Podstawy bioanalityki

Adam Grochowalski

Naturalne źródła substancji silnie toksycznychSubstancje szkodliwe pochodzenia naturalnego

amanityna

Kurara - curare

Tubocurarine

Strychnos Toxifera

ChondrodendrontomentosumPodstawowa roślina, z której pozyskiwane s ąalkaloidy do produkcji kurary

Atropa belladonna

Pokrzyk wilcza jagoda

Szalej jadowityCicuta virosa L.

Dawka śmiertelna – 5 g kłącza

blekot, bzducha wodna, cykuta, cykuta jadowita, pietruszyca wodna, szaleniec, szaleń, wsza wodna.

Tradycja literacka głosi, że wskutek otrucia cykutązmarł między innymi Sokrates

Szczwół plamistyConium maculatum L.

Lucrezia Borgia 1480-1519

Femme fatale

Bartolomeo Veneziano

www.dioksyny.pl

Zastosowanie nowoczesnych technik analizy umożliwia uzyskanie wyników, które są źródłem informacji o stanie poszczególnych elementów środowiska. Zazwyczaj prowadzenie takich badań przy pomocy tych technik jest bardzo pracochłonne i wymaga czasu, ponadto wymaga udziału wysoko wyspecjalizowanego personelu, co istotnie wpływa na koszt przeprowadzenia badań. Co więcej, wiele z nich może być przeprowadzonych jedynie w warunkach laboratoryjnych, co z kolei wpływa na opóźnienie pomiędzy pobraniem próbki a otrzymaniem wyniku.Od dłuższego już czasu wzrasta zapotrzebowanie na specyficzne i szybkie techniki analityczne, które umożliwiłyby prowadzenie badań bez opóźnienia czasowego oraz, co równie ważne, ze zmniejszoną inwazyjnością na środowisko.

Takie możliwości oferują metody z zakresu bioanalitykii biomonitoringu.

Idea wykorzystywania pojedynczych organizmów żywych, bądź też ich populacji, do rejestrowania i oceny pewnych charakterystycznych cech środowiska jest oparta na założeniu, że istnieje równowaga pomiędzy czynnikami środowiskowymi , a wymaganiami życiowymi różnych gatunków organizmów żywych. Założenie to zaczęto wykorzystywać już w XVI wieku, kiedy to obecność rud w ziemi wiązano z obecnoś-cią danych gatunków roślin. Również w celu wycenienia żyzności ziemi analizowano skład gatunkowy roślinności zarastającej dane tereny

Bioanalityka wykorzystuje aktywne biologicznie, akceptory określonych zanieczyszczeń.Uzyskana informacja jest bardzo ogólna, ale daje kompleksową odpowiedź czy środowisko oddziałuje toksycznie na organizmyżywe.Można wyodrębnić dwa główne narzędzia bioanalityki:

• Bioczujniki, gdy składnik aktywny biologicznie stanowi część odpowiedniego czujnika;

• Biotesty, gdy materiał biologiczny jest sam w sobie urządzeniem kontrolno-pomiarowym.

Biomonitoring jest definiowany jako zastosowanie

organizmu żywego lub materiału biologicznego do uzyskania

informacji o wybranym elemencie środowiska lub o jego

właściwości. Informacja ta uzyskiwana jest najczęściej ze

zmiany w składzie i liczebności organizmu monitorującego

lub ze zmian fizjologicznych i morfologicznych. Jeśli

używamy w badaniach materiału biologicznego, informację

tę może stanowić zmiana stężenia specyficznej substancji w

tym materiale.

Biomonitoring może być realizowany na dwa sposoby:

• W oparciu o typowe badania analityczne próbek bioty (pasywne próbniki akumulacyjne dla zanieczyszczeń);

• Poprzez obserwację biomonitorówi biowskaźników.

Biomonitory procesu akumulacji

Gatunek wskaźnikowy może akumulowaćsubstancję toksyczną w swoich narządach. Dla przykładu poroża saren mogą być dobrym wskaźnikiem nie tylko samego faktu skażenia metalami ciężkimi, lecz także daje nam przybliżony obraz nasilenia tego zjawiska. Innym przykładem może być dendroanaliza, czyli ocena stopnia zanieczyszczenia na podstawie przyrostu grubości pnia drzewa oraz jego składu chemicznego na poszczególnych słojach

Bioindykacja (biowskaźniki)

Zanieczyszczenia wpływają na wzajemne, biotyczne i abiotyczne składniki ekosystemu. Wśród złożonego ekosystemu wyodrębniły się organizmy czułe na zmiany składu chemicznego ich otoczenia. To one jako pierwsze wykazują zewnętrzne oznaki tych oddziaływań (jest to np. karłowacenie, zmiany barwy, czy nawet zanikanie gatunków). Związki przyczynowo-skutkowe tych procesów już od dawna są podmiotem badań. Wyselekcjonowano wiele gatunków roślin i zwierząt, które akumulują w swoich organizmach zanieczyszczenia, wykazują także zmiany morfologiczne, fizjologiczne, czy nawet behawioralne. Zaczęto je wykorzystywać jako biologiczne wskaźniki zanieczyszczeń biosfery.

Biowskaźnikami nazywamy gatunki lub zespoły gatunków organizmów żywych (mogą być to również całe ekosystemy), wrażliwych na dany czynnik środowiska w sposób umożliwiający jego ilościową i jakościową ocenę. Są używane w biomonitoringu do badania skażenia środowiska oraz oceny wpływu zanieczyszczenia na ekosystem, w którym gatunek istnieje.Dobrymi wskaźnikami mogą być jedynie nieliczne organizmy, gdyż muszą spełniać następującewarunki:

• Są pospolite i łatwo dostępne dla obserwatora;

• Są dostępne przez cały rok;

• Posiadają wąski oraz specyficzny zakres wymagańekologicznych;

• Pozwalają na stosunkowo szybką ocenę poziomu zanieczyszczenia;

• W zetknięciu z substancjami toksycznymi reagują szybko, jednoznacznie i wyraźnie.

Katastrofa Minamata

Choroba z Minamaty - zespół objawów chorobowych spowodowany uszkodzeniemukładu nerwowego w wyniku zatrucia metylort ęciąDo roku 2001 oficjalnie rozpoznano 2 265 przypadków (z czego 1784 osób zmarło).

W 1965 roku w Japonii ujawniono drugi przypadekzatruć metylortęcią, który miał miejsce w prefekturzeNiigata i który nazwano chorobą Niigata Minamata.

Ofiara katastrofy w Minamata

Lichenoindykacja

Jest to ocena zanieczyszczeniaśrodowiska wykorzystująca porosty, które są wyjątkowo wrażliwe na zanieczyszczenia atmosferyczne.Porosty (lichens) są to organizmy symbiotyczne powstałe na drodze ścisłego zespolenia samożywnego glonu lub sinicy z cudzożywnym grzybem. Powstały w ten sposób organizm posiada cechy niespotykane u obu form założycielskich.Ze względu na dużą wrażliwość porostów na zanieczyszczenia, praktycznie nie występują one na obszarach silnie uprzemysłowionych i zurbanizowanych, co pozwala na wykorzystanie ich jako biowskaźników.

Mikrobioanalityka

"OMIKA "

Opracowanie nowych technologii bioanalitycznych(„omik”) było, jak również nadal jest, istotnym elementem, a nawet bezwzględnym warunkiem rozwoju współczesnych nauk biologicznych, a zwłaszcza nutrigenomiki . Jest to nowy obszar badawczy wynikający ze współczesnej wiedzy, a przede wszystkim współczesnych oczekiwań i możliwości ochrony zdrowia mieszkańców krajów najbogatszych. Dalekosiężnym celem nutrigenomiki jest opracowanie indywidualnych strategii żywienia zapobiegającym chorobom i poprawiającym statusu zdrowotny ludzi.

Efektem tych strategii winno być precyzyjnie zaplanowane "żywienie molekularne", tj. dostosowanie składu diet do predyspozycji (specyfiki) genetycznej konsumenta.

Termin nutrigenomika po raz pierwszy został użyty przed 30 laty w odniesieniu do strategii przeciwdziałania hipoglikemii w cukrzycy metabolicznej o różnym podłożu genetycznym. Współczesny, intensywny rozwój nutrigenomiki jest następstwem opublikowania raportu International Human Genome Sequencing Consortium, co miało miejsce w pierwszym roku XXI wieku. Obecnie nutrigenomika jest wiedzą, a przede wszystkim metodą poznawania związków przyczynowo-skutkowych między genetycznymi predyspozycjami jednostki, determinowanymi strukturą DNA i mechanizmami dziedziczenia epigenetycznego, a fizjologiczną (głównie zdrowotną) reakcją organizmu na zróżnicowanie składu i właściwości diety.

Dynamiczny rozwój nutrigenomiki jest możliwy dzięki zastosowaniu nowych technologii bioanalitycznych, charakteryzujących się miniaturyzacją i automatyzacjąprocesów pomiarowych, równoczesną rejestracją setek lub tysięcy informacji oraz zastosowaniem złożonych narzędzi elektronicznych w analizie wyników.

Jest to konieczne z racji rozległości analizowanych zjawisk, obejmujących tysiące obserwacji biologicznych na poziomie komórek, tkanek i całego organizmu. Przedmiotem zainteresowania nutrigenomiki, w tym jej składowych „omik”, tj. transkryptomiki, genomiki, proteomiki i metabolomiki, są biologiczne skutki ekspresji 35-40 tysięcy genów reagujących na zmiany składu diety. Efektem ekspresji tej puli genów jest ponad 100 tysięcy białek i kilka tysięcy metabolitów.

W uproszczeniu można przyjąć, że transkryptomika pozwala odczytać, które grupy genów reagują na czynnik doświadczalny, tj. zmiany składu diety. Efektem reakcji jest proces transkrypcji, tj. przepisanie treści genu na RNA.

Zadaniem proteomiki jest weryfikacja relacji gen-białko, poprzez pomiar ilości i charakterystyki funkcji wszystkich białek komórki. Jest to pomiar efektów procesu translacji, czyli drugiego etapu reakcji genu na czynnik środowiska, obejmującego syntezę białek w oparciu o matrycęRNA. Proteomika jest nowoczesną technologiąrozdzielania i identyfikacji białek, będąca połączeniem 2D elektroforezy żelowej i nano-spektrometrii mas lub techniki

LC-MS, LC-MS/MS, LC-MS/FTIR i podobnych

Do odczytania RNA stosuje się złożoną technikęanalityczną z użyciem sond genetycznych zawierających zdefiniowane fragmenty genomu danego gatunku. Wykorzystuje się tu technikę elektroforezy, w tym elektroforezy kapilarnej sprzężonej ze spektrometriąmas.W modelowych doświadczeniach z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych mogą być również stosowane macierze Affymetrix Rat Genome U34A zawierające wzory 8000 genów wątroby szczura, pozwalające ocenićreakcję tego fragmentu genomu na zmiany składu diety.

Proteomika, jako „totalna” technika analityczna, obejmuje rozpoznanie wszystkich białek komórki lub tkanki, co pozwala zmniejszyć ryzyko przeoczenia niepożądanego efektu genetycznej modyfikacji składników pokarmowychw produktach spożywczych.

Przedmiotem metabolomiki są badania metabolitów obecnych w komórce i płynach tkankowych, będących produktami ekspresji genów i skutkami działania mechanizmów epigenetycznych. Do stosowania metabolomiki złożone są narzędzia badawcze takie jak: chromatografia cieczowa w sprzężeniu ze spektromertią mas wysokiej rozdzielczości oraz NMR. niezbędne jest teżodpowiednie oprogramowanie statystyczne (analiza chemometryczna).Nutrigenomika jest podporządkowana potrzebom utrzymania zdrowia ludzi, jednakże rozwijane na potrzeby nutrigenomiki nowe technologie bioanalityczne, głównie proteomika i metabolomika, wchodzą już w zakres metod badawczych, służących pełniejszej charakterystyce wpływu pasz na funkcjonowanie organizmu zwierząt.

Główne grupy substancji toksycznych•pierwiastki chemiczne

- główne metale śladowe (np. Zn, Cu, Pb, Cd, Hg)•nieorganiczne związki chemiczne

- azotany (NO3-) i azotany (NO2

-);- gazy (SO2, NOx, O3, HF); - detergenty (zeolity, poliwęglany, nadborany)

•Organiczne związki chemiczne- pestycydy (fungicydy, herbicydy, insektycydy)- pilichlorowane bifenyle (PCB) itp.- wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne

(WWA)- dioksyny i furany

Paul Hermann MüllerThe Nobel Prize in Medicine 1948

DDTDichloro difenylo trochloroetan4,4'-(2,2,2-trichloroethane-1,1-diyl)bis(chlorobenzene)

Iperyt siarkowy Luizyt

Adamsyt

Kwas 2,4,5-trichlorofenoksyoctowy

sarin

Sarin został otrzymany w 1938 roku w Niemczech przez Gerharda Schradera

Dawka śmiertelna – 0.1 mg / kg masy ciała

TabunN,N-dimetyloaminoetoksycyjanofosfina

Tabun po rozproszeniu go w formie aerozolu w powietrzu z np: samolotu opada szybko na dół, a powstające opary "ścielą" się zalegając w zagłębieniach w ziemi. Wdychany niszczy szybko układ nerwowy człowieka, co objawia się najpierw gwałtownymi drgawkami całego ciała a następnie zgonem. Stężenie śmiertelne (LC50) wynosi dla ludzi 150 mg/m3. Zatrutego tabunem człowieka można odratować pod warunkiem, że szybko poda mu się atropinę lub diazepam.

Tabun został otrzymany przypadkowo w 1936 r., przez niemieckiego chemika Gerharda Schradera

VX

uznawany jest za jeden z najniebezpieczniejszych gazów bojowych.Mimo mylącej nazwy VX-gaz jest trudno lotną cieczą (wystarczającą by wytworzyćśmiertelne stężenie). Jeżeli do organizmu przedostanie się poprzez drogi oddechowe VX jest około bardziej trujący od sarinu. Dawka śmiertelna – 0.003 mg / kg masy ciała

Jego wysoka lepkość i niska lotność powodują, że VX posiada teksturę oleju samochodowego. To czyni go szczególnie niebezpiecznym dla środowiska. VX nie posiada zapachu ani smaku. Może być rozprowadzany w postaci płynu bądź pary. Działa jak środek paralityczno-drgawkowy blokując (czerwony) funkcję enzymuacetylocholinesterazy (żółty).Powoduje to ciągłe skurcze wszystkich mięśni, co prowadzi do problemów z oddychaniem, a w efekcie do śmierci przez uduszenie.

VX

Połączenie synaptyczne:

1-mitochondrium 2-pęcherzyki presynaptycznez

neurotransmiterem3-autoreceptor4-szczelina synaptyczna 5-neuroreceptor 6-kanał wapniowy, 7-egzocytoza pęcherzyków

z neurotransmiterem8- receptor zwrotnego wychwytu mediatora

Broń binarna

amunicja, której wypełnienie stanowią substancje chemiczna praktycznie nietoksyczne, będące

substratami do reakcji syntezy bojowej środków trujących. Proces syntezy BST zapoczątkowany

jest bezpośrednio przed użyciem amunicji i zachodzi w czasie przemieszczania

jej w rejon celu.

W nocy z 2 na 3 grudnia 1984 roku w zakładach chemicznych firmy Union Carbide India Ltd miała miejsce katastrofa - otworzył się zawór bezpieczeństwa na zbiorniku magazynowym zawierającym silnie toksyczny izocyjanian metylu (MIC methyl isocyanate).

Uwolniony gazowy MIC utworzyłchmurę która przepłynęła nad pobliskie zabudowania.

BHOPAL – Indie, 3 grudnia 1984

Skażenie było bezpośrednią przyczyną śmierci około 2 500 osób. Szacuje się, że blisko 100 tys. doznało ciężkiego uszczerbku na zdrowiu. Dokładna liczba ofiar śmiertelnych i obrażeń nie jest pewna, ponieważ jeszcze w ciągu następnych lat następowały zgony spowodowane awarią. Ewakuacja około 200 tys. osób zapobiegła jeszcze bardziej tragicznym skutkom.

Rozmiary tragicznych skutków awarii uczyniły z niej najtragiczniejszą awarię odnotowaną w przemyśle chemicznym.

Kapsaicyna jest stosowana w niezabijającej broni chemicznej -rozmaitych aerozolach i proszkach służących do rozganiania tłumów (gaz łzawiący) lub samoobrony (tzw. gaz pieprzowy).

W dużych stężeniach kapsaicynajest śmiertelną trucizną. Symptomy przedawkowania to kłopoty z oddychaniem, sina skóra i konwulsje. Naturalnie występujące stężenia tego związku w ostrych przyprawach i żywności są jednak znacznie poniżej granicznej dawki śmiertelnej. Zbyt wysokie stężenie tego związku w żywności powoduje taką jego pikantność, że uniemożliwia to jej spożycie przez większośćludzi. Powoduje to, że przypadki zatruć kapsaicyną sąniezmiernie rzadkie.

Dawka śmiertelna kapsaicyny wynosi wg różnych źródeł od 56 do 512 mg/kg. Przyjmując najniższą z tych wartości można łatwo obliczyć, że do uśmiercenia przeciętnego, dorosłego człowieka potrzeba by co najmniej ok. 3,5 g tego związku, podczas gdy już 1-2 mg w 1 kg żywności nadają jej intensywną pikantność.

Botulina (botulinum)Clostridium botulinum

Toksyna botulinowa, jad kiełbasiany, botulina(łac. botulus - kiełbasa) - bakteryjna egzotoksyna wytwarzana przez bezwzględnie beztlenowe laseczki Clostridium botulinumoraz nielicznych innych przedstawicieli tego rodzaju. Chemicznie jest to mieszanina kilku różnych białek.

CDC klasyfikuje jad kiełbasiany do grupy A znaczenia, jako brońbiologiczna, co oznacza, że jest stosunkowo dogodnym czynnikiem rażącym. Ze względu na działanie (toksyczne) posiada charakter broni chemicznej, jednak tradycyjnie zalicza się ją do grupy broni biologicznej.

Nie są znane udokumentowane przypadki udanego użycia tej toksyny w jakichkolwiek atakach.

Rycyna - jedna z najbardziej trujących substancji pochodzenia roślinnego, otrzymywana z rącznika (Ricinuscommunis, rodzina Euphorbiaceae). Wszystkie części rośliny zawierają rycynę, ale największe stężenie (od 1 do 5 %)

jest w nasionach.Jako substancja białkowa z grupy lektyn nie miesza się z tłuszczami, co umożliwia produkcjęnieszkodliwego dla zdrowia oleju rycynowego, (który nie zawiera rycyny).

Alexander Fleming, odkrywca penicyliny

lekarz i mikrobiolog szkocki, profesor bakteriologii w Londynie (1881-1955). Prowadził badania nad środkami bakteriobójczymi pochodzenia biologicznego. W 1929 odkrył lizozym. Był jednym z współodkrywców penicyliny wyosobnionej z pleśni pędzlaka. W 1945 otrzymał Nagrodę Nobla - razem z H.W. Floreyem i E.B. Chainem.

Penicylina – wzór ogólny

Penicylina benzylowa Amoksycyklina

Truj ący motyl z rodziny HELICONIIDAE z Ameryki Południowej

Źródłem dioksyn są procesy termiczne KawiorZadaniem proteomiki jest weryfikacja relacji gen-białko, poprzez pomiar ilości i charakterystyki funkcji wszystkich białek komórki. Jest to pomiar efektów procesu translacji, czyli drugiego etapu reakcji genu na czynnik środowiska, obejmującego syntezę białek w oparciu o matrycęRNA. Proteomika jest nowoczesną technologią

rozdzielania protein metodą elektroforezybędąca obecnie połączeniem 2D elektroforezy żelowej i nano-spektrometrii mas lub technik:

LC-MS, LC-MS/MS, LC-MS/FTIR i podobnych

Zasada elektroforezy

Zjawisko elektrokinetyczne

Zjawisko ruchu fazy stałej w ośrodku ciekłym lub cieczy względem ciała stałego zachodzące pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego (np. elektroforeza, elektroosmoza)

Wprowadzenie

• Elektroforeza– Wykorzystanie zdolności poruszania się cząsteczek w

roztworze koloidalnym pod wpływem pola elektrycznego w kierunku anody i katody.

– Electro– Phoresis: pochodne od greckiego „przenosić”

• Technika elektroforezy jest nowoczesną metodąelektrochemiczną badania roztworów koloidalnych

ElektroforezaRozdzielanie na żelach w polu elektrycznym

• gel is usually polyacrylamide for proteins# and agarosefor DNA

• proteins are visualised by staining – Coomassie blue, silver

• separation depends on both charge and size– force driving molecules depends of charge– molecules experience frictional drag – depends on size and density of the gel

# PAGE – PolyAcrylamide Gel Electrophesis

Elektroforeza

• Szybkość migracji cząsteczki w żelu zależy od:• rozmiaru cząstek roztworu koloidalnego

– Duży wymiar, większy opór, wolniejsza migracja

• ładunku, którym obdarzone są cząstki w roztworze koloidu (prawo Coulomb’a)– Większy ładunek – szybsza migracja

PCR

Polymerase Chain Reaction

helisa DNA

Reakcja PCR składa si ę z wielokrotnie

powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodz ą

w ro żnych temperaturach.

Można zatem wymusza ć je bez ingerencji w skład

mieszaniny, a jedynie przez zmian ę temperatury

mieszaniny reakcyjnej.

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR

(ang. Polymerase Chain Reaction) – łańcuchowa reakcja

polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach

laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego

podgrzewania i oziębiania próbki.

Technika została wynaleziona w 1983 roku przez Kary'ego

Mullisa z kalifornijskiej firmy Cetus, za co Mullis otrzymał w

roku 1993 Nagrodę Nobla.

Do reakcji wprowadza si ę:

1. matrycowy DNA,2. trifosforany deoksyrybonukleozydów,3. startery (primery), czyli krótkie (najcz ęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty

DNA komplementarne do fragmentów matrycy, znajduj ących si ę na obu końcach interesuj ącego nas genu. Wyró żniamy dwa typy starterów: starter przedni – jego sekwencja musi by ć taka sama jak sekwencja powielana; starter wsteczny – jego sekwencja musi by ć komplementarna do powielanej.

4. termostabiln ą polimeraz ę DNA. Używanym do reakcji enzymem mo że być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermu s aquaticus lub polimeraza Pfu z archeowców Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje si ę większą progresywno ścią niż Taq, jednak że działa wolniej. Dost ępne są także inne polimerazy, b ędące z reguły modyfikacjami wy żej wymienionych.

Czasem dodaje si ę jeszcze innych składniki np. roztworu tRNA zapobiega jącego adsorbcji innych składników mieszaniny na ściankach naczynia, barwniki i wska źniki informuj ące o przebiegu reakcji (szczególnie w modyfikacjach PCR –Real Time PCR) i inne.

Reakcja PCR składa si ę z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodz ą w ro żnych temperaturach. Można zatem wymusza ć je bez ingerencji w skład mieszaniny, a jedynie przez zmian ę temperatury mieszaniny reakcyjnej.

Denaturacja. Pierwszym etapem jest rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA (lub mRNA, je śli stanowi matryc ę).

W wysokiej temperaturze (zwykle około 95 °C) p ękająwiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela si ęna dwa pojedyncze ła ńcuchy. W celu uzyskania tego efektu podnosi si ę temperatur ę mieszaniny reakcyjnej do wymaganych 95°na 15 sekund.

Annealing – hybrydyzacja odcinków starterowych.

Polega na tworzeniu odcinków dwuniciowych, składaj ących

się z przygotowanych starterów - cz ąsteczek DNA

komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlaj ących gen

mający ulec namno żeniu - z matrycow ą cząsteczk ą DNA.

Etap ten zachodzi w temperaturze ni ższej, ściśle okre ślonej

dla danej pary starterów (pomi ędzy 45-60 °C), przył ączają się

one do matrycy. Poniewa ż roztwory primerów s ą dodawane

w du żym nadmiarze w stosunku do matrycy, jest bardzo mał o

prawdopodobne, żeby na tym etapie, zamiast hybryd starter-

matryca utworzyły si ę hybrydy poł ączonych si ę ze sob ą

dwóch nici matrycy.

Elongacja – Na tym etapie zachodzi wła ściwa synteza DNA

i tym samym amplifikacja po żądanego genu.

Podwy ższenie temperatury do około 72 °C powoduje

utworzenie si ę na matrycy, z przył ączonymi do niej starterami,

kompleksu z polimeraz ą DNA, wskutek czego rozpoczyna si ę

synteza nici komplementarnej do matrycy. Reakcja ta trwa

zwykle 30 sekund.

Następnie cykl powtarza si ę i w kolejnym etapie annealingui elongacji jako matryca mog ą słu żyć wszystkie zsyntetyzowane dotychczas cz ąsteczki genu. W ten sposób reakcja, dopóki substraty i enzym są w wystarczaj ącej ilo ści, zachodzi coraz szybciej, powoduj ąc coraz wi ększy przyrost kopii genu na etapie elongacji.

Gdyby wydajno ść metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cz ąsteczki mo żna by uzyska ć 2n cząsteczek. W praktyce wydajno ść procesu jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR pozwala na geometryczne zwielokrotnienie po żądanego ła ńcucha DNA.

Konwencjonalna technika PCR pozwala na namna żaniełańcuchów DNA o maksymalnej długo ści ok. 10 kpz.

Kpz (kbp) (kilo par zasad) = 1,000 pz

PCR jest bardzo użytecznym narzędziem w różnego typu badaniach genetycznych ponieważ:•Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu - wystarczy znajomość sekwencji nukleotydów w odcinkach oskrzydlających gen.

Stosowane startery nie muszą być komplementarne do matrycy w 100%. Pozwala to na amplifikację wariantów tego samego genu, które różniąsię od siebie niewielkimi zmianami w sekwencji.

Jednocześnie jest to metoda specyficzna - przy doborze odpowiednich starterów, powielaniu ulega tylko jeden odcinek DNA

jest to metoda bardzo czuła. Pozwala na wykrycie nawet pojedynczej cząsteczki DNA

Do odczytania RNA stosuje się złożoną technikęanalityczną z użyciem sond genetycznych zawierających zdefiniowane fragmenty genomu danego gatunku. Wykorzystuje się tu technikę elektroforezy, w tym elektroforezy kapilarnej sprzężonej ze spektrometriąmas.W modelowych doświadczeniach z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych mogą być również stosowane macierze Affymetrix Rat Genome U34A zawierające wzory 8000 genów wątroby szczura, pozwalające ocenićreakcję tego fragmentu genomu na zmiany składu diety.

PCR for Medical HIV Diagnostics

ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

What is an ELISA?

• Enzyme-linked immunosorbent assay• Name suggests three components

– Antibody• Allows for specific detection of analyte of interest

– Solid phase (sorbent)• Allows one to wash away all the material that is not

specifically captured– Enzymatic amplification

• Allows you to turn a little capture into a visible colorchange that can be quantified using an absorbanceplate reader

What is it used for?

• Measure antibody levels (allergies, vaccines)

• Detect viruses (hepatitis, HIV, venereal diseases)

• Detect hormonal changes (pregnancy)• Detect circulatory inflammatory markers

(cytokines)

Advantages

• Sensitivity• Quantitative• Reproducible• Kit format

Enzymes with Chromogenic Substrates

• High molar extinction coefficient (i.e., strong color change)

• Strong binding between enzyme and substrate (low KM)

• Linear relationship between color intensity and [enzyme]

Antibodies

• Specificity• Diversity – hypervariable region (2020 ~

1026 combinations; human make ~ 108)• Affinity – range 105 < K < 109 M-1

Capture and Detection Antibodies Sandwich ELISA Competitive ELISA

• Less is more. More antigen in your sample will mean more antibody competed away, which will lead to less signal

Today’s Lab

• Our antigen = human albumin• Our antibody = rabbit anti-human• Our enzyme = horseradish peroxidase

• You will develop (i.e. perform enzymatic reaction) using o-phenylene diamine (OPD). It is hazardous. Please wear gloves and treat with respect.

Antibody Steps

• Antigen (purified albumin) is already coated onto microwell plates

• You will add standards and samples in triplicate• You will incubate for 60 minutes at 37 degrees C

to allow for Ab-Ag binding50 50 50

25 25 25

10 10 10

5 5 5

2.5 2.5 2.5

1 1 1

0.5 0.5 0.5

0 0 0

= standard

U = unknown

U1 U1 U1

U2 U2 U2

U3 U3 U3

U4 U4 U4

= blank

Data Analysis

•Standard Curve in Excel– Insert chart– Insert trendline (logarithmic)

•T-test– Ttest(array1, array2, tails, type)

Prezentacja testu ELISA

ELISA

ELEKTROFOREZA

ELEKTROFOREZAW zastosowaniach bioanalitycznych

ElektroforezaRozdzielanie na żelach w polu elektrycznym

•gel is usually polyacrylamide for proteins# and agarose for DNA

• proteins are visualised by staining – Coomassie blue, silver

•separation depends on both charge and size– force driving molecules depends of charge– molecules experience frictional drag – depends on size and density of the gel

# PAGE – PolyAcrylamide Gel Electrophesis

Elektroforeza żelowa

W elektroforezie żelowej środowiskiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel elektroforetyczny wykonany z agaru, poliglikoli, poliakrylamidów lub skrobi (metoda historyczna), uformowany w płytkę długości kilkunastu centymetrów (rzadziej słupek -elektroforeza dyskowa). Kroplę roztworu analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu (studzienkę) zanurzonym w buforze pH.

Elektroforeza żelowa

Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną elektrody, do których przykłada się stałe napięcie elektryczne rzędu 50- 2000 V. Ze względu na zróżnicowaną ruchliwość elektroforetyczną, różne cząsteczki w różnym stopniu oddalają siępodczas analizy od miejsca naniesienia próby. Stopniowo ulegają więc rozdzieleniu.

Elektroforeza żelowaTechnika ta jest najczęściej stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych z komórek. Jest też czasami stosowana jako jedna z technik pomiaru masy cząsteczkowej i badania polidyspersji polimerów syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu cząsteczek na szybkośćich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich ruchliwości z masą cząsteczkową, to może badane substancje poddać denaturacji, np. przy pomocy detergentu SDS (w przypadku białek) lub mocznika (w przypadku DNA lub białek).

SDS PAGE – molecular weight

• SDS – sodium dodecyl sulfate – anionowy detergent

• Binds to all proteins with a constant ratio 1 SDS for 2 amino acids

• Large –vecharge of SDS –uniformly charges the protein

• SDS unfolds protein so shape won’t matter

• Rate of movement will only depend on size

Gel Electrophoresis

Western blot

Western blot – metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca do wykrywania określonych białek.Rozdziela zdenaturowane białka według ich mas oraz natywne (niezdenaturowane) według ich struktury 3-D, za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Następnie białka sąprzenoszone na membranę (zwykle nitrocelulozowąlub PVDF). Obecność odpowiednich białek jest sprawdzana za pomocą odpowiednich przeciwciałprzyłączających się do ich epitopów, a następnie może addukt wybarwia się czernią amidową, Ponceau S czy Coomassie Brilliant Blue.

Przed dodaniem przeciwciał membrana zostaje "zablokowana" przez zanurzenie w roztworze innego białka, zwykle żelatyny, albuminy surowicy krwi bydlęcej (BSA) lub odtłuszczonego mleka w proszku, często z dodatkiem detergentu (np. Tween 20) lub w roztworze samego detergentu, w celu uniemożliwienia niespecyficznego łączenia się przeciwciał z membraną.

Analogicznie do metody ELISA w metodzie western blot można używać jednego przeciwciała związanego ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub dwóch rodzajów przeciwciał - nieznakowanego, przeciwko wykrywanemu białku (przeciwciała pierwszorzędowe) oraz znakowanego, przeciwko danemu izotypowi immunoglobulin (przeciwciała drugorzędowe; metoda pośrednia).

Przeciwciała są znakowane zwykle enzymem (np. peroksydaz ą chrzanow ą lub fosfataząalkaliczną), fluorochromem lub izotopem jodu 127J. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt adsorbujący się w membranie lub wywołujący luminescencję. W przypadku stosowania wizualizacji przez luminescencję lub stosowanie izotopów, obraz otrzymuje się przez odczyt sygnału przez specyficzny detektor (fluorymetr lub licznik scyntylacyjny).

Pierwszym etapem procedury jest uwolnienie białek komórkowych z preparatu. W tym celu stosuje się metody mechaniczne jak homogenizacje w moździerzu, odpowiednim homogenizatorze lub młynku oraz odpowiednie bufory zawierające detergenty (np. Triton X100 lub SDS) a także związki chelatujące jony (jak EDTA).Niekiedy zamiast wszystkich białek komórkowych bada się jedynie te pozyskane z błon lub wybranych frakcji organellowych. W tym celu przeprowadza się odpowiednie procedury ich izolacji.

Uzyskane w ten sposób homogenaty lub ekstrakty białkowe są rozdzielane metodąelektroforezy na żelu poliakrylamidowym (zwykle w warunkach denaturujących w żelu zawierającym SDS). Dzięki temu uzyskujemy rozdziałwszystkich białek ekstraktu na podstawie ich masy cząsteczkowej.

Następnym etapem jest ich transfer na odpowiedniąmembranę która wykonaną z nitrocelulozy lub PVDF -poli(fluorku winylidenu). Niekiedy stosuje się tak zwany transfer kapilarny, umieszczając membranę pomiędzy żelem a stosem fragmentów bibuły, które zasysają płyn z żelu a wraz z nim białka. Alternatywna metoda nosi nazwę elektrotransferu i wykorzystuje pole elektryczne aby przenieśćrozdzielone białka na membranę. Jakość transferu można sprawdzić barwiąc membranę barwnikiem Ponceau S lub Coomasie.

Kolejnym krokiem jest tak zwane blokowanie, czyli zabezpieczenie membrany przed niespecyficznym wiązaniem się do niej przeciwciał. Efekt ten otrzymuje się przez inkubację w roztworze albuminy z surowicy wołowej lub odtłuszczonego mleka oraz detergentu Tween . Po zakończeniu blokowania można przystąpić do inkubacji membrany w roztworze przeciwciał.

Zwykle stosuje się dwa przeciwciała: Pierwsze to tak zwane przeciwciało pierwszorz ędowe , wiążące się specyficznie do poszukiwanego białka. Jego nadmiar należy usunąć przez wypłukanie odpowiednim buforem. Następnie podaje się roztwór drugiego przeciwciała , zwanego drugorzędowym (niekiedy wykonuje się przedtem powtórne blokowaniu niespecyficznych miejsc wiążących na membranie). Wiąże się ono z przeciwciałem pierwszorzędowym a samo jest znakowane co umożliwia jego detekcję (należy jednak wspomnieć, że możliwa jest także wyznakowanie i detekcja przeciwciała pierwszorzędowego.Elementem znakującym zwykle jest enzym katalizuj ący(po dodaniu odpowiedniego substratu) reakcję dającą efekt chemiluminescencji lub reakcję barwną.

ELISA

Należy wspomnieć, że często wykonuje sięwariant tej techniki w którym bada się nie to czy dane białko znajduje się w badanym materiale, lecz czy w badanej surowicy znajdują się przeciwciała skierowane przeciwko antygenom związanym np. z poszukiwanym przez nas „zarazkiem”(przeciwciała z badanej surowicy traktuje siętu jako odpowiednik przeciwciałpierwszorzędowych).

Zarówno w nauce jak i medycynie metoda western blot szybko znalazła liczne zastosowania. Immunobloting stosuje się w diagnostyce chorób bakteryjnych, jak borelioza wywoływana przez krętka Borelia burgdorferi , gruźlica wywoływana przez prątki Mycobacterium tuberculosis. Technika ta może być również wykorzystywana w diagnostyce zakażeń wirusami, jak np. HIV, koronawirus wywołujący SARS czy wirus HSV będący czynnikiem etiologicznym opryszczki . Metodą western blot można również wykryć niektóre choroby pasożytnicze, jak wągrzyca spowodowana przez larwy tasiemca uzbrojonego, a nawet choroby genetyczne, jak pewne formy niedokrwistości Fanconiego [anemia]. Dane literaturowe wskazują, że możliwe jest równieżzastosowanie tej techniki w diagnostyce nowotworów, co dowodzi niezwykłej użyteczności i wszechstronnych możliwości jej wykorzystania.

Elektroforeza

• Szybkość migracji cząsteczki w żelu zależy od:• rozmiaru cząstek roztworu koloidalnego

– Duży wymiar, większy opór, wolniejsza migracja

• ładunku, którym obdarzone są cząstki w roztworze koloidu (prawo Coulomb’a)– Większy ładunek – szybsza migracja

Pierwszym, który zastosował w 1937 roku elektroforezę jako metodę rozdzielania, był A. W. Tiselius, a jego prace, dotyczące rozdzielenia białek, uhonorowane zostały Nagrodą Nobla. Początkowo eksperymenty prowadzone były w roztworach buforów w specjalnych U-rurkach. Jednak ze względu na znacznąkonwekcję i dyfuzję, spowodowaną wydzielaniem się ciepła, osiągano małe sprawności rozdzielania.

Dopiero zastosowanie stabilizujących wypełnień, takich jak: agar, żel poliakryloamidowy, metyloceluloza, a nawet wata szklana pozwoliło zmniejszyć niekorzystne efekty. Obecnie elektroforeza planarna: bibułowa i żelowajest stosowana głównie do rozdzielania biomolekuł.

History: First Steps

• Initial Investigations– Lodge (1886) - Curved

tube filled with a jelly and an aqueous solution of BaSO4

– Linder and Picton (1896) - Replaced jelly with a colloidal solution (colored)

History: Tiselius Method

• Minimize Convection = Sharpen Boundaries

• Chose density vs. temperature saddle point

• Used a square tube• Result: Larger useful Current

Densities

• Resolved Multiple Boundaries– Parallel incident light and

schlieren filtering produces dark lines at areas where the refractive index changes abruptly

– For opaque solutions, conductivity scanning methods developed by Vergonolle (1950)

History: Stable Media Methods

• Free methods still had limitations– Relatively large samples

required– Complete separation impossible

• Stable media solves these issues – Boundary issues minimized, thus

low molecular weight studies were possible

• Konig (1937) – First paper electrophoresis

method

History: Stable Media Methods

• Issues with paper methods– Evaporation– Limiting Current

– Chemical Instabilities

• Gel methods– Pioneered by Edman, Laemelli

and O’Farrell– Addresses above concerns– Allows for 2D analysis

– Mainstay of modern electrophoresis

Applications Elektroforeza kapilarna

Elektroforeza kapilarna jest metodą rozdzielania złożonych mieszanin związków organicznych przy zastosowaniu kapilary kwarcowej wypełnionej roztworem elektrolitu. Odkryta w 1980r i rozpowszechniona jako uniwersalna metoda rozdzielania zapewniająca większą sprawność niż HPLC oraz znacznie większąselektywność, dzięki możliwości dobierania szerokiej gamy elektrolitów, faz stacjonarnych, żeli i zróżnicowanego pola elektrycznego.

Ograniczenie konwekcji i dyfuzji możliwe było również

dzięki zastosowaniu rurek o małych średnicach, w których prowadzono rozdzielanie.

Prawdziwy przełom w rozwoju elektroforezy kapilarnej

nastąpił w 1981 roku, kiedy ukazały się prace

Jorgensona i Lukacsa. Datę tę uznaje się za początek wysoko sprawnej elektroforezy kapilarnej (HPCE).

Zastosowanie kapilar o średnicach 75 µm znacznie

ograniczyło wpływ wydzielanego ciepła nawet przy

stosowaniu napięcia rzędu 30 kV i pozwoliło uzyskaćwysokie sprawności.

electroosmotic flow profile hydrodynamic flow profile

laminar

Capillary Electrophoresis

• electroosmotic flow:– surface charges move to cathode, dragging

solution– surface charge “removes” friction between

solvent and walls of capillary

Optymalizację szybkości przepływu elektroosmotycznego przeprowadza się

w celu osiągnięcia odpowiedniej rozdzielczości w jak najkrótszym czasie, natomiast jego stabilność w czasie jest koniecznym warunkiem uzyskania powtarzalnych

wyników.

Cechą charakterystyczną przepływu elektroosmotycznego jest jego płaski profil

„B” (rys), dzięki czemu metoda CE osiąga sprawności mierzone ilością półek

teoretycznych rzędu 105 - 106.

Dla porównania sprawności uzyskiwane dla HPLC są rzędu 104, a dla GC rzędu 105 półek teoretycznych.

Oprócz elektroforezy w kapilarze zachodzi inne zjawisko elektrokinetyczne, elektroosmoza- ruch cieczy wypełniającej kapilarę. W zetknięciu z roztworem, na skutek jonizacji grup silanolowych -Si-

OH, wewnętrzna ściana kapilary jest naładowana ujemnie (rys).

Na zetknięciu fazy stałej i roztworu powstaje podwójna warstwa elektrycznao pewnym potencjale

elektrokinetycznym . Składa się ona z części bezpośrednio przylegającej do ściany kapilary i części

dyfuzyjnej, rozciągającej się w głąb roztworu o nadmiarowym ładunku dodatnim. Jeżeli taki uk ład

znajdzie się w polu elektrycznym, to hydratowane kationy części dyfuzyjnej warstwy podwójnej poruszająsię w kierunku katody, powodując przepływ cieczy w kapilarze.

Przepływ elektroosmotyczny (EOF) opisuje wzór:

VEOF = (ε * ξ / * η) * E = µEOF * E

VEOF - przepływ elektroosmotyczny

ε - stała dielektryczna

ξ - potencjał elektrokinetyczny

η - lepkość

E - natężenie pola elektrycznego

µEOF - ruchliwość elektroosmotyczna

fused silica capillary

50cm

HV(30kV)

pressurized

flowÔ

Capillary Electrophoresis

• Schematic:

Kapilara do analizy metodą CE

Zestaw do CE

30 - kV regulowanyczasilacz

prądu stałego

Katoda ( - )

Anoda ( + )

Roztwórelektrolitu

Elektroda platynowa

Termostat

Flow

Próbka

DetektorKapilara kwarcowa

rozdzielanie

+ ++ -

History: Capillary Methods

• Origins– Virtanen (1974) demonstrated

first useful CE system with 200 µm tubes.

– Held back by data acquisition

• Maturity– Jorgenson creditted with

making CE a supplemental mainstay to GE

– CE accelerated the completion of the Human Genome Project

Detektory spektrofotoetryczne w CEUV-VIS, Fluorescencyjne

Przypadkowy promień 1

Przypadkowy promień 2 Poliimid

Lustro srebrowe

kwarc

kapilara

Detektor

Detektor konduktometrycznyDetektor amperometryczny

Kapilara

Bufor

Elektroda Cu Katoda uziemiona

Mikropozycjonometr

Elektroda Pt

Elektroda Ag/AgCl

W zależności od warunków, w jakich prowadzony jest proces rozdzielania, wyróżnia sięróżne typy elektroforezy kapilarnej:Żelowa elektroforeza kapilarna(GCE – Gel Capillary Electrophoresis). Rozdzielanie prowadzone jest w kapilarach wypełnionych żelami o odpowiednich średnicach porów, które działają jak sita molekularne. Składniki próbki migruj ą wzdłużkapilary z szybkością zależną od ich wielkości.Strefowa elektroforeza kapilarna (CZE - Capillary Zone Electrophoresis ). Proces rozdzielania prowadzony jest w kapilarze wypełnionej w całej objętości tym samym buforem. Po przyłożeniu wysokiego napięcia składniki próbki obdarzone ładunkiem poruszają się z różną prędkością (rys.a).

Przygotowanie próbek

do technik

chromatograficznych

i bioanalityki

Przygotowanie próbek z analitycznego punktu widzeni a• Proces pomiarowy

Analiza jakościowa czy ilościowaMetody obliczenia wyniku

KRYTERIA WYBORU METODY ANALITYCZNEJ

Sprawność metody analitycznej – proces walidacjidokładność, poprawnośćprecyzja, czułość, granica oznaczalności, zakres oznaczania, selektywność, przepływność - wydajność metody analitycznej (throughput), stopień zautomatyzowania, elastyczność - uniwersalność (ruggedness), mobilność metody (portability), uciążliwość dla środowiska (greenness), koszt jednostkowego oznaczenia.

POBIERANIE PRÓBEK

• Wybranie miejsca pobrania próbki reprezentatywnej

• Wybranie metody pobierania właściwej dla charakteru próbki oraz miejsca pobierania

• Wybór odpowiednich naczyń do pobierania próbek

• Utrwalenie próbki: zabezpieczenie przed utratą lotnych analitów oraz wskutek adsorpcji lub absorpcji składników trudnolotnych

• Kontrolowanie zmian fizycznych i chemicznych składników próbki

• Metody utrwalania próbek nietrwałych

• Warunki dostarczania próbek do laboratorium

• Przechowywanie – warunki i czas

• Wstępne czynności postępowania z próbkami do badań

Ekstrakcja analitu z próbek

Wzbogacanie ekstraktu

Podstawy procesów ekstrakcji

Analiza związków organicznych

•Ekstrakcja substancji trudnolotnych z próbek ciekłych

•Ekstrakcja substancji trudnolotnych z próbek stałych

•Ekstrakcja substancji lotnych i wysokolotnych z próbek ciekłych i stałych

Analiza związków nieorganicznych

•Przygotowanie próbek do oznaczania zawartości metali

•Metody przygotowania próbek do oznaczania zawartości DNA Technika PCR

Pobieranie próbki

Utrwalenie próbki

Transport, przechowanie, wstępna obróbka,

Homogenizacja, suszenie

Ekstrakcja analitu

Wzbogacanie

Frakcjonowanie i izolowanie analitu

Analiza

Przygotowanie próbek do oznaczania dioksyn w żywności

Próbki gazowe

•1. Spaliny z kominów – paleniska domowe i energetyczne•2. Spaliny ze spalarni odpadów komunalnych, szpitalnych i

niebezpiecznych•3. Spaliny z pojazdów mechanicznych (źródła ruchome)•4. Gazy z instalacji przemysłowych w tym z zamkniętych obiegów

technologicznych•5. Powietrze na stanowisku pracy•6. Powietrze atmosferyczne•7. Powietrze z górnych warstw atmosfery

Cel wzbogacania próbek

� Wzbogacenie próbki w mikroskładniki– usunięcie matrycy próbki

� uzyskanie granicy oznaczalności

NAFION Nafion jest kopolimerem kwasu nadfluoro-3,6-dioxa-4-metylo-7okteno-sulfonowego i tetrafluoroetylenu (Teflonu ), otrzymany w 1960r przez Walthera Grot’a. Nafion zawiera szkielet teflonowy do którego dołączone są łańcuchy innego polimeru fluorowęglowego. Łańcuch fluorowęglowy zakończony jest kwaśną grupą sulfonową (-SO3H).

Nafion bardzo łatwo absorbuje wodę, zarówno z fazy gazowej jak i ciekłej. Każda z grup sulfonowych jest w stanie koordynować do 13 cząsteczek wody. Wewnątrz hydrofobowego polimeru kwasowe grupy sulfonowe tworzą kanały jonowe , co umożliwia szybki transport wody. W stosunku do pary wodnej Nafion spełnia rolębardzo selektywnej membrany półprzepuszczalnej.

Nafion nie jest materiałem mikroporowatym, który rozdziela związki na podstawie wielkości ich cząsteczek. Na przykład, osuszacze nafionowe mogą usun ąć wodęze strumienia wodoru , mimo że cząsteczka H2 jest dużo mniejsza od cząsteczki wody. Siłą napędową procesu nie jest ciśnienie, a prężność cząstkowa pary wodnej.

Pobieranie próbek powietrza

Naczynie próżniowe powlekane tantalem do pobierania próbek powietrza

Wysokoobjętościowy próbnik do oznaczania zanieczyszczeń powietrza

Próbniki po ekspozycji – ok. 1500 m3 powietrzaWysokoobjętościowy próbnik do oznaczania zanieczyszczeń powietrza

Pipeta gazowa

Wysokoobjętościowy próbnik do oznaczania zanieczyszczeńpowietrza

Airpointer – automatyczny analizator zanieczyszczeń powietrza Airpointer – automatyczny analizator zanieczyszczeń powietrza

Analizator zanieczyszczeń biologicznych w powietrzu

Aktywne pobieranie próbek powietrza

Sadza zatrzymana na filtrze

-Próbniki zaprojektowane do tygodniowej, miesięcznej i rocznej ekspozycji

SPMDs

PolietylenPUF

POG

Pasywne pobieranie próbek powietrza

• słońce• opady• zmiany kierunku wiatru• zapylenie

Obejma stalowa

PUF disk

Cyrkulacja powietrza

Próbnik

PUF-Disk PAS – Zastosowanie w terenie

Nie wpływają na pomiar:

Pobieranie próbek wody i ścieków

Pobieranie próbek ciekłych � Bez wzbogacania� Ze wzbogacaniem

Metody wzbogacania próbek ciekłych:Metody pasywne

� dyfuzja przez membranę (SPM, SPMD – Semipermeable Membrane Device)

Metody dynamiczne� adsorpcja na powierzchni ciała stałego (adsorpcja)� ekstrakcja do ciała stałego (SPE – Solid Phase Extraction)� mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME – Solid Phase

MicroExtraction)

Próbki wody do oznaczania

zawarto ści metalikonserwuje się za pomocą HNO3.

Próbki pobiera się do naczyń z polietylenu lub polipropylenu.

Nie wolno pobierać w tym celu próbek do naczyńszklanych.

Próbki wody do oznaczania związków organicznychkonserwuje się za pomocą metanolu lub chloroformu.

Próbki pobiera się do naczyń z silanizowanego szkła lub ze szkła borokrzemianowego zamykanego z teflonowym uszczelnieniem

Nie wolno pobierać w tym celu próbek do naczyń z tworzyw sztucznych

Szkło borokrzemianowe (Pyrex, Simax, Termisil…)

Próbnik do pobierania dioksyn i PCBs z wód i scieków

Membrana z polietylenu wypełniona trioleiną

Próbniki SPMD przygotowane do ekspozycji w ścieku

Próbnik SPMDzanurzony w ścieku Urządzenie do

pobierania próbek gleby

Aparat Soxhlet’a

Surowa membrana SPMD przed ekspozycjąw wodziew próbniku pasywnym

SPE SPE

SPE w układzie on-line

Pompa 2

Ściek

Kolumna analityczna

Kolumna SPE

DADMS

Detektory

PRÓBKA

ETAP 1- izolacja i wzbogacanie analitów z próbek wody

ZESTAWY SPME (SUPELCO)

SCHEMAT ZESTAWU DO MIKROEKSTRAKCJi KROPLĄ

ROZPUSZCZALNIKA - SDE ZESTAW SDE Ektrskacja do pojedynczej kropli - SDE

Mikroekstrakcja MEPS

MWAE

ASE®200 Accelerated Solvent Extractor

ASE Accelerated Solvent Extraction

ASE 300 Celka ekstrakcyjna ASE

Schemat ekstraktora nadkrytycznego SFE

Hollow Fibre separation

Wyparka obrotowa Büchi

Wyparka obrotowa Büchi

Odparowywacz Kuderna-Danisha

Politechnika Krakowska Wydział In żynierii i Technologii Chemicznej

Metody chromatografii w bioanalityce

Część 1

Adam Grochowalski

www.dioksyny.pl

• Panel „Dydaktyka”• Podpanel „Chromatografia”

Zygfryd Witkiewicz– Podstawy chromatografii

Z.Witkiewicz J. Hetper Chromatografia gazowa

Wolfgang Rödel, Gerhard Wölm– Chromatografia gazowa

Piotr Suder, Jerzy Silberring Spektometria mas Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego

Metody analizy instrumentalnej

Metody spektroskopowe� Spektroskopia molekularna� Spektromertia atomowa� Spektrometria mas� Spektroskopia rentgenowska

Metody analizy instrumentalnej

Metody elektroanalityczne� Voltamperometria� Polarografia� Konduktometria � Potencjometria� (Amperometria)� (Kulometria)� (Elektrograwimetria)

Metody analizy instrumentalnej

Metody chromatograficzne� Chromatografia gazowa� Chromatografia cieczowa � Chromatografia fluidalna� Chromatografia elektromigracyjna� Chromatografia planarna� Ultraszybka chromatografia gazowa

Pojęcie:dokładności, precyzji, czułości,

granicy wykrywalności, granicy oznaczalności

w metodach chromatografii.

Definicja chromatografiiChromatografia to technika rozdzielania, która opiera się na wielokrotnym, powtarzającym siępodziale rozdzielanych składników pomiędzy dwie nie mieszające się fazy:

Fazę stacjonarną i fazę ruchomą.

Faza stacjonarna jest nieruchomaFaza ruchoma przepływa w jednym kierunku

Warunkiem rozdzielenia substancji jest ich różnica w oddziaływaniu fizycznym z fazą stacjonarną

Chromatografia nie jest tylko metodą analityczną, ale coraz częściej wykorzystywaną techniką do otrzymywania substancji czystych w skali laboratoryjnej i przemysłowej

chromatografia preparatywna

- Przemysł farmaceutyczny- Przemysł kosmetyczny- Przemysł spożywczy

Rodzaje chromatografiiCieczowa - LC

KolumnowaPlanarna (cienkowarstwowa, bibułowa)Wysokosprawna cieczowa HPLCJonowymiennaŻelowa

Gazowa – GC Fluidalna - SFCElektromigracja – EM

Chromatografia gazowa

Rozdzielanie mieszaniny w układzie gaz – ciecz- chromatografia podziałowa

Rozdzielanie mieszaniny w układzie gaz – ciało stałe- chromatografia adsorpcyjna

Mechanizm rozdzielenia technik ą chromatografii

Teoria rozdzielania chromatograficznego

k – współczynnik retencji cs – stężenie składnika w fazie stacjonarnej, cm- stężenie składnika w fazie ruchomej (mobile phase)Vs, Vm – objętości fazy stacjonarnej i ruchomej

K – stała podziału dla układu faz w danej temperaturze

Współczynnik rozdzielania (α)α= K2 / K1 K1 = współczynnik retencji pierwszego pikuK2 = współczynnik retencji drugiego piku

� – współczynnik rozdzielenia substancji o czasach retencji tR1 i tR2 gdzie tR2 > tR1

α musi być > 1

Dla uzyskania sprawnego rozdzielenia tR >> tM

to znaczy, że k > 1

to znaczy, że cS i VS> 0

Czas retencji tRczas od momentu rozpoczęcia oddziaływań substancji z fazą stacjonarną(wprowadzenie na kolumnę)aż do uzyskania największego rozkładu stężenia substancji na wyjściu z kolumny chromatograficznej (maksimum piku chromatograficznego)

Substancja nie oddziaływująca z fazą stacjonarnąwędruje razem z fazą ruchomą i opuszcza kolumnę po

zerowym czasie retencjitM

Optymalizacja natężenia przepływufazy ruchomej u w celu uzyskania maksymalnej sprawności układu N wyrażonej jako funkcja wysokość półki teoretycznej Wrpt

Gdzie: A – stała charakteryzująca wypełnienie kolumny (dyfuzja wirowa)B – stała charakteryzująca dyfuzję cząsteczkową w kolumnieC – stała charakteryzująca opory przeniesienia masy na granicy faz

Równanie van Deemter’a

Wrpt min

Rozkład gaussowski stężeń substancji na wyjściu z kolumny – definicja piku chromatograficznego

2,36 σ

Sprawność rozdzielenia określana jest liczbąN półek teoretycznych kolumny

� – odchylenie standardowe dla piku w jednostkach czasuidealnie gaussowski, symetryczny pik:

symetryczny rozkład stężeń substancji

w – szerokość piku na określonej wysokości związana jest zależnością z wariancją σ2

Sprawność rozdzielenia wyrażoną liczbą półek teoretycznych Nmożna więc wyrazić wzorem:

wpodst– szerokość piku u podstawyw0,5h– szerokość piku w połowie wysokości

Sprawność rozdzielenia może być obliczona praktycznie:

Schemat rozdzielania mieszaniny na kolumnie chromatograficznej

Wykres funkcji odpowiedzi detektora w czasie Dyfuzyjne poszerzanie pasma chromatograficznego

Dyfuzja wirowa w kolumnie wypełnionej (kolumna pakowana)

RS– rozdzielczość pików dla dwóch substancji tR1 i tR2

tR2 > tR1

N2 – Liczba półek dla substancji o czasie retencji tR2

Rozdzielczość pików – warunek identyfikacji substancji

Równanie Purnell’a

Rozdzielczość pików

tr1 = czas retencji pierwszego pikutr2 = czas retencji drugiego pikuWb1 = szerokość piku przy podstawie (w jednostkach czasu) – pik pierwszyWb2 = szerokość piku przy podstawie (w jednostkach czasu) – pik drugi