkurencji pomiędzy cząsteczkami analitu

a cząsteczkami fazy ruchomej o miejsca aktywne sorpcyjnie na powierzchni fazy stacjonarnej. Im

silniejsze oddziaływanie analit - faza stacjonarna, tym anality są dłużej zatrzymywane

w kolumnie (tym większa jest ich retencja). Siła adsorpcji wzrasta ze wzrostem polarności

analitów.

Najczęściej stosowaną fazą stacjonarną w NP-HPLC jest krzemionka (Rysunek 1).

Rzadziej używane są inne porowate tlenki np. tlenek glinu. Powierzchnia tych faz stacjonarnych

jest gęsto pokryta grupami hydroksylowymi OH, które powodują, że powierzchnia ta jest silnie

polarna.

HO

SiO

SiO

SiO

H

O

OH

O

OH

O

OH

H H H

Rysunek 1. Struktura krzemionki

Na powierzchni krzemionki występują różne miejsca aktywne. Są to grupy silanolowe

i grupy siloksanowe. Grupy silanolowe występują jako: wolne grupy silanolowe

(o najwyższej zdolności adsorpcyjnej), geminalne (podwójne) grupy silanolowe oraz wicynalne

grupy silanolowe. Struktury i zawartości procentowe tych grup na powierzchni krzemionki

przedstawiono w Tabeli 2.

3

Tabela 2. Struktura i zawartość procentowa grup silanolowych występujących na powierzchni krzemionki

Nazwa grup

silanolowych

Struktura

Zawartość

procentowa

[%]

WOLNE

6 – 19

WICYNALNE

10 – 12

GEMINALNE

60 – 65

Dodatkowo na powierzchni krzemionki zlokalizowane są grupy siloksanowe, stanowiące

20 – 35 % w porównaniu do całkowitej liczby grup silanolowych, które powstają w wskutek

dehydroksylacji grup hydroksylowych.

Faza ruchoma w normalnym układzie faz składa się z niepolarnego rozpuszczalnika np.

heksanu, heptanu i niewielkiego dodatku modyfikatora o charakterze polarnym. Typowymi

dodatkami polarnymi są alkohole (np. metanol, etanol). Ich dodatek pozwala na kontrolowanie

retencji analitu w kolumnie. Stosowane rozpuszczalniki, ułożone według wzrastającej polarności

i mocy elucyjnej tworzą tak zwany szereg eluotropowy (Rysunek 2). Ze wzrostem polarności fazy

ruchomej zwiększa się retencja analitów.

Rysunek 2. Szereg eluotropowy rozpuszczalników

4

Normalny układ faz jest rzadziej stosowany niż odwrócony układ faz. Spowodowane jest

to znaczną hydrofilowością polarnej fazy stacjonarnej w NP-HPLC, która silnie adsorbuje wodę

znajdująca się w niewielkich ilościach w rozpuszczalnikach, co prowadzi do zmian właściwości

wypełnienia kolumny i ostatecznie dezaktywacji jej powierzchni. Takie procesy nie zachodzą na

fazie stacjonarnej w odwróconym układzie faz, co znacznie wydłuża żywotność kolumny.

Faza stacjonarna w RP-HPLC ma charakter bardziej hydrofobowy w stosunku do fazy

ruchomej. Jako fazę ruchomą stosuje się mieszaninę wody i rozpuszczalnika organicznego

w niej rozpuszczalnego, np. metanolu czy acetonitrylu. Również tutaj siłę wymywającą

rozpuszczalnika można określić posługując się szeregiem eluotropowym (Rysunek 2). Natomiast

jako fazę stacjonarną używa się najczęściej krzemionkę zmodyfikowaną grupami alkilowymi -

alifatycznymi bądź aromatycznymi. Ogólnie przyjęte jest, że mechanizm rozdzielania w RP-

HPLC oparty jest na oddziaływaniach hydrofobowych, które wynikają

z istnienia sił odpychających/przyciągających pomiędzy polarnym eluentem, względnie

niepolarnym analitem i niepolarną fazą stacjonarną. RP-HPLC posiada wiele zalet w porównaniu

do NP-HPLC. Należą do nich m.in.:

1) zdolność rozdzielenia związków o szerokim zakresie polarności,

2) niższy koszt faz ruchomych,

3) szybsze ustalenie stanu równowagi fazy ruchomej w kolumnie,

4) możliwość separacji związków jonowych i jonizowalnych przez użycie odczynników

tworzących pary jonowe,

5) szybsze analizy i wyższa ich powtarzalność.

Odwrócony układ faz ma także pewne ograniczenia. Dla wielu faz związanych, stabilność

wypełnienia kolumny utrzymuje się tylko w zakresie pH od 3 do 8 (związane jest

to ze stabilnością krzemionkowego szkieletu złoża oraz chemicznie związanych modyfikatorów

jego powierzchni). Kolejną wadą jest obecność resztkowych grup silanolowych na powierzchni

krzemionki, co wynika z niepełnego przereagowania grup hydroksylowych krzemionki

z odczynnikami alkilującymi. Może to powodować wydłużenie czasów retencji analitów

i niepowtarzalność wyników uzyskanych na różnych kolumnach z powodu silnej adsorpcji

substancji badanej oraz asymetrię pików, szczególnie związków o charakterze zasadowym

w formie sprotonowanej. W przypadku ogonowania piku współczynnik asymetrii przekracza

graniczną wartość symetryczności piku (równą 1,15). Natomiast w przypadku rzadziej

występującego zjawiska przodowania piku wartość ta jest niższa od 0,95.

Poszerzanie i ogonowanie pików w chromatografii powoduje m.in. niejednorodność fazy

stacjonarnej. Wynika to z obecności na jej powierzchni dwóch miejsc adsorpcji, różniących się

szybkością kinetyki (przenoszenia masy próbki) oraz procesu adsorpcji-desorpcji.

Na powierzchni fazy stacjonarnej występuje kilka silnych miejsc o dużej energii adsorpcji

(zjonizowane silanole) w obecności dużej liczby miejsc o małej energii adsorpcji (hydrofobowe

ligandy). Sprotonowane formy analitów o charakterze zasadowym silniej oddziałują

ze zjonizowanymi silanolami niż za pomocą oddziaływań hydrofobowych z ligandami fazy

stacjonarnej. W momencie wzrostu ilości substancji następuje nasycenie miejsc

wysokoenergetycznych, wówczas substancja adsorbuje się w miejscach niskoenergetycznych.

Biorąc pod uwagę obecność silnych i słabych miejsc adsorpcji ogonowanie pików może wynikać

ze znacznie wolniejszego procesu sorpcji-desorpcji cząsteczek analitów z silnych miejsc adsorpcji

w porównaniu do słabych miejsc. W celu ujednolicenia energetycznie powierzchni fazy

5

stacjonarnej, czyli dążenia do występowania jednego rodzaju oddziaływań dodaje się

do fazy ruchomej m.in. ciecze jonowe czy aminy, oddziałujące z miejscami sorpcyjnie aktywnymi.

W wyniku tego, desorpcja substancji rozpuszczonej z powierzchni fazy stacjonarnej następuje z

taką samą szybkością, powodując poprawę kształtu pików.

Innymi źródłami ogonowania lub niesymetryczności pików mogą być m.in:

Niewłaściwie zapakowane czoło kolumny - może powodować rozdwajanie pików

Zbyt duża siła elucyjna rozpuszczalnika próbki

Zanieczyszczone czoło kolumny

Wiek kolumny

Przebicie kolumny - zmiany kształtu spowodowane mogą być także tym, iż każda kolumna

posiada określoną pojemność sorbcyjną (tj. ilość półek teoretycznych dla dalej substancji), zbyt

duże objętości nastrzyku lub zbyt duże dozowane stężenia powodują, że kolumna jest

przeładowana

Obecnością martwych objętości w kolumnie oraz złe podłączenie kolumny do drenów

Zbyt krótki okres kondycjonowania kolumny - wpływa na odtwarzalność kształtu sygnałów,

podobnie jak jednorodność przepływu (brak pulsacji w układzie pomp), zmiany składu fazy

ruchomej

1.2. Fazy stacjonarne zbudowane ze zmodyfikowanej krzemionki

Złoże zbudowane z krzemionki można modyfikować wieloma podstawnikami różniącymi

się polarnością, co uznaje się za główną z jej zalet. Wśród niepolarnych podstawników wymienić

można łańcuchy alkilowe np. C4, C8, C18, C30 (Rysunek 3). Mniej niepolarne są złoża

zmodyfikowane niepolarnymi łańcuchami alkilowymi zawierające polarne grupy takie jak fenyl,

amid, -NH2, -CN, -NO2 (Rysunek 3).

Okazuje się, że nie można całkowicie pokryć grup silanolowych znajdujących się

na powierzchni krzemionki. Grupy hydroksylowe niepodstawione nazywane są resztkowymi

grupami silanolowymi. Ilość takich grup świadczy o jakości wykonania kolumny. Ostatecznie,

zmodyfikowane fazy stacjonarne zawierają najczęściej dwa centra adsorpcji, hydrofobowe grupy

alkilowe bądź arylowe, które mogą zawierać polarne grupy funkcyjne oraz polarne, resztkowe

grupy silanolowe. Właściwości chemiczne faz stacjonarnych na bazie krzemionki

w odwróconym układzie faz są określone przez strukturę związanych z powierzchnią ligandów,

ich długości, gęstości pokrycia (stężenia powierzchniowego), jednorodności pokrycia, mobilności,

ale także przez obecność resztkowych grup silanolowych.

6

Rysunek 3. Różne rodzaje połączeń faz stacjonarnych używanych w chromatografii cieczowej: (A) grupa

oktadecylowa, (B) grupa oktylowa, (C) grupa fenylo-propylowa, (D) grupa amino-propylowa, (E) grupa N-

acyloamidowa, (F) cholestero-amidowa

Fazy stacjonarne w odwróconym układzie faz traktowane są jako system trójwymiarowy,

do których wnętrza substancje rozpuszczone i składniki fazy ruchomej mogą przenikać na różną

głębokość. Proces ten jest uzależniony od wielkości i struktury związanych z nimi ligandów.

W strukturze fazy stacjonarnej wyróżnia się dwa rodzaje miejsc o właściwościach aktywnie

sorpcyjnych, które są określone na podstawie rozkładu energii (Rysunek 4). Miejsca

wysokoenergetyczne są najprawdopodobniej ośrodkami głęboko ukrytymi w warstwie związanej

z grupami alkilowymi, więc ich dostępność jest kontrolowana przez wielkość tych cząsteczek.

Mniejsze substancje rozpuszczone mogą przenikać głębiej wewnątrz warstwy związanej niż

większe. Miejsca niskoenergetyczne występują na granicy łańcuchów alkilowych i fazy ruchomej.

Rysunek 4. Występowanie miejsc nisko- i wysokoenergetycznych na zmodyfikowanej krzemionce

7

1.3. Mechanizm retencji na fazach RP

Zatrzymywanie (retencja) analitu w kolumnie zależy od siły jego oddziaływania z fazą

stacjonarną wypełnienia kolumny chromatograficznej. W Tabeli 3 znajduje się opis

podstawowych oddziaływań, których suma ma pływ na czas retencji analitu. Zostały one także

przedstawione graficznie na Rysunku 5.

Tabela 3. Oddziaływanie cząsteczkowe w RP-HPLC

Oddziaływanie cząsteczkowe Wkład do RP

Dyspersyjne, hydrofobowe Oddziaływanie specyficzne dla układu RP. Występuje

pomiędzy hydrofobowymi elementami cząsteczki

analizowanej a łańcuchami alkilowymi, które wprowadzono

na szkielet krzemionkowy kolumn typu C18 czy C8. Im jest

silniejsze tym większa jest retencja analitu, stąd przybliżoną

retencję można przewidzieć znając wartości log P

mieszaniny analitów.

Oddziaływania pi-pi,

aromatyczne

Występujący gdy cząsteczka oznaczana posiada wiązania

nienasycone, w tym aromatyczne i gdy faza stacjonarna

posiada wbudowane grupy fenolowe

3. Wiązania wodorowe (charakter

kwasowy)

Występują w przypadku gdy analit może być donorem lub

akceptorem wodoru i gdy faza stacjonarna posiada grupy

funkcyjne, które takimi donorami lub akceptorami mogą

być

4. Oddziaływania dipol-dipol

(charakter zasadowy)

Obserwowane gdy faza stacjonarna posiada specyficzne

grupy funkcyjne

Oddziaływania jonowe Oddziaływania niespecyficzne dla RP-HPLC (pierwotne

dla faz normalnych) pomiędzy analitem a fazą stacjonarną

w przypadku gdy faza posiada dużą gęstość resztkowych

grup hydroksylowych. Wiązanie to należy usuwać /

supresować, gdyż negatywnie wpływa na retencję

związków o właściwościach zasadowych.

Oczywiście na retencję analitu wpływa znacznie więcej czynników, takich jak rodzaj

modyfikatora organicznego, rodzaj dodatku do fazy ruchomej i jej pH, sprawność układu i jego

parametry (przepływ, rodzaj i rozmiary kolumny, temperatura).

8

Rysunek 5. Przykłady modyfikacji krzemionki i ich polarność

1.4. Supresja resztkowych grup silanolowych

W celu dezaktywowania grup silanolowych stosuje się proces określany w języku

angielskim jako end-capping, natomiast w polskim jako zabezpieczanie resztkowych grup

silanolowych. Jest to proces, w którym resztkowe grupy silanolowe są przekształcane

w znacznie mniej polarne grupy funkcyjne. Wpływa to na zmniejszenie wtórnego ich

oddziaływania z cząsteczkami polarnymi analitów. Oddziaływania silanolowe prowadzą

do asymetrii piku, niskiej wydajności kolumn i nieodtwarzalności retencji. Proces end-capping

zmniejsza ogonowanie pików na chromatogramach analiz polarnych analitów. Najczęściej

stosowanymi czynnikami chemicznymi używanymi w celu blokowania wolnych grup

silanolowych są trimetylochlorosilan (TMCS) i heksametylodisilazan (HMDS), wprowadzające

ugrupowania trimetylosililowe (TMS) (Rysunek 6).

O

Si

O

Si

O

Si

O

Si

O

Si

O

Si

O

Si

O

Si

O

Si

O

Si

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

Si

Si

H

Si

H

Si

H

Si

H

CH

2

CH

2

CH

2

CH

2

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

H

C

H2

CH

2

C

H2

CH

2

C

H2

CH

2

CH3

C

H2

CH

2

C

H2

CH

2

C

H2

CH

2

CH3

CH3

CH3

C

H2

CH

2

C

H2

CH

2

C

H2

CH

2

CH3

CH3

CH3

C

H2

CH

2

C

H2

CH

2

C

H2

CH

2

CH3

OH

O

O

Rysunek 6. Powierzchnia krzemionki z zabezpieczonymi grupami silanolowymi poprzez wykorzystanie TMCS lub

HMDS

Oszacowano, że efektywność procesu end-capping wynosi 50 %, co oznacza,

że następuje zablokowanie tylko około 50 % ilości resztkowych grup silanolowych. Innym

sposobem tłumienia oddziaływań pomiędzy analitem a resztkowymi grupami silanolowymi jest

wprowadzony ligand (TMS)

9

dodatek do fazy ruchomej alkiloamin, takich jak: trietyloamina (TEA), dimetylooktyloamina

(DMOA), cykloheksyloamina, czwartorzędowe jony amoniowe, czy rzadziej dwuwartościowe

kationy lub po prostu – amoniak.

Na Rysunku 7 przedstawiono przykładowy wpływ dodatku TEA i zmiany pH na czas

retencji i symetrię pików związków z grupy pochodnych fenyloetyloamin.

Rysunek 7. Chromatogram HPLC-UV/Vis rozdziału związków zasadowych (1. fenylopropanoamina, 2. efedryna, 3.

amfetamina, 4. meta-amfetamina, 5. fenteramina) w kolumnie typu C8 (4.6x150mm, 5 µm) z zastosowanie fazy nośnej

85 % buforu fosforanowego 10 mM i 15 % ACN oraz jej modyfikacji

1.5. Teoria półek teoretycznych

W chromatografii podziałowej rozdzielanie składników próbki jest wynikiem ich różnej

rozpuszczalności w fazach chromatograficznych. Dla zobrazowania procesu podziału przyjmuje

się, że kolumna chromatograficzna składa się z wielkiej ilości połączonych ze sobą sekcji, czyli

tzw. półek teoretycznych. Termin ten został zaczerpnięty z teorii destylacji i ma wymiar

całkowicie teoretyczny. Pod pojęciem półki teoretycznej rozumiemy taką objętość kolumny,

w której zostaje osiągnięty stan (dynamicznej) równowagi pomiędzy stężeniem związku w fazie

stacjonarnej, a jego stężeniem w fazie ruchomej.

Sprawność kolumn chromatograficznych decyduje o tym, czy uzyskane piki są wąskie czy

szerokie. Sprawność kolumn zależy od liczby półek teoretycznych (N) w danej kolumnie.

Im więcej półek teoretycznych, tym kolumna jest sprawniejsza i uzyskane piki rozdzielanych

substancji są węższe.

10

Liczba półek teoretycznych zależy od długości kolumny L oraz od wysokości pojedynczej półki

H:

N = L/H

gdzie:

N – liczba półek teoretycznych,

L – długość kolumny,

H – wysokość równoważna półce teoretycznej, inaczej oznaczana WRPT

Im większa jest wysokość półki teoretycznej, tym mniej półek teoretycznych znajduje się

w danej kolumnie i tym mniej sprawna jest kolumna, co powoduje, że uzyskane piki rozdzielanych

substancji są szersze.

Liczbę półek teoretycznych, czyli sprawność kolumny można wyznaczyć bezpośrednio

z chromatogramu przy użyciu substancji testowej. Substancją testową może być związek,

dla którego współczynnik retencji k mieści się w granicach od 5 do 10. Pik substancji testowej

powinien być symetryczny. Liczbę półek teoretycznych w kolumnie wyznacza się

z następujących zależności:

𝑁 = (𝑡𝑅𝜎)2

𝑁 = 5,54 (𝑡𝑅𝑊1/2

)

2

𝑁 = 16 (𝑡𝑅𝑊𝐵

)2

gdzie:

𝞼 – odchylenie standardowe krzywej Gaussa (szerokość piku na wysokości równej 0,882 h),

W1/2 – szerokość piku w połowie jego wysokości,

WB – szerokość piku przy podstawie.

Wszystkie wielkości mierzone są w jednostkach czasu i wyznaczane bezpośrednio

z chromatogramu (Rysunek 8). Liczba półek teoretycznych jest oczywiście wartością

bezwymiarową.

Rysunek 8. Sposób wyznaczania wartości niezbędnych do obliczenia sprawności kolumny

11

Efektywną liczbę półek teoretycznych w kolumnie wyznacza się z następujących zależności:

𝑁𝑒𝑓 = 5,54 (𝑡𝑅 − 𝑡𝑀𝑊1/2

)

2

𝑁𝑒𝑓 = Nx (𝑘

1 + 𝑘)2

Sprawność rozdzielenia jest wyrażana także rozdzielczością pików. Rozdzielczość pików określa

rozdzielenie dwóch pików z uwzględnieniem ich średnich szerokości na linii podstawy.

Rozdzielczość pików liczy się z następującego wzoru:

𝑅𝑆 =2(tR2 − tR1)

WB1 +WB2

gdzie:

RS – rozdzielczość pików, nazywana też zdolnością rozdzielczą kolumny,

tR1 – czas retencji substancji 1,

tR2 – czas retencji substancji 2, przy czym tR2 > tR1,

WB1 – szerokość piku 1 na linii podstawy,

WB2 – szerokość piku 2 na linii podstawy.

2. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z mechanizmem rozdzielania w RP-HPLC na przykładzie

leków o właściwościach zasadowych, sposobami supresji oddziaływań niespecyficznych

i tworzeniem par jonowych.

3. Część doświadczalna

Przed przystąpieniem do ćwiczenia i włączeniem chromatografu należy sprawdzić jego stan -

objętość zlewek i faz ruchomych. Dreny A i B powinny być włożone odpowiednio do butli

z wodą i acetonitrylem a pozostałe dreny zanurzone w mieszaninie woda-metanol (1:1).

Odpowiednimi przyciskami należy włączyć pompy i detektor UV/Vis i poczekać na

ustabilizowanie się detektora. W tym czasie można włączyć komputer i program zbierający dane.

Następnie należy wykonać odgazowanie systemu, tj. okręcić odpowiedni zawór na pompie i

włączyć przycisk purge. Poczekać na automatyczne wyłączenie się opcji purge. W tym czasie,

sprawdzić aktualne pH pozostałych faz ruchomych niezbędnych do ćwiczenia (Tabela 4)

a następnie należy je wstawić na 10 min do łaźni ultradźwiękowej w celu odgazowania.

Tabela 4. Skład oraz wartość pH składnika A faz ruchomych

Nr fazy Składnik A fazy ruchomej pH fazy

1 H2O + 10 % ACN

2 H2O + 10mM octanu amonu + 10% ACN

3 H2O + 10mM octanu amonu + kwas octowy + 10% ACN

4 H2O + 10 mM TEA + kwas octowy + 10 % ACN

5 H2O + 10 mM heksafluorofosforan amonu +10 % ACN

12

Wzorce oznaczanych leków (Tabela 5) powinny znajdować się w lodówce. Do analiz HPLC

należy wykorzystać stężenie 10 µg/ml. Jeśli w wialce nie będzie wystarczającej objętości należy

wykonać odpowiednie rozcieńczenie wykorzystując stężenia 100 µg/ml pojedynczych leków.

Podobnie w przypadku niewystarczającej objętości faz ruchomych należy, po konsultacji

z prowadzącym, przygotować odpowiednią ich ilość.

Tabela 5. Struktura i właściwości badanych trójcyklicznych antydepresantów (TCA)

Związek Struktura pKa log Ko/w

Doksepina

O

NCH

3

CH3

9,3 4,3

Imipramina

N

CH3

CH3

N

9,4 4,8

Klomipramina

N

CH3

CH3

N

Cl Cl

9,5 5,2

Trójcykliczne antydepresanty (ang. TCA - Tricyclic Antidepressants) należą do klasy leków

przeciwdepresyjnych. Ich działanie polega na blokowaniu wychwytu noradrenaliny i serotoniny

w wyniku czego zwiększają poziom tych neuroprzekaźników. Poprzez przywrócenie równowagi

tych neuroprzekaźników w mózgu, TCA łagodzą stan depresyjny. Dodatkowo powodują

uspokojenie i blokują działanie histaminy. Trójcykliczne antydepresanty wpływają również na

działanie acetylocholiny, substancji chemicznej w mózgu, która wpływa na ruch mięśni i funkcje

organizmu m.in. trawienie.

Wyjściowymi parametrami analizy HPLC jest przepływ 1 ml/min, stosunek fazy A (H2O + 10 %

ACN) do B (ACN) równy 65 do 35, analityczna długość fali 254 nm. Po upewnieniu się, że takie

warunki są wprowadzone w systemie, należy włączyć pompę. Po ustabilizowaniu się linii bazowej

na podglądzie sygnału detektora (po ok. 10 min od włączenia systemu) należy wykonać analizę

mieszaniny TCA dozując 10 µl próbki. Próbkę pobierać odpowiednią strzykawką, którą po

zadozowaniu należy przemyć specjalnie przygotowanym metanolem. Konieczne jest także

możliwe szybkie zakręcenie wialki z badanych roztworem.

Po wykonaniu oznaczenia należy zbadać ten sam roztwór z zastosowaniem pozostałych czterech

faz ruchomych. Przy każdej podmianie butli należy wykonać „purge” i odczekać min. 20 min na

13

skondycjonowanie systemu. Należy także określić czasy retencji analitów z zastosowaniem

wybranej fazy ruchomej. Po zakończonych analizach należy powrócić do pierwotnej fazy

i wypłukać kolumnę. Ostatecznie, należy zgrać uzyskane chromatogramy, wyłączyć przepływ

na pompie, poczekać aż ciśnienie spadnie do wartości bliskiej zeru, wyłączyć ją, detektor oraz

komputer i monitor.

4. Wymagania do ćwiczenia i raportu

Przed przystąpieniem do ćwiczenia należy przygotować się z zagadnień zawartych w części

teoretycznej instrukcji oraz:

- wartość stałej dysocjacji kwasowej i zasada „pH 2”

- rodzaje wiązań międzycząsteczkowych

W raporcie należy przedstawić i odpowiednio opisać uzyskane chromatogramy, policzyć liczbę

półek teoretycznych dla każdego z analitu i każdej fazy ruchomej, a także rozdzielczość dla dwóch

dowolnych analitów. Należy także odpowiedzieć na pytania:

- dlaczego anality wychodzą z kolumny w określonej kolejności?

- czy na ich oznaczanie ma wpływ pH fazy ruchomej? narysować dysocjację kwasową

klomipraminy i wskazać jaką ma postać zjonizowania w pH 4, 9 i 11

- czy dodatek TEA jako supresanta był dobrym rozwiązaniem?

- czy anality wytworzyły pary jonowe w anionem PF6-? jak to wpłynęło na ich retencję?

- które oddziaływania miały wpływ na retencję TCA w kolumnie C18?

- wskazać która faz ruchoma była najlepsza do analizy TCA i dlaczego.

5. Spis szkła i odczynników

- strzykawka mikrolitrowa 50 µl razem z opakowaniem

- buteleczka z rozpuszczalnikiem do przepłukiwania

- 5 butli 1 L na fazy ruchome

- cylinder miarowy na 1000 ml

- łaźnia ultradźwiękowa

- do przygotowania faz: kwas octowy, octan amonu, trietyloamina, heksafluorofosforan amonu

- acetonitryl czystości HPLC

6. Literatura

- Techniki separacyjne, Piotr Stepnowski, Elżbieta Synak, Beata Szafranek, Zbigniew

Kaczyński, Wydawnictwo Uniwersytetu Gdańskiego, 2010

- Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych, Zygfryd Witkiewicz, Wydawnictwo

WNT, 2013

- opracowania własne