ΠΡΟΤΥΠΑΠΡΟΤΥΠΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑΣΥΣΤΗΜΑΤΑΣΥΣΤΗΜΑΤΑ

ΓΕΝΕΤΙΚΗΓΕΝΕΤΙΚΗ & & ΜΟΡΙΑΚΗΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑΒΙΟΛΟΓΙΑΜΥΚΗΤΩΝΜΥΚΗΤΩΝ

ΠλεονεκτήματαΠλεονεκτήματα

ΤαχείαΤαχεία αύξησηαύξηση μεμε μορφήμορφή αποικιώναποικιών (2(2--33hh χρόνοςχρόνος διπλασιασμούδιπλασιασμού) ) ΜαζικήΜαζική παραγωγήπαραγωγή.. ΑπλάΑπλά θρεπτικάθρεπτικά ΟΟικονομικάικονομικά συστήματασυστήματα

MoMoνοκύτταροινοκύτταροι οργανισμοίοργανισμοί ((ζύμεςζύμες))--μονοπυρηνικάμονοπυρηνικά σπόριασπόρια ((νηματοειδείςνηματοειδείς))

ΚατάλληλοιΚατάλληλοι γιαγια γενετικήγενετική ανάλυσηανάλυση, , καθώςκαθώς είναιείναι απλοειδείςαπλοειδείς οργανισμοίοργανισμοίαλλάαλλά μπορούνμπορούν νανα υπάρξουνυπάρξουν καικαι σεσε διπλοειδήδιπλοειδή κατάστασηκατάσταση –– ΓενετικοίΓενετικοί χάρτεςχάρτες

ΜικρόΜικρό γονιδίωμαγονιδίωμα SS. . cerevisiaecerevisiae 1.4 1.4 xx 101077 bpbp(1/100(1/100--1/200 1/200 ανθρώπινουανθρώπινου)) AA..nidulansnidulans 2.7 2.7 xx 101077 bpbp

ΙκανότηταΙκανότητα μετασχηματισμούμετασχηματισμού –– ««αντιστροφήαντιστροφή»» γενετικήγενετικήΠοικιλίαΠοικιλία εξωγονιδιωματικώνεξωγονιδιωματικών φορέωνφορέων, , συστημάτωνσυστημάτων στοχευμένηςστοχευμένης

ενσωμάτωσηςενσωμάτωσης –– αντικατάστασηςαντικατάστασης γονιδίωνγονιδίων, , knockknock--outsouts, , κλπκλπ..

ΚυτταρικοίΚυτταρικοί ήή μοριακοίμοριακοί μηχανισμοίμηχανισμοί όμοιοιόμοιοι μεμε αυτούςαυτούς τωντων αντίστοιχωναντίστοιχωνανώτερωνανώτερων ευκαρυωτικώνευκαρυωτικών (>30% (>30% γονιδίωνγονιδίων ομόλογαομόλογα μεμε ανθρώπιναανθρώπινα γονίδιαγονίδια))

ΣυστήματαΣυστήματα έκφρασηςέκφρασης γονιδίωνγονιδίων απόαπό ανώτερουςανώτερους ευκαρυωτικούςευκαρυωτικούς οργανισμούςοργανισμούς

ΟΙΟΙ ΠΡΩΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣΠΡΩΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ……....

ΖΖύμεςύμες

Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae

SchizosacharomycesSchizosacharomyces pombepombe

ΝΝηματοειδείςηματοειδείς μύκητεςμύκητες

Aspergillus nidulansAspergillus nidulans

Neurospora crassaNeurospora crassa

ΛΙΓΑΛΙΓΑ ΙΣΤΟΡΙΚΑΙΣΤΟΡΙΚΑ…….... ΜερικάΜερικά απόαπό τατα καλύτερακαλύτερα στιγμιότυπαστιγμιότυπα

ΠρώτοΠρώτο μισόμισό τουτου αιώνααιώνα, , S. cerevisiae, A. nidulans & N. crassa, S. cerevisiae, A. nidulans & N. crassa, θεμελιώνονταιθεμελιώνονται ωςωςεξαιρετικάεξαιρετικά συστήματασυστήματα γενετικήςγενετικής ανάλυσηςανάλυσης –– ΦυλετικόςΦυλετικός κύκλοςκύκλος, , διασταυρώσειςδιασταυρώσεις, ,

ανάλυσηανάλυση ασκώνασκών, , γενετικοίγενετικοί χάρτεςχάρτες, , κλπκλπ

19411941,, Beadle & Tatum, Beadle & Tatum, μεταλλαγέςμεταλλαγές αυξοτροφίαςαυξοτροφίας στηστη N. crassa, N. crassa, θεμελίωσηθεμελίωση τουτουδόγματοςδόγματος έναένα γονίδιογονίδιο--έναένα ένζυμοένζυμο ((πρωτεΐνηπρωτεΐνη). ). ΗΗ αρχήαρχή τηςτης σύγκλισηςσύγκλισης γενετικήςγενετικής--

βιοχημείαςβιοχημείας..

1949, 1949, LindegrenLindegren, , ΣυζευκτικοίΣυζευκτικοί τύποιτύποι στοστο S. cerevisiaeS. cerevisiae

1952, 1952, ΑνακάλυψηΑνακάλυψη τουτου παραφυλετικούπαραφυλετικού κύκλουκύκλου στονστον A. nidulans A. nidulans απόαπό PontecorvoPontecorvo & & RoperRoper

19601960--19701970’’s Es Eδραίωσηδραίωση τουτου γενετικούγενετικού κώδικακώδικα καικαι αναλόγωναναλόγων ρυθμιστικώνρυθμιστικώνκυκλωμάτωνκυκλωμάτων (Scazzocchio, Arst,(Scazzocchio, Arst, HershkowitzHershkowitz,, GuarenteGuarente) ) αλλάαλλά καικαι τηςτης έλλειψηςέλλειψης

οπερονίωνοπερονίων σταστα ευκαρυωτικάευκαρυωτικά

19701970--19801980’’s, s, ΕπίτευξηΕπίτευξη γενετικούγενετικού μετασχηματισμούμετασχηματισμού στηστη ζύμηζύμη (197(19788) ) καικαι σεσε νηματοειδείςνηματοειδείς(1984), (1984), ΑπαρχήΑπαρχή τηςτης ΜοριακήςΜοριακής ΓενετικήςΓενετικής σεσε ευκαρυωτικάευκαρυωτικά. . ΜεταλλαγέςΜεταλλαγές ρύθμισηςρύθμισης τουτουκυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου cdccdc σεσε S. cerevisiaeS. cerevisiae & & S. pombe (Nurse, S. pombe (Nurse, NasmythNasmyth , Hartwell), Hartwell)

ΜεταλλαγέςΜεταλλαγές ελατωματικήςελατωματικής έκκρισηςέκκρισης sec (sec (SheckmanSheckman), ), ΜεταλλαγέςΜεταλλαγές μεταφραστικήςμεταφραστικής & & μεταγραφικήςμεταγραφικής ρύθμισηςρύθμισης ((HinnebushHinnebush, , StruhlStruhl, , Fink, Cooper) Fink, Cooper) στονστον S. cerevisiaeS. cerevisiae . .

ΜεταλλαγέςΜεταλλαγές κιρκαδικήςκιρκαδικής ρύθμισηςρύθμισης καικαι επιγενετικώνεπιγενετικών φαινομενένωνφαινομενένων RIP, MIP, quelling, RIP, MIP, quelling, ((SelkerSelker, , FaugeronFaugeron, , RosignolRosignol), ), μεταλλαγέςμεταλλαγές ρύθμισηςρύθμισης κυτταροσκελετούκυτταροσκελετού ((Morris, Morris, OsmaniOsmani) ) σεσε Neurospora, Aspergillus, Neurospora, Aspergillus, PodosporaPodospora, , AscobolusAscobolus

19901990’’s s ΓονιδίωμαΓονιδίωμα Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae (GoffeauGoffeau, 1996), 1996). . TwoTwo--hybrisdhybrisd system system (Fields & Song 1990). (Fields & Song 1990). ΜεταλλαγέςΜεταλλαγές ρύθμισηςρύθμισης τηςτης μεταγραφήςμεταγραφής μέσωμέσω τροποποίησηςτροποποίησης τηςτηςχρωματίνηςχρωματίνης στονστον S. cerevisiaeS. cerevisiae

20002000’’s s ΠρώτηΠρώτη πλήρηςπλήρης συλλογήσυλλογή απενεργοποιημένωναπενεργοποιημένων γονιδίωνγονιδίων ((knockknock--outsouts) ) στονστον S. S. cerevisiaecerevisiae. . ΓονιδιώματαΓονιδιώματα Aspergillus nidulans, Aspergillus nidulans, SchizosaccharomnycesSchizosaccharomnyces pombe, pombe, Neurospora crassaNeurospora crassa. . ΓονιδιώματαΓονιδιώματα συγγενώνσυγγενών παθογόνωνπαθογόνων μυκήτωνμυκήτων..

Zea maysZea mays(corn)(corn)

H. H. sapienssapiens((humanhuman))

C. elegansC. elegans

D. melanogasterD. melanogaster((fruit flyfruit fly))

A. nidulansA. nidulans

S. cerevisiaeS. cerevisiae((yeastyeast))

E. coliE. coli

1010

2323

1.05 x 101.05 x 10 8814000 14000 γονίδιαγονίδια

44

88

1616

11

2.72.7x 10x 107 7 bpbp14000 14000 γονίδιαγονίδια

1.1.44xx 1010 7 7 bpbp

44xx 1010 6 6 bpbp

101066 101077 101088 101099 10101010DNADNA content per cellcontent per cell (bp)(bp)

OrganismOrganism

ChromosomesChromosomesPer haploidPer haploid

cellcell

ΤΟΤΟ ΠΡΩΤΟΠΡΩΤΟ ΜΕΓΑΛΟΜΕΓΑΛΟ ΒΗΜΑΒΗΜΑ ΣΤΗΝΣΤΗΝ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΤΩΝΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ–– ΗΗΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΓΟΝΙΔΙΩΩΜΑΤΟΣΜΑΤΟΣ ΤΟΥΤΟΥ SS. . cerevisiaecerevisiae

~ 6000 ~ 6000 γονίδιαγονίδια(~2(~2κβκβ ΜΜ..ΟΟ.).)120 120 rRNAsrRNAs40 40 sRNAsRNA

274 274 tRNAtRNA51 51 ρετρομεταθετάρετρομεταθετάστοιχείαστοιχεία ΤΤyy

ΙντρόνιαΙντρόνια μόνομόνο σεσε rrRNARNA

1 1 cMcM~~ 33kbkb

28% 28% γνωστέςγνωστές λειτουργίεςλειτουργίες26% 26% ορφανάορφανά γονίδιαγονίδια

σεσε ΒΒ..ΔΔ..11% 11% μόνομόνο στονστον SaccharomycesSaccharomyces15% 15% ομόλογαομόλογα μεμε γνωστέςγνωστές

πρωτεΐνεςπρωτεΐνες14% 14% ομόλογαομόλογα μοτίβαμοτίβα6% 6% ΑΑ..ΠΠ..ΜΜ. ??. ??

>30% >30% γονίδιαγονίδια ομόλογαομόλογαανθρώπινωνανθρώπινων γονιδίωνγονιδίωνπεριλαμβανομένωνπεριλαμβανομένων καικαιγονιδίωνγονιδίων ««ασθενειώνασθενειών»»

Organelle biogenesisOrganelle biogenesisSignalSignal transductiontransduction

Cell rescueCell rescue

Not clearNot clear--cutcut

Amino acidsAmino acids

NitrogenNitrogen//SulfurSulfur

NucleotidesNucleotides

PhosphatePhosphate

CarbohydratesCarbohydrates

LipidsLipids

CofactorsCofactors

Energy metabolismEnergy metabolism

Cell growthCell growth,, cell divisioncell division, , DNADNA synthesissynthesis

TranscriptionTranscription,, transcription transcription controlcontrol

TranslationTranslation

Protein shapingProtein shaping

Transport facilitatorsTransport facilitators

Intracellular traffickingIntracellular trafficking

Cytoplasmic structureCytoplasmic structure

Nuclear structureNuclear structure

Cell envelopeCell envelope

14 14 ΚατηγορίεςΚατηγορίες ΠρωτεϊνώνΠρωτεϊνών τουτου ΣακχαρομύκηταΣακχαρομύκητα

1/3 1/3 ΓΟΝΙΔΙΓΟΝΙΔΙΩΝΩΝ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑΑ ΓΙΑΓΙΑ ΕΠΙΒΙΩΣΗΕΠΙΒΙΩΣΗ

ΟικογένειεςΟικογένειες πρωτεϊνώνπρωτεϊνών

ΦΥΛΕΤΙΚΟΣΦΥΛΕΤΙΚΟΣ & & ΑΦΥΛΕΤΙΚΟΣΑΦΥΛΕΤΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣΚΥΚΛΟΣ ΣΤΟΥΣΣΤΟΥΣ ΜΥΚΗΤΕΣΜΥΚΗΤΕΣ ΜΟΝΤΕΛΑΜΟΝΤΕΛΑ

ΑπομόνωσηΑπομόνωση μεταλλαγώνμεταλλαγών, , ταξινόμησηταξινόμηση σεσε επικρατούσεςεπικρατούσες--υπολειπόμενεςυπολειπόμενες, , θετικέςθετικές--αρνητικέςαρνητικές

ΗΗ ««φύσηφύση»» μιαςμιας μεταλλαγήςμεταλλαγήςμπορείμπορεί νανα μελετηθείμελετηθεί μεμε 4 4 γενετικάγενετικά ΤεστΤεστ

••ΓενετικούΓενετικού ΔιαχωρισμούΔιαχωρισμού. . ΈναΈνα γονίδιογονίδιο; ; ΔιασταύρωσηΔιασταύρωση μεμε φυσιολογικόφυσιολογικό τύποτύπο ((wt) wt) & &

αναζήτησηαναζήτηση τουτου 1:11:1

••ΕπικράτειαςΕπικράτειας.. ΦαινότυποςΦαινότυπος σεσε διπλοειδήδιπλοειδή..

••ΓενετικήςΓενετικής ΣυμπλήρωσηςΣυμπλήρωσης. . ΤεστΤεστλειτουργίαςλειτουργίας σεσε διπλοειδήδιπλοειδή. . ΕίναιΕίναι δυοδυο

μεταλλαγέςμεταλλαγές λειτουργικάλειτουργικάσυμπληρωματικέςσυμπληρωματικές;;

••ΓενετικήςΓενετικής ΣύνδεσηςΣύνδεσης. . ΤεστΤεστ τοπολογίαςτοπολογίας. . ΕίναιΕίναι δυοδυο μεταλλαγέςμεταλλαγές γενετικάγενετικάσυνδεδεμένεςσυνδεδεμένες ((στοστο ίδιοίδιο γονίδιογονίδιο););

ΑνάλυσηΑνάλυση απογόνωναπογόνων

ΥπάρχουνΥπάρχουν εξαιρέσειςεξαιρέσεις όπουόπου τατατεσττεστ δίνουνδίνουν ««περίεργαπερίεργα»»

αποτελέσματααποτελέσματα;;

••ΕνδογονιδιακήΕνδογονιδιακήσυμπληρωματικότητασυμπληρωματικότητα

••ΜηΜη--συνδεδεμένησυνδεδεμένη μημη--συμπληρωματικότητασυμπληρωματικότητα

ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥΤΟΥ S. cerevisiaeS. cerevisiae

ΜεθοδολογίαΜεθοδολογία όμοιαόμοια τουτου χημικούχημικού μετασχηματισμούμετασχηματισμού βακτηρίωνβακτηρίων

ΜεθοδολογίαΜεθοδολογία επιλογήςεπιλογής μετασχηματισμένωνμετασχηματισμένων: : γενετικήγενετική ((λειτουργικήλειτουργική) ) συμπλήρωσησυμπλήρωσημεταλλαγήςμεταλλαγής

ΒασικήΒασική προϋπόθεσηπροϋπόθεση: : ΣτέλεχοςΣτέλεχος μεταλλαγμένομεταλλαγμένο στοστο γονίδιογονίδιο επιλογήςεπιλογής ΧΧ-- ((προτιμότεραπροτιμότερα μεμεΜεταλλαγήΜεταλλαγή ολικήςολικής έλλειψηςέλλειψης) ) καικαι πλασμίδιοπλασμίδιο μεμε φυσιολογικόφυσιολογικό γονίδιογονίδιο επιλογήςεπιλογής ΧΧ+ +

ΚύτταραΚύτταρα στηστη λογαριθμικήλογαριθμική φάσηφάση αύξησηςαύξησης ((OD=0.5) OD=0.5) ΕπώασηΕπώαση σεσε οξικόοξικό LiLi ((ανάλογοανάλογο τουτου CaCa++++, , RbRb++++ σταστα βακτήριαβακτήρια))--ρευστοποίησηρευστοποίηση μεμβράνηςμεμβράνης

ΠολυαιθυλενικήΠολυαιθυλενική γλυκόληγλυκόλη ((PEG)+DPEG)+DΝΑΝΑ ((πλασμίδιοπλασμίδιο))ΘερμικόΘερμικό σοκσοκ 42 42 οο CC

EEπώασηπώαση σεσε επιλεκτικόεπιλεκτικό θρεπτικόθρεπτικό ((συνήθωςσυνήθως θρεπτικόθρεπτικό χωρίςχωρίς

ΑπόδοσηΑπόδοση: : διαφέρειδιαφέρει ανάλογαανάλογα τοτο πλασμίδιοπλασμίδιο ((αυτόνομοαυτόνομο ήή ενσωμάτωσηςενσωμάτωσης), ), μέγιστημέγιστη 101055--66 ττ//μμgg

ΠλασμίδιαΠλασμίδια πουπου αντιγράφονταιαντιγράφονται σεσε βακτήριαβακτήρια((ΕΕ..colicoli) ) καικαι στονστον SS. . cerevisiaecerevisiae

ΠεριέχουνΠεριέχουν γονίδιαγονίδια επιλογήςεπιλογής σεσε EE. . ccolioli((συνήθωςσυνήθως ΑΑrr) ) καικαι σεσε SS. . cerevisiae cerevisiae ((LEULEU2, 2,

TRDTRD1, 1, HISHIS3, 3, URAURA3, 3, κλπκλπ).).ΠλασμίδιαΠλασμίδια ενσωμάτωσηςενσωμάτωσης στοστο

γονιδίωμαγονιδίωμα

ΠλασμίδιαΠλασμίδια αυτόνομηςαυτόνομης αντιγραφήςαντιγραφής πουπουπεριέχουνπεριέχουν αλλαλληηλουχίεςλουχίες αυτόνομηςαυτόνομης

αντιγραφήςαντιγραφής ARSARS απόαπό τοτο γονιδίωμαγονιδίωμα τουτου SS. . cerevisiae cerevisiae ήή τοτο φυσικόφυσικό πλασμίδιοπλασμίδιο 22μμ

ΤαΤα πλασμίδιαπλασμίδια 22μμ υπάρχουνυπάρχουν >12 >12 αντίγραφααντίγραφα//κύτταροκύτταρο καικαι είναιείναι σταθεράσταθερά..

ΤαΤα πλασμίδιαπλασμίδια ARSARS υπάρχουνυπάρχουν επίσηςεπίσης σεσεπολλαπλάπολλαπλά αντίγραφααντίγραφα αλλάαλλά

είναιείναι ασταθήασταθή εκτόςεκτός εάνεάν περιέχουνπεριέχουν καικαιαλληλουχίεςαλληλουχίες CENCEN απόαπό τοτο κεντρομερέςκεντρομερές τουτουSS. . cerevisiaecerevisiae. . ΤαΤα πλασμίδιαπλασμίδια ARSARS--CENCEN: 1: 1--2 2

αντίγραφααντίγραφα//κύτταρακύτταρα..

ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝΣΤΟΝ SS. . cerevisiaecerevisiae

ARSARS

22μμ

CENCEN

Leu2Leu2++

MMετασχηματισμόςετασχηματισμόςστελέχουςστελέχους

LeuLeu22--

Leu2 Leu2 ++

ΑνάλογοΑνάλογο σύστημασύστημα μεμε αυτόαυτό τωντωνβακτηρίωνβακτηρίων όπουόπου κυρίωςκυρίωςχρησιμοποιούνταιχρησιμοποιούνται γονίδιαγονίδια

ανθεκτικότηταςανθεκτικότητας σεσε αντιβιοτικάαντιβιοτικά..

ΓΟΝΙΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣΕΠΙΛΟΓΗΣ ΣΤΟΝΣΤΟΝ SS. . cerevisiaecerevisiae-

ΑπαραίτητοιΑπαραίτητοι γιαγια τηντην αναγνώρισηαναγνώριση τωντων γενετικάγενετικά τροποποιημένωντροποποιημένωνκυττάρωνκυττάρων –– κλώνωνκλώνων..

ΚυρίωςΚυρίως γονίδιαγονίδια ενζύμωνενζύμων τουτου μεταβολισμούμεταβολισμού αμινοξέωναμινοξέων καικαιβάσεωνβάσεων πουπου αρχικάαρχικά κλωνοποιήθηκανκλωνοποιήθηκαν σεσε βακτήριαβακτήρια..

YYEAST EAST SESELECTABLE LECTABLE ΜΜARKERSARKERS

GG ENEENE EENZYMENZYME SS ELECTIONELECTION

HIS3HIS3 Imidazole glycerolphosphate dehydrataseImidazole glycerolphosphate dehydratase histidinehistidine

LEU2LEU2 ββ --IsopropylmalareIsopropylmalare dehydrogenasedehydrogenase leucineleucine

LYS2LYS2 aa --ΑΑminoadipateminoadipate reductasereductase lysine lysine

TRP1TRP1 NN -- (5(5 ΄--phosphoribosylphosphoribosyl)) --anthranilate isomeraseanthranilate isomerase tryptophan tryptophan

URAURA 33 OrotidineOrotidine --55 ΄--phosphate decarboxylasephosphate decarboxylase uracil uracil

ΚυριότεραΚυριότερα ΓονίδιαΓονίδια ΕπιλογήςΕπιλογής στονστον S. cerevisiaeS. cerevisiaeγονίδιαγονίδια βιοσύνθεσηςβιοσύνθεσης αμινοξέωναμινοξέων--πυριμιδινώνπυριμιδινών

ΟΟ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΝΗΜΑΤΟΕΙΔΩΝΝΗΜΑΤΟΕΙΔΩΝ ((ΑΑ. . nidulans)nidulans)

ΜεθοδολογίαΜεθοδολογία όμοιαόμοια αλλάαλλά καικαι μεμε σημαντικέςσημαντικές διαφορέςδιαφορές τουτου μετασχηματισμούμετασχηματισμού ζυμώνζυμώνΕπιλογήΕπιλογή μετασχηματισμένωνμετασχηματισμένων: : γενετικήγενετική ((λειτουργικήλειτουργική) ) συμπλήρωσησυμπλήρωση μεταλλαγήςμεταλλαγής. .

ΒασικήΒασική προϋπόθεσηπροϋπόθεση: : ΣτέλεχοςΣτέλεχος μεταλλαγμένομεταλλαγμένο στοστο γονίδιογονίδιο επιλογήςεπιλογής ΧΧ-- καικαι πλασμίδιοπλασμίδιο μεμεφυσιολογικόφυσιολογικό γονίδιογονίδιο επιλογήςεπιλογής ΧΧ+ . + . ΣπανιότεραΣπανιότερα χρησιμοποιούνταιχρησιμοποιούνται καικαι γονίδιαγονίδια

ανθεκτικότηταςανθεκτικότητας σεσε αντιβιοτικάαντιβιοτικά όπωςόπως ηη ολιγομυκίνηολιγομυκίνη, , φλυομυκίνηφλυομυκίνη, , υγρομυκίνηυγρομυκίνη..ΔιάκρισηΔιάκριση υπολειπόμενωνυπολειπόμενων καικαι κυρίαρχωνκυρίαρχων γενετικώνγενετικών στοιχείωνστοιχείων επιλογήςεπιλογής

μετασχηματισμένωνμετασχηματισμένων στελεχώνστελεχών

MMετασχηματισμόςετασχηματισμός πρωτπρωτooπλαστπλαστώώνν))σεσε ισοοσμωτικόισοοσμωτικό περιβάλλονπεριβάλλον.. ΤοΤο κυτταρικόκυτταρικότοίχωματοίχωμα καταστρέφεταικαταστρέφεται μεμε ενζυμικήενζυμική πέψηπέψη ((μέσωμέσω λυτικώνλυτικών ενζύμωνενζύμων). ).

ΟιΟι πρωτόπλαστεςπρωτόπλαστες, , πουπου μπορείμπορεί νανα προέρχονταιπροέρχονται απόαπό μυκήλιομυκήλιο ((πολυπύρηνοιπολυπύρηνοι) ) ήήκονιδιοσπόριακονιδιοσπόρια (1(1--2 2 πυρήνεςπυρήνες), ), απομονώνονταιαπομονώνονται απόαπό τοτο μείγμαμείγμα, , προστίθεταιπροστίθεται DNADNA((πλασμίδιοπλασμίδιο) ) καικαι PEGPEG. . ΗΗ σύντηξησύντηξη πρωτόπλαστωνπρωτόπλαστων οδηγείοδηγεί σεσε ««είσοδοείσοδο»» τουτου DNADNA. .

ΑναγέννησηΑναγέννηση πρωτόπλαστωνπρωτόπλαστων –– μετασχηματισμένωνμετασχηματισμένων πυρήνωνπυρήνωνΧαμηλήςΧαμηλής –– ΜέσηςΜέσης απόδοσηςαπόδοσης : 10: 10--101044 tt//μμg DNAg DNA. . ΕξαρτημένηΕξαρτημένη απόαπό τοτο πλασμίδιοπλασμίδιο..

ΠλασμίδιαΠλασμίδια ενσωμάτωσηςενσωμάτωσης: 10: 10--1000 1000 ττ//μμggΠλασμίδιαΠλασμίδια αυτόνομηςαυτόνομης αντιγραφήςαντιγραφής: 100.000 : 100.000 ττ//μμgg

ΑλλεςΑλλες μέθοδοιμέθοδοι:: ΗλεκτροδιάτρισηΗλεκτροδιάτριση, , ΒιολιστικόςΒιολιστικός βομβαρδισμόςβομβαρδισμός. . ΟχιΟχι ιδιαίτεραιδιαίτερααποδοτικότεροιαποδοτικότεροι τωντων κλασσικώνκλασσικών μεθόδωνμεθόδων..

ΠλασμίδιαΠλασμίδια πουπου περιέχουνπεριέχουν αλληλουχίεςαλληλουχίεςαντιγραφήςαντιγραφής ((OriCOriC) ) καικαι επιλογήςεπιλογής ((ΑΑrr) ) σεσε EE. . colicoli καικαι γονίδιογονίδιο επιλογήςεπιλογής στονστον AA. . nidulansnidulans

((ανθεκτικότηταανθεκτικότητα σεσε αντιβιοτικάαντιβιοτικά ήήσυμπλήρωσησυμπλήρωση μεταβολικήςμεταβολικής ανεπαρκείςανεπαρκείς ππ..χχ. .

argBargB, , amdSamdS, , pyrGpyrG))

ΤαΤα πλασμίδιαπλασμίδια αυτάαυτά ενσωματώνονταιενσωματώνονται στοστογονιδίωμαγονιδίωμα σεσε ομόλογεςομόλογες ήή μημη ομόλογεςομόλογες

περιοχέςπεριοχές. . ΗΗ ενσωμάτωσηενσωμάτωση τουςτους μπορείμπορεί ναναοδηγήσειοδηγήσει σεσε απλήαπλή ήή πολλαπλήπολλαπλήενσωμάτωσηενσωμάτωση τουτου πλασμιδίουπλασμιδίου ήή

αντικατάστασηαντικατάσταση ολοκλήρουολοκλήρου ήή μέρουςμέρους τουτουγονιδίουγονιδίου απόαπό τοτο γονιδίωμαγονιδίωμα

ΠλασμίδιαΠλασμίδια τύπουτύπου ARSARS χρησιμοποιούνταιχρησιμοποιούνται αλλάαλλά είναιείναι ιδιαίτεραιδιαίτερα ασταθήασταθή καικαι δενδενχχρησιμοποιούνταιρησιμοποιούνται ευρέωςευρέως

ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝΣΤΟΝ AA. . nidulansnidulans

ΗΗ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΣΤΟΣΤΟΥΝΥΝ AA. . nidulansnidulans

ΣτονΣτον SS. . cerevisiaecerevisiae, , πλασμίδιαπλασμίδια πουπου δενδεν φέρουνφέρουν αλληλουχίεςαλληλουχίες 22μμ ήή ARSARS ενσωματώνονταιενσωματώνονταικυρίωςκυρίως μεμε ομόλογοομόλογο ανασυνδυασμόανασυνδυασμό. . ΟΟ ετερόλογοςετερόλογος ((τυχαίοςτυχαίος;) ;) ανασυνδυασμόςανασυνδυασμός είναιείναι

πολύπολύ σπάνιοςσπάνιος

ΣτονΣτον AA. . nidulansnidulans, , τατα πλασμίδιαπλασμίδια ενσωματώνονταιενσωματώνονται μεμεομόλογοομόλογο καικαι//ήή ετερόλογοετερόλογο ανασυνδυασμόανασυνδυασμό

ΗΗ ενσωμάτωσηενσωμάτωση μπορείμπορεί νανα είναιείναι απλήαπλή ήή πολλαπλήπολλαπλή

γονιδιωματικόγονιδιωματικόαντίγραφοαντίγραφο argBargB

((μάρτυραςμάρτυρας))

ΑπλήΑπλή ομόλογηομόλογη ενσωμάτωσηενσωμάτωση ΤριπλήΤριπλή ομόλογηομόλογη ενσωμάτωσηενσωμάτωση

ΑπλήΑπλή ετερόλογηετερόλογη

ενσωμάτωσηενσωμάτωση

ΜΜ ττ1 1 ττ2 2 ττ33

ΣεΣε όλουςόλους τουςτους μύκητεςμύκητες, , γραμμικόγραμμικό πλασμιδιακόπλασμιδιακό DNADNA ενσωματώνεταιενσωματώνεται μεμε διπλόδιπλό ομόλογοομόλογοανασυνδυασμόανασυνδυασμό πουπου συνήθωςσυνήθως οδηγείοδηγεί σεσε γονιδιακήγονιδιακή αντικατάστασηαντικατάσταση στοστο γονιδίωμαγονιδίωμα..

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝΣΤΟΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΓΟΝΙΔΙΩΜΑ ΜΥΚΗΤΩΝΜΥΚΗΤΩΝ

ΧΧ

Α΄Α΄

απλόαπλόcrosscross--overover

ΔιπλασιασμόςΔιπλασιασμός γονιδίουγονιδίου ΑΑ

ΟμόλογοςΟμόλογος ΑνασυνδυασμόςΑνασυνδυασμόςΑΑ

απλόαπλόcrosscross--overover

ΕάνΕάν ηη θέσηθέση ενσωμάτωσηςενσωμάτωσηςαντιστοιχείαντιστοιχεί σεσε γονίδιογονίδιο = = απενεργοποίησηαπενεργοποίηση

ΕτερόλογοςΕτερόλογος ΑνασυνδυασμόςΑνασυνδυασμός

ΧΧ

ΓονιδιακήΓονιδιακή αντικατάστασηαντικατάσταση

Α΄Α΄

ΧΧ

Α΄Α΄

ΑΑ

ΧΧ

ΧΧ

ΑΑ++

ΑΑ--μεταλλαγήμεταλλαγή

ΧΧ

ΑΑ++

ΒΒ--

ΧΧ

ΑΑ

ΒΒ--

ΒΒ---- ΑΑ

ΒΒΔΔ

ΒΒ-

ΧΧ

ΑΑ

ΒΒ--ΔΔ ΒΒ++ΑΑ

ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΗΣΤΟΧΕΥΜΕΝΗ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ καικαι ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝΓΟΝΙΔΙΩΝ

ΣπουδαίοΣπουδαίο ««εργαλείοεργαλείο»» γιαγια τηντην λειτουργικήλειτουργική ανάλυσηανάλυση γονιδίωνγονιδίων

αα)) ΑντικατάστασηΑντικατάσταση –– μεμε γραμμικόγραμμικόομόλογοομόλογο DNADNA, , τοτο οποίοοποίο ««διορθώνειδιορθώνει»» τοτομεταλλαγμένομεταλλαγμένο γονίδιογονίδιο καικαι επιτρέπειεπιτρέπει τηντηνάμεσηάμεση επιλογήεπιλογή μετασχηματισμένωνμετασχηματισμένων

στελεχώνστελεχών..

ββ) ) ΣτοχευμένηΣτοχευμένη ενσωμάτωσηενσωμάτωση μέσωμέσω συγκεκριμένωνσυγκεκριμένων αλληλουχιώναλληλουχιών ππ..χχ. . έναένα πλασμίδιοπλασμίδιο πουπου φέρειφέρει τοτο γονίδιογονίδιοεπιβολήςεπιβολής ΑΑ καικαι τοτο γονίδιογονίδιο υπόυπό μελέτημελέτη ΒΒ προτιμούμεπροτιμούμε νανα ενσωματωθείενσωματωθεί μέσωμέσω αλληλουχιώναλληλουχιών ΑΑ, , ώστεώστε τοτουπόυπό μελέτημελέτη γονίδιογονίδιο ΒΒ νανα παραμείνειπαραμείνει όπωςόπως έχειέχει χωρίςχωρίς νανα ανασυνδυαστείανασυνδυαστεί –– ΤοΤο γονίδιογονίδιο ΒΒ τουτου πλασμιδίουπλασμιδίου

είναιείναι ελλειπέςελλειπές ήή φέρειφέρει μεταλλαγήμεταλλαγή, , άλληάλλη απόαπό αυτήαυτή τουτου γονιδίουγονιδίου ΒΒ τουτου γονιδιώματοςγονιδιώματος. . ΕπιλέγονταςΕπιλέγοντας στελέχηστελέχη ΒΒ++, , επιλέγουμεεπιλέγουμε τουςτους παραπάνωπαραπάνω ανασυνδυασμούςανασυνδυασμούς......

ΧΧhoIhoI

ΧΧ

AA++

BB++

BB++

ΑΑ++

ΧΧΧΧ ΒΒ++

ΑΑ--, , ΒΒ++

ΑΑ++

ΑΑ--xx

1) 1) ΧρησιμοποιόνταςΧρησιμοποιόντας γραμμικόγραμμικό DNADNA πουπουφέρειφέρει γονίδιογονίδιο επιλογήςεπιλογής τοτο οποίοοποίο

««διακόπτειδιακόπτει»» τοτο ΑΑ..ΠΠ..ΜΜ. . τουτου γονιδίουγονιδίου πουπου θαθααντικατασταθείαντικατασταθεί

2) 2) ΧρησιμοποιώνταςΧρησιμοποιώντας πλασμίδιοπλασμίδιο πουπου φέρειφέρει μέροςμέροςτουτου γονιδίουγονιδίου γιαγια απενεργοποίησηαπενεργοποίηση..

3) 3) ΕνσωμάτωσηΕνσωμάτωση μέσωμέσω δράσηςδράσης περιοριστικούπεριοριστικού ενζύμουενζύμου((REMIREMI). ). ΤαΤα άκραάκρα XhoIXhoI τουτου πλασμιδίουπλασμιδίου, , παρουσίαπαρουσία τουτουενζύμουενζύμου XhoIXhoI,, ανασυνδυάζονταιανασυνδυάζονται σεσε θέσειςθέσεις XhoIXhoI στοστο

γονιδίωμαγονιδίωμα. . ΑνΑν τοτο γονίδιογονίδιο μαςμας έχειέχει θέσηθέση XhoIXhoI οιοι πιθανότητεςπιθανότητεςαπενεργοποίησηςαπενεργοποίησης τουτου μέσωμέσω ενσωμάτωσηςενσωμάτωσης τουτου πλασμιδίουπλασμιδίου

είναιείναι μεγάλεςμεγάλες..

γγ)) ΣτοχευμένηΣτοχευμένη απενεργοποίησηαπενεργοποίηση γονιδίουγονιδίου∗∗∗∗ ΣεΣε περίπτωσηπερίπτωση θνησιγόνωνθνησιγόνων απενεργοποιήσεωναπενεργοποιήσεων οο μετασχηματισμόςμετασχηματισμός γίνεταιγίνεται σεσε διπλοειδήδιπλοειδή κύτταρακύτταρα......

xx

AArr

AArr

μετασχμετασχ..βακτηρίωνβακτηρίων

απομόνωσηαπομόνωσηDNADNA

AArrEcoRIEcoRI EcoRIEcoRI

+ T4 + T4 λιγάσηλιγάση

xx

EcoRIEcoRI

AArr

ΠροϋπόθεσηΠροϋπόθεση τηςτης μελέτηςμελέτης γονιδίωνγονιδίων πουπουμετασχηματίζουνμετασχηματίζουν στελέχηστελέχη μυκητώνμυκητών καικαι τουςτους

προσδίδουνπροσδίδουν ενδιαφέροντεςενδιαφέροντες φαινοτύπουςφαινοτύπους είναιείναι ηηαπομόνωσηαπομόνωση τωντων πλασμιδίωνπλασμιδίων πουπου εμπεριέχουνεμπεριέχουν ταταγονίδιαγονίδια αυτάαυτά. . ΗΗ ««διάσωσήδιάσωσή»» τουςτους γίνεταιγίνεται σεσε

βακτήριαβακτήρια EE. . colicoli..

ΣτονΣτον SS. . cerevisiaecerevisiae όπουόπου χρησιμοποιούνταιχρησιμοποιούνται κυρίωςκυρίωςαυτόνομααυτόνομα αντιγραφικάαντιγραφικά πλασμίδιαπλασμίδια αυτόαυτό είναιείναι απλόαπλό. .

ΤαΤα κύτταρακύτταρα λύονταιλύονται καικαι μετασχηματίζουμεμετασχηματίζουμεβακτήριαβακτήρια επιλέγονταςεπιλέγοντας ΑΑrr καθώςκαθώς όλαόλα τατα πλασμίδιαπλασμίδια

τουτου SS. . cerevisiaecerevisiae φέρουνφέρουν τοτο γονίδιογονίδιο ΑΑrr..

ΣτονΣτον AA. . nidulansnidulans όπουόπου τατα πλασμίδιαπλασμίδια ενσωματώνονταιενσωματώνονταιστοστο γονιδίωμαγονιδίωμα, , ηη ««διάσωσήδιάσωσή»» τουςτους είναιείναι

δυσκολότερηδυσκολότερη αλλάαλλά εφικτήεφικτή λόγουλόγου μιτωτικήςμιτωτικής ήήμειωτικήςμειωτικής ««εξωσωμάτωσηςεξωσωμάτωσης»» ((excisionexcision) ) τωντωνπλασμιδίωνπλασμιδίων –– κυρίωςκυρίως ότανόταν αυτάαυτά δημιουργούνδημιουργούν

διπλασιασμούςδιπλασιασμούς γονιδίωνγονιδίων. . ΕναλλακτικάΕναλλακτικά μπορούμεμπορούμενανα ««αποκόψουμεαποκόψουμε»» τηντην περιοχήπεριοχή ενσωμάτωσηςενσωμάτωσης καικαι

νανα τηντην απομονώσουμεαπομονώσουμε

««ΔΙΑΣΩΣΗΔΙΑΣΩΣΗ»» ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΑΠΟΑΠΟ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΕΝΑΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗΣΤΕΛΕΧΗ AA. . nidulansnidulans ήή SS. . cerevisiaecerevisiae

ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΜΕ ΓΕΝΕΤΙΚΗΓΕΝΕΤΙΚΗ ΣΥΜΠΛΗΡΩΣΗΣΥΜΠΛΗΡΩΣΗ

ΠλεονεκτήματαΠλεονεκτήματα

ΎπαρξηΎπαρξη εκατοντάδωνεκατοντάδωνμεταλλαγμένωνμεταλλαγμένων στελεχώνστελεχώνστουςστους μύκητεςμύκητες......

ΗΗ ευκολίαευκολία απομόνωσηςαπομόνωσης νέωννέωνμεταλλαγμένωνμεταλλαγμένων στελεχώνστελεχών..

ΗΗ ευκολίαευκολία παραγωγήςπαραγωγής πλήρωνπλήρωνγενωμικώνγενωμικών βιβλιοθηκώνβιβλιοθηκών λόγωλόγωτουτου μικρούμικρού γονιδιώματοςγονιδιώματος

καικαι τηςτης απουσίαςαπουσίας ιντρονίωνιντρονίων ((ήήπαρουσίαςπαρουσίας μικρώνμικρών ιντρονίωνιντρονίων).).

ΗΗ δυνατότηταδυνατότητα κλωνοποίησηςκλωνοποίησηςγονιδίωνγονιδίων μικρήςμικρής ομοιότηταςομοιότητας ήήμημη--ομολόγωνομολόγων γονιδίωνγονιδίων

απόαπό άλλουςάλλους οργανισμούςοργανισμούς..

ΑΝΑΓΝΩΡΙΖΟΝΤΑΣΑΝΑΓΝΩΡΙΖΟΝΤΑΣ ΤΟΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟΓΟΝΙΔΙΟ ΠΟΥΠΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΝΕΙΣΥΜΠΛΗΡΩΝΕΙ ΜΙΑΜΙΑ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗΜΕΤΑΛΛΑΓΗ

ΈΝΑΈΝΑ ΓΟΝΙΔΙΟΓΟΝΙΔΙΟ ΠΟΥΠΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΝΕΙΣΥΜΠΛΗΡΩΝΕΙ ΜΙΑΜΙΑ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗΜΕΤΑΛΛΑΓΗ ΔΕΝΔΕΝ ΕΊΝΑΙΕΊΝΑΙ ΑΝΑΓΚΑΣΤΙΚΑΑΝΑΓΚΑΣΤΙΚΑΤΟΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟΓΟΝΙΔΙΟ ΠΟΥΠΟΥ ΕΧΕΙΕΧΕΙ ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΕΙΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΕΙ ΗΗ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗΜΕΤΑΛΛΑΓΗ…………

……καικαι ηη σημασίασημασία τηςτης γενετικήςγενετικής ανάλυσηςανάλυσης

ΙΔΙΑΙΤΕΡΟΤΗΤΕΣΙΔΙΑΙΤΕΡΟΤΗΤΕΣ ΤΟΥΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣΤΗΣ ΖΥΜΗΣΖΥΜΗΣ

ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ –– ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝΓΟΝΙΔΙΩΝ ΜΕΣΩΜΕΣΩ ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗΣΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗΣ((ΚΑΤΑΣΤΟΛΗΚΑΤΑΣΤΟΛΗ ΜΕΣΩΜΕΣΩ ΠΟΛΛΩΝΠΟΛΛΩΝ ΑΝΤΙΓΡΑΦΩΝΑΝΤΙΓΡΑΦΩΝ))

ΜπορούμεΜπορούμε νανα υπερυπερ--εκφράσουμεεκφράσουμε γονίδιαγονίδια στονστον SS. . cerevisiaecerevisiae χρησιμοποιώνταςχρησιμοποιώνταςφορείςφορείς 22μμ ήή ARSARS ήή χρησιμοποιώνταςχρησιμοποιώντας ««δυνατούςδυνατούς υποκινητέςυποκινητές»». [. [ΣτονΣτον AA. . nidulansnidulans αυτόαυτό

μπορείμπορεί νανα γίνειγίνει μεμε πολλαπλήπολλαπλή ενσωμάτωσηενσωμάτωση ενεν σειράσειρά πλασμιδίουπλασμιδίου ήή μεμε ισχυρούςισχυρούςυποκινητέςυποκινητές όπωςόπως οο alcAalcA ((αφυδρογονάσηαφυδρογονάση αλκοόληςαλκοόλης)]. )]. ΗΗ υπερυπερ--έκφρασηέκφραση ενόςενός γονιδίουγονιδίουοδηγείοδηγεί σεσε ««εμφανείςεμφανείς»» φαινοτύπουςφαινοτύπους –– συχνάσυχνά μπορείμπορεί νανα ««παρακάμψειπαρακάμψει»» τηντην ανάγκηανάγκηάλλωνάλλων γονιδίωνγονιδίων ήή νανα καταστείλεικαταστείλει μεταλλαγέςμεταλλαγές ππ..χχ. (. (ii) ) ΑΑ ((ενεργοποίησηενεργοποίηση) ) ΒΒ ΓΓ. . ΣΣ’’ έναένα στέλεχοςστέλεχος ΑΑ--, , ηη υπερέκφρασηυπερέκφραση τουτου ΒΒ καταστέλλεικαταστέλλει τηντην έλλειψηέλλειψη τουτου ΑΑ. (. (

ΥπερέκφρασηΥπερέκφραση μπορείμπορεί νανα οδηγήσειοδηγήσει καικαι σσ’’ αρνητικούςαρνητικούς φαινοτύπουςφαινοτύπους ότανόταντοτο προϊόνπροϊόν πουπου υπερεκφράζεταιυπερεκφράζεται συμμετέχεισυμμετέχει σεσε περισσότεροπερισσότερο απόαπό έναένα μονοπάτιμονοπάτι

ΒΒ ΒΑΒΑ

ΑΑΓΓ ΓΑΓΑ

ΕάνΕάν υπερεκφραστείυπερεκφραστεί οο ΒΒ όλοόλο τοτο ΑΑ θαθα υπάρχειυπάρχει δεσμευμένοδεσμευμένο μεμε τοτο ΒΒ

ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΣΕΣΕ ΔΥΟΔΥΟ ΒΗΜΑΤΑΒΗΜΑΤΑΘΝΗΣΙΓΟΝΕΣΘΝΗΣΙΓΟΝΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ

MMΟΡΙΑΚΗΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗΜΕΛΕΤΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ

ΤΟΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑΣΥΣΤΗΜΑ ΔΙΠΛΟΥΔΙΠΛΟΥ ΥΒΡΙΔΙΟΥΥΒΡΙΔΙΟΥ ΣΤΟΝΣΤΟΝ SS. . cerevisiaecerevisiae (1989, (1989, Fields & Song)Fields & Song)

ΥΒΡΙΔΙΟΥΒΡΙΔΙΟ 1:1:ΠρωτεΐνηΠρωτεΐνη ΧΧ –– GALGAL4 4 μοτίβομοτίβο

δέσμευσηςδέσμευσης DNADNA

ΥΒΡΙΔΙΟΥΒΡΙΔΙΟ 2:2:ΠρωτεΐνηΠρωτεΐνη ΥΥ--GALGAL4 4 μοτίβομοτίβοενεργοποίησηςενεργοποίησης μεταγραφήςμεταγραφής..

ΕάνΕάν ΧΧ--ΥΥ σχηματίσουνσχηματίσουν σύμπλοκοσύμπλοκο, , ταταδύοδύο μοτίβαμοτίβα τουτου GALGAL4 4 έρχονταιέρχονται σεσεεπαφήεπαφή--συναρμολογούνταισυναρμολογούνται καικαι

ενεργοποιούνενεργοποιούν τοτο γονίδιογονίδιο

ΤαΤα ΧΧ & & ΥΥ μπορείμπορεί νανα είναιείναι γνωστάγνωστά ήήάγνωσταάγνωστα……

ΖύμηΖύμη::>1000>1000γονίδιαγονίδια, >4500 , >4500 αλληλεπιδράσειςαλληλεπιδράσεις πρωτεϊνώνπρωτεϊνών

ΒασίζεταιΒασίζεται στοστο ότιότι δομικάδομικά & & λειτουργικάλειτουργικά διακριτέςδιακριτές περιοχέςπεριοχές ((domains) domains) μιαςμιας πρωτεΐνηςπρωτεΐνης μπορούνμπορούννανα ««συναρμολογηθούνσυναρμολογηθούν»» λειτουργικάλειτουργικά ακόμηακόμη καικαι αναν εκφράζονταιεκφράζονται απόαπό διαφορετικουςδιαφορετικους φορείςφορείς

ΤΟΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑΣΥΣΤΗΜΑ ΔΙΠΛΟΥΔΙΠΛΟΥ ΥΒΡΙΔΙΟΥΥΒΡΙΔΙΟΥ ΣΤΟΝΣΤΟΝ SS. . cerevisiaecerevisiae

THE SPLITTHE SPLIT--UBIQUITIN MEMBRANE YEAST TWOUBIQUITIN MEMBRANE YEAST TWO--HYBRID SYSTEMHYBRID SYSTEM

Fusions of ubiquitin and a target protein are Fusions of ubiquitin and a target protein are recognized and cleaved by ubiquitinrecognized and cleaved by ubiquitin--specific proteases specific proteases

((UBPsUBPs) after a double glycine motif (Gly) after a double glycine motif (Gly--GlyGly--X) X) located at the Clocated at the C--terminus of ubiquitin. As opposed to terminus of ubiquitin. As opposed to

many other proteases, many other proteases, UBPsUBPs do not recognize a do not recognize a specific sequence of a polypeptide chain but instead specific sequence of a polypeptide chain but instead

recognize the folded ubiquitin.recognize the folded ubiquitin.Ubiquitin can be expressed in yeast as an NUbiquitin can be expressed in yeast as an N--terminal terminal

half (Nub) as well as a Chalf (Nub) as well as a C--terminal half (Cub). The two terminal half (Cub). The two halves retain their affinity for each other and halves retain their affinity for each other and

spontaneously reassemble to form the sospontaneously reassemble to form the so--called splitcalled split--ubiquitin. If the Nub and Cub moieties are coubiquitin. If the Nub and Cub moieties are co--

expressed within a single cell, the reporter protein that expressed within a single cell, the reporter protein that is fused to the Cis fused to the C--terminus of ubiquitin will be cleaved terminus of ubiquitin will be cleaved

off upon reoff upon re--assembly of the Nub and Cub moieties into assembly of the Nub and Cub moieties into splitsplit--ubiquitin A point mutation in the Nubiquitin A point mutation in the N--terminal half terminal half of ubiquitin (of ubiquitin (NubGNubG) completely abolishes the affinity ) completely abolishes the affinity

of the two halves for each other. As the separate of the two halves for each other. As the separate NubGNubGand Cub parts are not recognized by ubiquitinand Cub parts are not recognized by ubiquitin--specific specific proteases (proteases (UBPsUBPs), no cleavage of the reporter protein ), no cleavage of the reporter protein

takes place. The bait protein is fused to the Cub takes place. The bait protein is fused to the Cub domain followed by a reporter protein, and a prey domain followed by a reporter protein, and a prey protein is fused to a mutated protein is fused to a mutated NubGNubG domain. If bait domain. If bait

and prey interact, their interaction brings the and prey interact, their interaction brings the NubGNubGand Cub domains close enough together to and Cub domains close enough together to

reconstitute splitreconstitute split--ubiquitin, resulting in the release of ubiquitin, resulting in the release of the reporter protein (red) by the action of the the reporter protein (red) by the action of the UBPsUBPs..

ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ--ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

ΜΕΛΕΤΩΝΤΑΣΜΕΛΕΤΩΝΤΑΣ ΓΟΝΙΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑ ΤΩΝΤΩΝ ΟΠΟΙΩΝΟΠΟΙΩΝ ΗΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΕΊΝΑΙΕΊΝΑΙ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΗΑΠΑΡΑΙΤΗΤΗ ΓΙΑΓΙΑΤΗΝΤΗΝ ΕΠΙΒΙΩΣΗΕΠΙΒΙΩΣΗ ΤΟΥΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥΚΥΤΤΑΡΟΥ

ΕΙΣΑΓΩΓΗΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ ΜΕΡΙΚΗΣΜΕΡΙΚΗΣ ΑΠΩΛΕΙΑΣΑΠΩΛΕΙΑΣ ΗΗ ΤΡΟΠΟΠΟΗΜΕΝΗΣΤΡΟΠΟΠΟΗΜΕΝΗΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ

ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΕΣΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣΈναΈνα μοναδικόμοναδικό εργαλείοεργαλείο γιαγια τηντην in vivo in vivo μελέτημελέτη ενδογονιδιακώνενδογονιδιακών ήή διαγονιδιακώνδιαγονιδιακών

αλληλεπιδράσεωναλληλεπιδράσεων

ΚατασταλτικέςΚατασταλτικές μεταλλαγέςμεταλλαγές είναιείναι οιοι μεταλλαγέςμεταλλαγές πουπου τροποποιούντροποποιούν ήή καταστέλλουνκαταστέλλουν τοτοαποτέλεσμααποτέλεσμα ((φαινότυποφαινότυπο) ) πουπου προκαλείπροκαλεί μιαμια αρχικήαρχική μεταλλαγήμεταλλαγή

ΜιαΜια κατασταλτικήκατασταλτική μεταλλαγήμεταλλαγή μπορείμπορεί νανα είναιείναι::1.1.ΕνδογονιδιακήΕνδογονιδιακή2.2.ΔιαγονιδιακήΔιαγονιδιακή

•• ΟιΟι ΕνδογονιδιακέςΕνδογονιδιακές κατασταλτικέςκατασταλτικές μεταλλαγέςμεταλλαγές μπορείμπορεί νανα είναιείναι::1.1.ΑνΑνaaστροφήστροφή τηςτης αρχικήςαρχικής μεταλλαγήςμεταλλαγής

2.2.ΜεταλλαγήΜεταλλαγή ««ΔεύτερηςΔεύτερης θέσηςθέσης»»

ΟιΟι μεταλλαγέςμεταλλαγές δεύτερηςδεύτερης θέσηςθέσης μπορείμπορεί νανα είναιείναι: :

1.1. ΕξειδικευμένεςΕξειδικευμένες ωςως προςπρος τηντην αρχικήαρχικήμεταλλαγήμεταλλαγή ((alleleallele--specificspecific))--ΥποδηλώνουνΥποδηλώνουν ««επαφέςεπαφές»»..

2.2. ΜηΜη--εξειδικευμένεςεξειδικευμένες ωςως προςπρος τηντην αρχικήαρχικήμεταλλαγήμεταλλαγή ((allele nonallele non--specificspecific) ) ΥποδηλώνουνΥποδηλώνουν εναλλακτικούςεναλλακτικούςμηχανισμούςμηχανισμούς ((byby--passpass))

ΟιΟι ΔιαγονιδιακέςΔιαγονιδιακές κατασταλτικέςκατασταλτικές μεταλλαγέςμεταλλαγές μπορείμπορεί νανα είναιείναι: :

1.1. ΣεΣε γονίδιογονίδιο παρόμοιαςπαρόμοιας--εναλλακτικήςεναλλακτικής λειτουργίαςλειτουργίας (by(by--pass)pass)

2.2. ΣεΣε γονίδιογονίδιο πουπου κωδικεύεικωδικεύει πρωτεΐνηπρωτεΐνη πουπου αλληλεπιδράαλληλεπιδρά μεμε τηντηναρχικάαρχικά μεταλλαγμένημεταλλαγμένη πρωτεΐνηπρωτεΐνη

ΜεταφραστικήΜεταφραστική καταστολήκαταστολή

ΕΠΙΛΟΓΗ ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ

Η γενετική απομόνωση in vivo κατασταλτικών μεταλλαγών αποτελεί ισχυρή μεθοδολογίακαθορισμού περιοχών, ή συγκεκριμένων αμινοξέων, που αλληλεπιδρούν εντός της ίδιαςπρωτεΐνης (ενδογονιδιακά) ή μεταξύ διαφορετικών πρωτεϊνών (διαγονιδιακά). Πιοσυγκεκριμένα, μία ενδογονιδιακή κατασταλτική μεταλλαγή μπορεί να διαχωριστεί σεμεταλλαγή πρώτης θέσης (first-site suppressor mutation) ή σε μεταλλαγή δεύτερης θέσης(second-site suppressor mutation). Οι ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές πρώτηςθέσης είναι αυτές που «διορθώνουν» μία αρχική μεταλλαγή που προϋπάρχει στην πρωτεΐνη(αναστροφή), και επομένως προσδίδουν συνήθως φαινότυπο φυσικού τύπου. Οιενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές δεύτερης θέσης αφορούν σε ένα άλλο αμινοξύτης ίδιας πρωτεΐνης. Η δεύτερη κατασταλτική μεταλλαγή μπορεί να τροποποιεί τη δομή ήτη λειτουργία της πρωτεΐνης είτε αλληλεπιδρώντας άμεσα με το αρχικά μεταλλαγμένοαμινοξύ, είτε παρακάμπτοντας το πρόβλημα που είχε δημιουργήσει η αρχική μεταλλαγή. Μέσω των κατασταλτικών μεταλλαγών αποκαλύπτονται αμινοξέα που αλληλεπιδρούν ήβρίσκονται «κοντά» στο ενεργό κέντρο ή σε άλλες λειτουργικές περιοχές της πρωτεΐνης. Συχνά, οι κατασταλτικές μεταλλαγές δεύτερης θέσης προσδίδουν νέες ιδιότητες στηνπρωτεΐνη.

Οι διαγονιδιακές μεταλλαγές, είναι κατασταλτικές μεταλλαγές οι οποίες χαρτογραφούνται σεένα γονίδιο διαφορετικό από αυτό που φέρει την αρχική μεταλλαγή. Μπορεί απλά ναεπαναφέρουν το φυσικό τύπο, αλλά επίσης συχνά οδηγούν σε πλειοτροπικές αλλαγές στοκύτταρο. Μπορεί να αφορούν στην ενεργοποίηση ή την τροποποίηση ενός εναλλακτικούενζύμου, ή μια μεταλλαγή που «διορθώνει» την αλληλεπίδραση της αρχικά μεταλλαγμένηςπρωτεΐνης με κάποιο παράγοντα.

Περιληπτικά, κατασταλτικές μεταλλαγές είναι οι μεταλλαγές που τροποποιούν ή καταστέλλουντο αποτέλεσμα (φαινότυπο) που προκαλεί μια αρχική μεταλλαγή.

• Οι ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι:

1. Αναστροφή της αρχικής μεταλλαγής.

2. Μεταλλαγή δεύτερης θέσης.

• Οι μεταλλαγές δεύτερης θέσης μπορεί να είναι:

1. Εξειδικευμένες ως προς την αρχική μεταλλαγή (allele-specific)-Υποδηλώνουν«επαφές».

2. Μη-εξειδικευμένες ως προς την αρχική μεταλλαγή (allele non-specific) Υποδηλώνουν μηχανισμούς by-pass.

• Οι διαγονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι:

1. Σε γονίδιο παρόμοιας-εναλλακτικής λειτουργίας.

2. Σε γονίδιο του οποίου η μεταλλαγμένη λειτουργία έχει επιγενετικό αποτέλεσμα στηναρχική μεταλλαγή. Πολλαπλοί μηχανισμοί by-pass.

Μεταφραστική καταστολή.

ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝΜΕΣΩΜΕΣΩ ΑΠΛΗΣΑΠΛΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΉΣΓΕΝΕΤΙΚΉΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣΑΝΑΛΥΣΗΣ

……....καικαι μεμε μεμε τητη βοήθειαβοήθεια τουτου PCR PCR γιαγια τιςτις ενδογονιδιακέςενδογονιδιακές μεταλλαγέςμεταλλαγές

ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΥΝΘΕΤΙΚΗΣΣΥΝΘΕΤΙΚΗΣ ΘΝΗΣΙΜΟΤΗΤΑΘΝΗΣΙΜΟΤΗΤΑΑναζητώνταςΑναζητώντας αλληλεπιδράσειςαλληλεπιδράσεις……....

cDNA cDNA ««ξένουξένου»» γονίδιογονίδιο

ΡΡ ΤΤ

ΟΟ SS. . cerevisiaecerevisiae ήή οο AA. . nidulansnidulans ΣΑΝΣΑΝ ΠΡΟΤΥΠΑΠΡΟΤΥΠΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣΕΚΦΡΑΣΗΣ««ΞΕΝΩΝΞΕΝΩΝ»» ΓΟΝΙΔΙΩΝΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΠΟΑΠΟ ΑΝΩΤΕΡΟΥΣΑΝΩΤΕΡΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ

ΕναΕνα γονίδιογονίδιο απόαπό οποιοδήποτεοποιοδήποτε οργανισμόοργανισμό έχειέχει τητη δυνατότηταδυνατότητα νανα εκφραστείεκφραστεί στουςστους προτύπουςπροτύπουςμύκητεςμύκητες εάνεάν ((ii) ) κλωνοποιηθείκλωνοποιηθεί σσ’’ έναένα υποκινητήυποκινητή κατάλληλοκατάλληλο γιαγια τουςτους μύκητεςμύκητες ((iiii) ) δενδεν έχειέχει

ιντρόνιαιντρόνια, , δηλαδήδηλαδή είναιείναι cDNAcDNA ήή προέρχεταιπροέρχεται απόαπό οργανισμόοργανισμό πουπου δενδεν έχειέχει ιντρόνιαιντρόνιαΗΗ συμπλήρωσησυμπλήρωση γενετικώνγενετικών / / λειτουργικώνλειτουργικών μεταλλαγώνμεταλλαγών στουςστους μύκητεςμύκητες μεμε ξέναξένα γονίδιαγονίδια μπορείμπορείνανα οδηγήσειοδηγήσει στηνστην αναγνώρισηαναγνώριση ανάλογωνανάλογων γονιδίωνγονιδίων απόαπό άλλουςάλλους οργανισμούςοργανισμούς. . ΔενΔεν χρειάζεταιχρειάζεται τατα

γονίδιαγονίδια νανα είναιείναι ομόλογαομόλογα

ΗΗ έκφρασηέκφραση φυτικώνφυτικών ήή ζωικώνζωικών γονιδίωνγονιδίων στουςστους μύκητεςμύκητες επιτρέπειεπιτρέπει τηντην μελέτημελέτη τουςτους μεμεαπλούστερεςαπλούστερες τεχνικέςτεχνικές καικαι επιτρέπειεπιτρέπει τηντην γενετικήγενετική ανάλυσηανάλυση τουςτους ππ..χχ. . RasRas καικαι άλλαάλλα ογκογονίδιαογκογονίδια, ,

γονίδιαγονίδια κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου, , γονίδιαγονίδια ασθενειώνασθενειών, , γονίδιαγονίδια μεταφορέωνμεταφορέων

ΟιΟι μύκητεςμύκητες αποτελούναποτελούν πρότυπαπρότυπα συστήματασυστήματα κλωνοποίησηςκλωνοποίησης, , αναγνώρισηςαναγνώρισης καικαι λειτουργικήςλειτουργικήςανάλυσηςανάλυσης γονιδίωνγονιδίων φυτώνφυτών ήή ζώωνζώων..

ΣΥΖΕΥΚΤΙΚΟΙΣΥΖΕΥΚΤΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙΤΥΠΟΙ ΣΤΟΝΣΤΟΝ SS. . cerevisiaecerevisiae

ΠρότυποΠρότυπο σύστημασύστημα μελέτηςμελέτης μηχανισμώνμηχανισμών αναπτυξιακούαναπτυξιακού καθορισμούκαθορισμού συζευκτικώνσυζευκτικώντύπωντύπων καικαι τηςτης μεταγωγήςμεταγωγής ορμονικώνορμονικών σημάτωνσημάτων κατάκατά τητη διάρκειαδιάρκεια κυτταρικήςκυτταρικής

««συνομιλίαςσυνομιλίας»» πρινπριν τοτο σεξσεξ

ΔύοΔύο συζευκτικοίσυζευκτικοί τύποιτύποι:: αα καικαι aa. . ΤρίαΤρία γονίδιαγονίδια στηστη σειράσειρά. . ΈναΈνα ενεργόενεργό γονίδιογονίδιο στηστημέσημέση: : ΜΑΤαΜΑΤα καικαι MATaMATa. . ΔύοΔύο ««σιωπηλάσιωπηλά»» ακριανάακριανά γονίδιαγονίδια: : ΜΑΤαΜΑΤα καικαι ΜΑΤΜΑΤaa

((««ιδιόμορφαιδιόμορφα»») () (HML HML ήή HMR HMR θέσειςθέσεις))

ΑντιγραφήΑντιγραφή καικαι μετάθεσημετάθεση σιωπηλούσιωπηλού γονιδίουγονιδίου αντίθετουαντίθετου τύπουτύπου στηνστην περιοχήπεριοχή τουτουενεργούενεργού γονιδίουγονιδίου ΜΑΤΜΑΤ οδηγείοδηγεί στηνστην ενεργοποίησηενεργοποίηση τουτου σιωπηλούσιωπηλού γονιδίουγονιδίου καικαι τηντηνεναλλαγήεναλλαγή συζευκτικώνσυζευκτικών τύπωντύπων. . ΑυτήΑυτή ηη εναλλαγήεναλλαγή συμβαίνεισυμβαίνει κατάκατά τηντην εκβλάστησηεκβλάστηση

καικαι εγγυάταιεγγυάται ότιότι τοτο νέονέο κύτταροκύτταρο θαθα είναιείναι αντιθέτουαντιθέτου τύπουτύπου απόαπό τοτο πατρικόπατρικό

ΒασικάΒασικά χαρακτηριστικάχαρακτηριστικά κυττάρωνκυττάρων αα καικαι aa

αα: : ΕνεργόΕνεργό ΜΑΤαΜΑΤα, , ενεργοποιείενεργοποιεί τηντην παραγωγήπαραγωγή τηςτης αα--ΦερομόνηςΦερομόνης καικαι τουτου υποδοχέαυποδοχέα γιαγιατηντην aa--ΦερομόνηΦερομόνη. . ΔενΔεν σποριώνεισποριώνει καικαι διασταυρώνεταιδιασταυρώνεται μεμε κύτταρακύτταρα aa..

aa:: ΕνεργόΕνεργό ΜΑΤΜΑΤaa,, ενεργοποιείενεργοποιεί τηντην παραγωγήπαραγωγή τηςτης aa--ΦερομόνηςΦερομόνης καικαι τουτου υποδοχέαυποδοχέα γιαγιατηντην αα--ΦερομόνηΦερομόνη. . ΔενΔεν σποριώνεισποριώνει καικαι διασταυρώνεταιδιασταυρώνεται μεμε κύτταρακύτταρα αα..

ΣΕΝΑΡΙΟΣΕΝΑΡΙΟ ΣΥΖΕΥΞΗΣΣΥΖΕΥΞΗΣ

ΣταΣτα κύτταρακύτταρα αα ηη αα--ΦερομόνηΦερομόνη παράγεταιπαράγεται συνεχώςσυνεχώς, , διαχέεταιδιαχέεται καικαι αναγνωρίζεταιαναγνωρίζεται απόαπόειδικόειδικό υποδοχέαυποδοχέα σταστα κύτταρακύτταρα aa. . ΟΟ υποδοχέαςυποδοχέας μεταγάγειμεταγάγει τοτο ορμονικόορμονικό σήμασήμα σταστα γονίδιαγονίδιατουτου κυττάρουκυττάρου ώστεώστε ηη κυτταρικήκυτταρική διαίρεσηδιαίρεση νανα σταματήσεισταματήσει στηνστην ««αρχήαρχή»» τηςτης G1 G1 φάσηςφάσης. . ΣτηΣτη φάσηφάση αυτήαυτή τατα κύτταρακύτταρα a a παράγουνπαράγουν aa--ΦερομόνηΦερομόνη πουπου μεμε τητη σειράσειρά τηςτης διαχέεταιδιαχέεται σταστακύτταρακύτταρα αα, , αναγνωρίζεταιαναγνωρίζεται απόαπό ειδικόειδικό υποδοχέαυποδοχέα καικαι τοτο σήμασήμα μετάγεταιμετάγεται σταστα γονίδιαγονίδια τουτου

κυττάρουκυττάρου αα. . ΑκολουθείΑκολουθεί ηη παραγωγήπαραγωγή μικρώνμικρών εκφύσεωνεκφύσεων ((γλυκοπρωτεΐνεςγλυκοπρωτεΐνες) ) πουπουλειτουργούνλειτουργούν σανσαν σωληνώσειςσωληνώσεις σύζευξηςσύζευξης, , τατα κύτταρακύτταρα προσκολούνταιπροσκολούνται μεμε τητη βοήθειαβοήθειααγλουτινώναγλουτινών. . ΑκολουθείΑκολουθεί πλασμογαμίαπλασμογαμία καικαι καρυογαμίακαρυογαμία, , δηλαδήδηλαδή παράγεταιπαράγεται έναένα

διπλοειδέςδιπλοειδές κύτταροκύτταροΤοΤο διπλοειδέςδιπλοειδές αα//a a έχειέχει ενεργάενεργά καικαι τατα δύοδύοιδιόμορφαιδιόμορφα γονίδιαγονίδια ΜΑΤαΜΑΤα καικαι ΜΑΤΜΑΤaa, , ταταπροϊόνταπροϊόντα τωντων οποίωνοποίων σχηματίζουνσχηματίζουν έναέναετεροδιμερέςετεροδιμερές, , τηντην πρωτεΐνηπρωτεΐνη MATMATαα//MATaMATa. H . H λειτουργίαλειτουργία τηςτης πρωτεΐνηςπρωτεΐνης αυτήςαυτής καταστέλλεικαταστέλλειγονίδιαγονίδια τηςτης απλοειδούςαπλοειδούς φάσηςφάσης. . ΕτσιΕτσι, , εκτόςεκτόςάλλωνάλλων, , δενδεν παράγονταιπαράγονται φερομόνεςφερομόνες καικαι υποδοχείςυποδοχείς, , καικαι άλλεςάλλες πρωτεΐνεςπρωτεΐνες αναγκαίεςαναγκαίες γιαγια τηντην σύζευξησύζευξη. . ΤοΤο διπλοειδέςδιπλοειδές μπορείμπορεί νανα συνεχίσεισυνεχίσει τητη ζωήζωή τουτου ήήνανα μειωθείμειωθεί καικαι νανα σποριώσεισποριώσει. . ΗΗ σπορίωσησπορίωσηευνοείταιευνοείται απόαπό διατροφικέςδιατροφικές συνθήκεςσυνθήκες ««πείναςπείνας»»..

ΤαΤα ιδιόμορφαιδιόμορφα ΜΑΤαΜΑΤα καικαι ΜΑΤΜΑΤaa είναιείναι ρυθμιστικάρυθμιστικά μεταγραφικάμεταγραφικάγονίδιαγονίδια πουπου ελέγχουνελέγχουν τηντην έκφρασηέκφραση πολλαπλώνπολλαπλών γονιδίωνγονιδίων πουπου

καθορίζουνκαθορίζουν τοντον τύποτύπο τουτου κυττάρουκυττάρου. . ΑλλάΑλλά καικαι γονιδίωνγονιδίων ασχέτωνασχέτων μεμε τητησύζευξησύζευξη, , όπωςόπως τοτο ρετρομεταθετόρετρομεταθετό στοιχείοστοιχείο TyTy1 1 καικαι άλλαάλλα πουπου

εμπλέκονταιεμπλέκονται στονστον σχηματισμόσχηματισμό ψευδομυκηλίουψευδομυκηλίου..

ΤαΤα ιδιόμορφαιδιόμορφα ΜΑΤαΜΑΤα καικαι MATaMATa είναιείναι διπλάδιπλά γονίδιαγονίδια πουπου κωδικεύουνκωδικεύουντιςτις πρωτεΐνεςπρωτεΐνες

αα1 1 καικαι αα2 2 καικαι aa1 1 καικαι aa22

ΤοΤο σενάριοσενάριο αυτόαυτό είναιείναι απόαπό τατα απλούστερααπλούστερα. . ΣτουςΣτους ετεροθαλλικούςετεροθαλλικούςνηματοειδείςνηματοειδείς μύκητεςμύκητες υπάρχουνυπάρχουν πολυπλοκότερεςπολυπλοκότερες διαδικασίεςδιαδικασίες πουπου σεσεπολλέςπολλές περιπτώσειςπεριπτώσεις εμπλέκουνεμπλέκουν δεκάδεςδεκάδες ιδιόμορφωνιδιόμορφων μεμε εκατοντάδεςεκατοντάδες

συνδυασμούςσυνδυασμούς, , άλλοιάλλοι τωντων οποίωνοποίων είναιείναι γόνιμοιγόνιμοι καικαι άλλοιάλλοι όχιόχι..