RAPORT ROCZNY ZA ROK z realizacji Projektu w ramach...

Program LIDER – IV konkurs

Strona 1 z 14

Podać numer roku sprawozdawczego

1.DANE O PROJEKCIE

Tytuł projektu Nowy algorytm identyfikacji zakażeń Mycobacterium kansasii

Nr umowy LIDER/044/457/L-4/12/NCBR/2013

Data rozpoczęcia realizacji Projektu (zgodnie z umową)

01. 04. 2014 r. Data zakończenia realizacji Projektu (zgodnie z umową)

31. 03. 2017 r.

Słowa kluczowe Mycobacterium kansasii; typowanie genetyczne; molekularna diagnostyka bakteriologiczna; algorytm identyfikacji; epidemiologia

Klasyfikacja wg OECD Nauki medyczne i nauki o zdrowiu – Biotechnologia medyczna

2. DANE KONTAKTOWE KIEROWNIKA PROJEKTU I JEDNOSTKI

Imię i nazwisko Kierownika Projektu Dr n. med. Tomasz JAGIELSKI

Telefon (0) 22 55 41 312 e-mail [email protected]

Nazwa Jednostki Uniwersytet Warszawski

Adres 00-927 Warszawa; Krakowskie Przedmieście 26/28

Dane osoby odpowiedzialnej ze strony Jednostki za kontakty z NCBR /podać imię i nazwisko osoby, stanowisko służbowe i nazwa komórki organizacyjnej/

Dr n. med. Tomasz JAGIELSKI

Telefon (0) 22 55 41 312 Fax (0) 22 55 41 402

e-mail [email protected]

RAPORT ROCZNY ZA ROK …1... z realizacji Projektu w ramach Programu „LIDER”

ZA OKRES OD 01. 04. 2014 R. DO 31. 12. 2014 R.

mailto:[email protected]


Strona 2 z 14

3. ZADANIA BADAWCZE – ZAAWANSOWANIE PRAC /od początku realizacji projektu/

Nr

zad

ania

*

Nazwa zadania*

Status zadania (nie rozpoczęte/trwa/z

akończone)

Planowana realizacja zadania - wg harmonogramu umowy *

Rzeczywista realizacja zadania

Termin rozpoczęcia

realizacji zadania

Termin zakończenia

realizacji zadania

Planowany koszt zadania

(w zł)

Data rozpoczęcia realizacji zadania

Data zakończenia realizacji zadania

Poniesiony koszt realizacji zadania

(w zł) **

1 Przygotowanie materiału badawczego; wybór szczepów M. kansasii i ich rewitalizacja na pożywkach hodowlanych; zebranie i opracowanie wywiadu epidemiologicznego, w tym zebranie wywiadu o chorych, od których izolowano szczepy; analiza dokumentacji medycznej i laboratoryjnej; izolacja DNA chromosomowego ze szczepów M. kansasii; typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna – część I.)

ZAKOŃCZONE

2014-04-01

2014-09-30 148 800

2014-04-01

2014-09-30

157 273,31

2 Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależności szczepów do gatunku M. kansasii (testy biochemiczne, HPLC, analiza PCR-RFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna – część II); analiza profilów lekooporności (metoda mikrorozcieńczeń)

TRWA

2014-10-01

2015-03-31 200 400

2014-10-01

2015-03-31

104 079,52


Strona 3 z 14

Wypełnić dla wszystkich zadań od początku realizacji Projektu. *

Wypełnić zgodnie z harmonogramem stanowiącym załącznik nr 2 do umowy. **

Koszt poniesiony – suma kosztów kwalifikowanych w poprzednich latach budżetowych oraz wydatków poniesionych w bieżącym okresie sprawozdawczym.

3 Typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (m. in. analiza PFGE, AFLP, MST, PCR-RFLP, analiza sekwencyjna – część III); opracowanie nowej metody genotypowania (analiza bioinformatyczna); analizy komparatystyczne i filogenetyczne; określenie pokrewieństw genetycznych między szczepami M. kansasii; wykreślenie struktury genetycznej badanej populacji M. kansasii

NIE ROZPOCZĘTE

2015-04-01

2016-09-30 493 200 NIE DOTYCZY NIE DOTYCZY NIE DOTYCZY

4 Analiza profilów lekooporności (metoda pasków E-test); poszukiwanie genów związanych z wirulencją M. kansasii (analiza bioinformatyczna) i identyfikacja takich genów wśród szczepów M. kansasii (PCR sequencing)

NIE ROZPOCZĘTE

2015-12-01


5 Integracja i opracowanie danych; analiza statystyczna; propozycja algorytmu identyfikacji szczepów M. kansasii o szczególnym znaczeniu epidemiologiczny i klinicznym jako zasady nowego testu diagnostycznego

NIE ROZPOCZĘTE

2016-12-01


Razem 1 200 000,00 zł

Razem 261 352,83 zł


Strona 4 z 14

* zgodnie z kosztorysem stanowiącym załącznik nr 3 do umowy

** Suma wydatków poniesionych w bieżącym okresie sprawozdawczym

*** Suma kosztów kwalifikowanych w poprzednich latach budżetowych oraz wydatków poniesionych w bieżącym okresie sprawozdawczym

4. ZESTAWIENIE KOSZTÓW – STOPIEŃ WYKORZYSTANIA BUDŻETU

W bieżącym roku sprawozdawczym Od początku realizacji projektu

Koszty Planowane * (wg kosztorysu)

(w zł)

Koszty Poniesione ** (w zł)

Koszty Planowane * (w zł)

Koszty Poniesione *** (w zł)

1. Wynagrodzenia z pochodnymi 439 800 100 264,64 439 800 100 264,64

2. Aparatura 90 000 0,00 90 000 0,00

3. Inne koszty bezpośrednie 470 200 117 529,39 470 200 117 529,39

4. Koszty ogólne 200 000 43 558,80 200 000 43 558,80

Całkowity koszt realizacji Projektu = suma poz. 1 - 4 1 200 000 261 352,83 1 200 000 261 352,83


Strona 5 z 14

5. OPIS PRAC REALIZOWANYCH W BIEŻĄCYM OKRESIE SPRAWOZDAWCZYM

Zadanie* nr 1

Nazwa zadania: Przygotowanie materiału badawczego; wybór szczepów M. kansasii i ich rewitalizacja na pożywkach

hodowlanych; zebranie i opracowanie wywiadu epidemiologicznego, w tym zebranie wywiadu o chorych, od których

izolowano szczepy; analiza dokumentacji medycznej i laboratoryjnej; izolacja DNA chromosomowego ze szczepów

M. kansasii; typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna – część I.)

Wykonawcy zadania (imię i nazwisko, pełniona funkcja osób w zespole badawczym biorących udział w realizacji zadania):

1. Dr Tomasz Jagielski – a). Wybór i wstępna charakterystyka epidemiologiczna szczepów Mycobacterium kansasii

izolowanych w latach 2000-2013; b). Typowanie genetyczne (rpoB-typing) szczepów M. kansasii izolowanych

w latach 2000-2013; c). Nadzór merytoryczny nad wszystkimi etapami eksperymentalnymi projektu

uruchomionymi i realizowanymi w okresie sprawozdawczym; d). Organizacja i prowadzenie spotkań roboczych

członków zespołu badawczego; e). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych

2. Mgr Zofia Bakuła – a). Rewitalizacja i hodowla szczepów M. kansasii izolowanych w latach 2000-2009;

b). Typowanie genetyczne (hsp65-typing) szczepów M. kansasii izolowanych w latach 2000-2009;

c). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych

3. Mgr Izabela Szulc – a). Optymalizacja metody izolacji i izolacja chromosomowego DNA ze szczepów

Mycobacterium kansasii

4. Mgr Katarzyna Roeske – a). Typowanie genetyczne (hsp65-typing) szczepów M. kansasii izolowanych w latach

2010-2013

5. Mgr Małgorzata Proboszcz – a). Rewitalizacja i hodowla szczepów M. kansasii izolowanych w latach 2010-2013

6. Dr Magdalena Nowacka-Mazurek – a). Zebranie i opracowanie danych klinicznych chorych, od których

izolowano szczepy M. kansasii; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych

7. Dr Aleksandra Safianowska – a). Konsultacja w przygotowaniu materiału badawczego (szczepów M. kansasii);

b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych

Opis realizowanych prac**:

W ramach zadania nr 1, zgodnie z Harmonogramem projektu, przygotowano materiał badawczy. Na podstawie przeglądu

dokumentacji laboratoryjnej i mikrobiologicznej (z lat 2000-2013) Katedry Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii

i Alergologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (WUM), dokonano wyboru szczepów M. kansasii jako próby

badanej do dalszych zadań badawczych projektu. Szczepy rewitalizowano na pożywkach hodowlanych i izolowano z nich

chromosomowy DNA (po optymalizacji protokółu izolacji). Rozpoczęto też prace z zakresu typowania genetycznego

szczepów M. kansasii; w badaniu tym wykorzystano dwa genetyczne loci, tj. fragmenty genów hsp65 i rpoB.

Genotypowanie przy użyciu obu markerów genetycznych (hsp65- rpoB-typing) było kontynuowane w ramach zadania nr

2 (por. niżej). Od początku realizacji zadania nr 1, zbierano i analizowano dokumentację medyczną chorych, od których

izolowano wybrane szczepy M. kansasii. Ze względu na wyjątkowy charakter tej pracy (m.in. konieczność dotarcia do

archiwów medycznych, dociekanie brakujących danych, śledzenie historii choroby w różnych placówkach medycznych,

itp.), nie udało się jej zakończyć, jak planowano w harmonogramie projektu, w czasie przeznaczonym na realizację

zadania nr 1 (tj. do 30. 09. 2014 r.). Przegląd dokumentacji medycznej chorych stanowi zatem jedyny fragment zadania nr

1, który nie został w pełni zamknięty i jest kontynuowany w ramach zadania nr 2 (por. niżej).

Zadanie nr 2

Nazwa zadania: Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależności szczepów do gatunku M. kansasii (testy

biochemiczne, HPLC, analiza PCR-RFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna – część II);

analiza profilów lekooporności (metoda mikrorozcieńczeń)


Strona 6 z 14

Wykonawcy zadania (imię i nazwisko, pełniona funkcja osób w zespole badawczym biorących udział w realizacji zadania):

1. Dr Tomasz Jagielski – a). Typowanie genetyczne (rpoB-typing) szczepów Mycobacterium kansasii izolowanych

w latach 2000-2013; b). Optymalizacja warunków amplifikacji fragmentu 16S rDNA w szczepach Mycobacterium

kansasii; c). Nadzór merytoryczny nad wszystkimi etapami eksperymentalnymi projektu uruchomionymi

i realizowanymi w okresie sprawozdawczym; d). Organizacja i prowadzenie spotkań roboczych członków

zespołu badawczego; e). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych

2. Mgr Zofia Bakuła – a). Typowanie genetyczne (hsp65-typing) szczepów Mycobacterium kansasii izolowanych

w latach 2000-2009; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych

3. Mgr Izabela Szulc – a). Opracowanie warunków amplifikacji dla sekwencji repetytywnych VNTR Mycobacterium

kansasii: MKAN-MIRU13 i MKAN-MIRU14

4. Mgr Katarzyna Roeske – a). Typowanie genetyczne (hsp65-typing) szczepów Mycobacterium kansasii

izolowanych w latach 2010-2013

5. Mgr Małgorzata Proboszcz – a). Identyfikacja szczepów Mycobacterium kansasii metodą HPLC;

b). Współautorstwo doniesień zjazdowych

6. Dr Magdalena Nowacka-Mazurek – a). Zebranie i opracowanie danych klinicznych chorych, od których

izolowano szczepy Mycobacterium kansasii; b). Współautorstwo publikacji i doniesień zjazdowych

7. Dr Aleksandra Safianowska – a). Konsultacja przy identyfikacji gatunkowej szczepów Mycobacterium kansasii;

b). współautorstwo w publikacjach i doniesieniach zjazdowych

8. Dr Anna Brzostek – a). Konsultacja przy optymalizacji typowania genetycznego szczepów Mycobacterium

kansasii techniką analizy sekwencyjnej wybranych genetycznych loci (hsp65, rpoB)

Opis realizowanych prac**:

W ramach zadania nr 2, rozpoczętego, zgodnie z Harmonogramem projektu, 1. 10. 2014 r. i realizowanego do chwili

obecnej, ukończono prace z zakresu identyfikacji gatunkowej, polegające na weryfikacji przynależności wybranych

szczepów do gatunku M. kansasii, przy pomocy testów biochemicznych, analizy HPLC oraz analiz PCR-RFLP. Ponadto,

kontynuowano badania dotyczące typowania genetycznego szczepów M. kansasii, w oparciu o dwa markery genetyczne,

tj. fragmenty genów hsp65 i rpoB. Wytypowano również sekwencje repetytywne w genomie M. kansasii (o potencjalnym

znaczeniu jako markery genetyczne w identyfikacji/różnicowaniu prątków między- i wewnątrzgatunkowym) oraz

opracowano protokół ich amplifikacji. W trakcie realizacji zadania nr 2 kontynuowano także zbieranie i analizowanie

dokumentacji medycznej chorych. W końcu, w ramach rozpoczętego zadania nr 2, zgodnie z Harmonogramem projektu,

przystąpiono do oznaczeń profilów lekowrażliwości szczepów M. kansasii metodą mikrorozcieńczeń (zadanie to jest

w trakcie realizacji).

Podsumowując, realizacja wszystkich prac badawczych ujętych w zadaniach nr 1 i 2 przebiega zgodnie z Harmonogramem

projektu. Niewielkim odstępstwem jest kontynuacja jednego z zadań szczegółowych, wymienionych w ramach zadania nr

1, w czasie przeznaczonym na realizację zadania nr 2. To wydłużenie czasowe jednego z zadań szczegółowych nie zaburza

struktury Kosztorysu projektu, gdyż nie niesie kosztów materiałowych. Jednocześnie przewiduję, że zadanie to zostanie

ukończone razem z zakończeniem całego zadania nr 2. Termin 31. 03. 2015 r., tj. jak przewidziano w Harmonogramie

projektu, wydaje się niezagrożony.

Tabelę należy wypełnić tylko dla zadań wykonywanych w bieżącym okresie sprawozdawczym.

*Nr i nazwa zadania zgodne z harmonogramem stanowiącym załącznik nr 2 do umowy. ** Opis rezultatów osiągniętych w okresie sprawozdawczym lub działań wykonanych w tym okresie – w przypadku zadań, które nie zostały jeszcze zakończone.


Strona 7 z 14

6. SPRAWOZDANIE MERYTORYCZNE – PODSUMOWANIE OSIĄGNIĘTYCH WYNIKÓW

(nie więcej niż 10 str. A4)

6.1 Sumaryczny opis rezultatów osiągniętych w Projekcie (w podziale na zadania) – od początku realizacji Projektu

ZADANIE NR 1

Nazwa zadania: Przygotowanie materiału badawczego; wybór szczepów M. kansasii i ich rewitalizacja na pożywkach

hodowlanych; zebranie i opracowanie wywiadu epidemiologicznego, w tym zebranie wywiadu o chorych, od których

izolowano szczepy; analiza dokumentacji medycznej i laboratoryjnej; izolacja DNA chromosomowego ze szczepów

M. kansasii; typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna – część I.)

Status zadania: zakończone/w trakcie realizacji (wybrać właściwe)

Opis rezultatów:

1. PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU BADAWCZEGO; WYBÓR SZCZEPÓW M. KANSASII I ICH REWITALIZACJA NA POŻYWKACH

HODOWLANYCH

Pierwszy etap realizacji projektu obejmował staranne przeszukanie kolekcji szczepów należącej do Katedry Chorób

Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (WUM), w celu wyboru tylko takich

szczepów, które wcześniej zostały zidentyfikowane jako M. kansasii, przy użyciu metod hodowlanych

i chromatograficznych, względnie testu GenoType Mycobacterium CM/AS (HAIN Lifescience, Niemcy) w latach 2000-2013.

Chodziło przy tym o wybór takich szczepów, które były izolowane od chorych, dla których dostępna była dokumentacja

medyczna i laboratoryjna. W ten sposób wytypowano do badań grupę 174 szczepów pochodzących od 104 pacjentów

(przypadki kliniczne z lat 2000-2013). Przy sporządzaniu wykazu szczepów wytypowanych do badań, uwzględniono

podstawowe informacje socjo-demograficzne i kliniczne dotyczące pacjentów, informacje dotyczące materiału klinicznego,

z którego izolowano szczepy, a także dane na temat wszystkich badań diagnostycznych wykonanych w celu identyfikacji

prątków M. kansasii.

Badaną kolekcję uzupełniono dodatkowo o szczepy M. kansasii reprezentujące różne typy genetyczne. W tym celu

zakupiono szczep referencyjny M. kansasii Hauduroy ATCC® 12478™ (I typ genetyczny). Poza tym, dzięki uprzejmości

Radboud University Nijmegen Medical Centre (i współpracującego w ramach projektu dr. J. van Ingen) pozyskano szczep

M. kansasii Hauduroy ATCC® 25221™ (I typ genetyczny) a także 3 inne szczepy należące do typu I (NLA001000927;

NLA001000449; 1010001454), 5 szczepów reprezentujących II typ genetyczny (B11073207; NLA00100521; B11063838;

NLA001001128; 1010001458) i po jednym szczepie reprezentującym III (1010001468), IIIb (1010001469), IV (1010001493), V

(1010001495) oraz III/V (NLA001001166) typ genetyczny.

Kolejnym etapem projektu była rewitalizacja szczepów na pożywce Löwenstein’a-Jensen’a. Chodziło tu o wyprowadzenie

żywych kultur ze starych szczepów, przechowywanych na pożywkach hodowlanych w chłodni (temp. 4oC) lub w stanie

zamrożenia (temp. –80oC). (Żywych szczepów prątków wymagają badania lekowrażliwości.) Ponieważ prątki M. kansasii

należą do bakterii wolnorosnących (kolonie pojawiają się w hodowli zwykle po upływie ok. 2 tygodni; niekiedy hodowlę

uzyskuje się dopiero przy drugiej lub trzeciej próbie rewitalizacji ze stanu zamrożenia), etap rewitalizacji szczepów był

bardzo czasochłonny. Ostatecznie udało się rewitalizować 66 (37,9%) szczepów, pochodzących od 47 (45.2%) pacjentów.

2. IZOLACJA DNA CHROMOSOMOWEGO ZE SZCZEPÓW M. KANSASII

Izolację genomowego DNA przeprowadzono dla wszystkich badanych szczepów (174). Wykorzystano w tym celu zestaw

AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation Kit (Roche Diagnostics, Szwajcaria) i protokół producenta z własnymi

modyfikacjami. (Proces izolacji DNA prątków był specjalnie optymalizowany). Dla wszystkich 174 badanych szczepów

uzyskano DNA w stężeniach wystarczających do dalszych molekularnych analiz.

3. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA – CZĘŚĆ I.)

W ramach zadania nr 1 rozpoczęto badania w zakresie typowania genetycznego szczepów M. kansasii. Przeprowadzono,

analizę sekwencyjną fragmentu genu hsp65 (644 pz) dla 104 szczepów, pochodzących od różnych pacjentów. Dodatkowo,

wykonano analizę sekwencyjną fragmentu genu rpoB (342 pz) dla wybranych (15) szczepów M. kansasii, reprezentujących


Strona 8 z 14

różne typy genetyczne (por. zad. nr 2 p. 2). Stosowano metodę PCR-sequencing, wg protokółów publikowanych wcześniej

[2,6], zawierających własne modyfikacje. Podobieństwo [%] sekwencji oceniano względem sekwencji odpowiednich loci

szczepu ATCC 12478 (szczep referencyjny należący do I typu genetycznego M. kansasii), zdeponowanych w bazie GenBank

(NCBI). Wyniki analizy hsp65-typing przedstawiono w Tabeli I.

Tabela I. Wyniki analizy sekwencyjnej genu hsp65 dla 104 szczepów M. kansasii izolowanych od pojedynczych pacjentów.

Liczba szczepów Analiza sekwencyjna genu hsp65

99 100%

1 99%

1 99%

1 brak produktu

1 brak produktu

1 97% (typ II)

Wśród badanych szczepów, dla 101 (97,1%) sekwencja fragmentu genu hsp65 była identyczna lub niemal identyczna (99%

podobieństwa) z odpowiadającą sekwencją w szczepie referencyjnym ATCC 12478 (typ I). Szczepy te uznano jako

prezentujące genotyp I. Jeden szczep, którego sekwencja genu hsp65 wykazywała 97% podobieństwa z odpowiadającą

sekwencją w szczepie referencyjnym ATCC 12478 (typ I) został, w toku dalszych analiz, rozpoznany jako prezentujący II typ

genetyczny.

4. ZEBRANIE I OPRACOWANIE WYWIADU EPIDEMIOLOGICZNEGO, W TYM ZEBRANIE WYWIADU O CHORYCH, OD KTÓRYCH

IZOLOWANO SZCZEPY. ANALIZA DOKUMENTACJI MEDYCZNEJ I LABORATORYJNEJ

Bardzo ważnym etapem podjętym w ramach zadania nr 1 była szczegółowa analiza retrospektywna danych o pacjentach,

od których izolowano szczepy M. kansasii. Analiza uwzględniała możliwie pełną charakterystykę demograficzną i kliniczną

pacjentów. Kwalifikację przypadku mykobakteriozy rozpatrywano na podstawie kryteriów klinicznych (i), radiologicznych

(ii) i bakteriologicznych (iii), zdefiniowanych przez American Thoracic Society (ATS) [1].

Z uwagi na specyficzny charakter tej części projektu, wymagającej dotarcia do archiwów medycznych, współpracy z różnymi

klinicystami, nierzadko z różnych ośrodków, czas przeznaczony na jej realizację został przedłużony o czas trwania kolejnego

zadania (nr 2).

Na podstawie analizy danych laboratoryjnych, przeprowadzonej przy wyborze próby badanej (por. p. 1), ustalono, że wśród

104 pacjentów, wydalających prątki wytypowane do badań, było 61 kobiet i 43 mężczyzn. Wiek ustalono dla 97 (93,3%)

pacjentów (zakres, 21-92 lata; średnia wieku, 63,8 ± 17,8 lat (64 ± 17,9 lat dla kobiet, 64 ± 17,2 lat dla mężczyzn)).

W okresie objętym sprawozdaniem, szczegółową analizę dokumentacji medycznej przeprowadzono dla 46 (44,2%) spośród

104 pacjentów zakwalifikowanych w pierwszym etapie zadania nr 1. W liczbie 46 prześledzonych przypadków, 17 (36,9%)

stanowiły przypadki potwierdzonej mykobakteriozy (spełnione wszystkie trzy kryteria, wg ATS). Prawdopodobną

mykobakteriozę (spełnione dwa z trzech kryteriów, wg ATS) rozpoznano u 13 (28,3%) pacjentów. U pozostałych 16 (34,8%)

pacjentów wykazano kolonizację prątkami M. kansasii (spełniony tylko jeden lub niespełnione kryteria, wg ATS).

ZADANIE NR 2

Nazwa zadania: Identyfikacja gatunkowa; weryfikacja przynależności szczepów do gatunku M. kansasii (testy biochemiczne,

HPLC, analiza PCR-RFLP); typowanie genetyczne szczepów M. kansasii (analiza sekwencyjna – część II); analiza profilów

lekooporności (metoda mikrorozcieńczeń)

Status zadania: zakończone/w trakcie realizacji (wybrać właściwe)

Opis rezultatów:

1. IDENTYFIKACJA GATUNKOWA. WERYFIKACJA PRZYNALEŻNOŚCI SZCZEPÓW DO GATUNKU M. KANSASII (TESTY BIOCHEMICZNE, HPLC,

ANALIZA PCR-RFLP)

Na tym etapie realizacji projektu weryfikowano przynależność gatunkową badanych szczepów. Dla wszystkich 174

wytypowanych szczepów przeprowadzono uzupełniającą identyfikację gatunkową przy użyciu techniki HPLC [4], a także

analizy PCR-RFLP dla genów hsp65 i rpoB, wg wcześniej opublikowanych protokółów [5,6]. Dla 104 szczepów, izolowanych

od różnych pacjentów, przeprowadzone zostało typowanie testem GenoType Mycobacterium CM/AS (Hain, Niemcy).


Strona 9 z 14

Dodatkowo, test GenoType Mycobacterium CM/AS wykonano dla szczepów, dla których uzyskano niejednoznaczne wyniki

identyfikacji przy użyciu pozostałych metod. Łącznie test GenoType Mycobacterium CM/AS wykonano dla 118 szczepów.

Ważnym celem tej części projektu było porównanie 4 różnych metod stosowanych w identyfikacji prątków M. kansasii, tj.:

techniki HPLC (i), komercyjnego testu GenoType Mycobacterium CM/AS (ii) oraz analizy PCR-RFLP dwóch genetycznych loci

(hsp65, rpoB) (iii; iv). Podobna analiza porównawcza nigdy wcześniej nie była przeprowadzona. Do analizy włączono tylko

szczepy pochodzące od różnych pacjentów (104). Wyniki przedstawiono w Tabeli II.

Tabela II. Wyniki analizy porównawczej metod stosowanych w identyfikacji gatunkowej prątków M. kansasii.

Liczba

szczepów

Metoda stosowana w identyfikacji gatunkowej:

HPLC GenoType Mycobacterium CM/AS PCR-RFLP hsp65 PCR-RFLP rpoB

97 M. kansasii M. kansasii M. kansasii M. kansasii

2 M. kansasii M. kansasii M. kansasii brak produktu

2 M. kansasii M. kansasii brak produktu brak produktu

1 M. kansasii brak DNA brak produktu M. kansasii

1 M. kansasii M. kansasii M. kansasii M. xenopii

1 M. kansasii bakterie inne niż Mycobacterium sp. M. kansasii M. kansasii

Odsetek szczepów zidentyfikowanych jako M. kansasii wyniósł 100% (104/104 szczepy) dla techniki HPLC, 99% (103/104)

dla testu GenoType Mycobacterium CM/AS, 97% (101/104) dla metody PCR-RFLP hsp65 oraz 95% (99/104) dla metody

PCR-RFLP rpoB. Zbieżne wyniki we wszystkich 4 metodach uzyskano dla 97 (93,3%) szczepów.

2. TYPOWANIE GENETYCZNE SZCZEPÓW M. KANSASII (ANALIZA SEKWENCYJNA – CZĘŚĆ II).

Wyniki identyfikacji gatunkowej przeprowadzonej przy użyciu metody PCR-RFLP dla genów hsp65 i rpoB (por. p. 1)

wykorzystano także do określenia typów genetycznych M. kansasii. Oznaczenie typów genetycznych wymagało

przeprowadzenia uzupełniających reakcji restrykcji dla produktów amplifikacji otrzymanych w procedurze PCR-RFLP.

Wyniki oznaczeń dla wszystkich 174 badanych szczepów M. kansasii przedstawiono w Tabeli III. Ogółem, na podstawie

połączonych wyników analizy PCR-RFLP hsp65 i rpoB, 166 (95,4%) szczepów zidentyfikowano jako I typ genetyczny, a jeden

(0,6%) szczep – jako II typ genetyczny.

Tabela III. Ocena przynależności badanych szczepów do podgatunku.

Liczba

szczepów

Metoda stosowana w typowaniu genetycznym:

PCR-RFLP hsp65 PCR-RFLP rpoB

159 M. kansasii I M. kansasii I

5 M. kansasii I brak produktu

2 M. kansasii I M. xenopii

1 M. kansasii II M. kansasii II

2 brak produktu M. kansasii I

3 brak produktu brak produktu

1 M. xenopii M. xenopii

1 M. fortuitum brak produktu

W ramach omawianej części projektu przeprowadzono też uzupełniające analizy typowania dla wybranych (15) szczepów

M. kansasii reprezentujących różne typy genetyczne (kontynuacja zadania nr 1 p. 3). Ogólnie, dla wszystkich tych szczepów

wykonano identyfikację przy użyciu testu GenoType Mycobacterium CM/AS, typowanie metodą PCR-RFLP dla genów hsp65

i rpoB oraz analizy sekwencyjne dla fragmentu genu hsp65 (644 pz), rpoB (342 pz) oraz niekodującego regionu ITS (436 pz).

Wyniki analiz zestawiono w Tabeli IV i V.

Uzyskane wyniki wykazały, że test GenoType Mycobacterium CM/AS, często stosowany do wykrywania prątków atypowych

(włączając M. kansasii), nie pozwala na identyfikację typów genetycznych M. kansasii. Różnice w profilach

hybrydyzacyjnych testu są niepowiązane z przynależnością szczepu do określonego typu genetycznego.

Z kolei analiza sekwencyjna genów hsp65, rpoB i ITS wykazała homogenność genetyczną w obrębie genotypu I M. kansasii

(podobieństwo sekwencji we wszystkich trzech loci: 99-100%) oraz pewne zróżnicowanie genetyczne w obrębie genotypu II

M. kansasii (np. podobieństwo sekwencji w regionie ITS: 91-100%).


Strona 10 z 14

Tabela IV. Wyniki analiz przeprowadzonych dla wybranych szczepów M. kansasii prezentujących różne typy genetyczne.*

L.p. Numer szczepu Typ** Typ wg

HAIN

PCR-RFLP Analiza sekwencyjna genu/regionu:

hsp65 rpoB hsp65 rpoB ITS

1. ATCC12478 I III I I 100% 100% 100%

2. B11073207 II III II II 97% 95% 95%

3. NLA00100521 II III I I BD***

99% 95%

4. ATCC25221 I III I I 100% 99% 100%

5. NLA001001166 III-V III IV IV 96% 92% 91%

6. B11063838 II III II II 96% 95% 95%

7. NLA001000927 I III I I 100% 99% 100%

8. NLA001001128 II III II II 96% 95% 96%

9. NLA001000449 I III I I 100% 99% 100%

10. 1010001468 III I III III BD 96% 91%

11. 1010001454 V IV V V 95% 96% 92%

12. 1010001458 II IV IV IV 97% 93% 93%

13. 1010001493 IV IV V V 95% 97% 93%

14. 1010001495 I III I I 100% 99% 100%

15. 1010001469 IIIb III II II 97% 95% 95%

* Szczepy zakupione w kolekcjach kultur lub udostępnione przez Radboud University Nijmegen Medical Centre (poza pulą 174

szczepów wytypowanych do badań);

** Oznaczenie typu genetycznego wg specyfikacji dołączonej do przesłanego szczepu;

*** BD, brak danych

Tabela V. Podobieństwo sekwencji w trzech różnych loci w obrębie wyróżnionych typów genetycznych I i II M. kansasii.*

Typ Analiza sekwencyjna genu/regionu:*

Liczba szczepów

hsp65 Liczba

szczepów rpoB

Liczba szczepów

ITS

I 5 100% 5 99-100% 5 100%

II 4 96-100% 5 94-100% 5 91-100%

* Szczepy zakupione w kolekcjach kultur lub udostępnione przez Radboud University Nijmegen Medical Centre (poza pulą 174 szczepów

wytypowanych do badań)

W okresie podlegającym sprawozdaniu rozpoczęto analizę sekwencyjną regionu ITS, fragmentu genu rpoB (342 pz) oraz

fragmentu genu 16S rRNA dla wszystkich pozostałych szczepów M. kansasii (innych niż wymienionych w Tab. IV)

wytypowanych do badań w projekcie.

W okresie sprawozdawczym, w ramach zadania nr 2, podjęto też poszukiwania sekwencji repetytywnych w genomie

M. kansasii, mogących być użytymi w funkcji markerów genetycznych w identyfikacji/różnicowaniu prątków M. kansasii

(szczepów i typów genetycznych). W tym celu przeprowadzono analizę sekwencji genomu szczepu M. kansasii ATCC 12478,

dostępną w bazie GenBank (NCBI Ref. Seq.: NC_022663.1) przy użyciu programu NTI Vector. Zidentyfikowano 19

potencjalnych loci (MIRU1-MIRU19, MIRU23) zawierających sekwencje powtórzone. Zaprojektowano 19 par starterów dla

amplifikacji wytypowanych sekwencji. Obecnie zoptymalizowany protokół amplifikacji sekwencji jest testowany na

wybranej puli szczepów M. kansasii.

3. ANALIZA PROFILÓW LEKOOPORNOŚCI (METODA MIKROROZCIEŃCZEŃ)

Pod koniec sprawozdawanego okresu (12. 2014 r.) rozpoczęto kolejnym etap projektu (obecnie w trakcie realizacji)

zaplanowany w ramach zadania nr 2 Harmonogramu projektu, tj. oznaczanie wrażliwości szczepów M. kansasii na panel

leków p/prątkowych. Stosowana jest metoda mikrorozcieńczeń, wg wytycznych Clinical and Laboratory Standards Institute

(CLSI) [8]. Wśród testowanych leków są leki tzw. pierwszego rzutu: streptomycyna (SM), izoniazyd (INH), etambutol (EMB)

i ryfampicyna (RMP), a także leki tzw. drugiego rzutu, tj. ryfabutyna (RFB), amikacyna (AMK), ciprofloksacyna (CFX),

klofazymina (CFZ), klarytromycyna (CLR) i etionamid (ETH).

PIŚMIENNICTWO:

1. Griffith D.E., Winthrop K. i wsp.: ATS Mycobacterial Diseases Subcommittee; American Thoracic Society; Infectious

Disease Society of America. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of

nontuberculous mycobacterial diseases. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175, 367-416 (2007)


Strona 11 z 14

2. Hong K., Sun-Hyun K., Tae-Sun S., Mi-na K., Gill-Han B., Young-Gil P., Sueng-Hyun L., Chang-Yong C., Yoon-Hoh K.,

Bum-Joon K. PCR restriction fragment length polymorphism analysis (PRA)-algorithm targeting 644 bp Heat Shock

Protein 65 (hsp65) gene for differentiation of Mycobacterium spp. J. Microb. Met. 62, 199-209 (2005)

3. Iwamoto T. I Saito H. Comparative study of two typing methods hsp65 PRA and ITS sequencing revealed a possible

evolutionary link between Mycobacterium kansasii type I and II isolates. FEMS Microbiol. Lett. 254, 129-133

(2005)

4. Butler, W. R. i Kilburn J. O. Identification of major slowly growing pathogenic mycobacteria and Mycobacterium

gordonae by high-performance liquid chromatography of their mycolic acids. J. Clin. Microbiol. 30, 2402-2407

(1988)

5. Telenti A., F. Marchesi, M. Balz, F. Bally, E. C. Böttger, Bodmer T. Rapid identification of mycobacteria to the

species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J. Clin. Microbiol. 31, 175-178 (1993)

6. Kim B.-J., K.-H. Lee, B.-N. Park, S.-J. Kim, G.-H. Bal, S.-J. Kim, Kook Y.-H. Differentiation of mycobacterial species by

PCR-restriction analysis of DNA (343 base pairs) of the RNA polymerase gene (rpoB). J. Clin. Microbiol. 39, 2102-

2109 (2001)

7. Universal Bacterial Identification by PCR and DNA Sequencing of 16S rRNA Gene. PCR for Clinical Microbiology,

2010, Part 3, 209-214.

8. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003. Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardiae,

and Other Aerobic Actinomycetes: Approved Standard M24-A. NCCLS, Wayne, USA.


Strona 12 z 14

Postęp przy realizacji projektu przedstawiono graficznie na Ryc. 1.

RYC. 1. SCHEMAT ILUSTRUJĄCY KLUCZOWE ETAPY PROJEKTU – POSTĘP PRAC


Strona 13 z 14

6.2 Spis publikacji powstałych w ramach Projektu (tytuł, autorzy, wydawnictwo – nazwa, tom , rok)

1. Bakuła, Z., Safianowska, A., Nowacka-Mazurek, M., Bielecki, J., Jagielski, T. Mycobacterium kansasii: biologia patogenu oraz cechy kliniczne I epidemiologiczne zakażeń. Post. Mikrobiol., 2014, 53(3), 241-254. /Impact Factor2013 = 0,271/.

6.3 Inne formy upowszechniania wyników badań (np. udział w konferencjach, sympozjach, wdrożenia), rok

1. Jagielski, T., Modrzejewska, M., Bakuła, Z., Safianowska, A., Nowacka-Mazurek, M., Bielecki, J. Typowanie genetyczne szczepów klinicznych Mycobacterium kansasii metodą PCR-RFLP dla genów hsp65 i rpoβ. (XXXII. Zjazd Polskiego Towarzystwa Chorób Płuc, Wisła, 2012). R013. (Streszczenie nagrodzone stypendium Polskiego Towarzystwa Chorób Płuc)

2. Bakuła, Z., Safianowska, A., Nowacka-Mazurek, M., Bielecki, J., Jagielski, T. The predominance of subtype I among Mycobacterium kansasii clinical isolates from Poland, as evidenced by PCR restriction-enzyme analysis of the hsp65 gene. Proceedings of the 24

th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,

Barcelona, 2014, p. 184. (In: Mycobacterial susceptibility and molecular epidemiology. P0933).

3. Bakuła, Z., Safianowska, A., Proboszcz, M., Nowacka-Mazurek, M., Bielecki, J., Jagielski, T. Comparison of three PCR-based methods with high-pressure liquid chromatography (HPLC) analysis for the identification of Mycobacterium kansasii clinical isolates. Proceedings of the 25

th European Congress of Clinical Microbiology and

Infectious Diseases, Copenhagen, 2015, Pxxxx. /Praca przyjęta na zjazd; nagrodzona stypendium przez European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID 2015 Travel Grant)/

6.4 Informacja o patentach, zgłoszeniach patentowych, licencjach, czy wdrożeniach będących wynikiem projektu, rok

Brak

6.5 Informacja o działaniach promocyjnych zgodnie z umową na wykonanie projektu

(dotyczy: informowania opinii publicznej o tym, że realizacja Projektu została sfinansowana przez Centrum – podać datę i miejsce zamieszczenia informacji, sposób informowania)

Informacja na stronie Zakładu Mikrobiologii Stosowanej, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski: http://zms.biol.uw.edu.pl/projekty-badawcze/ Witryna internetowa dedykowana projektowi jest obecnie w trakcie realizacji. Jej uruchomienie przewiduje się na wiosnę 2015 r.

7. ZGODNOŚĆ POSTĘPÓW W REALIZACJI PROJEKTU Z OPISEM PROJEKTU, HARMONOGRAMEM I KOSZTORYSEM PRAC, STANOWIĄCYMI ZAŁĄCZNIKI DO UMOWY

Czy postęp i zakres prac są zgodne z umową?

Jeśli zaznaczono NIE, tzn. w ciągu okresu sprawozdawczego nastąpiły odstępstwa od ustaleń rzeczowych/czasowych/finansowych zawartych w umowie, należy poniżej wskazać, jakie są to odstępstwa (i jakich zadań dotyczą), podać ich przyczyny, wymienić podjęte lub planowane działania naprawcze, określić wpływ na dalsze prowadzenie projektu i osiągnięcie planowanych rezultatów.

TAK NIE

Zadanie nr … Nazwa zadania …. Odstępstwo: …. Przyczyna: …. Działania naprawcze:…….. Wpływ na rezultaty Projektu:……. Zadanie nr ……..

………….

http://zms.biol.uw.edu.pl/projekty-badawcze/


Strona 14 z 14

8. CZY DALSZE PROWADZENIE PRAC PROWADZI DO OSIĄGNIĘCIA ZAKŁADANYCH WYNIKÓW?

Tak Nie

9. PODPISY I PIECZĘCIE

Data i podpis Kierownika Projektu

Podpis i pieczęć służbowa osoby odpowiedzialnej ze strony Jednostki za część finansową raportu

Pieczęć Jednostki

10. POTWIERDZENIE ZŁOŻENIA RAPORTU - wypełnia NCBR

Data złożenia raportu

Imię i nazwisko pracownika NCBR

Podpis

RAPORT ROCZNY ZA ROK z realizacji Projektu w ramach...

Documents

Transcript of RAPORT ROCZNY ZA ROK z realizacji Projektu w ramach...