Peptydy
35
1 Peptydy ksander Kołodziejczyk Gdańsk 2011
description
Aleksander Kołodziejczyk. Peptydy. Gdańsk 2011. Peptydy są to związki powstające w reakcji acylowania aminokwasów aminokwasami. Wiązanie peptydowe jest to wiązanie amidowe pomiędzy aminokwasami. - PowerPoint PPT Presentation
Transcript of Peptydy
1
Peptydy
Aleksander Kołodziejczyk
Gdańsk 2011
2
Peptydy są to związki powstające w reakcji acylowania aminokwasów aminokwasami
CH COOH
R
H2N
AA1
C
NH2 CH COOH
R'AA2
C
+
- HOH
wiązanie peptydowe
CH CO NH CH COOH
R R'
H2N
AA1 AA2
C C
aminokwasN-terminalny
aminokwasC-terminalny
Wiązanie peptydowe jest to wiązanie amidowe pomiędzy aminokwasami
3
W zależności od ułożenia grup funkcyjnych tworzących wiązanie peptydowe mogą być wiązania -peptydowe i inne. Wiązania -peptydowe powstają pomiędzy grupą -karboksylową i -aminową.
CH3
CH CO NH CH COOH
CH2 CO NH CH2 CO NH CH CO NH (CH2)3 CH COOHNH2
NH2
C C
C
CCC
C
wiązanie -peptydowe
wiązanie -karboksypeptydowe wiązanie -aminopeptydowe
Nomenklatura peptydówCH(CH3)2 CH3
CH2SH
CO-NH(CH2)4CHCO-NHCHCO-NHCH2COOH
NH2 CH2OH
H2NCHCO-NHCHCO-NHCHCO-NHCH2CO-NHCHCOOH
(CH2)2
Val Ala Cys GlyGlu Lys Ser Gly
waliloalanylocysteinyloglicylo--glutamylo-N-lizyloseryloglicyna
Val-Ala-Cys-Gly--Glu-N-Lys-Ser-Gly1 2 3 4 5 6 7 8
VACG--E--KSG
N-terminalny C-terminalny
4
Val-Ala-Gly H-Val-Ala-Gly-OH
cyklopeptydy Pro Phe
Phe
Phe
Phe
Val Pro
ProPro Alaantanamid
cyklo(-Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-Phe-Pro-)
Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-Phe-Pro
CH(CH3)2
CH CO NH CH CO
CH3
HN
H
NH CH2 CO OH
5
Nagrody Nobla za osiągnięcia związane z peptydami
1902 Emil Fischer badanie cukrów, synteza pierwszych peptydów 1923 Frederick Banting odkrycie insuliny John Maclead1952 Archer Martin opracowanie chromatografii peptydów, Richard Synge ustalenie budowy gramicydyny
1958 Frederick Sanger ustalenie przestrzennej budowy insuliny Dorothy Hodgkin 1972 Christian Anfinsen ustalenie budowy i wyjaśnienie działania Stanford Moor rybonuleazy, William Stein konstruktorzy analizatora aminokwasów
1955 Vincent du Vigneaud otrzymanie oksytocyny i wazopresyny, pierwszych biologicznie czynnych peptydów
1977 Roger Guillemin badanie hormonów mózgowych Andrew Schally Rosalyn Yalow1980 Walter Gibert badanie struktury białek i peptydów Frederick Sanger
1984 Robert Merrifield synteza peptydów na fazie stałej
6
Peptydy wytwarzane przemysłowo
oksytocyna wazo-presyna
insulina ludzka
somatotropinaACTH
angiotensyny enkefaliny gastryna antybiotykipeptydowe
aspartam
kalcytonina glukagonsomato-liberyna tyreoliberyna
Źródła peptydów
materiał biologiczny synteza inżynieria genetyczna
klasyczna w roztworze SPPSenzymatyczna
7
Chemiczna synteza peptydów
NH2 CH
R
COOH NH2 CH
R'
COOH NH2 CHR
CO NH CH COOH
R'
+
Ala-GlyAla + Gly + Gly-Ala
+ Ala-Gly-Gly + Ala-Gly-Ala
+ .......
+ Gly-Ala-Ala + Gly-Ala-Gly
+ Ala-Ala-Gly + Ala-Ala-Gly
+ Ala-Ala + Gly-Gly
8
X-Ala
NH2 CH2 COOH NH2 CH2 CO Y
Gly
Gly-Y
X-Ala + Gly-Y X-Ala-Gly-Y
NH2 CH
CH3
COOH
Ala CH3
NH CH COOHX
X-Ala + Gly-Y X-Ala-Gly-Yaktywacja
aminokwas acylujący
aminokwas acylowany
peptydchroniny
X : osłona grupy aminowej
(ochrona funkcji aminowej)
Y : osłona grupy karboksylowej
9
Dobra osłona peptydowa powinna:
być łatwa do wprowadzania;być trwała w takcie syntezy peptydu i jego oczyszczaniu;zapewniać dobrą rozpuszczalność chronionego AA;ułatwiać reakcję tworzenia wiązania peptydowego;utrudniać reakcje uboczne, w tym racemizację;zapewniać możliwość selektywnego lub/i równoczesnego usuwaniawszystkich osłon;być łatwo usuwalna (w 100%).
Syntetyczna rybonukleaza A, w której usunięto 83% osłonmiała jedynie 70% aktywności biologicznej białka natywnego.
10
11
Osłony grupy aminowej
CH2O
O
C benzyloksykarbonyl (karbobenzoksy)Z (Cbo lub Cbz)
CH3
CH3
CH3
O
O
C C t-butyloksykarbonylBoc osłonyuretanowe
CH2 OOC
9-fluorenylometoksy-karbonyl
Fmoc
CH3 SO2
tosyl
Tos
O
O
ftalil
Pht HCO formyl
HCO (For)
uretan – pochodna kwasu węglowego:
O
R-O-C-NH-AA
12
Osłony grupy karboksylowej (głównie estry):
-O-CH3metyl OMe -O-CH2CH3
etyl OEt
-O-C(CH3)3 t-butyl O-t-Bu O CH2
-O-CH2Ph benzyl OBzl
O CH2 NO2
p-nitrobenzyl
ONBzl
Osłony grupy hydroksylowej:
benzyl, t-butyl; acetyl (Ac-); trimetylosilyl – (CH3)3Si-
Osłony grupy tiolowej:
benzyl; acetamidometyl (AcNH-CH2-); t-butyl
Osłony grupy imidazolowej:
benzyl; t-butoksyl; formyl; benzyloksymetyl (Bom- – Bzl-O-CH2); - tosyl; Fmoc
Osłony grupy guanidynowej:
nitro (-NO2); tosyl, p-metoksybenzenosulfonyl (Mbs-); benzyloksykarbonyl
13
METODY TWORZENIA WIĄZANIA PEPTYDOWEGO
Metoda kardodiimidowa (DCC)
Ac-Phe Leu-OMe+DCC
Ac-Phe-Leu-OMe (54%)
Ac-D-Phe-Leu-OMe (7%)+
Ac-Phe-DCU (17%)+ DCU+
N C N dicykloheksylokarbodiimidDCC
DCMdicykloheksylomocznik
HOH
N
O
O
CHAc-NH
CH2
Ph
C NH
Ac-Phe-DCM
N-acetylofenyloalanylodicykloheksylomocznik
C
N-acylomocznik
N
O
H H
C NN C NDCC
14
O-acyloizomocznik
O-(N-acetylofenyloalanylo)dicykloheksyloizomocznik
N C N
+DCCOH
O
CHAc-NH
CH2
PhAc-Phe
C
..:
N N
O
CH
CH2
Ph
NHAc
O
CH
C
O-Ac-Phe-izo-DCU
Produkt uboczny
N
O
O
CHAc-NH
CH2
Ph
C NH
Ac-Phe-DCM
N-acetylofenyloalanylodicykloheksylomocznik
C
N-acylomocznik
15
E =YDL
YLL + YDL
100
Ac-Phe Leu-OMe+DCC Ac-Phe-Leu-OMe (54%)
Ac-D-Phe-Leu-OMe (7%)
+
DCU+Ac-Phe-DCU (17%)+
Wydajność reakcji = wydajność
Ac-Phe-Leu-OMe: 54%Stopień racemizacji E = 11%
Reakcja z udziałem soli estru
Ac-PheDCC, NEt3 Ac-Phe-Leu-OMeHCl.Leu-OMe+ (61%)
+ Ac-D-Phe-Leu-OMe (23%)
+ Ac-Phe-DCU (8%)
E = 27%
Metoda DCC z dodatkami obniżającymi racemizację
Ac-PheDCC, NEt3
HOBtAc-Phe-Leu-OMeHCl.Leu-OMe+ (88%)
+ Ac-D-Phe-Leu-OMe (1,4%)
+ Ac-Phe-DCU (1,4%)
E = 1,6%
dodatki
N
O
O
OH
HONSuN
N
OH
N
HOBt
16
Metoda mieszanych bezwodników
chloromrówczan s-butylu mieszany bezwodnik
Z-AlaNEt3
Z-Ala-O-CO-O-s-Bu+
(65%)
Phe-ONaZ-Ala-Phe-ONa
E < 0,1%
ClCO-O-s-Bu-15oC
1. ClCO-O-s-Bu, NEt3
Z-Ala2. Phe-OMe
Z-Ala-Phe-OMe (95%)
Metoda aktywnych estrów
Aktywne estry: p-nitrofenylowe; pentafluorofenylowe; -OBt; -ONSu
Boc-Val-OR + (92%)Boc-Val-Tyr-OBzlTyr-OBzl(akt)
Metoda EEDQ
N OEt
C=O
OEtEEDQ
N-etoksykarbonylo-2-etoksy-1,2-dihydrochinolina
CHO-Phe +(88%)
CHO-Phe-Phe-ONBzlTosOH.Phe-ONBzlEEDQ
NEt3
17
Metoda BOP
+ Z-Gly-Phe-Val-OMeBOP
HOBtZ-Gly-Phe Val-OMe (92%),E = 1,2%
NN
NOP(CH3)2N
(CH3)2N(CH3)2N
PF6-
+
BOPheksafluorofosforantris(dimetyloamino)-1-benzotriazyloksy-fosfoniowy
tris(dimetylo)fosforotriamid jest kancerogenny.
heksafluorofosforan tris(pirolidyno)--1-benzotriazoliloksyfosfoniowy
BrP
N
N
N
PF6
-
+ PyBroP
heksafluorofosforan bromo-tris(pirolidyno)fosfoniowy
NN
NO(CH3)2N
(CH3)2NBF4
-
+
TBTUC
tetrafluoroboran [2-(1-benzotriazolo)]--1,1,3,3-tetrametylouroniowy
NN
NOP
N
N
NPF6
-
+
PyBOP
Niekancerogenne odczynniki kondensuące.
18
Metoda azydkowa
+
(55%)
Boc-Val-NHNH2 HNO2 Boc-Val-N3 Boc-Val-Ala-O-t-Bu
Metoda azydkowa ma obecnie jedynie historyczne znaczenie. Dawniej uważana za „bezracemizacyjną” była stosowana do łączenia fragmentów peptydów. Inne metody łączenia fragmentów dawały produkty mocno zracemizowane. W metodzie azydkowej stopień racemizacji osiąga wielkość kilku procent.
Racemizacji ulega aminokwas acylującyX-AA + AA'-Y
aktywacjaX-AA-AA'-Y + X-D-AA-AA'Y
Stopień racemizacji zależy zarówno od metody stosowanej do utworzenia wiązania peptydowego, jak i właściwości komponentu acylującego; istotną rolę pełni rodzaj osłony grupy aminowej. Osłony uretanowe (Z, Boc, Fmoc) są bezracemizacyjne, tzn. podczas reakcji tworzenia wiązania peptydowego ulegają racemizacji w stopniu poniżej 0,1%.
19
Zależność stopnia racemizacji E od konfiguracji reagentów
Reakcja E
Z-Leu + Leu-OMe <0,1
Ac-Leu + Leu-OMe 40
Ac-D-Leu + Leu-OMe 13
Ac-Leu + Phe-OMe 35
Ac-D-Leu + Phe-OMe 21
CHO-Leu + Leu-OMe 5
CHO-D-Leu + Leu-OMe 4
Z-Gly-Leu + Leu-OMe 34
Z-Gly-D-Leu + Leu-OMe 70
X-AA + AA'-YDCC
X-AA-AA'-Y + X-D-AA-AA'YRT
EL+L =YDL
YLL + YDL
100 ED+L =YLL
YDL + YLL
100
AA zawierające osłony acylowe (Ac, Bz, CHO, Pht), a także AA acylowane innym aminokwasem (peptydem) racemizują znacznie podczas acylowania (aktywacji). Stopień racemizacji zależy również od wzajemnej konfiguracji aminokwasów tworzących wiązanie peptydowe.
20
Stopień racemizacji jest zależny nie tylko od właściwości reagujących komponentów aminokwasowych i rodzaju aktywacji, ale również od warunków reakcji, czylirozpuszczalnika, temperatury i czasu reakcji.
Synteza peptydów i białek w komórkach jest w 100% bezracemizacyjna.
21
Synteza na nośniku stałym - SPPS
ClCH2 P P = polistyren sieciowanydiwinylobenzenem
2. B- (neutralizacja)
XNH-CHR'-COO-+
XNH-CHR''-COOH DCC + dodatki
XNH-CHR'-COO-N N = nośnik
H2N-CHR'-COO-N
NXNH-CHR''-CO-NH-CHR'-COO-
1. - X (deprotekcja)
Synteza w roztworze nazywana jest syntezą klasyczną. W 1963 r. B. Merrifield zaproponował nową metodę syntezy peptydów, została ona nazwana syntezą na fazie stałej, SPPS - solid phase peptide synthesis.
Synteza peptydów na fazie stałej
22
Polimer do SPPS stosowany jest zwykle w postaci kuleczek o średnicy ziarna 20-100m
Ziarna są porowate, zawierająwiele kanalików. W tych kanalikach rosną łańcuchy syntezowanych peptydów. W ziarnie o średnicy 50 m zawierającym 0,3 mmola peptydu na 1 g żywicy znajduje się 1012 łańcuchów peptydowych.
Syntezę peptydów sposobem SPPS prowadzi się obsadzając ziarna żywicy pierwszym aminokwasem zwykle w granicach 0,2-0,7 mmola/g żywicy.
Kanaliki muszą mieć odpowiednią średnicę, żeby pomieścić łańcuchy rosnącego peptydu. Przed rozpoczęciem syntezy polimer jest traktowany rozpuszczalnikiem, w którym pęcznieje powiększając rozmiary porów.
Żywica Merrifielda (kopolimer styreno-diwinylobenzenowy) pęcznieje pod wpływem dichlorometanu zwiększając dziewięcio-krotnie swoją objętość.
23
Zwykle poszczególne operacje na żywicy przeprowadza się w różnych rozpuszczalnikach. Zmianę rozpuszczalnika należy przeprowadzać stopniowo.
Synteza peptydu na fazie stałej to powtarzające się cyklicznie operacje jednostkowe.
SPPS zostałazautomatyzowana
przemy- wanie
depro-tekcja
przemy- wanie
neutra-lizacja
przemy- wanie
acylo-wanie
test
acylo-wania
24
Operacje jednostkowe liczba czas [min]
A. Przemywanie – przygotowanie do deprotekcji 1. EtOH/AcOH, 1:1 1 1 2. AcOH 3 1
B. Deprotekcja 3. Wytrząsanie z 1M HCl/AcOH 1 5 4. Wytrząsanie z 1M HCl/AcOH 1 15
A. Przemywanie – przygotowanie do neutralizacji 5. AcOH 3 1 6. AcOH/EtOH, 1:1 1 1 7. EtOH 3 1 8. EtOH/DCM, 1:1 1 1 9. DCM 3 1
D. Neutralizacja 10. NEt3/DCM 1 2 11. NEt3/DCM 1 5
25
E. Przemywanie – przygotowanie do acylowania 12. DCM 1 1
F. Acylowanie (ang. coupling) 13. Boc-AA (3 eq), DCC. DCM 1 120 14. Przemywanie DCM 1 3 15. Boc-AA (3 eq), DCC. DCM 1 60G. Przemywanie – przygotowanie do testu Kaisera 16. DCM 3 1 17. DCM/EtOH, 1:1 1 1 18. EtOH 3 1
H. Test Kaisera 19. Sprawdzenie stopnia acylowania 1 7
Procedura zależy od stosowanych osłon, odczynników sprzęgających, a także od właściwości fizykochemicznych stosowanego nośnika. Nośnik może przypominać peptyd, np. żywica poliamidowa Scheparda
W syntezie peptydów na żywicy Scheparda stosuje się osłony Fmoc. Usuwa się je w środowisku zasadowym. Po zakończeniu syntezy peptyd zdejmuje się z nośnika.
26
odszczepieniez polimeru
deprotekcja
peptydylo-polimer
peptydchroniony
peptydwolny
(NH-CHR-CO)n-NH-CHRn+2-COOHXNH-CHR1-CO-
(NH-CHR-CO)n-NH-CHRn+2-COOHH2N-CHR1-CO-
N(NH-CHR-CO)n- NH-CHRn+2-COO-XNH-CHR1-CO-
Początkowo największym problemem SPPS była niska czystość peptydu,spowodowana niższą niż 100% wydajnością poszczególnych etapów reakcji, nie tylko acylowania, ale i deprotekcji i neutralizacji.
Wydajność poszczególnych etapów reakcji udało się zwiększyć prawie do 100% poprzez stosowanie nadmiaru reagentów, a w razie potrzeby powtarzania etapu. Nadmiar odczynników w metodzie SPPS nie stanowi problemu, ponieważ łatwo je usunąć poprzez odsączenie i przemycie żywicy. Zwykle cena syntezowanego peptydu jest tak wysoka, że koszty nadmiarowych odczynników nie są brane pod uwagę.
27
Ala Leu Val Tyr Phe
Ala Leu Val PheAla Leu Tyr Phe
Tyr PheAla Valtetrapeptydy
Leu Val Tyr Phe
Ala Leu Phe
ValAla Phe
Ala Tyr PheVal Tyr Phe + .....
tripeptydy
Peptydy błędne
28
Frakcja
Średnia wydajność poszczególnych etapów syntezy [%]
90 98 99 99,5 99,9
Udział frakcji po ostatnim etapie syntezy oksytocyny (9-peptydu)
9-peptyd 43 85 92 96 99
8-peptydy 38 14 8 4 1
7-peptydy 15 1 0,3
Udział frakcji po ostatnim etapie syntezy rybonukleazy (124-peptydu)
124-peptyd 8 29 54 88
123-peptydy 21 36 33 11
122-peptydy 26 22 10 1
Skład produktu końcowego w syntezie peptydów metoda SPPS
29
Syntezy enzymatyczne
AA + AA' AA-AA' + HOHproteaza
X-AA-OR + H-Eaminokwasacylujący
enzym
kompleks aktywny substrat-enzym
X-AA-AA'-Y
AA'-Y aminokwasacylowany
X-AA-OH
HOH
produktaminolizy
produkthydrolizy
ROH
[X-AA-E]
30
Z-Phe-OCH2CF3+ LeuNH2
CT-O-PEG-OMe 20h, 20oC, 0,5% HOHt-PenOH/benzen 1:1
Z-Phe-LeuNH2 Z-PheOH
96% 4%
CT: -chymotrypsyna
HO-PEG-OMe: monometylowy eter poli(glikolu etylenowego)
CT-O-PEG-OMe: CT kowalencyjnie związana z HO-PEG-OMe
t-PenOH: t-pentanol
31
Wybrane przykłady zastosowania CT-O-PEG-OMe do syntezy peptydów
Składnik acylujący acylowany Czas reakcji [h]
Wydajnośćpeptydu
Stopień hy-drolizy %
Z-PheOEt LeuNH2 36 40 8
Z-PheOEt LeuNH2 96 78 22
Z-Phe-OCH2CF3 LeuNH2 36 90 10
Z-Phe-OCH2CF3 Leu-OMe 96 8 15
Z-Phe-OCH2CF3 D-Leu-OMe 48 63 14
Boc-D-Phe-Tyr-Cam LeuNH2 96 15 4
Boc-Tyr-Gly-Gly-Phe-NHCH3
LeuNH2 48 70 17
32
Synteza LH-RH hormonu uwalniającego hormon luteinizujący
luteinizing hormon releasin hormon
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2
dekapeptyd
pEHWSYGLRPGNH2
pEHWSY-OMe + GLRPGNH2
CT, 2mpH + 8,540% DMF
pEHWSYGLRPGNH2 95%LH-RH
0,10M 0,12M
33
OH H OMe
OMe NH2
NH2
OMe OEt
NH2
NH2
OH
OMe
pE H W S Y
DCC
T
P
CT CPD-Y
CPD-Y
BF3/MeOH
T: trypsyna
CT: chymotrypsyna
P: papaina
CPD-Y: karbopeptydaza Y
CLP: klostrypaina
H
zz
OHz H OEt
OEtz OEt
OEtzOBzl
NH2
NH2
NH2
OBzl
G L R P G
DCC
CT
CLP
CPD-Y
PPSE
PPSE: specyficzna endoproteaza postprolinowa
34
Synteza aspartanu – słodkiego peptydu
Z-Asp + 2 Phe-OMetermolizyna
pH = 0, 40oC, 12h
Z-Asp-Phe-OMe.Phe-OMe
HCOONH4, Pd/C
MeOH
Asp-Phe-OMe
- Phe-OMe
aspartan
Polisynteza
Ze względu na duże zapotrzebowanie na peptydy skonstruowano syntezatory peptydów umożliwiające równoczesną syntezę kilkudzie-sięciu, a nawet kilkuset różnych peptydów. Takie operacje prowadzi się np. na prętach pokrytych glikolem polietylenowym lub innym polimerem zdolnym do przyłączenia C-końcowego aminokwasu. Pręty osadzone są w gniazdach bloku, a każde gniazdo zaopatrzone jest w system doprowadzający roztwory odczynników.
Wypróbowano też syntezę peptydów w pojemniczkach podobnych do woreczków z herbatą ekspresową; takie woreczki można było w zależności od potrzeb umieszczać w różnych reaktorach.
35
Synteza kombinatoryczna – biblioteki peptydów
Z-AA1-20 20 różnych AA-Y+aktywacja
Z-AA1-20-AA-Y20 różnych dipeptydów
Z-AA1-20 + AA1-20-AA-Y aktywacjaZ-AA1-20-AA1-20-AA-Y
400 różnych tripeptydówZ-AA1-20 +
aktywacja
AA1-20-AA1-20-AA-Y
Z-AA1-20-AA1-20-AA1-20-AA-Y
8000 różnych tetrapeptydów
Tym sposobem wyselekcjonowano heksapeptyd: Ac-RRWWCRNH2
o bardzo wysokiej aktywności przeciwbakteryjnej z pośród mieszaniny zawierającej
34 mln peptydów
