Prof. dr hab. inż. Sławomir Milewski Gdańsk, 03.07.2017 Katedra Technologii Leków i Biochemii Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska

Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Moniki Niewiadomskiej

Rola Alg13 N-acetylglukozaminyl transferazy w patogenności Candida albicans

Candida albicans to oportunistycznie patogenny drobnoustrój grzybowy, który

jest jednym z najważniejszych czynników etiologicznych grzybic układowych. Takie grzybice, z narastającą częstotliwością występujące u pacjentów z osłabionym systemem odpornościowym, a właściwie ich diagnostyka i leczenie, stanowią poważny problem kliniczny. Trudności, które w tym względzie występują, wynikają m.in. z niedostatecznej liczby skutecznych, a jednocześnie mało toksycznych dla pacjenta leków, a sytuację pogarsza narastające zjawisko oporności patogennych drożdżaków, w tym C. albicans, na działanie chemoterapeutyków. Tym ważniejsze jest poszukiwanie alternatywnych możliwości terapeutycznych, także poprzez identyfikację nowych celów molekularnych dla chemoterapeutyków, m.in. spośród czynników patogenności. Chociaż genom C. albicans został już poznany, to fizjologiczna rola wielu genów, a właściwie ich produktów w mechanizmach patogenezy tego drobnoustroju pozostaje nieznana. Ważną rolę w tych mechanizmach odgrywają sekrecyjne mannoproteiny, tak więc szlaki metaboliczne biosyntezy, w tym szczególnie glikozylacji tych białek i enzymy katalizujące poszczególne jej etapy Identyfikacja czynników patogenności oraz możliwe sposoby terapii kandydoz oparte na farmakologicznym zaburzaniu funkcjonowania tych czynników, są przedmiotem intensywnych badań w wielu ośrodkach naukowych na całym świecie. Do tego grona należy także grupa badawcza prof, Joanny Kruszewskiej funkcjonująca w ramach kierowanej przez prof. Grażynę Palamarczyk Pracowni Glikobiologii Grzybów IBB PAN w Warszawie, do której należy Autorka recenzowanej rozprawy, p. mgr Monika Niewiadomska.

Przedmiotem prac badawczych prowadzonych przez Doktorantkę w ramach Jej projektu doktorskiego był enzym, N-acetyloglukozaminylo transferaza, katalizująca drugi etap biosyntezy 14-członowego rdzenia oligosacharydowego osadzonego na fosforanie dolicholu, będącej elementem N-glikozylacji białek. Białko to jest kodowane przez gen CaALG13, będący ortologiem genu ALG13 z S.

cerevisiae. Chociaż sporo wiadomo na temat odpowiedniego genu i białka z drożdży piekarniczych, to badanie funkcjonalności odpowiednika z C. albicans jest jak najbardziej uzasadnione, z uwagi na jego potencjalną rolę w patogenezie tego drobnoustroju. Tego zadania podjęła się p. Niewiadomska w swoim projekcie doktorskim.

Doktorantka wykazała, że orf19.19.6025 jest ortologiem genu ScALG13 i koduje podjednostkę katalityczną enzymu katalizującego drugą reakcję biosyntezy 14-członowego rdzenia oligosacharydowego osadzonego na fosforanie dolicholu. Skonstruowała mutanta C. albicans, w którym jedna kopia genu CaALG13 została unieczynniona, a druga umiejscowiona w wersji, której ekspresja była kontrolowana obecnością antybiotyku tetracyklinowego w podłożu. Mutant ten został wykorzystany jako model do badania wpływu zmian w poziomie ekspresji CaALG13 na ekspresję i aktywność produktów szeregu innych genów uczestniczących w procesie N-

glikozylacji białek w C. albicans oraz na niektóre czynniki patogenności tego drobnoustroju, w tym zdolność do transformacji morfologicznej, tworzenia biofilmu oraz ekspresji genów kodujących niektóre adhezyny.

Wyniki badań p. Niewiadomskiej opisane w Jej rozprawie doktorskiej mają w mojej opinii oczywisty charakter nowości naukowej i istotne znaczenie poznawcze. Pani Niewiadomska wykonała serię dobrze zaplanowanych eksperymentów, wykorzystując bogaty zestaw metod badawczych z zakresu mikrobiologii, biologii komórki, biologii molekularnej i biochemii. Wiele z zastosowanych technik wymaga od eksperymentatora dużej biegłości laboratoryjnej, którą się Doktorantka niewątpliwie wykazała.

Zanim przejdę do szczegółowego omówienia zawartości poszczególnych części rozprawy, pozwolę sobie na sformułowanie wagi dotyczącej jej tytułu w wersji polskojęzycznej. Uważam, że nie do końca odpowiada on zawartości pracy. Jednoznaczne określenie wpływu jakiegoś czynnika na patogenność drobnoustroju jest możliwe jedynie z wykorzystaniem modelu in vivo, tzn. sprawdzenia jak wpływa zmiana tego czynnika na wirulencję komórek wprowadzonych do organizmu zwierząt laboratoryjnych (zwykle myszy lub szczurów). Doktorantka nie wykonała takich badań, zbadała natomiast w warunkach in vitro wpływ zmian w poziomie ekspresji genu CaALG13 i aktywności produktu tego genu na niektóre czynniki wirulencji C.

albicans. W tej sytuacji znacznie właściwszy jest tytuł angielskojęzyczny rozprawy, w którym jest mowa o wpływie enzymu na ekspresję czynników patogenności C.

albicans. Za najistotniejsze dokonania Doktorantki poczynione w trakcie realizacji

doktorskiego projektu badawczego, którego wyniki opisano w recenzowanej rozprawie uważam:

a) określenie wpływu obniżenia poziomu ekspresji genu CaALG13 na ekspresję genów CaALG7 i CaALG14 oraz aktywność Alg7p.

b) wykazanie wpływu obniżenia aktywności Alg13p i Alg7p na czynniki patogenności C. albicans: zmniejszenie zdolności do transformacji morfologicznej form drożdżowych do mycelialnych, tworzenia biofilmu i zmian w ekspresji genów HPW1 i ALS1 kodujących adhezyny, odgrywające istotną rolę w adhezji komórek C.

albicans.

c) wykazanie wpływu obniżenia aktywności Alg13p i Alg7p na skład ściany komórkowej oraz podatność na działanie czynników wpływających na biogenezę ściany.

Wszystkie te dokonania mają istotne znaczenie poznawcze, czego potwierdzeniem jest opublikowanie dużej części uzyskanych wyników w postaci artykułu w BBA, którego współautorką (pierwszym autorem) jest Doktorantka.

Dysertacja p. Niewiadomskiej spisana została na 160 stronach, ilustrowana

jest licznymi wykresami, schematami i zdjęciami, zawiera cytaty z aż 306 pozycji literaturowych. Układ pracy można uznać za standardowy. Główne jej rozdziały to kolejno: streszczenie w j. polskim i angielskim, wykaz stosowanych skrótów, cel pracy, wstęp teoretyczny, cel pracy, opis materiałów i metod eksperymentalnych, opis uzyskanych wyników, dyskusja podsumowanie oraz spis piśmiennictwa.

Omówienie dotychczasowego stanu wiedzy, zatytułowane jako Wstęp zajmuje 28 stron. Jest to w mojej opinii ciekawe i dobrze opracowane omówienie najważniejszych informacji dotyczących w kolejności: ogólnych informacji o C.

albicans jako oportunistycznie patogennym drobnoustroju grzybowym,

mechanizmach i czynnikach patogenności tego drożdżaka (w tym m.in. polimorfizmie, zdolności do tworzenia biofilmu oraz mechanizmach adhezji do komórek nabłonkowych i uczestniczących w tym procesie adhezynach), struktury ściany komórkowej C. albicans i roli jej składników w patogenności i wreszcie biochemii glikozylacji bialek w komórkach tego drobnoustroju. Układ i kolejność podrozdziałów tej części rozprawy wydaje się najwłaściwszy z możliwych, a zakres przedstawionych tam informacji uważam za optymalny. Ta część rozprawy zawiera szereg cennych, interesujących danych, wspartych cytatami do jak najbardziej aktualnej literatury. Zapoznanie się z nią znakomicie ułatwia zrozumienie kolejnych

części pracy. Nie znalazłem we Wstępie istotnych błędów merytorycznych, a jedynie kilka drobnych nieścisłości edytorsko/stylistycznych.

Str. 19, Zamiast „oportunistycznym gatunkiem drożdżaka” powinno być „oportunistycznie patogennym gatunkiem drożdżaka”

Str. 21, Podana kwota 6,5 biliona dolarów przeznaczana jakoby w USA na leczenie infekcji powodowanych przez C. albicans jest chyba przeszacowana o trzy rzędy wielkości. Kwota ta jest o wiele większa niż cały roczny budżet USA. Wydaje mi się, że błąd wynika z niewłaściwego przetłumaczenia angielskiego (American English) określenia „billion” na polski „bilion” zamiast właściwego „miliard”.

Str. 33, Użycie terminu „interkalacja” dla określenia oddziaływania Amfoterycyny B z ergosterolem nie wydaje się właściwe. Pojęcie to stosowane jest głównie dla określenia wbudowywania ligandów do DNA pomiędzy dwie sąsiednie pary zasad. W tym przypadku właściwsze byłoby określenie „tworzenie kompleksów z ergosterolem”.

Str. 33, Nie bardzo wiem na czym miałby polegać „protonowy gradient w komórce”. Zapewne chodzi o „protonowy gradient w poprzek błony cytoplazmatycznej’?

Cel pracy został przez Doktorantkę sformułowany w jednym zdaniu, co jest

niewątpliwą zaletą, po którym następuje dość rozbudowane uzasadnienie, zawierające także pewne powtórzenia fragmentów streszczenia rozprawy.

Opisy metod eksperymentalnych zostały przez Autorkę rozprawy umieszczone

w rozdziale Materiały i Metody. Są to opisy precyzyjne i kompletne. Drobne niedociągnięcia:

- Doktorantka nadużywa określenia „bufor” stosując je także w niektórych przypadkach (rzadkich) do roztworów nie mających cech roztworów buforowych, np. „Bufor denaturujący 0,5 M NaOH + 1,5 M NaCl” (str. 62);

- określenie „zwirować” to slang laboratoryjny. Powinno być „odwirować”. Mój sprzeciw budzi także określenie „worteksować”, a głęboki sprzeciw – „zworteksować”. Nie mogę się także pogodzić z użyciem terminu „zdeletowany gen”.

Uzyskane rezultaty przedstawione zostały w głównym rozdziale Wyniki o objętości 49 stron. Sposób przedstawienia jest w pełni profesjonalny. Odpowiednia analiza statystyczna została zastosowana wszędzie, gdzie było to konieczne. W opisie wyników wplecione zostały elementy komentarza w stopniu całkowicie uprawnionym, a niekiedy nawet koniecznym. Jakość zamieszczonych zdjęć i wykresów nie budzi wątpliwości.

Uwagi do tej części rozprawy :

1. Zidentyfikowanych czynników patogenności C. albicans jest wiele. Doktorantka zbadała wpływ zmian w ilości i aktywności produktu genu CaALG13 na kilka z nich, niewątpliwie ważnych. Szkoda, że nie został zbadany wpływ na biosyntezę, sekrecję i aktywność jednego z najważniejszych czynników wirulencji, jakim jest wytwarzanie proteaz aspartylowych z grupy SAP1-7. Warto nadmienić, że enzymy te, a przynajmniej część z nich, jest mannoproteinami, zawierającymi także fragmenty N-oligosacharydowe.

2. W celu wykazania wpływu zmian poziomu ekspresji genu CaALG13 na zdolność C. albicans do transformacji morfologicznej Doktorantka zastosowała trzy modele eksperymentalne: podłoże stałe Spider i dwa podłoża płynne, YP Serum i YPD. Zastosowane dwóch pierwszych modeli nie budzi moich wątpliwości, natomiast podłoże YPD nie jest na ogół wykorzystywane w tego typu badaniach. Klasyczny układ, to tzw. podłoże

Lee i temperatura 37 °C jako czynnik indukujący transformację. Ponadto, w podłożach płynnych możliwe jest ilościowe określenie stopnia

transformacji Y→M, czego Doktorantka nie dokonała. 3. Nie kwestionując wiarygodności wyników eksperymentu, w którym

Doktorantka oceniała wpływ zmian poziomu ekspresji genu CaALG13 na zdolność C. albicans do tworzenia biofilmu, pozwalam sobie zwrócić uwagę na fakt, że znane są metodyki badawcze, w których możliwa jest bardziej ilościowa ocena tej zdolności, uwzględniająca pomiar ilości komórek żywych znajdujących się w biofilmie (np. z wykorzystaniem odczynników tetrazoliowych, takich jak XTT).

4. Cenna obserwacja dotyczącą wpływu zmian poziomu ekspresji genu CaALG13 na ekspresję dwóch genów, których produkty odgrywają istotną rolę w adhezji komórek C. albicans mogła być uzupełniona o szacunkową ocenę samej adhezji do różnych powierzchni.

5. Proszę o wyjaśnienie zastosowania nazwy „heksokinaza” jako zamiennika nazwy „β-N-acetyloheksoaminidaza”. Z tego co wiem, to mianem „heksokinaza” określa się enzym katalizujący fosforylację grupy 6-OH glukozy.

6. Doktorantka badała wpływ zaburzenia aktywności Alg13p na stopień N-glikozylacji dwóch białek, Hex1p i Phr1p, wykorzystując w tym celu metody elektroforetyczne. W przypadku białka Hex1p stwierdzono większą ruchliwość elektroforetyczną w warunkach niedenaturujących białka powstającego w komórkach o obniżonej aktywności Alg13p, co zostało zinterpretowane jako dowód na niższą masę cząsteczkową białka, najprawdopodobniej w wyniku obniżenia stopnia N-glikozylacji Hex1p. Jest to prawdopodobne, trzeba jednak pamiętać, że ruchliwość elektroforetyczna w warunkach niedenaturujących zależy nie tylko od masy cząsteczkowej, ale także ładunku białka. Ten aspekt powinien zostać uwzględniony w dyskusji.

Kilkustronnicowa Dyskusja jest dojrzała, kompetentna i wyczerpująca. Doktorantka umiejętnie uniknęła wysuwania zbyt daleko idących wniosków. Znaczący fragment tej części rozprawy poświęcony jest przedyskutowaniu zagadnienia wzajemnych zależności pomiędzy składnikami kompleksu Alg7p/Alg13p/Alg14p, ze sformułowaniem ostatecznego wniosku, iż funkcjonowanie tego kompleksu jest regulowane przez aktywność białka Alg7p, a istotne znaczenie

ma takŹ e mozliwoś ó wią zania Alg13p do bł on RE przez Alg14p. lnteresują ca jestdyskusja dotyczą ca stwierdzonych konsekwencji zmniejszonej aktywnoś ci biał kaAlg13p. Moż e jedynie wań o był oby poś wię ciÓ nieco wię cej miejsca stwierdzonejroznlcy we wpł ywie na N-glikozylację biał ek Hex1p i Phr1p.Czy w literaturze znanesą przykł ady podobnego zrÓż nicowania efektu w wyn| ku unieczynnienia genu lubzastosowania inhibitora innego niz Alg13p enzymu uczestniczą cego w N-glikozylacji?

Lista skrótów zawiera 54 pozycje. Są to w znakomiĘ wię kszoś ci skróty czę stostosowane w teś cie rozprawy, a jednocześ nie niekoniecznie powszechnie znane, cojednoznacznie potwierdza trafnoś ć ich wyboru' Zbę dne wydaje mi się jedyniepodawa n ie skrótów naz'lt l am i nokwasów biał kowych

Sporzą dzają c spis cytowanej literatury Doktorantka zadbał a o jednolity stylukł adu cytatów. Cytowana literatura jest jak najbardziej aktualna, wię kszoś Ócytowanych prac ukazał o się po roku 2000, W tym spora czę ś Ć w ostatnich 10 latach.

Rozprawa napisana jest generalnie dobrym j ę zykiem, czyta się j ą zzainteresowaniem. Nie znalazł em W tekŚcie rozprawy istotnych bł ę dównomenklaturowych i w zakresie sł ownictwa specjalistycznego (kilka mniej istotnychzostał o wymienionych powyzej). Bł ę dy edytorskie są nieliczne.

Pani Niewiadomska jest współ autorką dwóch publikacji w czasopismach z listylSl (Biochimica et Biophysica Acta oraz Acta Neurobiologiae Experimentalis), z tymze jedynie tematyka pierwszego z nich, w którym p. Niewiadomska jest pierwsząautorką , jest zttią zana z tematyką rozprawy doktorskiej. Ponadto, w dorobkuDoktorantki znajduje się 7 doniesień konferencyjnych (2 ustne i 5 posterowych).

Badania p' Niewiadomskiej był y finansowane przez wewnę trzny minigrant lBB,którego Doktorantka był a kierowniczką oraz w czę ś ci przez grant NcN, kierowanyprzez p. prof. Palamarczyk.

Analiza treś ci przedstawionych powyzej uwag i zastrzeŻ eń wyraź nie wskazuje,ż e wię kszoś ć z nich wynika prawie na pewno z niedokł adnoś ci lub niezrę cznoŚciopisu, a nie rzeczywistych bł ę dów. Nie mam najmniejszych wą tpliwoś ci, Ż eprzedstawiona rozprawa speł nia warunek ustawowy, t.j. zawiera istotne elementynowoŚci naukowej, a moja jednoznacznie pozytywna ocena jej zawań oś ci skł aniamnie do sformuł owania wniosku o dopuszczenie p. Niewiadomskiej do dalszychetapÓw przewodu doktorskiego. Jestem takż e cał kowicie przekonany, Ż e dorobeknaukowy Doktorantki, W tym szczegÓlnie oceniana przeze mnie Jej rozprawadoktorska, uzasadnia nadanie Pani mgr Monice Niewiadomskiej stopnia naukowegodoktora.