Oasis PRiME 生物样本分析的最佳选择”Ÿ物... · 2019-07-04 · Oasis PRiME HLB 3-Step...

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生物样本方法开发策略

Waters CG Marketing

孙超


生物分析方法开发的挑战

http://www.google.com/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjdzrau7ILMAhULGz4KHdEAD_MQjRwIBw&url=http://equitech-bio.en.frbiz.com/group-emulsifiers/37307909-non_sterile_rat_plasma_with_edta.html&bvm=bv.119028448,d.cWw&psig=AFQjCNEGfKXoafTgizSy2Kb6NRTJOgoU7g&ust=1460335615335786

http://www.google.com/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjnorfy7ILMAhUCdT4KHVbrCQEQjRwIBw&url=http://www.paduiblog.com/pa-dui/pennsylvania-dui-appeal-another-conviction-overturned/&bvm=bv.119028448,d.cWw&psig=AFQjCNHfQvJQmbVWryZEDZnfj9BHNLr-1g&ust=1460335781809882

https://www.google.com/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwiLncPe7ILMAhWMCD4KHeUYD_gQjRwIBw&url=https://www.thermoscientific.com/en/product/cedia-oral-fluid-drugs-abuse-assays.html&bvm=bv.119028448,d.cWw&psig=AFQjCNFqH0NhNjza6mWcBIegH6Blj37Q2w&ust=1460335729670050


生物分析挑战罪魁祸首-磷脂

ü 血中产生基质效应的最主要成分；

ü 含有亲水基团容易离子化；

ü 含有亲脂基团容易在色谱柱上富集；

ü 分子量不定难以监测；

ü 蛋白沉淀无法去除

常见误区

n 监测磷脂，并未发现背景很高

R：亲脂性的磷脂在柱上富集，进

样几针或几十针背景逐渐升高或突

然流出，并无规律可循

n 方法验证“通过了”

R: 方法验证通常采用混合血，实

际分析中样本磷脂组成差异更大

n 同位素内标可消除基质效应

R：研究表明，氘代内标和原型受

基质效应干扰程度不同

我们的目标完全去除磷脂，让方法开发更简单


磷脂的堆积会导致基质效应以及不可预测的结果

使用蛋白沉淀法，磷脂会堆积在色谱

柱中（一批50个样品）

右图显示蛋白沉淀后第一针进样和最

后一针进样的磷脂色谱图和分析物色

谱图。可以看到磷脂的堆积以及和目

标物的共流出，这会造成基质效应，

并影响定量准确性。

Application Note: Rapid, Reliable Metabolite Ratio Evaluation for MIST Assessments in Drug Discovery and Preclinical Studies, 720004453enApplication Note: Rapid, Reliable Metabolite Ratio Evaluation for MIST Assessments in Drug Discovery and Preclinical Studies, 720004453en

Danaceau et al. 2014 Bioanalysis 6(6) 761-771


磷脂的监测方法1:监测单独的MRM离子通道

We monitor MRM transitions 496 > 184 (C16) and 524 > 184 (C18)

We monitor MRM transitions 704 > 184, 758 > 184, and 806 > 184 (C30-38)

Typical lysophospholipid

Typical Phosphatidylcholine

Utilizing a triple quadrupole mass spectrometer, we monitor individual MRM transitions to quantify levels of specific lipids.

184

184


磷脂的监测方法2:监控所有磷脂*

Monitoring 184 > 184 shows all phosphatidylcholines in the sample and is a good measure of overall cleanliness.

Monitoring 1 MRM transition rather than 5 is a more efficient use of duty cycle.

Polar Head GroupFragment Hydrophobic Chains

*Little, J., Wempe, M. and Buchanan, C. Journal of Chromatography B, 833 (2006) 219-230.

184


全扫描 (100~1000)方式下的MS谱图

直接注入标样与经不同净化方式所得鼠血清基质的混合物 (未经色谱分离)

消除样品基质中的干扰物可大大减少对样品离子化的干扰。

标样溶液

固相萃取 (<10%离子抑制)

液液萃取 (40-60%离子抑制)

蛋白质沉淀 (80-90% 离子抑制)

Scan ES+6.00 e7

Scan ES+6.00 e7

Scan ES+6.00 e7

Scan ES+6.00 e7

心得安Propranolol


¡ 我到底用哪种前处理方法最好？

¡ 我不知道怎么做SPE 的方法开发？

¡ 我没有SPE 操作经验？

前处理技术的挑战


生物样本前处理方法决策树

样品是否需要浓缩？

否是

OStro 板 .通过式SPE.无需方法开发.去除磷脂/蛋白

OASIS PRiME HLB. 三步法. 流速更快.去除磷脂/色素/盐

OASIS MCX/MAX/WAX/WCX.2*4方法学.高选择性.进一步提升灵敏度

OASIS PRiME MCX （pKa>=4.5）. 三步法/四步法. 流速更快. 去除磷脂



第一步：Ostro 96孔板/升级版PPT法

将Ostro 放置到收集板上,加入 50-200µL 血浆到孔内

用力加入3倍体积的 2% 甲酸乙腈溶液, (不推荐使用甲醇),用排枪抽吸三次以混匀

利用正压或真空装置过滤样本,滤液分析

Ostro Training Materials/ostro_flash.exe


Ostro 96孔板-回收率&除磷脂效果

为各种分析物获得最佳回收率为各种分析物获得最佳回收率

(6 replicates in data set)

残留磷脂水平残留磷脂水平


Ostro应用于：药物及其代谢物研究

Ostro+XP=快速色谱分析，快速柱平衡，降低基质效应，提高方法稳定性

关键词：

n 通过去除血浆中蛋白和磷脂，不会吸附样品中的待测物

n 可检测到更多的代谢物，掌握全局


Ostro应用于：磷脂组学—Ostro+BEH Hilic

¡ Ostro下接2ml 收集板

¡ 取100ul 血浆上样到Ostro板

¡ 加入800ul 乙醇，并用枪混匀10X

¡ 负压装置加压到-15Hg，收集洗脱液

¡ 重复第三、第四步，合并流通液

¡ 加入800ul 4.5:4.5:1 氯仿：甲醇：TEA混合溶液

¡ 负压装置加压到-15Hg，收集洗脱液

¡ 重复第六、第七步，合并洗脱液

¡ 分别将流通液和洗脱液挥干，

用200ul 氯仿：甲醇 1：1复溶、进样

到BEH Hilic色谱柱分析




否是






PROCESS

ROBUSTNESS

improvements in…

MATRIX EFFECTS

EASE of USE

Oasis PRiME……


Oasis PRiME HLB :更简单的方法流程

活化

平衡

清洗

5% 甲醇水

洗脱

90：10 乙腈/甲醇

上样上样

100% 甲醇

100% 水

5% 甲醇水

100% 甲醇

上样

传统的流程简化的

不怕流干


微孔湿润


微孔去湿


去湿现象/干涸效应对SPE的影响

步骤正相反相

活化不需要始终需要

平衡建议进行始终需要

¡ 对于反相SPE而言，活化和平衡步骤至关重要

如果在活化和平衡步骤操作不谨慎，特别是当使用真空萃取装置时，有些柱芯的吸附剂孔可能会不到润湿，从而导致化合物的保留能力差和样品回收率变差。


Oasis® HLB固相萃取吸附(1996):现代固相萃取技术的划时代进步

l “亲脂性结构”l 提供反相保留特性

亲水性

单体

亲脂性

单体

NO

v无硅醇基活性vpH 应用范围 0-14v吸附剂干涸后对回收率和分析重现性全无影响v亲水性结构如同‘极性抓钩’，有助于保留亲水性物质 v极高的比表面积, 比硅胶吸附剂用量减少2/3

l“亲水性结构”提供优良的浸润性即使吸附剂干涸也无需担心回收率降低或分析结果重现性不佳的问题

‘HLB’= Hydrophilic Lipophilic Balance

N-乙烯吡咯烷酮二乙烯基苯

HydroCollapse Best.mpg


血浆样品净化效果比较

Oasis PRiME HLB 3-Step Protocol vs. Competitor 5-Step Protocol

CLEANER samples in fewer steps with Oasis PRiME HLB

Phospholipids Remaining in Final Eluate

Oasis PRiME HLB Competitor SX Competitor SOPPT 1:3 Plasma:ACN

Area

Cou

nts

n=5

Comparative separations may not be representative of all applications.


更快的流速

¡ 更快速不管是对于小柱还是96孔板，更不容于出现堵柱情况

Loading compared to Oasis HLB with 4 inch Hg, N=4

FASTER flows across multiple devices and sample matrices


Oasis PRiME HLB3步法流程示例:回收率和基质效应

回收率基质效应

3-Step Protocol CONCLUSIONHIGH analyte recoveries (>80%) and

LOW (<15%) matrix effects


Oasis PRiME HLB : 血浆中内源性类固醇

Oasis PRiME HLB µElution plate, N=4

流程

¡ 150 μL 血浆 (10 ng/mL)

¡ 300 μL 4:1 MeOH:ZnSO4 (89g/L) 蛋白沉淀

¡ 3220 rcf离心10min

¡ 上清液用900 μL 4% H3PO4

处理后的样品上样(2次)

2 x 200 μL of 25% MeOH清洗

2 x 25 μL 90:10 ACN:MeOH洗脱

50 μL 25% MeOH 稀释

进样7.5 μL

ModifiedOasis PRiME Protocol


Cortisol Adione 17-OHP

0%

20%

40%

60%

80%

-20%

-40%

RecoveryMatrix Effects

Recovery Matrix Effects

Mean S.D. %RSD Mean S.D.

皮质醇 72.7% 3.1% 4.2% -19.0% 3.1%

雄烯二酮 72.5% 1.9% 2.7% -6.9% 2.2%

17-羟孕酮 71.5% 1.9% 2.6% -4.5% 1.3%

Mean -10.1%

Oasis PRiME HLB 回收率和基质效应

较低的标准偏差(3.1% or less)证明 Oasis PRiME HLB

的提取和净化效果的一致性

血浆中内源性类固醇

平均基质效应10%


磷脂峰面积

PPT 22152370

PRiME HLB 690579

Oasis PRiME HLB 表现优异:去除97%磷脂 vs. PPT

Oasis PRiME HLB vs. PPT 磷脂去除

PPT

Oasis PRiME HLB

PPT 流程:

150 μL 血浆 (10 ng/mL)

加入300 μL 4:1 MeOH:ZnSO4 3220 rcf 离心10min

血浆中内源性类固醇




否是






混合模式的吸附剂


Oasis® 2x4 方法

酸

样品制备

上样

清洗:5% 氨水

洗脱 1:100% 甲醇

洗脱 2:含2% 甲酸的甲醇

中性化合物

对于碱:pKa 2-10使用Oasis® MCX

对于强酸pKa <1.0使用 Oasis® WAX

对于强碱pKa >10使用 Oasis® WCX

对于酸pKa 2-8使用 Oasis® MAX

提取流程 2样品制备

上样

清洗:2% 甲酸

洗脱1:100% 甲醇

洗脱2:含5% 氨水的甲醇

提取流程 1

碱强酸强碱

酸性化合物碱性化合物


碱 (质子接受体)

B BH+ + OH-

(未离子化) (离子化)

50% @ pKb* 50% 0% Low pH 100%100% High pH 0%

* pKa of conjugate acid

碱性化合物离子化:离子交换机理的关键

pKa = pH at which 50% of the analyte molecules in solution are charged (ionized) and 50% are un-ionized


酸(质子供给体)

HA H+ + A-

(未离子化) (离子化)

50% @ pKa 50%100% Low pH 0% 0% High pH 100%

酸性化合物离子化:离子交换机理的关键

pKa = pH at which 50% of the analyte molecules in solution are charged (ionized) and 50% are un-ionized


方法开发依据：OASIS 2×4方法学

¡ 氟尼酸是一种非甾体抗炎免疫药 (NSAID)

¡ 治疗风湿性关节炎

¡ 两性离子 (羧酸与氨基)

氟尼酸M.W. 282.2pKa’s* = 4.44 and 2.26

*Takacs-Novak, K.; Avdeef, A.; Box, K. J.; Podanyi, B.; Szasz, G. J. Pharm. Biomed. Anal. 1994 (12) pp. 1369-1377.


4种吸附剂上的回收率：氟尼酸

氟尼酸的结果

0

20

40

60

80

100

Oasis® WAXElute 2

% 回

收率

Oasis® MCXElute 2*

Oasis® WCXElute 1

Oasis® MAXElute 2

*In addition, 18% is found in Elute 1

Chambers所有吸附剂的回收率都是可接受的


评估洗脱液的基质效应

-30

-20

-10

0

10

20

% 基

质效应

Oasis® WAXElute 2

Oasis® MCXElute 2

Oasis® WCXElute 1

Oasis® MAXElute 2

Chambers

Oasis® WCX 被排除.

增强效应

抑制效应


监控残留的磷脂

3 Phospholipid Channels

Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40

%

0

100

0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40

%

0

100

0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40

%

0

100

0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40

%

0

100MAX_e2_010406_003 1: MRM of 5 Channels ES+

TIC8.00e4

WAX_e2_010406_003 1: MRM of 5 Channels ES+ TIC

8.00e4

MCX_e2_010406_003 1: MRM of 5 Channels ES+ TIC

8.00e4

2.49

2.422.402.53

2.95

WCX_e1_010406_003 1: MRM of 5 Channels ES+ TIC

8.00e42.53

2.48

2.42

2.352.33

2.952.892.69

Oasis® MCX

Oasis® WCX

Oasis® MAX

Oasis® WAX

查看流动相的兼容性 Chambers


洗脱液与流动相的兼容性

¡流动相 pH 10¡每种吸附剂的最终洗脱溶剂:

– Oasis® MCX Elute 2: 5% NH4OH in MeOH– Oasis® WAX Elute 2: 5% NH4OH in MeOH– Oasis® WCX Elute 1: 100% MeOH– Oasis® MAX Elute 2: 2% HCOOH in MeOH

¡结论:– Oasis® MAX 不兼容– Oasis® WAX 兼容性好

o基于上述3个因素，最终确定 Oasis® WAX。


介绍 Oasis PRiME MCX: Oasis PRiME 家族新成员

• 样品预处理• 典型的酸化使用 4% H3PO4，

1:1 稀释

• 100 mM 甲酸胺含 2% 甲酸

上样

• 100% 甲醇

清洗 1

• 5% 氨化甲醇

清洗 2

洗脱

简单洁净:

•简单通用的方法即可让碱性化合物获得高的，可重复的回收率 √

•去除掉提取液中 99% 磷脂干扰√

• 该产品是经过PRIEM MCX产品QC检验，以确保性能 √

快速:

•无需活化平衡步骤√

•优化生产工艺以确保流速稳定 √

Oasis PRiME MCX 4 Step Method技术专利申报中

Not Validated for In Vitro Diagnostic Use


Oasis PRiME MCX: Certificate of Analysis


Mor

phine

Oxym

orph

one

Hydr

omor

phon

edih

ydro

code

ineNa

loxon

eCo

deine

preg

abali

nga

bape

ntin

met

hylon

e6-

beta

Nalt

rexo

lNo

roxy

codo

neAm

phet

amine

Naltr

exon

eOx

ycod

one

6-ac

etyl

mor

phine

MDA

Norh

ydro

codo

neet

hylon

em

ethe

dron

eHy

droc

odon

e

O-de

smet

hyl T

ram

adol

dehy

dron

orke

tam

ine

Met

ham

phet

amine

MDM

A

m-h

ydro

xybe

nzoy

lecgo

nine

butyl

one

Phen

term

inem

ephe

dron

eno

rket

amine

MDE

Arit

alinic

acid

keta

mine

Norfe

ntan

yl

Benz

oylec

gonin

e

7-am

inoclo

naze

pam

N-de

smet

hyl z

opicl

one

Zopic

lone

Tram

adol

N-de

smet

hyltr

amad

ol

met

hylph

enida

teTa

pent

adol

α-PV

P

7-am

inoflu

nitra

zepa

mCo

caine

Norm

eper

idine

Mep

eridi

neZo

lpide

mα-

PVP

met

Norb

upre

norp

hine

Chlor

iazep

oxide

trazo

done

Coca

ethy

lene

fenf

luram

inePh

ency

clidin

eFe

ntan

yl

α-Hy

drox

ymida

zolam

Mida

zolam

Flur

azep

amBu

pren

orph

ineED

DPve

rapa

mil

Prop

oxyp

hene

Met

hado

ne

α-Hy

drox

yalpr

azola

mAl

praz

olam

120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%

Oasis MCX Recovery

Oasis PRiME MCX 4-Step

Recovery with Oasis PRiME MCX and Oasis MCX (N=4)

Recoveries are equivalent to Oasis MCX. What about phospholipids?



在洗脱步骤降低了磷脂含量



MCX PRiME HLB 90:10 PRiME HLB 80:20 PRiME HLB 50:500

20000000

40000000

60000000

80000000

100000000

120000000

140000000

PC/LPC Concentration in Sample Eluate

58X decrease in phospholipid concentration compared to Oasis MCX Protocol 1

Oasis PRiME HLB with 90/10 ACN:MeOH

Oasis MCX with Protocol 1Oasis PRiME MCX with 4 Step Method



可以更简单一点么?

• 样品预处理***• 200 mM 甲酸胺含有 4%

H3PO4 ，进行 1:1 稀释

• 100% MeOH

Load

• 5% 氨化甲醇

清洗 1

洗脱

Oasis PRiME MCX 3 Step Method专利技术申请中

***Note: The ammonium formate is

being added to the load solution, 200 mM with 4%

H3PO4(not 4% FA) for a final

concentration of 100 mM Ammonium formate and 2%

H3PO4

YES!!!Eliminate a wash step

to save even more time



Mor

phine

Oxym

orph

one

Hydr

omor

phon

edih

ydro

code

ineNa

loxon

eCo

deine

preg

abali

nga

bape

ntin

met

hylon

e6-

beta

Nalt

rexo

lNo

roxy

codo

neAm

phet

amine

Naltr

exon

eOx

ycod

one

6-ac

etyl

mor

phine

MDA

Norh

ydro

codo

neet

hylon

em

ethe

dron

eHy

droc

odon

e

O-de

smet

hyl T

ram

adol

dehy

dron

orke

tam

ine

Met

ham

phet

amine

MDM

A

m-h

ydro

xybe

nzoy

lecgo

nine

butyl

one

Phen

term

inem

ephe

dron

eno

rket

amine

MDE

Arit

alinic

acid

keta

mine

Norfe

ntan

yl

Benz

oylec

gonin

e

7-am

inoclo

naze

pam

N-de

smet

hyl z

opicl

one

Zopic

lone

Tram

adol

N-de

smet

hyltr

amad

ol

met

hylph

enida

teTa

pent

adol

α-PV

P

7-am

inoflu

nitra

zepa

mCo

caine

Norm

eper

idine

Mep

eridi

neZo

lpide

mα-

PVP

met

Norb

upre

norp

hine

Chlor

iazep

oxide

trazo

done

Coca

ethy

lene

fenf

luram

inePh

ency

clidin

eFe

ntan

yl

α-Hy

drox

ymida

zolam

Mida

zolam

Flur

azep

amBu

pren

orph

ineED

DPve

rapa

mil

Prop

oxyp

hene

Met

hado

ne

α-Hy

drox

yalpr

azola

mAl

praz

olam

120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%



Recovery with Oasis PRiME MCX:3 Step and 4 Step Methods (N=4)

Recoveries are comparable between the methods. What about phospholipids?



在洗脱步骤降低了磷脂含量



MCX PRiME HLB 90:10 PRiME HLB 80:20 PRiME HLB 50:500

20000000

40000000

60000000

80000000

100000000

120000000

140000000

PC/LPC Concentration in Sample Eluate

3X increase in phospholipid concentration compared to Oasis PRiME MCX 4 Step

Method

Oasis PRiME HLB with 90/10 ACN:MeOH

Oasis MCX with Protocol 1

Oasis PRiME MCX with 4 Step

Method

Oasis PRiME MCX with 3 Step

Method





否是






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