N ? > ? J :Ь G H ? = H K M > : J K L < ? G G H ? Ю @ ? L...

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ

ПАТОЛОГИИ И ПАТОФИЗИОЛОГИИ»

На правах рукописи

Островский Дмитрий Сергеевич

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ КОНСТРУИРОВАНИЯ ИСКУССТВЕННОЙ

РОГОВИЦЫ НА ОСНОВЕ 3D КЛЕТОЧНЫХ СФЕРОИДОВ И ПОЛИМЕРНЫХ

МАТЕРИАЛОВ

14.03.03 - патологическая физиология

14.01.24 – трансплантология и искусственные органы

Диссертация

На соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук,

Сабурина Ирина Николаевна,

доктор медицинских наук,

Борзенок Сергей Анатольевич

Москва – 2018

2

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................4

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................9

1.1 Строение роговицы........................................................................................9

1.1.1 Передний эпителий роговицы.........................................................11

1.1.2 Строма...............................................................................................12

1.1.3 Задний эпителий...............................................................................21

1.2 Создание искусственной роговицы..............................................................23

1.2.1 Характеристика клеток……………………………………………23

1.2.2 Полимерные материалы...................................................................27

1.2.3 Биосинтетические материалы.........................................................29

1.2.4 Фиброин шелка.................................................................................30

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ........................................................................................................32

2.1 Первый этап. Выделение первичной клеточной культуры кератоцитов и

клеток заднего эпителия......................................................................................33

2.1.1 Выделение первичной клеточной культуры кератоцитов.............34

2.1.2 Выделение клеток заднего эпителия роговицы..............................35

2.2 Второй этап. Подбор питательной среды для клеточных культур............35

2.2.1 Подбор питательной среды для 2D культуры кератоцитов...........36

2.2.2 Подбор питательной среды для 2D культуры клеток заднего

эпителия роговицы....................................................................................37

2.2.3 2D культивирование полученных клеточных культур.................37

2.2.4 Криоконсервация/Дефростация клеточных культур кератоцитов и

клеток заднего эпителия роговицы..........................................................38

2.3 Третий этап. 3D клеточное культивирование..............................................38

2.3.1 Определение жизнеспособности полученных 2D и 3D клеточных

культур.......................................................................................................40

2.3.2 Проведение иммуноцитологического исследования полученных

2D и 3D клеточных культур......................................................................40

3

2.4 Четвертый этап. 2D культивирование кератоцитов на полимерных

материалах...........................................................................................................43

2.5 Пятый этап. 2D и 3D культивирование кератоцитов на фиброине

шелка....................................................................................................................44

2.5.1 Метод «ДНК-комет»........................................................................45

2.5.2 Определение раннего апоптоза.......................................................46

2.6 Обработка количественных данных.............................................................46

2.7 Перечень используемого лабораторного оборудования и расходных

материалов...........................................................................................................47

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.............................................................................................50

3.1 Получение первичной клеточной культуры...............................................50

3.1.1 Кератоциты.......................................................................................50

3.1.2 Клетки заднего эпителия роговицы................................................53

3.2 Подбор питательной среды для клеточных культур...................................53

3.2.1 2D культивирование кератоцитов...................................................53

3.2.2 2D культивирование клеток заднего эпителия роговицы.............68

3.3 3D культивирование......................................................................................76

3.3.1 3D культивирование кератоцитов...................................................76

3.3.2 3D культивирование сфероидов клеток заднего эпителия

роговицы....................................................................................................96

3.4 2D культивирование кератоцитов на полимерных материалах...............100

3.5 Культивирование кератоцитов на фиброине шелка.................................102

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................107

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................116

ОСНОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.................................................118

БИБЛИОГРАФИЯ.......................................................................................................119

4

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

По данным Всемирной организации здравоохранения, заболевания

роговицы являются одной из основных причин слепоты во всем мире и находятся

на 4-ом месте в структуре инвалидности по зрению (World Health Organization,

2017). Примерно 25% от общего числа больных составляют помутнения роговицы,

приводящие к частичной или полной потере зрения (Либман Е.С., Калеева Э.В.,

Рязанов Д.П. 2012). Традиционно при лечении таких патологических состояний

применяют методы сквозной или послойной кератопластики с использованием

трупного донорского материала (Борзенок С.А. 1988–2015). В наиболее тяжелых

случаях прибегают к кератопротезированию – замене мутной оптической части

роговицы искусственным прозрачным материалом (Мороз З.И. 1987; Борзенок С.А.

2012; Cardon H. 1964; Huang Y.C. 2011). Возможности кератопластики

ограничиваются дефицитом трупного донорского материала, а современное

кератопротезирование не позволяет гарантированно избежать отторжения

кератопротеза (Борзенок С.А. 2008).

В связи с этим, во всем мире проводятся научные исследования в области

разработки искусственной роговицы - искусственно созданной методами

биоинженерии ткань, обладающая прочностными, оптическими и

трансплантационными свойствами, идентичными натуральной роговице (Борзенок

С.А., Сабурина И.Н. 2012; Polisetti N., Islam M.M., Griffith M. 2013).

В зависимости от степени поражения структур переднего сегмента глаза,

тканевые эквиваленты роговицы могут иметь различные составные компоненты и,

соответственно, могут представлять собой эквивалент стромы роговицы для

передней послойной кератопластики, эквивалент комплекса «строма + задний

эпителий» для задней послойной кератопластики, эквивалент всех слоев роговицы

для сквозной кератопластики (Yamato M., Hayashida Y., Watanabe K. 2004; Lai J.Y.,

Chen K.H., Hsiue G.H. 2007).

Для создания каждого слоя роговицы in vitro используются различные

источники донорского клеточного материала и техники конструирования,

5

наиболее распространенной из которых является культивирование клеток

роговицы на искусственном внеклеточном матриксе (Parke-Houben R., Fox C.H.,

Zheng L.L. et al., 2015; Mirazul I.M., CėplaV. et al., 2015). Передний и задний

эпителиальные слои культивируют в двухмерных (2D) условиях на пленках –

эквивалентах боуменовой и десцеметовой мембран, а клетки стромы роговицы – в

трехмерных условиях (3D) (Takezawa T., Nishikawa K., Wang P.C. 2011; Yoshida J.,

Oshikata-Miyazaki A., Yokoo S. et al., 2014).

Одним из наиболее перспективных материалов для тканевой инженерии,

выполняющих функцию матрицы, является шелк паутинной нити. Основной

структурный белок паутинной нити – фибриллярный белок фиброин, обладает

высокой прочностью на разрыв и эластичностью, биосовместимостью и заданной

биодеградируемостью (Агапов И.И., Пустовалова О.Л., Мойсенович М.М. и др.,

2009; Altman G.H., Diaz F., Jakuba C., et al., 2003; Nazarov R., Jin H.J., Kaplan D.L.,

et al., 2004; Kim U.J., Park J., Kim H.J., et al., 2005; Bogush V.G., Sokolova O.S.,

Davydova L.I., et al., 2009). Такие матриксы способны поддерживать рост и адгезию

клеток в течение длительного времени и сохранять высокий уровень их

жизнеспособности при культивировании.

С учетом изученной литературы нам представляется возможным

конструирование искусственной роговицы с использованием полимерных

материалов. Современные методы 3D культивирования клеток позволяют

достигать образования прозрачного естественного внеклеточного матрикса in vitro

с помощью вариаций культуральных условий (Zhihua Z., Guoguang N., Jin S.C., et

al., 2014). Многоклеточный сфероидный микроагрегат 3D сфероид – форма

клеточной культуры, в которой клетки приближаются по свойствам к клеткам

нативной ткани и при определенных условиях синтезируют естественный

внеклеточный матрикс, что делает их подходящими для конструирования

искусственной роговицы (Byun Y.S., Tibrewal S., Kim E. et al., 2014). С учетом всего

выше перечисленного и анализа литературы была определенна цель настоящего

исследования.

6

Цель работы: Разработка методологических подходов к конструированию

искусственной роговицы на основе культивированных клеток трупной донорской

роговицы в виде 3D клеточных сфероидов и полимерных материалов.

Задачи исследования:

1. Разработать протокол выделения кератоцитов и клеток заднего эпителия

(роговичного эндотелия) из трупной донорской роговицы человека.

2. Изучить в эксперименте in vitro особенности формирования 3D клеточных

сфероидов из выделенных кератоцитов и клеток заднего эпителия (роговичного

эндотелия) человека.

3. Изучить в эксперименте in vitro биосовместимость полимерных материалов,

пригодных для конструирования искусственной роговицы.

4. Изучить в эксперименте in vitro адгезивные свойства полученных 2D и 3D

клеточных культур к отобранному полимерному материалу.

Научная новизна

1. Впервые предложен оригинальный метод выделения кератоцитов роговицы

человека, который позволяет получить статистически более высокий выход

жизнеспособных клеток и сохранить их выживаемость для дальнейшего

культивирования. Показано, что оптимальным методом выделения клеток

заднего эпителия роговицы человека является эксплантационный.

2. Впервые показано, что добавление L-аскорбиновой кислоты в полную

питательную среду на основе DMEM/F12, содержащей 5% ЭТС, ФРФ при сроке

культивирования 35 суток, способствует максимальному накоплению

внеклеточного матрикса коллагена 1, 3, 5 и 6 типов, а так же увеличению

основных белков малых лейцин богатых протеогликанов (кератокансульфата и

люмикана) и снижению экспрессии нехарактерных белков (а-гладкомыщечного

актина и виментина) в 3D клеточных сфероидах кератоцитов.

3. Впервые показана возможность использования пленок фиброина шелка, как

материала показавшего наилучшие адгезивные свойства в сочетании с 3D

7

сфероидами из кератоцитов для создания слоистой структуры элементов

искусственной роговицы.

4. Впервые доказано, что 3D клеточные сфероиды являются наиболее

оптимальной структурой в сравнении с 2D культурой клеток роговицы

человека, и могут быть использованы при конструировании эквивалентов

искусственной роговицы.

Теоретическая и практическая значимость

1. Разработанный протокол выделения кератоцитов включает два этапа:

механическая деструкция, с последующей щадящей ферментативной

дезагрегацией стромы роговицы, что позволяет увеличить получаемое

количество жизнеспособных клеток на 23%, в сравнении с широко

используемым протоколом (р ≤ 0,05).

2. Впервые показано, что при культивировании клеток заднего эпителия роговицы

в полной питательной среде на основе DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС, в

течение 35 суток сохраняется гексогональная морфология и пролиферативная

активность.

3. Впервые показано, что при создании 3D сфероидов из клеток роговицы

человека, а именно кератоцитов и клеток заднего эпителия, для сохранения

характерного фенотипа и жизнеспособности оптимальным является 1000 и 500

клеток в сфероиде соответственно.

4. Разработан протокол создания эквивалента искусственной роговицы в виде

слоистой структуры на основе пленок из фиброина шелка и 3D сфероидов из

кератоцитов роговицы человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложенный протокол выделения и культивирования кератоцитов и клеток

заднего эпителия роговицы позволяет увеличить количество получаемых

клеток, сохранить характерный фенотип и высокую пролиферативную

активностью.

8

2. Условия 3D клеточного культивирования позволяющие получить сфероиды из

кератоцитов (1000 клеток на сфероид) и клеток заднего эпителия роговицы (500

клеток на сфероид), обладающие высокой жизнеспособностью и сохранным

фенотипом, а также способность синтезировать внеклеточный матрикс из

коллагенов 1, 3, 5, 6 типов.

3. Полимерный материал фиброин шелка обладает высокой биосовместимостью

с кератоцитами, а культивирование 3D клеточных сфероидов на пленках из

фиброина шелка, с последующим наслаиванием друг на друга, позволяет

получить слоистую структуру с равномерным распределением клеток.

Публикации по теме диссертации

Всего по теме выпускной квалификационной работы (диссертации)

опубликовано 9 публикации, 4 из которых в журналах, рекомендованных ВАК для

публикации основных научных результатов по теме диссертации.

Структура и объём выпускной квалификационной работы (диссертации)

Текст выпускной квалификационной работы (диссертации) изложен на 145

страницах, содержит 19 таблиц и 55 рисунков. Работа состоит из введения и 3 глав,

включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты

собственных исследований, содержит общее заключение, выводы и практические

рекомендации. Список литературы состоит из 257 источников, включающих 18

отечественных и 239 иностранных публикации.

Личный вклад автора

Автор принимал непосредственное участие в постановке задач исследования

и разработке концепции, осуществлял сбор материала для исследования, выполнял

стендовые исследования, участвовал в экспериментальных исследованиях.

Автором самостоятельно сформирована база данных, проведена статистическая

обработка, анализ и интерпретация полученных результатов.

9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заболевания, приводящие к помутнению роговицы, являются одной из

основных причин слепоты во всем мире. В глобальном масштабе помутнения

роговицы занимают четвертое место в структуре слепоты и слабовидения после

катаракты, глаукомы и возрастной макулярной дегенерации, и затрагивают от

четырех до восьми миллионов человек, 90% из которых живут в развивающихся

странах (Whitcher J.P., Srinivasan M., Upadhyay M.P. 2001; Murthy G.V.S., Johnson

G.J. 2012). Однако, следует отметить, что помутнение роговицы одного глаза,

которое так же приводят к инвалидности, не отражается в этих статистических

данных. Кроме того, доля лиц молодого возраста в данной нозологии значительно

больше, чем в других заболеваниях, вызывающих слепоту.

На сегодня основным методом лечения помутнения роговицы является

трансплантация донорской роговицы – кератопластика. Однако во всем мире

отмечается нехватка донорского материала, а иногда и противопоказания для его

использования, в связи с чем крайне актуальным является разработка альтернативы

использования донорской роговицы – имплантация искусственной роговицы.

Термин «искусственная роговица» в большей мере относился к

кератопротезам, которые предполагали использование пластмассовых полимеров

и других синтетических материалов, однако, в последнее время, этот термин

используется более широко для обозначения любого материала,

имплантированного с целью восстановления полной структуры и функции

роговицы.

1.1 Строение роговицы

Одной из основных задач создания искусственной роговицы является четкое

воспроизведение структуры и функций нативной роговицы.

Известно, что роговица представляет собой прозрачную часть фиброзной оболочки

глаза, располагающуюся в передней части глазного яблока и выполняющую две

основные функции: механическую (поддержание структурной целостности

глазного яблока) и оптическую (светопреломление и светопропускание) (Вит В.В.

2003; Guarnieri F.A. 2015). Роговица имеет форму выпукло-вогнутой линзы

10

толщиной в среднем 555 мкм в центральной части и до 700 мкм на периферии (Вит

В.В. 2003; Guarnieri F.A. 2015).

В строении роговицы выделяют 6 гистологических слоев:

1. передний эпителий, по морфологии являющийся многослойным плоским;

2. боуменова мембрана — базальная мембрана переднего эпителия;

3. строма — промежуточный слой роговицы;

4. слой Дуа - данный слой был открыт в 2013 году и представляет собой мембрану

между последним слоем кератоцитов стромы и десцеметовой мембраной (Dua

H.S, Faraj L.A., Said D.G., et al. 2013);

5. десцеметова мембрана — базальная мембрана заднего эпителия;

6. задний эпителий (иногда называемый эндотелием), по морфологии —

однослойный кубический (Вит В.В. 2003; Guarnieri, F. A. 2015).

На рисунке 1 показана упорядоченная структура ткани роговицы в

поперечном сечении

Рисунок 1. Строение роговицы. 1- передний эпителий, 2- боуменова мембрана, 3 - строма,

3.1 - кератоциты, 3.2 - коллагеновые волокна, 4- десцеметова мембрана, 5 - задний эпителий, 6 -

слой Дуа.

11

1.1.1 Передний эпителий роговицы

Передний эпителий роговицы представляет собой стратифицированный,

плоский, многослойный эпителий толщиной 50 мкм. Здоровый эпителий в норме

имеет 5-7 слоев клеток, которые условно можно разделить на три различных

клеточных слоя:

1) базальный слой, содержащий стволовые клетки, и являющийся

единственным эпителиальным клеточным слоем способным подвергаться митозу

(Hanna C., O'Brien J.E. 1960).

2) средний слой, содержащий клетки полигональной формы с наличием

тонофибрилл, которые в момент миграции клеток разрушаются и клетки

принимают ромбовидную форму (Hanna C., O'Brien J.E. 1960).

3) поверхностный слой плоских клеток, образующий плотные соединения,

создавая тем самым первичный химический и антиген-защитный барьер в роговице

(Hanna C., O'Brien J.E. 1960).

Поддержание постоянной десквамации эпителия роговицы зависит от

стволовых клеток, которые находятся в нише на стыке между склерой и роговицей

- лимбальная зона (Schermer A., Galvin S., Sun T.T. 1986). Повреждение стволовых

клеток лимба может привести к помутнению роговицы (Nieto-Nicolau N., Martinez-

Conesa E.M., Casaroli-Marano R.P. 2016).

Потеря эпителиального барьера обычно приводит к потере прозрачности

роговицы. В связи с чем была выдвинута гипотеза о том, что естественные или

тканевые трансплантаты не могут преуспеть без функционального эпителия.

Однако значительные успехи в культивировании эпителия роговицы на различных

субстратах (Zieske J.D. 1994) и тот факт, что донорские роговицы (которые

деэпителиализированы) получают эпителиальный рост от реципиента,

культивирование эпителия в настоящее время не является существенной целью в

разработке искусственной роговицы.

12

1.1.2 Строма

Более 90% роговицы составляет строма. Имеющиеся на сегодня данные

убедительно демонстрируют высокую значимость создания стромальной части в

связи с тем, что она обеспечивает большинство основных функций ткани роговицы.

Известно, что строма имеет толщину приблизительно 500 мкм и

представляет собой относительно бесклеточную структуру, содержащую

коллагеновые фибриллы 1 и 5 типа (Meek K.M., Leonard D.W. 1993);

гликозаминогликаны, такие как: кератансульфат и дерматансульфат (Anseth A.

1961); различные протеогликановые белки: кератокан, люмикан, декорин, мимекан

и другие белковые составляющие, включающие фибронектин, ламинин и коллаген

3 и 6 типов (Axelsson I., Heinegard D. 1978).

Прозрачность стромы роговицы в значительной степени обеспечивается

тонким взаимодействием между компонентами межклеточного матрикса и

кератоцитами (Вит В.В. 2003; Joyce N. C., Meklir, B. et al., 1996; Michelacci Y. M.

2003; Guarnieri F.A. 2015). Последние представляют собой популяцию

мезенхимальных клеток роговицы, которые располагаются между слоями

коллагеновых волокон, морфологически напоминающие дендритные клетки с

множеством отростков, которые, соединяясь друг с другом, образуют трехмерную

сеть (Вит В.В. 2003; Zieske J. D. 2004; Guarnieri F.A. 2015).

Кроме того, прозрачность стромы зависит от высокоорганизованного

коллагена (1, 3, 5, 6 типов), образующего фибриллы с равномерными

промежутками и размерами, что играет одну из ключевых ролей в поддержании

прозрачности роговицы. Среднее межфибриллярное расстояние составляет 41,5

нм, а диаметр коллагеновых фибрилл варьирует от 22,5 до 35 нм, в зависимости от

типа коллагена (Sayers Z., Koch M.H., Whitburn S.B. 1982). Фибриллы образуют

около 200 слоев ламелл, каждая из которых ориентирована в направлении,

ортогональном соседним ламеллам, для обеспечения прочности, упругости и

прозрачности роговицы (Рис. 2) (Maurice D.M. 1957). Верхние ламеллы

переплетаются и заканчиваются в боуменовой мембране, значительно увеличивая

жесткость передней стромы в отличие от задних двух третей. Эта специфическая

13

архитектура также отвечает за поддержание кривизны роговицы (Muller L.J., Pels

E., Vrensen G.F. 2001).

Рисунок 2. Строение роговицы человека: 1 - передний эпителий, 2 - строма, 3 - клетки

заднего эпителия. Строма занимает основную часть объема и имеет сложную структуру

выровненных коллагеновых ламелл с различной ориентацией фибрилл.

Основные направления изучения формирования стромы, в настоящее время

сосредоточены на воспроизведение ее уникальной архитектоники (Orwin E.L.,

Borene M.L., Hubel A. 2003; Crabb R.A., Chau E.P., Evans M.C. et al., 2006 ), а также

сохранения фенотипа кератоцитов (Minami Y., Sugihara H., Oono S. 1993; Zieske

J.D., Mason V.S., Wasson M.E. et al., 1994; Germain L., Auger F.A., Grandbois E., et

al., 1999; Griffith M., Hakim M., Shimmura S., et al., 2002; Li F., Carlsson D., Lohmann

C., et al., 2003). При этом следует отметить, что успешное воспроизведение

архитектуры роговицы требует детального изучения технологий создания

послойной слоистой структуры роговицы путем сборки in vivo / in vitro различных

материалов и клеток (кератоцитов).

В норме кератоциты находятся в роговице в стадии G0 (стадия покоя)

клеточного цикла (Вит В.В. 2003; West-Mays J.A., Dwivedi D.J. 2006). При

травматических или инфекционных повреждениях роговицы под действием

цитокинов происходит активация окружающих раневую поверхность кератоцитов

с последующей их дифференцировкой в фибробласты, которые принимают

активное участие в регенерации поврежденной структуры (Вит В.В. 2003; West-

Mays J.A., Dwivedi D.J. 2006). Однако, при некоторых повреждениях возможно

образование в зоне повреждения трансформирующего фактора роста (TGF), что

14

способствует дальнейшей дифференцировке фибробластов в миофибробласты (Le

Roux S., Borbely G., Słoniecka M. et al., 2015). Основным характерным отличием

миофибробластов является экспрессия α-гладкомышечного актина и синтез

неорганизованного фиброзного внеклеточного матрикса, приводящего к

образованию рубцовой ткани (Zieske J.D., Francesconi C.M., Guo X. 2004; West-

Mays J.A., Dwivedi D.J. 2006; Wilson S.E. 2012). Фиброзное заживление уменьшает

прозрачность роговицы из-за новообразованного неукомпактизованного

внеклеточного матрикса и снижения синтеза основных протеогликанов и

кристаллина (Michelacci Y.M. 2003; Jester J.V. 2008; Mc Intosh Ambrose W., Schein

O., Elisseeff J. 2010). Кроме того, данный процесс может изменять форму роговицы

как путем новообразующейся ткани, так и путем перераспределения механической

нагрузки и натяжения стромы.

Таким образом, лучшее понимание основных клеточных и молекулярных

механизмов, которые регулируют биомеханическую активацию кератоцитов

роговицы, может в конечном итоге привести к более эффективным подходам в

создании искусственного эквивалента роговицы (Mc Intosh Ambrose W., Schein O.,

Elisseeff J. 2010).

В этой связи крайне актуальным является изучение онтогенеза кератоцитов.

Известно, что на третьей неделе внутриутробного развития из нервной трубки в

сторону покровной эктодермы выпячиваются глазные бороздки, которые после

смыкания нервной пластинки превращаются в первичные глазные пузыри

(Карлсон Б. 1983; Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005). В начале пятой

недели дистальная часть глазного пузыря начинает впячиваться (инвагинирует) и

образуется двуслойный незамкнутый глазной бокал. Перед началом инвагинации

глазной бокал вступает в плотный контакт с поверхностной эктодермой и

индуцирует выпячивание зачатка хрусталика в сторону глазного бокала (Карлсон

Б. 1983; Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005). После отделения

хрусталика от зачатка роговичного эпителия происходит миграция клеток из

нервного гребня в пространство между хрусталиком и эпителием формируя слой

эндотелиальных клеток, которые синтезируют первичную строму, состоящую из

15

коллагеновых фибрилл. Вторая волна мезенхимальных клеток из нервного гребня

наполняет первичную строму и они становятся кератоцитами (Карлсон Б. 1983;

Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005). После миграции кератоциты

начинают синтезировать внеклеточный матрикс, состоящий, в основном, из

коллагенов 1, 3, 5 и 6 типа и гликозааминогликанов, тем самым увеличивая объем

первичной стромы. После слияния век примитивный эпителий роговицы

уменьшается до нескольких слоев и остается неизменным до момента открытия век

(Карлсон Б. 1983; Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005; Miron-Mendoza

M., Graham E., Kivanany P., et al., 2015). Ряд изменений происходит и с

кератоцитами - после наполнения первичной стромы клетки постепенно снижают

свою пролиферативную активность, и, к моменту открытия век, прекращают

пролиферацию и останавливаются в стадии G0 клеточного цикла (Карлсон Б. 1983;

Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005; West-Mays J.A., Dwivedi D.J.

2006; Lynch A.P., O’Sullivan F., Ahearne M. 2016). При повреждении роговицы

кератоциты могут перейти в дивергентный фенотип, который зависит от

конкретных клеточных сигналов. Поскольку кератоциты происходят из популяции

клеток нервного гребня, было установлено, что их регенеративные возможности

схожи с таковыми стволовых клеток (Funderburgh J.L., Mann M.M., Funderburgh

M.L., 2003; Nishida T. 2010). Недавно были проведены экспериментальные работы

над перепелами по пересадке меченых стромальных кератоцитов в зону ранних

миграционных путей нервного гребня с отслеживанием их дальнейшей судьбы во

времени (Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. 2005; Lynch A.P., O’Sullivan

F., Ahearne M. 2016). Было показано, что данные клетки мигрировали, но не

смешивались с зарождающимися клетками нервного гребня (Yam G. H., Williams

G.P., Setiawan M., et al. 2017). Кроме того, стромальные кератоциты подавляли

экспрессию кератансульфата и дифференцировались в мультипотентные

предшественники, способные формировать некоторые производные нервного

гребня, такие как гладкие мышцы и миофибриллы, в дополнение к кератоцитам

роговицы и эндотелиальным клеткам (Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M.

2005). Однако, они не смогли образовать все производные нервного гребня и не

16

приводили к появлению тканей другого происхождения. Результаты показывают,

что кератоциты роговицы сохраняют пластичность даже после своей конечной

дифференцировки, что проявляется в их реакции на повреждение роговицы

(Funderburgh J.L., Mann M.M., Funderburgh M.L., et al., 2003; Lwigale P.Y., Cressy,

P.A., Bronner-Fraser M. 2005; Nishida T. 2010).

Одним из первых наблюдаемых изменений в строме роговицы после травмы

является гибель субпопуляции кератоцитов (Nishida T., 2010). В случае

эпителиальных повреждений роговицы, при которых эпителий соскабливается,

обнажая боуменову мембрану, кератоциты непосредственно под мембраной

подвергаются апоптозу. Вскоре погибшие клетки заменяются новыми в результате

митоза соседних клеток, и, следовательно, не происходит дальнейшего ответа

кератоцитов (Covre J.L., Cristovam P.C., Loureiro R.R., et al. 2016). Эта

первоначальная гибель клеток кератоцитов является доброкачественным ответом,

развивающимся для ограничения воспаления и потери прозрачности (Jeste J.V,

Petroll W.M., Cavanagh H.D. 1999; Guarnieri F.A. 2015). Область и степень гибели

клеток в строме роговицы, по-видимому, зависят от типа и вида травмы. Так, при

фоторефрактивной керактэктомии (корректирующая хирургическая процедура,

при которой с поверхности деэпителизированной роговицы точечно при помощи

лазера испаряют (аблируют) участки боуменовой мембраны и стромы), апоптоз

кератоцитов обычно наблюдается в поверхностной строме роговицы (до 85 мкм от

поверхности). Лазерный in situ кератомилез (LASIK) представляет собой более

новую корректирующую процедуру, при которой лоскут эпителия и базальной

мембраны сначала отсекают параллельно поверхности роговицы микрокератомом,

и затем лазерная абляция выполняется на нижележащей строме. В LASIK смерть

кератоцитов обнаруживается глубже в строме и обычно ограничивается передней

и задней пластинчатой поверхностью, созданной микрокератомом (Miron-Mendoza

M., Graham E., Kivanany P., et al., 2015; Sidney L.E., Hopkinson A. 2018). Ранние

исследования показали, что цитокины, такие как интерлейкин-1 (IL-1) и фактор

некроза опухолей альфа (TNFα), секретируемые из вышележащего эпителия, могут

модулировать апоптоз кератоцитов. В частности, считается, что IL-1 вызывает

17

гибель кератоцитов, действуя в качестве стимулятора аутокринной продукции

FAS-лиганда, медиатора апоптоза (Jester J.V., Petroll W.M., Cavanagh H.D. 1999;

Sidney L.E., Hopkinson A. 2018). Эта гипотеза была основана на факте снижения

апоптоза кератоцитов у мышей с дефицитом FAS в ответ на повреждение эпителия

роговицы. Однако, другая работа показала, что когда культивируемые кератоциты

обрабатываются IL-1α в течение 24 ч, клетки не погибают. Фактически,

окрашивание TUNEL в обработанных IL-1 кератоцитах не наблюдалось до 7 дней

после обработки, и это коррелировало с переходом в развитии клеток, который

делал их чувствительными к IL-1α (Lynch A.P., O’Sullivan F., Ahearne M. 2016;

Sidney L.E., Hopkinson A. 2016). Таким образом, необходимы дополнительные

исследования, чтобы определить, почему некоторые кератоциты уязвимы к

апоптозу, индуцированному IL-1α, в то время как другие не являются и могут

регулировать апоптотический ответ (Sidney L.E., McIntosh O.D., Hopkinson A.

2015).

При проникающих кератэктомических повреждениях с нарушением

целостности базальной мембраны, вслед за первоначальной гибелью кератоцитов

в роговице следует дальнейший переход субпопуляции оставшихся кератоцитов к

восстановительному или «активированному» фенотипу (Miron-Mendoza M., Lin X.,

Ma L. et al., 2012; Quantock A.J. 2015). Примерно через 6 ч после травмы

активированные кератоциты теряют свою неподвижность, вступают в клеточный

цикл и мигрируют к месту повреждения. Их размер и содержание органелл

увеличиваются, и они начинают проявлять морфологические характеристики

фибробластов - принимают веретеновидную форму, обладают множественными

ядрышками и не имеют цитоплазматических гранул (Etheredge L., Kane B.P.,

Hassell J.R. 2009). Была разработана модель культуры клеток для изучения

активации фибробластов, в которой изменение фенотипа кератоцитов схоже с

таковым при ранении (Miron-Mendoza M., Lin X., Ma L. 2012; Wilson S.E. 2012;

Quantock A.J. 2015). В этой модели кератоциты выделяют из нативной стромы и

поддерживают в бессывороточной среде, в которой они сохраняют многие in vivo

характеристики покоящихся кератоцитов, а именно: их дентритную морфологию и

18

взаимосвязанные псевдоподии (Sloniecka M., Backman L.J., Danielson P. 2015).

Добавление сыворотки и последующее пассирование этих клеток приводит к их

активации, связанной с возникновением признаков, описанных выше. Другие

изменения включали изменения в экспрессии генов, такие как индукция в

фибронектине и матриксной металлопротеиназе (MMP), коллагеназе (Miron-

Mendoza M., Lin X., Ma L. 2012). Считается, что изменение экспрессии MMP лежит

в основе ремоделирования внеклеточного матрикса (Miron-Mendoza M., Graham E.,

Kivanany P., Quiring J. 2015). Наконец, переход в "режим регенерации" также связан

с остановкой экспрессии кристаллинов роговицы, транскетолазы и

альдегиддегидрогеназы (Jester J.V., Petroll W.M., Cavanagh H.D. 1999; Zieske J.D.,

Joyce N.C. 2004; Jester J.V. 2008). Использование культуральной модели in vitro, а

также дальнейшее ее сопоставление с моделями роговичной раны in vivo показало,

что ряд факторов роста и цитокинов способствует активации кератоцитов. Среди

них - IL-1α, экспрессируемый роговичным эпителием и высвобождаемый в строму

при повреждении эпителиального субстрата, был идентифицирован как

необходимый медиатор экспрессии гена коллагеназы в активированных

фибробластах (Jester J.V., Petroll W.M., Cavanagh H.D. 1999). Со временем при

добавлении сыворотки в культуральную среду клетки приобретают

компетентность для синтеза аутокринного IL-1α, и это называется «петлей IL-1».

Экспрессия петли IL-1α также обнаруживается в активированных кератоцитах,

выделенных из роговицы через 7 дней после кератэктомического повреждения - за

эти сроки успевает завершиться реэпителизация и образоваться базальная

мембрана (Wu J., Du Y., Mann M.M. 2014). Таким образом, постоянная секреция

аутокринного IL-1α позволяет активированным кератоцитам продолжать

ремоделирование репарационной ткани в отсутствие эпителиального

секретируемого IL-1α. Другие исследования показали, что компетентность

активированных кератоцитов экспрессировать IL-1α зависит от экспрессии

требуемого промежуточного сигнального интервала NFκB (Sidney L.E., Mc Intosh

O.D., Hopkinson A. 2015).

19

Миофибробласт - еще один фенотип кератоцитов, наблюдаемый в строме

роговицы после травмы и впервые обнаруженный в ранах кожи. Эти клетки

являются субпопуляцией активированных фибробластов, характеризующейся

более крупными размерами и экспрессией альфа-гладкомышечного актина (αSMA)

(Santhanam A., Torricelli A.A., Wu J., et al., 2015). Полагают, что миофибробласты

роговицы непосредственно в ране ответственны за ее сокращение, а также за

организацию внеклеточного матрикса во время регенерации роговицы

(Funderburgh J.L., Funderburgh M.L., Mann M.M., et al., 2009). Трансформирующий

фактор роста бета (TGFβ) представляет собой цитокин, выделяемый

эпителиальными клетками роговицы, который может контролировать поведение

регенерирующих фибробластов (Jester J.V., Petroll W.M., Cavanagh H.D. 1999;

Wilson S.E. 2012). Культивированные без сыворотки кератоциты при воздействии

TGFβ демонстрируют трансформацию в миофибробласты, которые специфичны

для TGFβ, поскольку совместная обработка блокирующими антителами к TGFβ

показала ингибирование этой трансформации (Gallego-Muñoz P., Ibares-Frias L.,

Valsero-Blanco M.C. 2017). Таким образом, TGFβ был идентифицирован как

мощный индуктор трансформации миофибробластов в кератоцитах роговицы

(Santhanam A., Torricelli A.A., Wu J. 2015). В другой работе было показано, что

активированные фибробласты роговицы и миофибробласты не являются

конечными фенотипами и способны к взаимному переходу (Le Roux S., Borbely G.,

Słoniecka M., et al., 2015; Sarenac T., Trapecar M., Gradisnik L., et al. 2016). Недавно

на мышах была разработана модель проникающей кератэктомии, которая показала,

что после нарушения базальной мембраны TGFβ2 высвобождается роговичным

эпителием в строму. TGFβ2 индуцирует трансформацию кератоцитов в

миофибробласты (Saika S., Yamanaka O., Okada Y. 2016). На органотипических

культурах также было показано, что когда эпителиальные клетки роговицы

культивируют на искусственной стромальной поверхности, где они неспособны

продуцировать базальную мембрану, они высвобождают TGFβ2 в строму, где

кератоциты стимулируются к переходу в фенотип миофибробластов (West-Mays J.

A., Dwivedi D. J. 2006; Le Roux S., Borbely G., Słoniecka M., et al., 2015; Sarenac T.,

20

Trapecar M., Gradisnik L., Rupnik M.S., Pahor D., 2016). Когда в этой модели

стимулируется синтез базальной мембраны, фибротический фенотип не возникает,

а TGFβ2 остается в эпителии. Дополнительные доказательства в поддержку

представления о том, что базальная мембрана контролирует фиброзирование,

включает мутантных мышей с нарушенными базальными мембранами, такими как

мыши Le-AP-2α, недавно разработанный условный нокаут транскрипционного

фактора AP-2α. У мышей Le-AP-2α базальная мембрана представляет собой

прерывистую структуру (Gallego-Muñoz P., Ibares-Frias L., Valsero-Blanco M.C., et

al., 2016), под которой TGFβ2 обнаруживается в строме, и проявляется αSMA-

иммунореактивность, свидетельствующая о трансформации резидентных

кератоцитов в миофибробласты. Эти мыши также отличались пролиферацией

кератоцитов и иммунореактивностью к фосфо-Smad2, расположенной ниже по

ходу передачи сигнальной молекуле TGFβ (West-Mays J.A., Dwivedi D.J., 2006; Le

Roux S., Borbely G., Słoniecka M., et al., 2015; Sarenac T., Trapecar M., Gradisnik L.,

et al., 2016). Наличие миофибробластов в роговице in vivo после фоторефрактивной

кератэктомии также было подтверждено и коррелировало с резким помутнением

стромы. Снижение отражательной способности миофибробластов, когда клетки

начинают исчезать, также коррелирует с уменьшенной мутностью в модели

кролика фоторефрактивной кератэктомии. Появление этих клеток in vivo также

можно отнести к TGFβ-ответу, поскольку локальная обработка раневой области

после фоторефрактивной кератэктомии кролика TGFβ-блокирующими антителами

выявила резкое снижение количества миофибробластов, а также, повышение

прозрачности роговицы. В совокупности эти данные показывают, что базальная

мембрана играет значительную роль в поддержании гомеостаза роговицы и

минимизации фиброзного ответа путем контроля высвобождения TGFβ2 в строму

(West-Mays J.A., Dwivedi D.J. 2006; Le Roux S., Borbely G., Słoniecka M., et al., 2015;

Petrol M.W., Miron-Mendoza M. 2015; Sarenac T., Trapecar M., Gradisnik L., Rupnik

M.S., Pahor D. 2016).

21

1.1.3 Задний эпителий

Задний эпителий роговицы развивается из эмбриональных клеток нервного

гребня. Клетки заднего эпителия роговицы человека in vivo на десцеметовой

мембране находятся в G1-фазе клеточного цикла (Joyce N.C. 2012) и имеют

ограниченную пролиферативную способность. Этот факт объясняет возрастное

снижение плотности клеток заднего эпителия роговицы. Так, средняя плотность

клеток снижается с 3600 клеток/мм2 в возрасте 5 лет до 2700 клеток/мм2 в возрасте

15 лет (Nucci P., Brancato R., Mets M.B. 1990). Дальнейшее снижение центральной

плотности клеток заднего эпителия роговицы у взрослых составляет 0,6% в год с

постепенным изменением формы и размера клеток (Bourne W.M., Nelson L.R.,

Hodge D.O. 1997), поскольку известно, что закрытие дефекта слоя клеток заднего

эпителия происходит за счет увеличения размеров клеток, мигрирующих в область

повреждения (Steele C. 1999). Плотность клеток ниже уровня 500 клеток/мм2

приводит к отеку роговицы и, следовательно, к уменьшению остроты зрения.

Однако в ряде работ было доказано, что клетки заднего эпителия роговицы

способны к пролиферации в естественных условиях, также эти клетки обладают

способностью к пролиферации в условиях invitro (Newsome D.A., Takasugi M.,

Kenyon K.R., et al. 1974; Baum J.L., Niedra R., Davis C., et al. 1979; Fabricant R.N.,

Alpar A.J., Centifanto Y.M., et al. 1981; Insler M.S., Lopez J.G. 1986 - 1991; Tchah H.

1992; Engelmann K., Bednarz J., Schafer H.J., et al. 2001; Amano S., Mimura T.,

Yamagami S., et al. 2005; Enomoto K., Mimura T., Harris D.L., et al. 2006; Lai J.Y.,

Chen K.H., Hsiue G.H. 2007; Hitani K., Yokoo S., Honda N., et al., 2008; He Z.,

Campolmi N., Ha Thi B.M., et al. 2011; Choi J.S., Kim E.Y., Kim M.J., et al. 2013;

Okumura N., Hirano H., Numata R., et al. 2014; Moysidis S.N., Alvarez-Delfin K.,

Peschansky V.J. et al. 2015; Okumura N., Kakutani K., Numata R., et al. 2015; Peh G.S.,

Chng Z., Ang H.P., et. Al. 2015). В указанных работах была показана возможность

получения первичной клеточной культуры клеток заднего эпителия роговицы из

донорских роговиц. Возраст доноров роговиц, используемых для получение

клеточной культуры заднего эпителия роговицы, существенно варьирует в

литературе: от 8-недельных эмбрионов человека (Hyldahl L. 1984) до 80 лет

22

(Tripathi R.C., Tripathi B.J. 1982; Chen K.H., Azar D., Joyce N.C. 2001). При этом, у

пожилых доноров пролиферативные свойства клеток заднего эпителия роговицы

имеют тенденцию к снижению, что было подтверждено в ряде работ (Blake D.A.,

Yu H., Young D.L. 1997; Miyata K., Drake J., Osakabe Y. 2001; Enomoto K., Mimura

T., Harris D.L. 2006; Mimura T., Joyce N.C. 2006; Konomi K., Joyce N.C. 2007; Zhu

Y.T., Hayashida Y., Kheirkhah A. 2008; Song Z., Wang Y., Xie L. 2008; Joyce N.C.

2012). Gao и др., в 2010 году не смогли продемонстрировать высокую

пролиферативную активность клеток заднего эпителия роговицы выделенных из

зародышевых роговиц (Gao Y., Zhou Q., Qu M. 2011).

Следует отметить, что вне зависимости от возраста, человеческие клетки

заднего эпителия роговицы, полученные с периферической области роговицы,

имеют более высокую способность к репликации по сравнению с клетками

полученных из центральной зоны (Bednarz J., Rodokanaki-von Schrenck A.,

Engelmann K. 1998; Konomi K., Zhu C., Harris D. 2005; Mimura T., Joyce N.C. 2006;

Konomi K., Joyce N.C. 2007; Song Z., Wang Y., Xie L. 2008; Gao Y., Zhou Q., Qu M.

2011).

Первое сообщение об успешном культивировании клеток заднего эпителия

роговицы было сделано в 1965 году Mannagh и др. (Mannagh J.J., Irving A. 1965).

Данный факт послужил началом поиска оптимальных путей выделения и

культивирования клеток заднего эпителия роговицы, который до сих пор является

актуальным.

Одной из трудностей получения и культивирования клеток заднего эпителия

роговицы является тот факт, что на сегодня нет ни одного строгоспецифичного

маркера, подтверждающего природу полученных клеток, как клеток заднего

эпителия роговицы. Однако, в имеющихся на сегодня работах, в качестве

основного идентифицирующего маркера клеток заднего эпителия роговицы

использует фермент Na+/К+ АТФ-азу, с деятельностью которого связана основная

функция клеток - помпальная, обеспечивающая сохранение прозрачности

роговицы. Кроме того, в ряде работ имеются данные о том, что маркер плотных

межклеточных контактов (ZO-1) также является характерным для клеток заднего

23

эпителия роговицы. На сегодня, к обязательным условиям выделения клеток

заднего эпителия роговицы является выявление вышеуказанных маркеров (Ide T.,

Nihida K., Yamato M. 2006; Madde P.W., Lai J.N., George K.A. 2011; Ju C., Zhang K.,

Wu X. 2012).

Таким образом, для создания искусственной роговицы крайне актуальным

является подбор оптимальных параметров выделения и культивирования клеток

переднего, заднего эпителия роговицы и кератоцитов. Создание стромы роговицы

в основном базируется на использовании различных полимерных и

биосинтнтических материалов. Однако, в последнее время, появляются

исследования, посвященные созданию стромы роговицы путем выработки

межклеточного матрикса культивируемыми кератоцитами. Вместе с тем, несмотря

на способность клеточной культуры продуцировать межклеточный матрикс,

данный процесс является крайне длительным.

1.2 Создание искусственной роговицы

Несмотря на большое количество работ, посвященных созданию

искусственной роговицы, до сих пор данная задача остается нерешенной. К

основным принципам конструирования искусственной роговицы (кератопротеза)

относятся:

1) внутристромальное (интраламеллярное) крепление протеза;

2) перфорированная или сетчатая гаптическая часть кератопротеза;

3) материал гаптической части должен отличаться от материала прозрачной

оптической части (Калинников Ю.Ю. 2005).

1.2.1 Характеристика клеток

Одним из основополагающих компонентов межклеточного матрикса

роговицы являются протеогликаны, представляющие собой высокомолекулярные

соединения, состоящие из белка и гликозаминогликанов. При этом, тип

гликозаминогликанов, образуюших протеогликананы, определяет их тканевую

специфичность и общую функцию (Caterson B., Melrose J. 2018).

24

Известно, что кератансульфат – это наиболее распространенный

гликозаминогликан роговицы, входящий в состав ее основных протеогликанов:

кератокана, люмикана и мимекана (Funderburgh J.L. 2002). Непосредственно роль

кератансульфата заключается в контроле за развитием новообразованных тканевых

структур и в поддержании их функции. Важно отметить, что роговица приобретает

свою прозрачность в течение периода эмбрионального развития, при этом

отмечается экспоненциальное накопление кератансульфата. В связи с чем, одной

из задач построения искусственной роговицы является поддержание синтеза

кератансульфата кератоцитами in vitro (Meek K.M., Knupp C. 2015).

В единичных экспериментальных работах было показано, что кератоциты

секретируют протеогликаны характерные для нормальной роговицы. Также, было

показано, что секреция кератансульфата кератоцитами меняется при

патологических состояниях, при повреждении стромы роговицы было выявленное

увеличение сульфатированного кератансульфат, а при заживлении - накопление

низкосульфтрованного кератансульфата (Frikeche J., Maiti G., Chakravarti S. 2016).

Среди протеогликанов роговицы особо выделяют кератокан и люмикан,

относящиеся к представителям малых лейцин богатых протеогликанов (Kurpakus

Wheater M., Kernacki K.A., Hazlett L.D. 1999).

Исходно кератокан локализуется на мембране клетки, далее происходит его

секреция во внеклеточный матрикс, где он связывается с кератансульфатными

цепями (Funderburgh J.L., Funderburgh M.L., Mann M.M., Conrad G.W. 1991).

Основными функция данного протеогликана является поддержание стромально-

матричной структуры роговицы и ее прозрачности. Кератокан в основном

локализуется в роговице, но также может детектироваться в трахее, кишечнике,

яичниках, легких и скелетных мышцах. Дефекты данного гена могут вызывать

аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующиеся уплощением роговицы

(Pellegata N.S., Dieguez-Lucena J.L., Joensuu T., et al. 2001).

Важнейшая роль люмикана - поддержание прозрачности роговицы путем

регуляции коллагенового филогенеза. В роговице люмикан содержит

кератансульфатные цепи, состоящие из несульфатированного гликопротеина (Liu

25

C.Y., Kao W.W. 2012). Широкое распространение данного белка отвечает за

функциональные особенности в тканевом морфогенезе и поддержание тканевого

гомеостаза. Множество клинических проявлений нехватки люмикана проявляется

в помутнение роговицы, хрупкости кожи и сухожилий, задержке заживления ран

(Walter M.N., Dehsorkhi A., Hamley I.W., Connon C.J. 2016).

Таким образом, точное количество и баланс стромальных протеогликанов

необходимы для поддержания прозрачности роговицы и должны быть учтены при

разработке методики создания искусственной роговицы.

Одним из вопросов культивирования кератоцитов является сохранение их

фенотипа и предупреждение их трансформации в фибробласты и миофибробласты

(Myrna K.E., Pot S.A., Murphy C.J. 2009). Для характеристики клеток в культуре на

ряду с их морфологической оценкой производится оценка наличия экспрессии

мезенхимальных маркеров, наиболее известными из которых являются а-

гладкомышечный актин и виментин. а-гладкомышечный актин представляет собой

высококонсервативный белок, структурные компоненты которого играют важную

роль в регулировании формы и движение клеток (Hinz B., Mastrangelo D., Iselin

C.E., et al. 2001). Под действием а-гладкомышечного актина формируется

сократительные цитоскелетные элементы, организованные в пучки, называемые

стрессовыми волокнами, которые являются широко признанными маркерами для

миофибробластов. Наличие а-гладкомышечного актина позволяет

миофибробластам генерировать более высокие сократительные силы, чем

фибробластам (Jester J.V., Petroll W.M., Barry P.A., Cavanagh H.D. 1995). Известно,

что экспрессия а-гладкомышечного актина регулируется гормонами,

пролиферацией клеток и изменением патологического состояния (Hinz B. 2007).

Основное место локализации - цитоплазма клетки.

Виментин представляет собой промежуточные волокна, обнаруженные в

различных не эпителиальных клетках, особенно мезенхимальных. Виментин

участвует в стабилизации коллагеновых мРНК 1 типа для коллагена 1 и 2 типов.

Высоко экспрессируется в фибробластах, слабо экспрессируется в Т- и В-

26

лимфоцитах и клеточных линиях лимфомы. Локализуется в цитоплазме клетки

(Castro-Muñozledo F., Meza-Aguilar D.G., Domínguez-Castillo R. 2017).

Параллельно с направлениями, посвященными создания стромы

искусственной роговицы, ведутся работы по воссозданию эндотелиального пласта

роговицы. При этом, одним из основополагающих вопросов в развитии данного

направления, является проблема характеристики клеток, так как на сегодня не

существует маркеров, строго специфичных для эндотелия роговицы. В этой связи,

имеется большое количество работ, направленных на изучение комбинации

различных маркеров для характеристики данных клеток. Установлено, что одной

из основных функций эндотелия роговицы является помпальная, связанная с

деятельностью Na/K-АТФ-азы (Yoshida J., Yokoo S., Oshikata-Miyazaki A., et al.

2017).

Na+/K+ АТФаза представляет собой сложный белок, встроенный в наружную

мембрану клетки, и имеющий центры связывания для ионов натрия и калия, а

также, активный центр, где осуществляются связывание и гидролиз АТФ. Действие

данного белка создает электрохимический градиент ионов натрия и калия,

обеспечивая энергию для активного транспорта различных питательных веществ

(Vázquez N., Chacón M., Rodríguez-Barrientos C.A., et al. 2016).

Характерным для эпителиальных клеток, в том числе для эндотелия

роговицы, является наличие плотных контактов – запирающих межклеточных

контактов, в составе которых мембраны соседних клеток максимально сближены и

«сшиты» специализированными белками (Knust E., Bossinger O. 2002).

Роль плотных контактов заключается в том, чтобы ограничивать и

регулировать параклеточную диффузию: они предотвращают протекание тканевой

жидкости через эпителий, но при необходимости могут быть проницаемыми для

ионов, небольших гидрофильных молекул и даже макромолекул. Также, плотные

контакты выполняют так называемую функцию «ограждения», они предотвращают

диффузию компонентов мембраны в её внешнем слое, благодаря чему

поддерживается разница в составе апикальной и базолатеральной мембран.

Плотные контакты задействованы в сигнальных путях, регулирующих

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%B5%D0%B6%D0%BA%D0%BB%D0%B5%D1%82%D0%BE%D1%87%D0%BD%D1%8B%D0%B5_%D0%BA%D0%BE%D0%BD%D1%82%D0%B0%D0%BA%D1%82%D1%8B

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%B5%D0%B6%D0%BA%D0%BB%D0%B5%D1%82%D0%BE%D1%87%D0%BD%D1%8B%D0%B5_%D0%BA%D0%BE%D0%BD%D1%82%D0%B0%D0%BA%D1%82%D1%8B

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D0%BB%D0%B5%D1%82%D0%BE%D1%87%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D0%BC%D0%B5%D0%BC%D0%B1%D1%80%D0%B0%D0%BD%D0%B0

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%91%D0%B5%D0%BB%D0%BE%D0%BA

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%94%D0%B8%D1%84%D1%84%D1%83%D0%B7%D0%B8%D1%8F

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A2%D0%BA%D0%B0%D0%BD%D0%B5%D0%B2%D0%B0%D1%8F_%D0%B6%D0%B8%D0%B4%D0%BA%D0%BE%D1%81%D1%82%D1%8C

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A2%D0%BA%D0%B0%D0%BD%D0%B5%D0%B2%D0%B0%D1%8F_%D0%B6%D0%B8%D0%B4%D0%BA%D0%BE%D1%81%D1%82%D1%8C

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0%BE%D0%BD%D1%8B

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%93%D0%B8%D0%B4%D1%80%D0%BE%D1%84%D0%B8%D0%BB%D1%8C%D0%BD%D0%BE%D1%81%D1%82%D1%8C

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%BE%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%83%D0%BB%D0%B0

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%B0%D0%BA%D1%80%D0%BE%D0%BC%D0%BE%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%83%D0%BB%D0%B0

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D0%B5%D1%80%D0%B5%D0%B4%D0%B0%D1%87%D0%B0_%D1%81%D0%B8%D0%B3%D0%BD%D0%B0%D0%BB%D0%B0_(%D0%B1%D0%B8%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%8F)

27

пролиферацию, поляризацию и дифференциацию эпителиальных клеток (Balda M.

S., Matter K. 2008.).

Всего в состав плотных контактов входит около 40 различных белков, как

мембранных, так и цитоплазматических. Наиболее изучен белок

цитоплазматической пластинки ZO-1, он имеет несколько доменов, участвующих

в белок-белковых взаимодействиях, каждый из которых обеспечивает контакт с

другими компонентами (Matter K., Balda M. S. 2003).

Данный белок локализация на клеточной мембране и может участвовать в

регулирование экспрессии генов, а именно влиять на пролиферацию

эпителиальных клеток через взаимодействие с транскрипционным фактором. В

экспериментах in vitro было доказано, что нокаут ZO-1 в эпителиальных клетках не

является существенным для формирования плотных соединений, однако,

отмечается заметная задержка в их образовании, так как движения белка ZO-1

происходит от цитоплазмы к мембране и детектируется как раннее событие,

происходящее одновременно с контактом клеток (Neil E., Capaldo C.T., Macara I.G.

2006).

Таким образом, при создании искусственной роговицы, для понимания

соответствия воссоздаваемой ткани, крайне актуальным является оценка

экспрессии указанных маркеров.

1.2.2 Полимерные материалы

При подборе материала для конструирования оптической части

искусственной роговицы немаловажным является использование материала,

обладающего оптической прозрачностью, способностью преломлять лучи света, а

также, способного к диффузии биологических питательных веществ. Ключевым

значением при выборе материала является его высокая биосовместимость с

тканями роговицы человека.

Одно из первых упоминаний о замене участка роговицы прозрачным

стеклянным аналогам датируется концом 18 века. Однако, высокий уровень

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D1%80%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D1%84%D0%B5%D1%80%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F

https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%9F%D0%BE%D0%BB%D1%8F%D1%80%D0%BD%D0%BE%D1%81%D1%82%D1%8C_%D0%BA%D0%BB%D0%B5%D1%82%D0%BA%D0%B8&action=edit&redlink=1

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%94%D0%B8%D1%84%D1%84%D0%B5%D1%80%D0%B5%D0%BD%D1%86%D0%B8%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%BA%D0%B0_%D0%BA%D0%BB%D0%B5%D1%82%D0%BE%D0%BA

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%B5%D0%BC%D0%B1%D1%80%D0%B0%D0%BD%D0%BD%D1%8B%D0%B5_%D0%B1%D0%B5%D0%BB%D0%BA%D0%B8

https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=ZO-1&action=edit&redlink=1

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%91%D0%B5%D0%BB%D0%BE%D0%BA-%D0%B1%D0%B5%D0%BB%D0%BA%D0%BE%D0%B2%D1%8B%D0%B5_%D0%B2%D0%B7%D0%B0%D0%B8%D0%BC%D0%BE%D0%B4%D0%B5%D0%B9%D1%81%D1%82%D0%B2%D0%B8%D1%8F

28

развития асептического некроза роговицы реципиента и экструзии протеза привели

к отказу от этого подхода (Филатов В.П. 1936).

Так же, для изготовления кератопротезов применялись такие материалы, как

горный хрусталь (Nussbaum J.N. 1863), целлулоидин (Dimmer F. 1891), акрил

(Cardona H. 1962), плексиглас (Binder H.F., Binder R.F. 1956), метилметакрилата

(Cardona H. 1964), платина (Torres M., Rniz R. 1963). На сегодняшний день,

применяются протезы из титана, тантала, силикона, гидрогеля,

полиметилметакрилата (ПMMA), политетрафторэтилена (ПТФЭ), биологических

материалов и др. (Федоров С.Н., Мороз З.И., Зуев В.К. 1982; Астахов Ю.С.,

Хапчаев Р.Т. 2005; Pan H.W., Iakymenko S.C., Xu J.T. 2012).

Одним из первых материалов, широко используемых в офтальмологии для

создания исскуственной роговицы, является ПММА (Ridley H.L. 1956).

Биосовместимость данного материала к тканям роговицы была показана

многочисленными отечественными и зарубежными авторами (Ballestri M., Caruso

E., Guerrini A. 2018). Однако, используемые кератопротезы из ПММА,

представляли собой 2-х компонентную структуру, в которой роль опорного

элемента выполняла металическая или полимерная конструкция, а оптическая

часть представляла собой линзу из ПММА. Данные конструкции позволяли

восстановить остроту зрения и сохранялись в роговице в течение нескольких лет

(Федоров С.Н. 1969; Якименко С.А. 1985; Мороз З.И., Власова В.А., Ковшун Е.В.

2013; Stone W.I., Herber E. 1963; Dohlman C.N., Refojo M.F., Rose J. 1967; Cardona

H. 1969; Choyce D.P. 1973).

Вместе с тем, жесткость конструкции и отсутствие диффузии питательных

веществ привели к большому списку осложнений, таких как: развитие вторичной

глаукомы, асептического некроза, формирования рубцовой ткани с последующей

экструзией данной конструкции (Краснов М.М., Орлова Е.М. 1967; Гундорова Р.А.,

Малаева Л.В., Удинцов Б.Е. 1977; Федоров С.Н., Мороз З.И., Зуев В.К. 1982;

Якименко С.А. 1985; Cardona H. 1964; Barraquer J. 1965; Dohlman C.N., Refojo M.F.,

Rose J. 1967; Choyce D.P. 1973; Girard L.J., Hawkins R., Nieves R. 1977; Pintucci S.,

Pintucci F., Ceccom M.S.C. 1999).

29

Указанные факты обусловили поиск новых материалов, как для оптической,

так и для гаптической части искусственной роговицы. Подход к синтетическому

конструированию роговицы быстро эволюционировал, и на смену твердым

опорным материалам пришли мягкие, гидрофильные материалы используемые для

восстановления роговицы реципиента (Li F., Carlsson D., Lohmann C. 2003). В

следствии этого исследования и разработки в области искусственной роговицы во

всем мире сфокусировались на мягких материалах, включая гидрогели и

биополимерные каркасы. Наиболее успешным примером синтетической роговицы

на основе гидрогеля является кератопротез «Alpha Cor», состоящий из сополимера

гидроксиэтилметакрилата (ГЭМА), разработанный Chirila и Hicks (Chirila T.V.

2001; Hicks C.R., Crawford G.J., Lou X. 2003). Оптическая часть «Alpha Cor»

представляет собой однородную линзу из ГЭМА с хорошей механической

прочностью. Данный материал содержит 40% воды. Известно, что при более

высоких концентрациях фаза полимера ГЭМА отслаивается и образует хрупкий

непрозрачный пористый материал (Hench L.L., Jones J.R. 2004). Пористая

структура ГЭМА обеспечивает синтез белков соединительной ткани реципиента

внутри структуры кератопротеза, что обеспечивает закрепление синтетического

биоматериала с тканями реципиента (Trinkhaus-Randall V., Banwatt R., Cappechi J.

1991; Chirilia T.V., Chen Y.C., Griffin B.J. 1993). Однако, проведенные

долгосрочные исследования на животных моделях выявили такие осложнения, как

образование ретрокорнеальных мембран, кальцификацию роговицы реципиента,

развитие эндофанталмита и глаукомы (Legeais J.M., Renard G., Rossi C. 1991; Chirila

T.V. 2001; Hicks C.R., Crawford G.J., Lou X., et al., 2003).

1.2.3 Биосинтетические материалы

Наиболее совершенными считаются кератопротезы, в которых гаптическая

часть интимно связана с биологической донорской тканью, что обеспечивает

высокую прочность искусственной роговицы. Для решения данной задачи в

последнее время широко используются биосинтетические деградируемые

материалы. Кроме того, важно отметить, что данные материалы имитируют

30

межклеточный матрикс, играющий одну из ведущих ролей в сохранении фенотипа

и функций кератоцитов. Роль межклеточного матрикса крайне важна, так еще с

начала эмбриогенеза он, обеспечивая межклеточные взаимодействия, способствует

формированию полностью функционального органа (Hay E.D. 1989).

Поскольку коллаген является основным структурным компонентом

внеклеточного матрикса стромы, большой интерес представляет его использование

при создании искусственной роговицы. В настоящее время, имеется ряд работ,

посвященных использованию коллагеновых матриц в создании искусственной

роговицы (Calderon-Colon X., Xia Z., Breidenich J.L., et al. 2012; Mi S., Connon C.J.

2013; Xiao X., Pan S., Liu X., et al., 2014). Однако, используемый коллаген

характеризуется высоким процентным содержанием воды, что приводит к

дисперсии волокон и образованию жидкого и трудно манипулируемого геля

(Calderon-Colon X., Xia Z., Breidenich J.L., et al. 2012). Для решения данной

проблемы был разработан сжатый коллагеновый матрикс, лишенный указанных

недостатков. Кроме того, была показана возможность создания данным методом

тонких, прочных, прозрачных биосовместимых пленок. На данных мембранах

отмечалось поддержание клеточной адгезии и дифференцировки клеток до

состояния нативных кератоцитов (Mi S., Connon C.J. 2013). В эксперименте на

кроликах было показано, что полученные мембраны сохраняют свою прозрачность,

а также, поддерживают рост эпителиальных клеток на своей поверхности (Hay E.D.

1989). Однако, следует отметить, что коллаген представляет собой белок

животного происхождения, и может быть потенциальным источником инфеции

(Van Essen T.H., Lin C.C., Hussain A.K. 2013). В связи с этим, остается актуальным

поиск прозрачного биодеградируемого искусственного материала. Одним из таких

материалов является фиброин шелка.

1.2.4 Фиброин шелка

Фиброин шелка представляет собой структурный белок шелковых волокон

шелкопряда Bombyx mori (Altman G.H., Diaz F., Jakuba C., et al. 2003). Данный

материал давно известен в медицине, на его основе изготавливают хирургический

31

шовный материал, так же фиброин шелка используют как альтернативу

амниотической мембраны для покровной кератопластики.

Фиброин шелка, полученный из коконов шелковой моли, после очистки

может быть использован либо в форме волокон, либо в жидкой форме,

позволяющей сформировать ряд структур: от ультратонких мембран до пористых

губок. Важно отметить, что мембраны из фиброина, в отличие от амниотической

мембраны, прозрачны и в этом смысле сопоставимы с эквивалентами на основе

коллагена (Bray L.J., George K.A., Ainscough S.L., et al. 2011; Bray L.J., George K.A.,

Ainscough S.L., et al. 2012).

Ряд проведенных исследований показал, что указанные мембраны

поддерживают адгезию, рост и дифференцировку клеток, полученных из всех трех

основных слоев роговицы (Benedek G.B. 1971; Panilaitis B., Altman G.H., Chen J.

2003; Wang Y., Rudum D.D., Walsh A. 2008; Gil E.S., Mandal B.B., Park S., et al. 2010;

Harking D.G., Chirila T.V. 2012).

В экспериментах in vivo была доказана возможность использования

фиброина шелка для трансплантации лимбальных эпителиальных клеток на

поверхность роговицы, а также, для создания аналога десцеметовой мембраны и

последующей трансплантации культуры клеток заднего эпителия роговицы (Harkin

D.G., George K.A., Madden P.W. 2011; Bray L.J., George K.A., Ainscough S.L. 2011).

Предварительное исследование Higa с соавторами (Higa K., Takeshima N., Moro F.

et al. 2011) показало, что имплантация мембран из фиброина шелка в строму

роговицы не вызывает развития воспалительных реакций и не влияет на

прозрачность роговицы.

Стоит отметить, что прозрачность фиброиновых матриц уменьшается по

мере увеличения их толщины (Bray L.J., George K.A., Hutmacher D.W. et al. 2012).

Однако, в исследовании Lawrenceс с соавторами была показана возможность

создания слоистой структуры стромы роговицы состоящей из тонких фиброиновых

пленок (толщина 2мм) с культивируемыми кератоцитами (Lawrence B.D., Marchant

J.K., Pindrus M., et al. 2009).

В исследовании Guan с соавт. фиброин шелка в комбинации с хитозаном

имплантированы в роговичный карман у кроликов. Несмотря на то, что

используемая комбинация была не прозрачной на момент производства, после

32

имплантации прозрачность значительно увеличилась, воспалительная реакция при

этом отсутствовала (Guan L., Tian P., Ge H., et al. 2013).

ГЛАВА 2

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование было проведено на базе Центра фундаментальных и

прикладных медико-биологических проблем ФГАУ «НМИЦ «МНТК

«Микрохирургии глаза» им. С.Н. Федорова» Минздрава России и включала в себя

5 этапов.

На первом этапе работы разрабатывали методику выделения клеток

стромальной части роговицы - кератоцитов и клеток заднего эпителия из

постмортальных роговиц человека. Контрольную группу составила стандартная

методика получения клеточной культуры кератоцитов, опытную группу -

получение клеток кератоцитов разработанным оригинальным методом. Получение

клеток заднего эпителия проводили стандартной методикой эксплантационного

культивирования.

На втором этапе работы подбирали оптимальный состав полной питательной

среды для культивирования полученных кератоцитов и клеток заднего эпителия.

Третий этап включал в себя создание 3D клеточных сфероидов из

полученных клеточных культур и изучением их свойств.

На четвертом этапе проводили культивирование 2D клеточной культуры

кератоцитов на выбранных полимерных материалах.

Культивирование полученных 2D и 3D клеточных культуры кератоцитов на

фиброине шелка для получения слоистой структуры стромальной части

искусственной роговицы проводили на пятом этапе.

33

2.1 Первый этап. Выделение первичной клеточной культуры кератоцитов и

клеток заднего эпителия

В работе использовали клеточную культуру, выделенную из стромальной

части роговицы - кератоциты и клетки заднего эпителия роговицы.

Для получения первичной культуры кератоцитов и клеток заднего эпителия

использовали постмортальные роговицы, непригодные для трансплантации в

клинике, полученные из Глазного банка ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургии

глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Экспериментальные

исследования на тканях, выделенных из постмортальных человеческих глаз,

проводились в соответствии с официально принятыми процедурами и

специальным разрешением в рамках законодательства РФ. Характеристики

использованного донорского материала представлены в таблице 1.

Таблица № 1. Характеристика материала используемого в работе

Количество роговиц n=27

Соотношение мужчин и женщин 17 / 10

Средний возраст 58 (+/- 16)

Среднее время от момента смерти до

ввода в эксперимент

18 (+/- 5)

Полученную роговицу фиксировали в искусственной передней камере,

ориентировали клетками заднего эпителия вверх, используя шпатель-скребок,

десцеметову мембрану с клетками заднего эпителия отделяли по линии Швальбе.

Оставшуюся без переднего эпителия и десцеметовой мембраной строму

использовали для получения первичной культуры клеток кератоцитов.

Полученные первичные культуры клеток культивировали по протоколам

предложенным ниже.

Первичная культура клеток кератоцитов была получена из постмортальных

роговиц (n=7) 2 способами: контрольная группа - кератоциты, полученные методом

предложенным Funderburgh M.L. с соавторами в 2005 году (Funderburgh M.L., Du

34

Y., Mann M.M., et al. 2005), опытная группа - кератоциты, полученные

оригинальным методом выделения. Для проведения сравнительного анализа обеих

групп использовали два критерия: количество и процент жизнеспособных

полученных клеток.

В каждой группе исследования после механического удаления переднего

эпителия и десцеметовой мембраны с клетками заднего эпителия, выкраивали

фрагмент роговицы диаметром 8 мм. Далее, используя гистологическое лезвие,

роговицу делили на 8 равных частей, 4 из которых составили контрольную группу,

другие 4 - опытную группу.

2.1.1 Выделение первичной клеточной культуры кератоцитов

В настоящее время встречается несколько методик выделения кератоцитов.

Самым распространенным способом является методика, предложенная

Funderburgh M.L., которая включает в себя дополнительную механическую и

длительную ферментативную дезагрегацию роговицы. Согласно данной методике,

к полученным фрагментам роговицы добавляли 1 мл раствора DMEM/F12 и

коллагеназы IIтипа в концентрации 2 мг/мл, экспозиция в растворе - 12 часов при

t+4 ОС. По истечению времени, проводили центрифугирование 1500 обор/мин, в

течении 5 минут, при t +37 ОС, удаляли супернатант, к осадку добавляли новую

порцию раствора DMEM/F12 и коллагеназы IIтипа в концентрации 10 мг/мл,

экспозиция составила 2 часа при t+37 ОС. Далее проводили повторное

центрифугирование 1500 обор/мин, в течении 5 минут при t +37 ОС, полученную

суспензию клеток в объеме 2 мл питательной среды переносили в чашки Петри (35

мм) для дальнейшего культивирования. Клетки полученные по описанному

протоколу составили контрольную группу.

В качестве опытной группы была предложена оригинальная методика

выделения, включающая в себя кратковременную ферментативную дезагригацию

фрагментов роговицы. Для этого кусочки переносили в коническую пробирку типа

Эппендорф и добавляли 1 мл раствора DMEM/F12 и коллагеназы II типа в

концентрации 10 мг/мл, пробирку помещали в термошейкер, используя следующие

35

параметры: 800 об/мин, t+37 ОС в течение 20 мин. Полученные фрагменты

переносили в чашки Петри (35 мм) для дальнейшего культивирования.

2.1.2 Выделение клеток заднего эпителия роговицы.

Первичная культура клеток заднего эпителия была получена методом

эксплантационного культивирования. Для этого десцеметову мембрану (n=27) с

клетками заднего эпителия делили на 3 части используя гистологическое лезвие.

Каждый кусочек переносили в чашку Петри d=35мм и добавляли 500 мкл

соответствующей питательной среды.

Заключительным этапом выделения первичной клеточной культуры

кератоцитов и клеток заднего эпителия стало определение общего количества и

процента жизнеспособных клеток. Для этого спустя 24 часа культивирования

чашки Петри промывали раствором Версена и в течение 10 минут обрабатывали

0,25% раствором Трипсин-Версена. К полученной суспензии клеток добавляли 2

мл питательной среды, содержащей эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), для

инактивации трипсина, центрифугировали при 1100 об/мин, 5 мин, t+37 ОС. Далее

удаляли супернатант, к осадку добавляли 1 мл Cell Wash и в этом объеме буфера

проводили подсчет клеток в автоматическом счетчике Luna II, с последующим

определением жизнеспособности клеток, используя флуоресцентный краситель

«Live and Dead». Анализ производили на проточном цитофлуориметре Cyto Flex.

2.2 Второй этап. Подбор питательной среды для клеточных культур

На сегодня существует большое разнообразие сред для культивирования

кератоцитов и клеток заднего эпителия роговицы. Однако, данное обстоятельство

приводит к получению гетерогенных культур клеток, в связи с чем крайне

актуальным является подбор базовой среды с оптимальным соотношением

основных компонентов питательных сред.

36

2.2.1 Подбор питательной среды для 2D культуры кератоцитов

Подбор оптимального состава среды для культивирования кератоцитов

осуществлялся в 2 этапа.

На 1 этапе проводили подбор базовой питательной среды, для этого

фрагменты роговиц(n=5), обработанных по оригинальной методике,

представленной выше, переносили в чашки Петри d=35мм с одной из исследуемых

питательных сред, к каждой из которых добавляли 1% раствор антибиотика и 2мМ

L-глутамина. Список используемых базовых сред представлен в таблице 2.

Спустя 3-е суток, клетки подвергались ферментативной обработке 0,25%

раствором Трипсин-Версена 1:1, полученную суспензию переносили в 15 мл

пробирки и центрифугировали 1100 об/мин, 5 мин. Далее, полученный осадок

ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (pH=7,4), подсчет количества

клеток проводили, используя автоматический счетчик клеток Luna II.

Таблица № 2. Перечень базовых сред используемых для культивирования клеток кератоцитов.

Среда №1 Среда №2 Среда №3 Среда №4

Базовая среда DMEM low

glucose MEM 𝒂MEM DMEM/F12

Количество используемых

кусочков n=20 n=20 n=20 n=20

На 2-м этапе осуществляли подбор компонентов необходимых для

культивирования кератоцитов. С этой целью изучалось влияние количественного

содержания ЭТС и фактора роста фибробластов (ФРФ) на пролиферативную

активность и фенотип кератоцитов. В качестве базовой питательной среды

использовали DMEM/F12 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 1% раствор

антибиотиков. Точная концентрация различающихся компонентов представлена в

таблице 3. Для проведения 2-го этапа было использовано 15 постмортальных

роговиц, выделение и культивирование проводили аналогично 1-му этапу подбора

питательной среды.

37

Таблица № 3. Концентрация эмбриональной телячьей сыворотки и наличия фактора роста

фибробластов в исследуемых средах

2.2.2 Подбор питательной среды для 2D культуры клеток заднего эпителия

роговицы

Для подбора оптимальной культуральной среды для клеток заднего эпителия

роговицы полученные фрагменты десцеметовой мембраны с клетками заднего

эпителия культивировали, используя различные базовые среды с добавлением 10%

ЭТС, 2мМ L-глутамина и 1% раствор антибиотиков. Список базовых сред

представлен в таблице 4.

Таблица №4. Перечень базовых сред, используемых для культивирования

клеток заднего эпителия роговицы

Среда № I Среда № II Среда № III

Базовая среда DMEM/F12 Среда 199 DMEM/F12/Среда 199

(0,5:0,5:1)


фрагментов n=27 n=27 n=27

2.2.3 2D культивирование полученных клеточных культур

Культивирование всех полученных в ходе исследования клеточных культур

проводили при стандартных условиях: t+37 ОС, 5% CO2. Полную смену

культуральной среды проводили каждые 3-ое суток, визуальный контроль роста

клеток осуществляли используя инвертированный световой фазово-контрастный

микроскоп Olympus IX-81. При достижении 80%-конфлуэнтности клетки

пассировали. Для этого чашки Петри промывались 3-х кратно раствором Версена,

Среда

№4.1

Среда

№4.2

Среда

№4.3

Среда

№4.4

Среда

№4.5

Среда

№4.6

Среда

№4.7

Среда

№4.8

Эмбриональная телячья

сыворотка - - 2 % 5 % 10 % 2 % 5 % 10 %

Фактор роста фибробластов - 10

нг/мл - - -

10

нг/мл

10

нг/мл

10

нг/мл


кусочков n=15 n=15 n=15 n=15 n=15 n=15 n=15 n=15

38

далее добавляли 0,25% раствор Трипсин-Версена 1:1 и инкубировали при t +37 ОС

в течение 10 минут. Полученную суспензию клеток собирали в 15 мл

центрифужные пробирки, центрифугировали при 1100 об/мин, 5 мин, t+37 ОС.

Супернатант удаляли используя аспиратор, осадок ресуспендировали в

соответствующей полной ростовой среде, проводили подсчет клеток в

автоматическом счетчике клеток Luna II и переносили в культуральные флаконы

25 см2 с добавлением 5 мл полной питательной среды.

2.2.4 Криоконсервация/Дефростация клеточных культур кератоцитов и

клеток заднего эпителия роговицы.

Для создания клеточного банка для дальнейшей работы с полученными

культурами клеток осуществляли криоконсервацию на разных этапах

культивирования. Полученную суспензию клеток кератоцитов 3-го пассажа и

клеток заднего эпителия 1-го и 2-го пассажа центрифугировали при 1100 обр/мин,

5 мин. Осадок ресуспендировали в полной питательной среде из расчета 1х106

кл/мл на 1 мл среды. Суспензию клеток переносили в 2 мл криопробирки и

добавляли диметисульфооксид (ДМСО) 10% от объема суспензии. Пробирки

помещали в специальные контейнеры для заморозки Cool Cell® и переносили в

низкотемпературный холодильник (-800С), снижение температуры осуществлялось

в течение 14 часов, 10С в минуту. Далее пробирки переносили в сосуды Дьюара с

жидким азотом для долгосрочного хранения культуры.

Для дефростации пробирку с клеточной суспензией изымали из сосуда

Дьюара и размораживали при +37 ОС в течение 5 мин. Полученную суспензию

переносили в 15 мл центрифужные пробирки и центрифугировали 1100 об/мин, 5

мин, t+37 ОС. Осадок ресуспендировали в соответствующей полной ростовой среде

объемом 5 мл и переносили в культуральный флакон 25 см2.

2.3 Третий этап. 3D клеточное культивирование

Метод получения 3Dклеточных сфероидов был однотипным для получения

сфероидов как из кератоцитов, так и из клеток заднего эпителия. Сфероиды

39

создавали с использованием неадгезивных агарозных планшетов 3D Petri Dish.

Клеточную культуру кератоцитов 4 пассажа и клетки заднего эпителия 2 пассажа

промывали раствором Версена, далее подвергали ферментативной обработке

0,25% раствором Трипсин-Версена (1:1), время экспозиции составило 10 минут,

t+37 ОС. Полученную суспензию клеток центрифугировали 1100 обр/мин, 5 мин, к

образовавшемуся осадку добавляли необходимое количество полной питательнои

среды для получения заданнои концентрации 1,3х106 кл/мл (1000 клеток в

сфероиде) и 6,7х105 кл/мл (500 клеток в сфероиде).

Культивирование сфероидов из кератоцитов осуществлялось в 4-х

различных по составу средах, представленых в таблице 5.

Таблица №5. Состав сред для культивирования 3D клеточных сфероидов кератоцитов

Среда №4.4 Среда №4.4.1 Среда №4.7 Среда №4.7.1

Базовая среда DMEM/F12 DMEM/F12 DMEM/F12 DMEM/F12

Антибиотики 1 % 1 % 1 % 1 %

L - глутамин 2мМ 2мМ 2мМ 2мМ

Эмбриональная телячья сыворотка 5 % 5 % 5 % 5 %

Фактор роста фибробластов - - 10 нг/мл 10 нг/мл

L- аскорбиновая кислота - 1мг/мл - 1мг/мл

Одной из основных функций кератоцитов является синтез коллагена,

представляющий собой сложный многоэтапный процесс, начинающийся в клетке

и завершающийся в межклеточном матриксе. Известно, что одну из ведущих ролей

в процессе синтеза коллагена играет L-аскорбиновая кислота, необходимая для

образования ковалентных связей между молекулами коллагена при сборке

коллагеновых фибрилл. В связи с чем, было изучено влияние L-аскорбиновой

кислоты на формирование 3D клеточных сфероидов кератоцитов.

Сфероиды из клеток заднего эпителия роговицы культивировали на полной

питательной среде подобранной на 2-м этапе.

40

Культивирование осуществлялось при стандартных условиях, смена среды

проводилась каждые 2 суток. Срок наблюдения для 3D клеточных сфероидов

кератоцитов составил 35 суток, для 3D клеточных сфероидов клеток заднего

эпителия роговицы - 14 суток.

2.3.1 Определение жизнеспособности полученных 2D и 3D клеточных культур

На всех этапах работы проводили оценку жизнеспособности полученных

клеточных культур используя флуоресцентный краситель «Live and Dead». Данный

краситель представляет собой коммерческий набор, содержащий в своем составе

два флуоресцентных красителя: живые клетки окрашиваются в зеленый цвет (Ex.

494; Em. 515), мертвые клетки окрашиваются в красный цвет (Ex. 528; Em. 617).

Для оценки жизнеспособности 2D культуры клеток на этапах пассирования

отбирали пробу 1х105 клеток. Полученную суспензию клеток переносили в

пробирки для проточного цитофлуориметра, центрифугировали 1100 обр/мин, 5

мин, супернатант удаляли и добавляли 1 мл раствора Cell Wash. Далее повторно

центрифугировали 1100 обр/мин, 5 мин, полученный осадок ресуспендировали в

100 мкл раствора фосфатного-солевого буфера с 1х концентрацией раствора «Live

and Dead» и инкубировали при комнатной температуре 10 минут в темноте. Анализ

осуществляли используя проточный цитофлуориметр Cyto Flex.

Для оценки жизнеспособности 3D клеточных культур использовали по 10

сфероидов каждого типа, согласно протоколу, представленному выше. Оценку

жизнеспособности клеточных сфероидов проводили используя лазерно-

сканирующий конфокальный микроскоп Olympus FV 10i.

2.3.2 Проведение иммуноцитологического исследования полученных 2D и 3D

клеточных культур

Для определения и детекции изменений фенотипа полученных клеточных

культур на каждом этапе проводили иммуноцитологическое исследование 2D и 3D

клеточных культур.

41

Для анализа 2D клеточных культур изучали экспрессию характерных

маркеров кератоцитов (кератансульфат, кератокан, люмикан), характерного

маркера миофиробластов (а-гладкомышечный актин), а так же, характерных

функциональных белков клеток заднего эпителия роговицы (Na/K АТФаза,

Люмикан, ZO-1). С этой целью использовали специальные 4-х или 8-и луночные

слайд-флаконы, в каждую лунку которого добавляли суспензию клеток,

полученную согласно протоколам, описанным выше, в концентрации 5х103 с

добавлением 0,8 мл соответствующей полной питательной среды.

Культивирование проводили в течение 5 суток при стандартных условиях.

Для анализа 3D клеточных сфероидов, помимо выше указанных маркеров,

изучали экспрессию маркеров внеклеточного матрикса (коллагены 1, 3, 5 и 6 типа)

и маркера цитоскелета (виментин). С этой целью проводили выведение 256

сфероидов для каждой точки детекции: из кератоцитов на сроках 1, 7, 14, 21, 28 и

35 сутки, а из клеток заднего эпителия роговицы - на 1, 7 и 14 сутки. Окраску

проводили в пробирках типа Эппендорф объемом 0,6 мл.

Протокол проведения иммуноцитологического анализа для 2D и 3D

клеточных культур был одинаков и включал в себя следующие этапы: фиксацию

материала, пермобилизацию клеток, окраску первичными антителами, окраску

вторично-меченными антителами, контрастирование клеточного ядра, заключение

препарата под покровное стекло.

Фиксацию клеточных культур проводили в 10% растворе формалина (pH-7.4)

в течение 10 минут при комнатной температуре. Фиксатор отмывали 3 раза по 5

мин холодным раствором (+4ОС) фосфатно-солевого буфера (pH-7.4).

Пермобилизацию клеток проводили 0,25% раствором Triton-X100 в фосфатно-

солевом буфере в течение 10 минут. Далее клетки отмывали 3 раза по 5 минут

раствором фосфатно-солевого буфера (pH-7.4). Для уменьшения

неспецифического связывания антител производили обработку образцов

раствором фосфатно-солевого буфера с добавлением 1% бычьего сывороточного

альбумина и 0,1% Tween 20. После чего, образцы инкубировали в течение 1 часа

при комнатной температуре используя первичные антитела, разведенные в

42

фосфатно-солевом буфере с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина и

0,1% Tween 20, концентрация антител представлена в таблице 6. По истечению

времени тщательно отмывали образцы раствором фосфатно-солевого буфера (pH-

7.4) 3 раза по 5 мин при комнатной температуре. Для детекции первичных антител

использовали вторичные антитела, коньюгированые с флуорохромными

красителями, разведенными в фосфатно-солевом буфере (pH-7.4) с добавлением

1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Tween 20, инкубировали в течение 1

часа, концентрация антител представлена в таблице 7. Вторичные антитела

отмывали 3 раза по 5 мин раствором фосфатно-солевого буфера (pH-7.4).

Контрастирование ядер проводили бис-бензимидом (Hoechst 33258) 0,1 мг/мл в

растворе фосфатно-солевого буфера (pH-7.4), по истечению времени краситель

также удалялся раствором фосфатно-солевого буфера (pH-7.4) 3 раза по 5 мин.

Полученные образцы монтировали фиксирующим раствором под покровное

стекло, стекла хранились при t+4 ОС не более 2-х дней с момента окраски до

момента анализа. Исследование производили на инвертированном лазерно-

сканирующем конфокальном микроскопе Olympus FV 10i.

Полученные снимки анализировали используя программное обеспечение

«CellProfiler», которое позволяет выделять необходимые для анализа клеточные

компоненты, а именно ядро, цитоплазму или клетку (ядро + цитоплазма), и

рассчитать интенсивность свечения каждой клетки, используя встроенные

инструменты программного обеспечения.

Таблица 6. Перечень используемых первичных антител

Название антител Используемое разведение Источник

Кератокан 1:100 Кролик

Кератансульфат 1:100 Мышь

Люмикан 1:200 Кролик

a-гладкомышечный актин 1:100 Мышь

Виментин 1:250 Мышь

Коллаген 1 1:200 Кролик

Коллаген 3 1:200 Мышь

43

Коллаген 5 1:200 Кролик

Коллаген 6 1:200 Мышь

Na / K АТФаза 1:100 Мышь

ZO-1 1:100 Кролик

Таблица № 7. Перечень используемых вторичных антител

Название Разведение Флуорохромный краситель

Козлиные против Мыши

(Goat anti-Mouse) 1:250

Alexa Fluor 594

(Ex590; Em617)

Козлиные против Кролика (Goat

anti-Rabit) 1:250

Alexa Fluor 488

(Ex495; Em519)

2.4 Четвертый этап. 2D культивирование кератоцитов на полимерных

материалах

Для подбора оптимальных материалов были использованы следующие

образцы полимерных материалов (Таблица №8)

Таблица № 8 Перечень используемых материалов

Материал Производитель Количество

Фиброин шелка Лаборатория бионанотехнологий * 24

Гидроксиэтилметакрилат (ГЭМА) ООО «Научно-экспериментальное

производство МГ»(Москва)

24

Олигоуретанметакрилат (ОУМА) ООО «Репер НН» (Нижний

Новгород)

24

Полиметилметакрилат (ПММА) ООО «Экспериментально-

техническое производство»

(Москва)

24

*Пленки фиброина шелка были предоставлены лабораторией

бионанотехнологий ФГБУ "НМИЦ трансплантологии и искусственных органов

имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России, заведующий д.б.н. Агапов

И.И.

Все полученные образы материалов имели одинаковую форму диаметром 10

мм и толщиной 0,5 мм.

44

Для исследования биосовместимости полученных образцов были

сформированы 5 групп (4 опытные группы содержащие исследуемый материал и 1

контрольная группа - полистирол (культуральный пластик)), распределение

материала по группам представлено в таблице № 9. Исследуемый материал

переносили в 24-луночные культуральные планшеты и добавляли суспензию

кератоцитов 2х103 в каждую лунку. Культивировали в полной ростовой среде в

течении 6 суток, смена среды была однократно на 3-и сутки. Для оценки

пролиферативной активности кератоцитов на материале, каждые сутки

ферментативно снимали клетки с 4-х лунок каждой группы, центрифугировали и

проводили подсчет клеток.

Таблица № 9 Распределение материала по группам

Группа № 1 № 2 № 3 № 4 № 5

Исследуемый

материал

Фиброин шелка ГЭМА ОУМА ПММА Полистирол

2.5 Пятый этап. 2D и 3D культивирование кератоцитов на фиброине шелка

На данном этапе изучали особенности культивирования 2D и 3D культур

кератоцитов на фиброине шелка (n=100) с целью последующего создания слоистой

структуры стромы искусственной роговицы.

Для проведения 2D культивирования с культурой кератоцитов полученные

пленки фиброина шелка (d=18 мм) фиксировали между клипсами (Рис. 1), далее к

полученной конструкции добавляли суспензию клеток кератоцитов 4-го пассажа в

концентрации 5х104 /на одну пленку (n=30). Для 3D культивирования

использовали 50 шт сфероидов на одну пленку (n=30). Культивирование проводили

вполной ростовой среде (DMEM/F12, ЭТС 5%, 1 мг/мл L-аскорбиновой кислоты,

2мМL-глутамин, 1% антибиотиков) в течение 7суток.

Для создания слоистой структуры стромальной части роговицы пленки

фиброина шелка (n=40) с 3D клеточными сфероидами (50 сфероидов на одну

пленку) культивировали в полной ростовой среде, срок культивирования составил

45

7 суток. Далее материал извлекали из клипс и наслаивали друг на друга, срок

культивирования составил 7 суток.

После истечения срока культивирования определяли жизнеспособность и

ранний апоптоз клеток, используя комбинацию красителей 7-аминоактиномицин Д

(7AAD) и Аннексин V. Детекцию токсического действия материала на клетки

определяли используя метод «ДНК- комет».

2.5.1 Метод «ДНК-комет»

Метод «ДНК-комет» позволяет определить повреждение ДНК и изучить

репарацию на уровне одиночной клетки. Метод основан на регистрации различной

подвижности в постоянном электрическом поле поврежденной ДНК и/или

фрагментов ДНК индивидуальных лизированных клеток, заключенных в

агарозном геле. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический

след, визуально напоминающий «хвост кометы», параметры которого зависят от

степени поврежденности ДНК. Подготовительный этап включал в себя подготовку

предметных стекол с нанесением слоя агарозы. Фиброин шелка с 2D или

3Dклеточной культурой промывали раствором Версена, далее добавляли 0,25%

раствор Трипсина-Версена 1:1, инкубировали 10 мин при t+37 ОС. Полученную

суспензию центрифугировали 1100 об/мин, 5 мин, осадок ресуспендировали в

фосфатносолевом буфере (pH-7.4), забирали пробу объемом 10 мкл (концентрация

клеток 1х104) и переносили в пробирки типа Эппендорф с 1% раствором

легкоплавкой агарозы объемом 75 мкл. Полученную суспензию помещали на

предметные стекла с агарозным покрытием и охлаждали в течение 10 мин при t+4

ОС. Далее переносили в лизирующий раствор (10мМ Триса, 2,5 М NaCl, 100мМ

ЭДТА) инкубация составила 1 час при t+4 ОС. Полученные препараты переносили

в щелочной раствор (pH>13) для проведения электрофореза 1В на 1 см, 20 мин,

нейтрализацию проводили используя фосфатно-солевой буфер (pH-7.4). Для

окрашивания использовали раствор этидиума бромида в дистиллированной воде,

экспозиция составила 2 часа при t+4 ОС, в темноте. Анализ препаратов проводили

используя лазерно-сканирующий конфокальный микроскоп Olympus FV 10i.

46

Полученные изображения анализировали с помощью встроенного программного

обеспечения микроскопа.

Для получения количественных данных, полученные изображения ДНК-

комет делили на 5 условных типов. Используя математическую формулу

рассчитывали Индекс ДНК - комет:

Где I dc- индекс ДНК-комет; n0 до n4 - количество ДНК-комет каждого типа;

∑ - общая сумма ДНК-комет.

2.5.2 Определение раннего апоптоза

Для определения характера влияния материала на клеточную культуру

использовали флуоресцентный краситель 7AAD, связывающийся с

поврежденными клетками, и Аннексин V, связывающийся с клеточным белком

фосфатидилсерином при запуске апоптоза. С этой целью к суспензии клеток с

концентрацией 1х105 добавляли 5 мкл красителя 7AAD, конъюгированного с

флуоресцентным цианиновым красителем Cy3 (Ex550; Em570) и 10 мкл Аннексина

V коньюгированного с флуоресцентным красителям Alexa Fluor 488 (Ex. 495; Em.

519). Инкубировали 10 мин при комнатной температуре в темноте. Материал

анализировали используя проточный цитофлуориметр Cyto Flex.

2.6 Обработка количественных данных

Статистическую обработку полученных данных проводили используя

методы описательной статистики программного обеспечения Graph Pad Software

Prisma 7.

47

2.7 Перечень используемого лабораторного оборудования и расходных

материалов

Все манипуляции с тканями и клеточными культурами проводили в

стерильных условиях ламинарных боксов IIкласса безопасности. В таблице 10

перечислено используемое в работе оборудование, в таблице 11 представлены

используемые компоненты сред и реактивы, в таблице 12 представлены расходные

материалы.

Таблица 10. Используемое лабораторное оборудование

Оборудование Производитель

Ламинарный бокс II класса безопасности MSC-

Advantage Termo Fisher Scientific, Германия

Центрифуга SL-40R Termo Fisher Scientific, Германия

Центрифуга LMC-3000 Biosan, Латвия

Термошейкер TS-100 Biosan, Латвия

Инкубатор NU-5510 NuAire, США

Морозильная камера MDF-U3286S (-80ОС) Sanyo, Япония

Контейнер для криоконсервации Cool Cell LX Biocision, США

Сосуд Дьюара Cryo Diffusion, Франция

Автоматический счетчик клеток Luna II Logos biosystems, Коррея

Инвертированный световой микроскоп Olympus IX-

81 Olympus, Япония

Лазерно-сканирующий микроскоп Olympus FV-10i Olympus, Япония

Проточный цитофлуориметр Cyto Flex Beckman Coulter, США

Таблица 11. Реактивы для работы с клеточными культурами

Реактивы Производитель

Эмбриональная телячья сыворотка HyClone, TermoFisherScientific, США

L - глутамин GlutoMax TermoFisherScientific, США

Смесь антибиотиков (пеницилин 10000 МЕ/мл,

стрептомицин 10000 мкг/мл, амфоторецин 25 мкг/мл) Sigma Aldrich, Канада

Базовая среда DMEM low glucosa

48

Базовая среда MEM

Базовая среда 𝒂MEM

Базовая среда DMEM/F12

Базовая среда 199

ПанЭко, Россия

Фактор роста фибробластов

Коллагеназа II типа TermoFisherScientific, США

Раствор Трипсин-Версена 0,25%


Раствор Версена

Фосфатно солевой буфер


Диметилсульфоксид (ДМСО)

L- аскорбиновая кислота Sigma Aldrich, Канада

Формалин

PanReac AppliChem, Германия Triton X100

Twen 20

Агароза

ДиаЭм, Россия

Этидиум бромид

Live and Dead

Abcam, Великобритания

Аннексин V

Люмикан

a-Гладкомышечный актин

Виментин

Коллаген 1

Коллаген 3

Коллаген 5

Коллаген 6

Na / K АТФаза

ZO-1

Вторичные антитела Козлиные против Мыши (Goat

anti-Mouse)

Вторичные антитела Козлиные против Кролика (Goat

anti-Rabit)

49

7AAD Beckman Coulter, США

Кератокан

Santa-Cruz BIotechnology, США

Кератансульфат

Cell Wash BD, США

Таблица 12. Лабораторная посуда, используемая в работе

Посуда Производитель

Чашка Петри 35 мм

SPL, Корея

Слайд флакон для проведения иммуноцитохимии

Чашка Петри 100 мм

Corning, США

Культуральный флакон 25см2

Криопробирки 2 мл.

Пробирки центрифужные 15 мл

Пробирки для проточника 12х75 Beckman Coulter, США

Пробирки типа Эппендорф GenFollower, Китай

50

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Получение первичной клеточной культуры

3.1.1 Кератоциты

На сегодня существует несколько методик дезагрегации ткани для получения

первичной культуры клеток. Для получения культуры кератоцитов общепринятым

способом выделения является методика, предложенная Funderburgh M.L. с

соавторами в 2005 году (Funderburgh M.L., Du Y., Mann M.M., et al. 2005).

Особенностью данного метода является значительная механическая и долгая

ферментативная дезагрегация стромы роговицы раствором коллагеназы 2типа.

Известно, что механическая и ферментативная дезагрегация повышает выход

клеток отражающий состав ткани за короткое время, однако данные методы

диссоциации приводят к селекции клеток по их устойчивости к протеазам и

механическому стрессу (Фрешни Р.Я. 2010). Одним из недостатков использования

ферментативной дезагрегации является повреждение ткани, которое может

происходить в следствии продолжительного времени инкубации, а также утрата

уникального фенотипа клеток. Кроме того, грубая механическая и долгая

ферментативная дезагрегация неизбежно запускает механизмы репарации и

способствует переходу кератоцитов в миофибробласты, тем самым способствует

получению гетерогенной клеточной культуры (Shi L., Stachon T., Seitz B., et al.

2018).

Таким образом, для сохранения максимального выживания клеток, важно

минимизировать механическое повреждение ткани, а также, время инкубации в

растворах ферментов. В данной связи нами был предложен протокол, основанный

на уменьшении механического повреждения и времени ферментативной

дезагрегации стромы роговицы.

При изучении первичной клеточной культуры кератоцитов полученной по

методу предложенным Funderburgh M.L., было отмечено, что на первые сутки

культивирования выделенная культура была представлена единичными клетками,

имеющими округлую форму, адгезия отсутствовала (Рис. 3 А). На вторые сутки

51

была выявлена частичная адгезия клеточной культуры, при этом наблюдалось

большое количество не адгезированных клеток (Рис. 3 Б ).

Рисунок 3. Морфология первичной культуры кератоцитов, полученная по методу

предложенным Funderburgh M.L.. А - первые сутки культивирования; Б - вторые сутки

культивирования. Световая фазово-контрастная микроскопия ув. 100х

На рисунке 4 схематично представлен протокол выделения кератоцитов

согласно оригинальной методике.

Рисунок 4. Протокол выделения кератоцитов, оригинальный метод. А - механическая

удаление клеток переденего и заднего эпителия; Б - В - выкраивание 8 мм центральной зоны

роговицы; Г - механическая дезагрегация стромы роговицы; Д - фрагмент стромы роговицы

после ферментативной дезагрегации; Е - первичная клеточная культура 1 сутки культивирования.

А-Г - макросьемка этапов оригинального метода выделения; Д - совмещенная фотография,

световая фазово-контрастная микроскопия ув. 40х; Е – световая фазово-контрастная

микроскопия ув. 100х

52

Полученный фрагмент объемом 1/8 стромы роговицы обрабатывали

раствором коллагеназы 2типа, после ферментативной обработки фрагмент

переносили в чашку Петри с добавлением культуральной среды. Спустя 12 часов

фрагмент был полностью диссоциирован на одиночные клетки, находящиеся в

большой концентрации с растворением внеклеточного матрикса.

С помощью автоматического счетчика клеток проводили подсчет

полученных клеточных культур. Количество полученных клеток с использованием

различных методов выделения представлены в таблице 13.

Таблица 13. Количество клеток, первично выделенных из фрагментов стромы роговицы,

тыс. клеток ±σ

Методика Funderburgh M.L. Оригинальная методика

Количество клеток 6,3±0,76 8,7±1,04*

*р ≤ 0,05 по сравнению с методикой Funderburgh M.L.

Жизнеспособность полученных клеточных культур оценивали с помощью

проточного цитофлуориметра с использованием набора «Live and Dead» (Рис. 5).

На рисунке показано, что количество жизнеспособных клеток в группе,

выделенной по методике Funderburgh M.L., составило 64,13%, по оригинальной

методике - 86,05%.

Рисунок 5. Определение жизнеспособности полученных клеточных культур.

А - жизнеспособность клеточной культуры, полученной по методике FunderburghM.L.;

Б - жизнеспособность клеточной культуры, полученной оригинальным методом.

Проточная цитофлуориметрия.

53

Таким образом, предложенный оригинальный метод выделения кератоцитов

позволяет получить статистически более высокий выход жизнеспособных клеток и

повышает их выживаемость. Дальнейшее проведение работы проводилось на

культуре клеток, полученных оригинальным методом выделения.

3.1.2 Клетки заднего эпителия роговицы.

Для получения первичной культуры клеток заднего эпителия роговицы

использовали эксплантационный метод.

3.2 Подбор питательной среды для клеточных культур.

Для выделения и культивирования специфических клеточных культур

существует большое количество базовых сред - это питательные среды, имеющие

определенный химический состав, на основе которых получают полную

питательную среду - эта раствор базовой среды с добавлением различных

компонентов, таких как: глутамин, сыворотка, факторы роста. На сегодня нет

единого состава среды для выделения и культивирования кератоцитов и клеток

заднего эпителия роговицы. Каждая исследовательская группа использует

собственный протокол состава среды, при этом, в некоторых случаях, добавление

специфических компонентов не обусловлено. Данный факт связан с тем, что

подбор оптимального состава среды проводится эмпирическим путем.

3.2.1 2D культивирование кератоцитов

Проблема выделения и культивирования кератоцитов до сих пор остается

крайне актуальной в современной регенеративной медицине. 2D культивирование

кератоцитов неизбежно приводит к их дифференцировке в фибробласты (Dreier B.,

Thomasy S.M., Mendonsa R., et al. 2013; Guo X., Sriram S., Tran J.A., et al. 2018;

Thomasy S.M., Raghunathan V.N., Miyagi H., et al. 2018). Известно, что при

благоприятных условиях фибробласты способны возвращаться к состоянию покоя

и приобретать фенотип кератоцитов. Однако, при увеличении сроков

2Dкультивирования возможен переход фибробластов в миофибробласты, которые

54

не способны к возврату в исходное состояние. Важно отметить, что

миофибробласты секретируют неорганизованный внеклеточный матрикс,

характеризующийся потерей прозрачности - являющейся одной из ключевых

функций стромы роговицы (Chen T.C., Chang S.W., Wang T.Y. 2013). Таким

образом, на данном этапе работы нами осуществлялся подбор оптимальных

условий культивирования кератоцитов, способствующих сохранению их

уникальных характеристик.

Подбор оптимальной питательной среды для культивирования кератоцитов

проводили в 2 этапа. На первом этапе осуществляли подбор базовой среды для

культивирования первично выделенной клеточной культуры кератоцитов.

Было проведено сравнение наиболее распространенных базовых сред,

используемых для культивирования кератоцитов, представленных в доступной

литературе: DMEM с низким содержанием глюкозы, MEM, 𝒂MEM, DMEM/F12

(Таблица 2), при этом была изучена адгезия клеток и изменение их морфологии.

Полученные результаты оценивали на 1-е и 3-е сутки культивирования.

Полученные результаты показали, что в базовой среде DMEM с низким

содержанием глюкозы наблюдалась адгезия клеток небольшими конгломератами

уже на первые сутки культивирования, но уже к концу вторых суток

прослеживалось открепление клеток и их деструкция в среде (Рис. 6 А). На 3-и

сутки в культуре детектировались единичные прикрепленные клетки с большим

количеством дебриса в среде (Рис. 6 Б).

При культивировании в базовых средах MEMи 𝒂MEM были получены

схожие результаты, на 1-е сутки культивирования отмечалась адгезия клеток к

поверхности культурального пластика в виде небольших конгломератов (Рис. 6 В,

Д). На 3-и сутки морфология клеток изменялась, клетки приобретали

фибробластоподобную морфологию, что являлось косвенным свидетельством

потери фенотипа кератоцитов (Рис. 6 Г, Е).

Наилучшие результаты были получены при использовании среды

DMEM/F12. На 1-е сутки культивирования наблюдалась адгезия большого

количества выделенных клеток (Рис. 6 Ж). На 3-и сутки была получена 90%-

55

конфлуэнтность в культуре, при этом полученные клетки имели морфологию

характерную для кератоцитов (Рис. 6 З).

Рисунок 6. Морфология первичной культуры кератоцитов. А - кератоциты 1 сутки

культивирования, среда №1; Б - кератоциты 3 сутки культивирования, среда №1; В - кератоциты

1 сутки культивирования, среда №2; Г - кератоциты 3 сутки культивирования, среда №2; Д -

кератоциты 1 сутки культивирования, среда №3; Е - кератоциты 3 сутки культивирования, среда

№3; Ж- кератоциты 1 сутки культивирования, среда №4; З - кератоциты 3 сутки культивирования,

среда №4. Световая фазово-контрастная микроскопия ув 100х

56

В таблице 14 представлена оценка влияния базовой среды на

культивирование кератоцитов


тыс. клеток ±σ

Среда №1

(DMEM low glucose)

Среда №2

(MEM)

Среда №3

(𝒂MEM)

Среда №4

(DMEM/F12)

Количество

клеток 25±1,76* 56±2,36* 70±1,24* 180±1,56

*р ≤ 0,05по сравнению со средой DMEM/F12

Таким образом, в качестве базовой среды была определена среда DMEM/F12,

дальнейший подбор дополнительных компонентов проводили с использованием

данной среды.

На втором этапе было проведено исследование влияния дополнительных

компонентов на культивирование кератоцитов. Изучалось влияние ЭТС и ФРФ

(таблица 3). Использование ЭТС обусловлено содержанием в ней большого

количество различных факторов роста, необходимых для адгезии и пролиферации

клеток. Однако, отсутствие стандартизации сред, а также возможность передачи

прионных инфекций, диктует необходимость разработки бессывороточных сред.

Вместе с тем, имеющиеся в настоящее время бессывороточные среды не способны

в полной мере поддерживать фенотип клеток (Фрешни). В этой связи нами было

изучено влияние сред с отсутствием и малой концентрацией ЭТС на 2D клеточную

культуру кератоцитов. Выбор ФРФ был обусловлен его способностью

стимулировать синтез малых лейцинбогатых протеогликанов, а именно:

кератокана, кератансульфата и люмикана, являющихся характерными для

кератоцитов.

Оценку результатов подбора (4-й пассаж клеточной культуры) проводили по

следующим критериям: количество полученных клеток и сохранность фенотипа


Полученные результаты показали, что адгезия клеток наблюдалась на всех

типах сред на 1-е сутки культивирования. По достижению 90%-конфлуэнтности

проводили пассирование клеточной культуры раствором Трипсин-Версена и его

57

последующей инактивацией питательной средой, содержащей 10% ЭТС.

Дальнейшее культивирование проводили в полной питательной среде в

соответствии с группой исследования (таблица 3).

На среде № 4.1, в состав которой не входили ЭТС и ФРФ, на 2 сутки после

пассирования наблюдали адгезию клеток к культуральному пластику, но спустя 5

суток клетки откреплялись и плавали в растворе (Рис. 7). Однако, после замены

среды, адгезия клеток отсутствовала, при дальнейшем культивировании отмечали

полную потерю клеток. Срок культивирования составил 17 суток. Данные

изменения могут свидетельствовать о необходимости замены среды или о

неадекватности ее компонентов, требующихся для культивирования кератоцитов.

Рисунок 7. Морфология клеточной культуры кератоцитов, среда № 4.1.

А - конфлуэнтность кератоцитов; Б - кератоциты после пассирования; В - кератоциты 2 сутки

культивирования после пассирования; Г - кератоциты 5 сутки культивирование.

Световая фазово-контрастная микроскопия ув. 100х

В среде № 4.2, содержащей дополнительный компонент ФРФ, после

пассирования наблюдали формирование свободно плавающих клеточных

агрегатов, адгезия отсутствовала. На 7-е сутки культивирования отмечали

постепенное разрушение агрегатов до единичных клеток (Рис. 8). При дальнейшем

58

культивировании была обнаружена полная потеря клеток. Срок культивирования

составил 21 день. Таким образом, нами было показано, что изолированное

использование ФРФ, не приводит к каким-либо значимым изменения по сравнению

с культивированием на бессывороточной среде № 4.1.



культивирования после пассирования; Г - кератоциты 7 сутки культивирование.

Световая фазово-контрастная микроскопия ув. 100х

В среде № 4.3, в состав которой входила 2% ЭТС и отсутствовал ФРФ,

адгезия клеток наблюдалась на протяжении всего периода культивирования (39

суток). При пассировании клеток наблюдалось изменение морфологии, клетки

уменьшались в объеме и вытягивались. На 2-м пассаже клетки были слабо

вытянутые, увеличения количества клеток не наблюдалось, они практически не

подвергались митозу (Рис. 9). Данные изменения полностью соответствуют

условиям культивирования, а именно низкому содержанию ЭТС, которая была

59

оптимальна для адгезии клеток, однако для поддержания пролиферативной

активности используемая концентрация была недостаточной.


А - конфлуэнтность кератоцитов; Б - кератоциты после пассирования; В - кератоциты 1 пассажа;

Г - кератоциты 2 пассажа. Световая фазово-контрастная микроскопия ув. 100х

В среде № 4.4, в состав которой входила 5% ЭТС, адгезия наблюдалась на

всем протяжении культивирования (34 суток), при этом наблюдалась более

выраженная пролиферативная активность клеток. Так же было отмечено изменение

морфологии при пассировании в виде вытягивания клеток (Рис. 10). В данной

группе наблюдения был получен 4-й пассаж, который в последствии использовали

в иммуноцитологическом анализе.

60




В среде № 4.5, содержащей максимальное количество ЭТС - 10%,

наблюдалась ожидаемая высокая пролиферация, а также, изменение морфологии

клеток в сторону приобретения фибробластоподобного фенотипа (Рис. 11). Клетки

культивировали до 4-го пассажа, после проводили иммуноцитологический анализ.

Срок культивирования составил 25 суток.

При изучении культивирования кератоцитов в средах, содержащих

комбинацию ФРФ и ЭТС (2% - среда № 4.6 (Рис. 12), 5% - среда 4.7 (Рис. 13), 10%

- среда 4.8 (Рис. 14)) визуальных отличий по сравнению со средами содержащими

только ЭТС выявлено не было. При этом, в среде, содержащей ФРФ и 2% ЭТС

(среда 4.6) были получены результаты полностью соответствующие результатам,

полученным в среде содержащей лишь 2% ЭТС (среда 4.3).

61






культивирования после пассирования; Г - кератоциты 5 сутки культивирование. Световая

фазово-контрастная микроскопия ув. 100х

62







63

Таким образом, 4-й пассаж кератоцитов, с которыми проводилась

дальнейшая работа, был получен только в средах №4.4, 4.5, 4.7, 4.8. В таблице 15

приведено количество клеток, полученных при культивировании в данных средах.


мил. клеток ±σ

Среда №4.4 Среда №4.5 Среда №4.7 Среда №4.8

Количество

клеток 1±0,50* 1,5±0,45* 0,9±0,56* 1,8±0,76

*р ≤ 0,05 относительно среды №4.8

Таким образом, наибольший выход клеток отмечался в средах, содержащих

10% ЭТС (№4.5, 4.8).

Для оценки фенотипа полученных 2D клеточных культур проводили

иммуноцитологический анализ. Было выявлено, что клетки, культивируемые в

средах, содержащих 5% ЭТС (№4.4 (Рис. 15)) и 5% ЭТС с добавлением ФРФ (№4.7

(Рис. 16)), экспресируют характерные маркеры кератоцитов: кератокан,

кератансульфат, люмикан, при этом экспрессия а-гладкомышечного актина

характерного для миофибробластов отсутствовала. В средах, содержащих 10%

ЭТС (№4.5 (Рис. 17)) и 10% ЭТС с добавлением ФРФ (№4.8 (Рис. 18)) наоборот,

отмечалась экспресия а-гладкомышечного актина, а экспрессия характерных

маркеров кератоцитов в данных группах исследования отсутствовала. Таким

образом, наиболее оптимальными средами для культивирования кератоцитов

являются среды, содержащие 5% ЭТС и 5% ЭТС с добавлением ФРФ. Увеличение

процентного содержания ЭТС в среде приводит к статистически значимому

количеству получаемых клеток, однако при этом наблюдается их

дифференцировка в миофибробласты.

64

Рисунок 15. Иммуноцитохимический анализ культуры кератоцитов 4 пассаж, среда № 4.4.

А - отсутствие характерного маркера миофибробластов а-гладкомышечного актина; Б - слабая

экспрессия характерного маркера люмикана; В - экспрессия характерного маркера кератокана;

Г - экспрессия характерного маркера кератансульфата. Иммуноцитохимическое окрашивание,

лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра докрашены красителем бис-бензимид

(Hoechst 33258) ув. 600х

65


А - экспрессия характерного маркера миофибробластов а-гладкомышечного актина; Б - слабая

экспрессия характерного маркера люмикана; В - отсутствие экспрессии характерного маркера

кератокана; Г - отсутствие экспрессии характерного маркера кератансульфата.

Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра

докрашены красителем бис-бензимид (Hoechst 33258) ув. 600х

66


А - отсутствие характерного маркера миофибробластов а-гладкомышечного актина;

Б - экспрессия характерного маркера люмикана; В - экспрессия характерного маркера

кератокана; Г - слабая экспрессия характерного маркера кератансульфата.



67


А - экспрессия характерного маркера миофибробластов а-гладкомышечного актина; Б - слабая

экспрессия характерного маркера люмикана; В - отсутствие экспрессии характерного маркера

кератокана; Г - отсутствие экспрессии характерного маркера кератансульфата.



Дальнейшее проведение экспериментов проводили в средах 4.4 и 4.7 в связи

с сохранением фенотипа кератоцитов.

68

3.2.2 2D культивирование клеток заднего эпителия роговицы.

Для подбора оптимального состава среды для культивирования клеток

заднего эпителия роговицы, согласно литературным данным, использовали две

наиболее распространенные базовые среды (DMEM/F12; M199) и их комбинацию

(DMEM/F12 и М199 (0,5:0,5:1)) с добавлением 10% ЭТС (таблица 4).

При культивировании десцеметовой мембраны на среде № I, включавшей в

себя базовую среду DMEM/F12, на 1-е сутки отмечали постепенную потерю

исходных клеток заднего эпителия роговицы, параллельно с данным процессом

наблюдалась пролиферация оставшихся клеток на культивируемой мембране. При

полном покрытии десцеметовой мембраны (6-10 сутки) наблюдалась постепенная

миграция клеток на поверхность культурального пластика с их последующей

адгезией. Пролиферация клеток наблюдалась как от единичных прикрепленных

клеток, так и единой линией, характерной для эпителиальных клеток. При оценке

морфологии клеток отмечалось увеличение размеров клеток, при этом

наблюдалось сохранение гексогональной формы клеток, характерной для заднего

эпителия роговицы. Вытягивания клеток в сторону приобретения

фибробластоподобной формы отмечено не было (Рис. 19). По достижению 90% -

конфлуэнтности клетки пассировали.

При культивировании в среде № II, включавшей в себя базовую среду М199,

на 1-е сутки отмечали образование бесклеточных участков на десцеметовой

мембране. Дальнейшее культивирование показало, что на 5-е сутки происходит

увеличение общего количество клеток на десцеметовой мембране, однако, клетки

меняли свой фенотип, вытягивались, и при миграции на пластик не сохраняли свою

эпителиальную морфологию. При пассировании полученных клеточных культур,

отмечали сохранение фибробластоподобной морфологии (Рис. 20).

При культивировании в среде № III, включавшей в себя базовую среду

DMEM/F12 и среду М199 в соотношении 1:1, наблюдалась постепенная потеря

клеток на десцеметовой мембране. На 12-е сутки культивирования отмечалась

полная потеря клеток заднего эпителия роговицы (Рис. 21).

69

Рисунок 19. Морфология клеточной культуры клеток заднего эпителия роговицы, среда

№I. А - 1 сутки культивирование десцеметовой мембраны с клетками заднего эпителия роговицы;

Б -10 сутки культивирования клеток; В - единичные прикрепленные клетки; Г - конфлюэнтность

клеток 1 пассажа; Д - конфлюэнтность клеток 2 пассажа. Световая фазово-контрастная

микроскопия, ув. 100х

70

Рисунок 20. Морфология клеточной культуры клеток заднего эпителия роговицы среда

№II. А - 1 сутки культивирование десцеметовой мембраны с клетками заднего эпителия

роговицы; Б - 5 сутки культивирования клеток; В - конфлюэнтность клеток 1 пассажа; Г -

конфлюэнтность клеток 2 пассажа. Световая фазово-контрастная микроскопия, ув. 100х

Рисунок 21. Морфология клеточной культуры клеток заднего эпителия роговицы среда

№III. А - 1 сутки культивирование десцеметовой мембраны с клетками заднего эпителия

роговицы; Б - 12 сутки культивирования клеток. Световая фазово-контрастная микроскопия,

ув. 100х

Для проведения иммуноцитологического исследования проводили анализ

полученных клеточных культур 2-го пассажа в средах № I и № II. Для сравнения

морфологии полученных клеточных культур использовали нативные клетки

заднего эпителия роговицы. Для этого роговицу фиксировали в искусственной

передней камере, используя микротом удаляли 2/3 объема стромы роговицы,

71

полученную десцеметову мембрану переносили в чашку Петри d=35 мм клетками

заднего эпителия вверх. Далее проводили иммуноцитологическое окрашивание,

согласно протоколу, представленному в главе 2.

Нами было обнаружено, что нативная культура клеток заднего эпителия

роговицы экспрессирует маркер люмикан и Na/K АТФазу (Рис. 22 ), в единичных

клетках детектировалась экспрессия промежуточного филамента цитоскелета -

виментина (Рис. 23). В исследуемой нативной культуре клеток была выявлена не

характерная экспрессия а-гладкомышечного актина в ядре клетки (Рис. 23), тогда

как известно, что специфическим местом локализации данного маркера является

цитоплазма клетки.

Рисунок 22. Иммуноцитохимический анализ нативных клеток заднего эпителия роговицы

человека. А-Б - экспрессия маркера Na/KАТФазы (красный), экспрессия маркера люмикан

(зеленый). Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная

микроскопия, А - ув. 100х; Б - ув. 600х; ядра докрашены красителем бис-бензимид (Hoechst 33258)

72

Рисунок 23. Иммуноцитохимический анализ нативных клеток заднего эпителия роговицы

человека. А-Б - экспрессия маркера белка промежуточного филамента - виментин (красный),

экспрессия маркера a-гладкомышечного актина (зеленый). Иммуноцитохимическое

окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, А - ув. 100х; Б - ув. 600х; ядра

докрашены красителем бис-бензимид (Hoechst 33258)

Иммуноцитологическое исследование полученных клеточных культур

(среда № I) показало, что культивируемые клетки способны сохранять нативный

фенотип. Так, была показана экспрессия Na/K АТФазы (Рис. 24 А), люмикана (Рис.

24 А) и виментина (Рис. 24 Б). Кроме того, была выявлена детекция маркера

плотных межклеточных контактов ZO-1 (Рис. 24 В), подтверждающего

эпителиальную природу полученных клеток. Экспрессия а-гладкомышечного

актина так же была обнаружена в ядре клетки (Рис. 24 Б).

Иммуноцитологическое исследование клеточной культуры, полученной при

культивировании в среде № II, выявило изменение клеточного фенотипа, что

соответствовало данным световой микроскопии. Было выявлено отсутствие

экспрессии белка ZO-1 (Рис. 25 В), наблюдалась низкая экспрессия характерных

белков Na/K АТФазы и люмикана (Рис. 25 А), а экспрессия а-гладкомышечного

актина была аналогична нативным клеткам (Рис. 25 Б).

73

Рисунок 24. Иммуноцитохимический анализ клеточной культуры заднего эпителия

роговицы человека, 2 пассаж, среда №I. А - экспрессия маркера Na/KАТФазы (красный),

экспрессия маркера люмикан (зеленый); Б- экспрессия маркера белка промежуточного

филамента виментина (красный), экспрессия а-гладкомышечного актина (зеленый); В -

экспрессия характерного маркера плотных контактов ZO-1. Иммуноцитохимическое

окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ув. 600х, ядра докрашены

красителем бис-бензимид (Hoechst 33258)

74

Рисунок 25. Иммуноцитохимический анализ клеточной культуры заднего эпителия

роговицы человека, 2 пассаж, среда № II. А - низкая экспрессия маркера Na/KАТФазы (красный),

низкая экспрессия маркера люмикан (зеленый); Б- экспрессия маркера белка промежуточного

филамента виментина (красный), экспрессия а-гладкомышечного актина (зеленый); В -

отсутствие экспрессии характерного маркера плотных контактов ZO-1. Иммуноцитохимическое

окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ув. 600х, ядра докрашены

красителем бис-бензимид (Hoechst 33258)

75

Для сравнительного анализа полученных данных использовали программное

обеспечение CellProfiler. Было показано, что экспрессия а-гладкомышечного

актина была равнозначной в исследуемых группах и нативном клеточном

материале. Экспрессия промежуточного филамента виментина и люмикана в

полученных культурах была достоверно больше, чем в нативной культуре, однако,

статистически значимой разницы между клеточными культурами, полученными в

средах №I и №II выявлено не было. Исследование Na/К АТФазы показало

достоверное увеличение экспрессии данного маркера в культуре клеток,

полученных в среде № I. Статистической разницы между нативной культурой

клеток и культурой клеток, полученной в среде № II, выявлено не было (Рис. 26).

Рисунок 26. Изменение экспрессии маркеров в полученных клеточных культурах клеток

заднего эпителия роговицы в сравнении с нативными клетками.

Таким образом, наиболее оптимальной средой для культивирования клеток

заднего эпителия роговицы, является среда № I содержащая DMEM/F12 с

добавлением 10% ЭТС. Полученные результаты подтвердили экспрессия

характерных маркеров исследуемых клеток, а именно: Na/К АТФазы и люмикана,

а так же маркера эпителиальных клеток ZO-1. При этом экспрессия а-

гладкомышечного актина была аналогична его экспрессии в нативной культуре

клеток.

76

3.3 3D культивирование

Полученные клеточные культуры кератоцитов 4-го пассажа,

культивированные в отобранных на предыдущем этапе средах, переводили в

условия 3D культивирования. Известно, что добавление L-аскорбиновой кислоты

стимулирует синтез коллагена, однако, завершение процесса сборки молекулы

коллагена происходит в межклеточном матриксе, в связи с чем

3Dкультивирование, способствующее накоплению межклеточного матрикса,

является наиболее оптимальным для полноценного функционирования


Охарактеризованные клетки заднего эпителия роговицы 2-го пассажа,

культивированные в отобранной ранее среде, также переводили в условия 3D

культивирования, поскольку известно, что трехмерное культивирование

способствует сохранению эпителиального фенотипа клеток.

3.3.1 3D культивирование кератоцитов.

Для получения сфероидов из кератоцитов было использовано 4 разные по

составу среды, 2 из которых были отобранных на этапе 2D клеточного

культивирования и те же по составу среды, но с добавлением L-аскорбиновой

кислоты.

Было показано, что формирование сфероидов из 500 клеток в сфероиде (Рис.

27 А-Г) во всех анализируемых средах имело общую тенденцию. После 5-ти часов

культивирования клетки формировали рыхлые агрегаты, а к 7-м суткам были

сформированы компактные сфероиды с постепенным уменьшением их размеров

(таблица 16). Дальнейшее культивирование в течение 35 суток, каких-либо

значимых изменений не выявило. Также было показано, что в течении всего

периода культивирования полученные сфероиды сохраняли свою

жизнеспособность (Рис. 28 А, Б).

77

Рисунок 27. 3D культура кератоцитов, 500 клеток в сфероиде. A - среда культивирования

№4.4; Б - среда культивирования №4.5; В - среда культивирования №4.7, Г - среда

культивирования №4.8. Световая фазово-контрасная микроскопия, ув. 100х

Таблица 16. Изменение размеров сфероидов в процессе культивирования,

500 клеток в сфероиде

Сроки

культивирования

Культуральная среда

№4.4 №4.7 №4.4.1 №4.7.1

1 168,76±18,6 171,00±21,8 169,98±24,9 180,97±36,1

7 160,12±24,8 164,00±19,0 162,67±32,4 169,80±28,9

14 152,76±12,8 153,09±23,9 152.98±19,9 160,00±21,0

21 145,16±11,0 145,49±17,9 145,38±9,0 151,4±12,0

28 140,80±14,6 140,83±9,8 140,72±11,6 145,9±10,6

35 135,80±9,7 137,16±8,3 134,89±7,6 139,78±8,9

78

Рисунок 28. Определение жизнеспособности 3D клеточных сфероидов кератоцитов, 500

клеток в сфероиде. А - 1 сутки культивирование; Б - 35 сутки культивирования. Лазерная

сканирующая конфокальная микроскопия, живые клетки (зеленые) мертвые клетки (красные),

ув. 600х

Динамика формирования сфероидов, содержащих 1000 клеток в сфероиде,

была аналогичной (Рис. 29 А -Г, А-Б, Рис. 30, Табл. 17)

Рисунок 29. 3D культура кератоцитов, 1000 клеток в сфероиде. A - среда культивирования

№4.4; Б - среда культивирования №4.5; В - среда культивирования №4.7, Г - среда

культивирования №4.8. Световая фазово-контрасная микроскопия, ув. 100х

79



Сроки

культивировани

я


№4.4 №4.7 №4.4.1 №4.7.1

1 212,71±25,9 210,65±21,9 211,89±34,9 209,76±21,8

7 193,35±20,8 191,67±17,7 191,54±21,8 190,32±16,8

14 183,68±12,7 183,04±15,8 182,92±18,6 182,34±16,9

21 172,65±14,6 175,67±12,6 171,94±13,9 174,15±14,9

28 155,38±21,9 168,64±14,9 155,60±17,8 167,18±13,9

35 149,05±17,8 160,80±12,8 150,09±16,9 161,09±12,9

Рисунок 30. Определение жизнеспособности 3D клеточных сфероидов кератоцитов, 1000

клеток в сфероиде. А - 1 сутки культивирование; Б - 35 сутки культивирования. Лазерная

сканирующая конфокальная микроскопия, живые клетки (зеленые) мертвые клетки (красные),

ув. 600х

Имуноцитологическое исследование показало, что уже в первые сутки

культивирования в 3D клеточных сфероидах детектировались характерные

маркеры кератоцитов кератокан (красный) и кератансульфат (зеленый) (Рис. 31-

32). Сравнительную оценку экспрессии указанных маркеров проводили на

основании средней интенсивности свечения с использованием программного

обеспечения Cell Profiler. Из представленных графиков видно, что достоверной

разницы между группами и сроками культивирования в экспрессии данных

80

маркеров выявлено не было. При этом, в каждой группе отмечалось постепенное

увеличение экспрессии кератансульфата к 35 суткам наблюдения. Экспрессия

кератокана была стабильной или немного снижалась (Рис. 33).

Рисунок 31 . Иммуноцитохимический анализ 3D клеточных сфероидов кератоцитов, 500

клеток в сфероиде. Динамика изменения экспрессии кератокана (красный) и кератансульфата

(зеленый). A - среда культивирования №4.4; Б - среда культивирования №4.5; В - среда

культивирования №4.7, Г - среда культивирования №4.8. Иммуноцитохимическое окрашивание,

лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ув. 600х

81

Рисунок 32. Иммуноцитохимический анализ 3D клеточных сфероидов кератоцитов, 1000

клеток в сфероиде. Динамика изменения экспрессии кератокана (красный) и кератансульфата

(зеленый). A - среда культивирования №4.4; Б - среда культивирования №4.5; В - среда



82

Рисунок 33. Динамика изменения экспрессии кератокана и кератансульфата.

83

После первых суток культивирования было показано достоверное снижение

экспрессии люмикана - белка богатого лейцином протеогликан, основная функция

которого заключается в поддержании прозрачности роговицы путем высокой

организации и регуляции коллагеновых фибрилл во всех группах культивирования

(Рис 34-35). Мы считаем, что данный факт связан не с уменьшением синтеза

данного белка, а с уменьшением размеров клеток формирующих сфероид в

процессе его компактизации, поскольку известно, что люмикан экспрессируется в

цитоплазме клеток. Наибольшая экспрессия люмикана наблюдалась в группах

содержащих L-аскорбиновую кислоту, при этом было показано, что в группе с

посевной концентрацией 1000 клеток на сфероид уровень экспрессии достоверно

больше (р ≤ 0,005), чем в группе с посевной концентрацией 500 клеток на сфероид

(Рис. 36).

84


клеток в сфероиде. Динамика изменения экспрессии люмикана (зеленый). A - среда

культивирования №4.4; Б - среда культивирования №4.5; В - среда культивирования №4.7, Г -

среда культивирования №4.8. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая

конфокальная микроскопия, ув. 600х

85


клеток в сфероиде. Динамика изменения экспрессии люмикана (зеленый). A - среда

культивирования №4.4; Б - среда культивирования №4.5; В - среда культивирования №4.7, Г -

среда культивирования №4.8. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая


86

Рисунок 36. Динамика изменения экспрессии люмикана.

87

Характерный белок миофибробластов а-гладкомышечный актин при

культивировании 3Dсфероидов детектировался в малом количестве, и к 35-м

суткам его экспрессия достоверно (р ≤ 0,05) снижалась (Рис. 37-39)

Иммуноцитологическое исследование промежуточного филамента

мезенхимальных клеток виментина так же показало достоверное (р ≤ 0,005)

снижение к 35-м суткам культивирования (Рис. 37-39). По нашему мнению, данный

факт снижения мезенхимальных маркеров свидетельствует о переходе кератоцитов

из активного состояния, характеризующегося приобретением

фибробластоподобной морфологии и способностью к активному митозу, к

состоянию покоя и восстановлению исходного фенотипа кератоцитов.


клеток в сфероиде. Динамика изменения экспрессии виментина (красный) и а-гладкомышечного

актина (зеленый). A - среда культивирования №4.4; Б - среда культивирования №4.5; В - среда



88


клеток в сфероиде. Динамика изменения экспрессии виментина (красный) и а-гладкомышечного

актина (зеленый). A - среда культивирования №4.4; Б - среда культивирования №4.5; В - среда



89

Рисунок 39. Динамика изменения экспрессии а-гладкомышечного актина и виментиан.

90

При изучении динамики изменения экспрессии коллагена 1 и 3 типа (Рис. 40-

41), в течение всего периода культивирования было выявлено, что максимальная

экспрессия выше указаных маркеров наблюдалась в группах с добавлением L-

аскорбиновой кислоты, при этом достоверной разницы между группой сфероидов

из 1000 клеток и 500 клеток, выявлено не было (Рис. 42).


клеток в сфероиде. Динамика изменения экспрессии коллагена 3 типа (красный) и коллагена 1

типа (зеленый). A - среда культивирования №4.4; Б - среда культивирования №4.5; В - среда



91






92

Рисунок 42. Динамика изменения экспрессии коллагена 1 и 3 типов.

93

При изучении динамики изменения экспрессии коллагена 5 и 6 типов в

течение всего периода культивирования отмечалось аналогичное с коллагеном 1 и

3 типов. Так же, максимальная экспрессия коллагенов 5 и 6 типов отмечалась в

группах с добавлением L-аскорбиновой кислоты (Рис. 43-45), при этом

достоверной разницы между группами из 500 и 1000 клеток в сфероиде, выявлено

не было.






94






95

Рисунок 45. Динамика изменения экспрессии коллагена 5 и 6 типов.

96

Таким образом, наиболее оптимальной средой для культивирования

сфероидов из кератоцитов является среда, содержащая DMEM/F12, 5% ЭТС, ФРФ

и L-аскорбиновую кислоту, срок культивирования 35 суток, 1000 клеток в

сфероиде. Данные условия, на наш взгляд, способствуют максимальному

накоплению внеклеточного матрикса коллагена 1, 3, 5 и 6 типов, а так же,

увеличению основных белков малых лейцинбогатых протеогликанов

(кератоканссульфата и люмикана) и снижению экспрессии нехарактерных белков

(а-гладкомыщечного актина и виментина). Дальнейшее исследование

осуществлялось с использованием сфероидов, полученных при указанных

условиях.

3.3.2 3Dкультивирование сфероидов клеток заднего эпителия роговицы.

Из охарактеризованной клеточной культуры заднего эпителия роговицы 2-го

пассажа были созданы 3Dклеточные сфероиды, содержащие 500 клеток на

сфероид. На первые сутки сфероиды образовывали рыхлые агрегаты со слабо

выраженной округлой формой (Рис. 46), к 7-м суткам были образованы компактные

сфероиды (Рис. 46), к 14-м суткам наблюдения размер сфероида не менялся (Рис.

46 ,Табл. 18), при этом сфероиды оставались жизнеспособными на протяжении

всего срока культивирования (Рис. 47).

Рисунок 46. 3D клеточная культура клеток заднего эпителия роговицы, 500 клеток в

сфероиде. Световая фазово-констрастная микроскопия ув. 100х

97



Рисунок 47. Определение жизнеспособности 3D клеточных сфероидов клеток заднего

эпителия роговицы, 500 клеток в сфероиде. А - 1 сутки культивирование; Б - 14 сутки

культивирования. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, живые клетки (зеленые)

мертвые клетки (красные), ув. 600х

Сроки культивирования


№ I

1 217,98±16,9

7 185,28±21,7

14 182,31±17,3

98

Иммуноцитологический анализ показал, что а-гладкомышечный актин не

экспресируется клетками заднего эпителия роговицы в 3Dклеточных сфероидах

(Рис. 48 А, В, Д ).

Нами было отмечено увеличение экспрессии люмикана к 14-м суткам, в свою

очередь, противоположная тенденция была обнаружена в экспрессии Na/K

АТФазы (Рис. 48 Б, Г, Е). При этом, следует отметить, что при

иммуноцитологическом исследовании данных маркеров в нативной культуре

клеток заднего эпителия роговицы, было отмечено увеличение экспрессии Na/K

АТФазы в зоне дефекта слоя клеток. Таким образом, на наш взгляд, повышение

экспрессии Na/K АТФазы наблюдается при повреждении клеток заднего эпителия

роговицы. Следовательно, уменьшение Na/K АТФазы в 3D культуре клеток заднего

эпителия роговицы свидетельствует о стабилизации полученной клеточной

культуры.

Анализируя полученные результаты 3D культивирования можно сделать

вывод, что 3D клеточные сфероиды являются наиболее оптимальной структурой в

сравнении с 2D культурой и могут быть использованы в регенеративной медицине

или при конструировании эквивалентов роговицы.

99

Рисунок 48. Иммуноцитохимический анализ 3D клеточной культуры клеток заднего

эпителия роговицы. А,В,Д - отсутствие экспрессии а-гладкомышечного актина; Б,Г,Е - динамика

изменения экспрессии характерных маркеров Na/K АТФаза (красный), люмикан (зеленый); А-Б

- 1 сутки культивирования; В-Г - 7 сутки культивирования; Д-Е - 14 сутки культивирования.

Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ув.

600х, ядра докрашены красителем бис-бензимид (Hoechst 33258)

100

3.4 2Dкультивирование кератоцитов на полимерных материалах

Для проведения оценки пролиферативной активности кератоцитов на

полимерных материалах проводили подсчет количества клеток в течение 6-ти

суток. Общий вид используемых в иссследовании материалов представлен на

рисунке 49. Количество полученных кератоцитов в группах исследования на

различные сроки культивирования указаны в таблице 19.

Рисунок 49. Общий вид используемого материала. А - фиброин шелка материал № 1;

Б - Гидроксиэтилметакрилат (ГЭМА) материал № 2; В - Олигоуретанметакрилат (ОУМА)

материал № 3; Г - Полиметилметакрилат (ПММА) материал №4

101

Таблица 19. Количество кератоцитов в экспериментальных группах

Группа №1 №2 №3 №4 №5

Сутки

наблюдения

1 11,24±0,7 10,42±1,31 12,44±0,96 15,67±0,49 15,08±0,9

2 33,49±1,01 22,19±1,97 25,67±1,07 30,25±0,45 35,44±1,71

3 119,2±1,9 38,56±1,75 44,50±1,24 120,17±2,17 96,50±3,92

4 170,69±0,8 71,00±1,76 76,19±1,52 179,00±0,93 160,33±2,77

5 243,23±5,6 93,81±2,93 101,0±11,74 242,33±4,56 231,44±6,61

6 263,49±8,1 128,0±3,13 182,75±6,58 261,75±9,44 253,42±6,14

Полученные результаты 2D клеточного культивирования кератоцитов на

ПММА и фиброине шелка показали схожие результаты адгезии клеток, что

свидетельствует о нетоксичности исследуемых материалов, а также были более

высокими по сравнению с результатами, полученными на материалах ОУМА и

ГЭМА. Из чего нами было сделано предположение, что материалы ОУМА и ГЭМА

могут быть потенциально пригодны для использования в создании оптической

части, однако непригодны для создания каркасной структуры роговицы.

Материалы, показавшие наилучшие результаты адгезии, ПММА и фиброин шелка,

могут быть использованы как для создания каркасной, так и оптической

характеристики стромы, однако только фиброин шелка из-за своих физико-

химических свойст позволяет создать слоистую структуру, отвечающую всем

требованиям предъявляемым к исскуственной роговицей.

Таким образом, фиброин шелка был выбран для дальнейшей работы, как

материал показавший наилучшие адгезивные свойства, и использован для создания

слоистой структуры стромы роговицы.

102

3.5 Культивирование кератоцитов на фиброине шелка.

Для создания слоистой структуры стромальной части роговицы

использовали пленки фиброина шелка. Общий вид пленок и схема

подготовительного этапа представлен на рисунке 50.

Исследование пленок проводили в 2 этапа: на 1-м этапе проверяли

токсичность материала и характер распространения 2D и 3D клеточных культур,

пассируемых на материале. После 7-ми суток культивирования проводили анализ

жизнеспособности клеточных культур, однако стандартный метод определения,

при использовании флуоресцентного красителя, не дал ожидаемых результатов,

это связано с тем, что пленки фиброина шелка хорошо впитывали краситель и

детекция на конфокальном микроскопе была невозможна из-за сильного фонового

окрашивания. В связи с этим, нами был использован метод «ДНК комет», который

позволяет детектировать повреждение ДНК, которое может привезти к запуску

апоптоза или некроза (Рис. 51).

103

Рисунок 50. Схема проведения культивирования кератоцитов на фиброине шелка. А-

общий вид фиброина шелка; Б- прозрачность фиброина шелка; В - Е - поэтапная сборка

конструкции для культивирования фиброина шелка с клетками; Ж-З - общий вид фиброина

шелка с 3Dклеточными сфероидами кератоцитов

104

При анализе полученных данных «ДНК-комет» было показано, что материал

не является токсичным. Для сравнения использовали культуру клеток,

культивируемую на пластике, а положительным контролем - клетки после 10 минут

экспозиции под ультрафиолетом. Достоверное различие было в опытных группах

с положительным контролем, это позволяет сделать вывод о том, что материал не

является токсичным (Рис. 52).

При анализе характера клеточного роста с помощью световой микроскопии,

было показано, что использование 3D клеточных сфероидов сопровождается более

равномерным распространением клеток по материалу, в отличие от 2D культуры.

Рисунок 51. Пять условных типов «ДНК-комет» полученных при оценке

жизнеспособности клеточной культуры культивируемых на материале. Лазерная сканирующая


Рисунок 52. Сравнение индекса «ДНК-комет» 2D и 3D клеточных культур

культивируемых на пленках фиброина шелка.

105

На 2-м этапе работы использовали 3 пленки с клеточными сфероидами и 4-я

пустая для создания слоистой структуры (Рис. 53), срок культивирования составил

7 суток (Рис. 54). Была показана возможность создания слоистой структуры

используя пленки из фиброина шелка и 3Dклеточных сфероидов, при этом,

отмечалось прикрепление и распределение клеток между пленками, оценку

жизнеспособности клеток проводили, используя метод ДНК-комет на каждом

уровне в отдельности. Анализируя полученные результаты, было показано, что

жизнеспособность клеток в различных слоях достоверно меняется, однако был

отмечен более высокий уровень индекса ДНК-комет на среднем уровне (Рис. 55).

Возможно данный факт связан с тем, что для конструирования стромальной части

роговицы необходимо использовать перфорированные пленки фиброина шелка для

лучшей диффузии питательных веществ.

Рисунок 53. Схематическое изображение слоистой структуры на основе пленок фиброина

шелкаи 3D клеточных сфероидов

Рисунок 54. Общий вид полученной слоистой структуры. Световая микроскопия А-ув.

10х; Б - ув. 40х

106

Рисунок 55. Сравнения индекса «ДНК-комет» в полученной слоистой структуре.

107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вопрос создания искусственной роговицы остается крайне актуальным до

настоящего времени. В доступной литературе представлено большое количество

разнообразных подходов для решения данной проблемы. Одним из наиболее

перспективных направлений является создание слоистой структуры роговицы с

использованием клеточных культур, полученных из каждого слоя роговицы в

комбинации с матриксом. Однако данный подход имеет ряд проблем, включающих

в себя отсутствие стандартизации методов выделения и культивирования

клеточных культур, оптимального материала или комбинации материалов,

пригодных для создания оптических, механических и биологических свойств

искусственной роговицы, а так же метода конструирования искусственной

роговицы на основе матриксов в совокупности с клеточными культурами.

В связи с этим была сформулирована цель нашего исследования - разработка

методологических подходов к конструированию искусственной роговицы на

основе культивированных клеток трупной донорской роговицы в виде

3Dклеточных сфероидов и полимерных материалов.

Для достижения поставленной цели, работа была разделена на 5 этапов,

которые включали в себя разработку протокола выделения и культивирования

клеточных культур кератоцитов и заднего эпителия роговицы, подбор питательной

среды, изучение сфероидообразования из полученных клеточных культур

кератоцитов и заднего эпителия роговицы, подбор полимерного материала

пригодного для конструирования искусственной роговицы, а так же, создание

слоистой структуры на основе отобранного полимерного материала.

На первом этапе осуществляли подбор оптимальных условий для выделения

и культивирования кератоцитов. Для этого был разработан оригинальный протокол

и проведен сравнительный анализ с методикой, предложенной FunderburghM.L. с

соавт. (Funderburgh M.L., Du Y., Mann M.M., et al. 2005), которая является широко

используемой для выделения кератоцитов.

Суть методики, предложенной FunderburghM.L. заключается в том, что после

механического удаления клеток переднего и заднего эпителия роговицы,

108

производят выкраивание центральной зоны с последующей механической и 2-х

этапной ферментативной дезагрегацией фрагмента роговицы, полученную

суспензию клеток переносят в полную питательную среду (Funderburgh, J.L.,

Funderburgh, M. L., Mann, M. M., et al., 2009). Однако данный протокол имеет ряд

недостатков, таких как малая жизнеспособность получаемых клеток и запуск

дифференцировки кератоцитов в фибробласты (Funderburgh JL, Funderburgh ML,

Du Y. 2016).

Разработанный протокол оригинального метода выделения включает схожие

этапы с протоколом FunderburghM.L., такие как механическое удаление клеток

переднего и заднего эпителия роговицы и выкраивание центральной зоны. Однако

имеет и существенные отличия, такие как более щадящую механическую и

ферментативную дезагрегацию, что не вызывает выраженного клеточного ответа

на повреждение и способствует тем самым сохранению жизнеспособности клеток.

Проведенное исследование показало, что оригинальный метод выделения

способствует увеличению количество получаемых клеток и их жизнеспособности,

а так же, уменьшает время получения первичной культуры клеток, сократив этапы

ферментативной дезагрегации.

При подборе оптимального состава среды для 2D клеточного

культивирования кератоцитов, полученных оригинальным методом выделения,

оценивали морфологические особенности полученных клеточных культур, а так

же, проводили подсчет количества клеток в контрольный сроки наблюдения. При

сопоставлении совокупности полученных данных делали вывод о наиболее

оптимальных составах сред для 2Dкультивирования кератоцитов.

При выборе оптимального состава полной питательной среды сначала

проводили оценку влияния базовых сред, а затем с добавлением необходимых

питательных компонентов.

В группе, содержащей базовую среду DMEM/F12, отмечалось получение

достоверно большего количества клеток (р ≤ 0,05) в сравнении с группами

содержащими базовые среды: аMEM, MEM и DMEM с низким содержанием

глюкозы. Дальнейший подбор оптимального состава полной питательной среды

109

проводили на базовой среде DMEM/F12 с добавлением ЭТС, ФРФ, раствора

антибиотиков и L-глутамина.

Известно, что для поддержания пролиферативной активности клеток

необходимо добавление ЭТС. Нами было выявлено, что оптимальная концентрация

ЭТС, необходимая для поддержания пролиферативной активности кератоцитов,

составляет 5%, так как при 2% концентрации ЭТС пролиферация клеток была

недостаточной для многократного пассирования, а при увеличении концентрации

ЭТС до 10%, при достоверно большем количестве получаемых кератоцитов,

отмечалось изменение их морфологии, а именно, вытягивание и приобретение

веретенообразной формы.

Добавление ФРФ в полную питательную среду достоверных различий, в

сравнении с группами, не содержащими ФРФ, не выявило.

Фенотипирование полученных 2D клеточных культур кератоцитов,

культивируемых на питательной среде, содержащей DMEM/F12 и 5% ЭТС,

выявило экспрессию характерных маркеров кератоцитов: кератокана,

кератансульфата и люмикана, а также отсутствие маркера миофибробластов

а-гладкомышечного актина, что согласуется с данными зарубежных авторов (Guo

X., Sriram S., Tran J.A., et al. 2018). При культивировании в среде, содержащей

DMEM/F12 и 10% ЭТС, было выявлено отсутствие экспрессии кератокана и

кератансульфата, слабая экспрессия люмикана, а так же, наличие экспрессии а-

гладкомышечного актина, что возможно обусловленно повышенным содержанием

ЭТС в культуральной среде, поскольку известно, что ЭТС способствует

фибробластной трансформации клеток (Фрешни Р.Я. 2010). Полученные нами

результаты не соответствуют данным зарубежных авторов, которые отмечают

сохранение фенотипа полученной культуры клеток в данной среде (Chen J., Zhang

W., Backman L.J., et al. 2018; Isaacson A., Swioklo S., Connon C.J. 2018), что требует

проведения дальнейших исследований.

На втором этапе работы проводили выделение и подбор питательной среды

для клеток заднего эпителия роговицы.

110

Выделение и культивирование клеток заднего эпителия роговицы человека

является сложной задачей, так как до сих пор нет оптимального состава

питательной среды для их последующего культивирования.

Одним из самых распространенных методов выделения первичной

клеточной культуры клеток заднего эпителия роговицы является

эксплантационный метод (Joyce N.C. 2005), при этом ряд авторов предлагает

альтернативные методы выделения клеток, к которым можно отнести

ферментативную дезагрегацию клеточного слоя, основным недостатком которого

является разрыв межклеточных контактов эпителиальных клеток и запуск

эпителио-мезанхимального перехода (Peh G.S., Chng Z., Ang H.P., et al. 2015).

Первичная культура клеток заднего эпителия роговицы была получена

эксплантационным методом. Для подбора оптимальной полной питательной среды

изучали влияние базовых сред DMEM/F12 и М199 с добавлением 10% ЭТС, а так

же их комбинацию. Нами была отмечена общая закономерность присущая

клеточным культурам полученным на базовых средах DMEM/F12, М199 с

добавлением 10% ЭТС: после выделения десцеметовой мембраны с клетками

заднего эпителия роговицы наблюдалось постепенное увеличение количества

клеток на мембране и после достижения высокой плотности, миграция их на

культуральный пластик. Однако, в ходе культивирования было выявлено, что в

группе, содержащей среду М199, клетки постепенно меняли свою морфологию,

теряли гексогональную форму и становились более вытянутыми, при этом была

отмечена высокая пролиферативная активность не характерная для клеток заднего

эпителия роговицы.

В группе, содержащей комбинацию сред DMEM/F12 и M199 с добавлением

10% ЭТС, отмечалось постепенное снижение количества клеток.

Важно отметить, что некоторые зарубежные автора предлагают, для более

успешного культивирования клеток заднего эпителия роговицы использовать

покрытие культурального пластика ламинином или фибронектином, однако,

использование данных компонентов невозможно, так как они не разрешены для

использовании в офтальмологии (Zhu Y.T., Tighe S., Chen S.L. 2015).

111

Фенотип полученных клеточных культур сравнивали с фенотипом нативной

клеточной культуры клеток заднего эпителия роговицы. Данное обстоятельство

обусловленно тем фактом, что в доступной литературе нет характерных маркеров

для данных клеток, и изучение полученных культур проводят только по ряду

маркеров, таких как Na/K АТФаза и ZO-1. Стоит отметить, что данные маркеры так

же могут экспрессироваться и в других эпителиальных клетках.

Нами было показано, что нативные клетки заднего эпителия роговицы

экспрессируют Na/K АТФазу, люмикан, в единичных клетках встречается

экспрессия виментина, также была отмечена нехарактерная локализация

экспрессии a-гладкомышечного актина, которая детектировалась исключительно в

ядрах клеток. Следует отметить, что экспрессия Na/K АТФазы возрастала в зоне с

уменьшением плотности клеток, а экспрессия люмикана - снижалась.

При анализе групп, полученных 2D клеточных культур клеток заднего

эпителия, было показано, что экспрессия а-гладкомышечного актина

статистически не отличается в сравнении с нативными клетками, при этом

увеличение экспрессии виментина и люмикана было статистически достоверно

(р < 0,001). Ключевым отличием между группами было отсутствие экспрессии

ZO-1 в клеточной культуре, культивируемой на питательной среде М199, что

свидетельствует о запуске эпителиально-мезенхимальной пластичности.

Возможно данная трансформация клеток и вызвала тот факт, что в данной культуре

нами детектировалось уменьшение экспрессии Na/K АТФазы, отвечающей за

активную насосную функцию в клетках заднего эпителия роговицы.

Таким образом, нами было показано, что получение функциональной

клеточной культуры клеток заднего эпителия роговицы возможно на

культуральной среде, содержащей DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС.

Третий этап работы был посвящен созданию 3D клеточных сфероидов из

кератоцитов и клеток заднего эпителия роговицы, полученных по разработанному

протоколу.

Для решения данной задачи изучали влияние разных по составу сред на

процесс формирования сфероида.

112

Было сформировано 4 группы сфероидов из кератоцитов, культивируемых

различных средах, в две из которых была добавлена L-аскорбиновая кислота,

которая, как известно, стимулирует синтез внеклеточного матрикса. Для

определения оптимального количества клеток в сфероиде, в каждой группе

исследования было сформировано по 2 подгруппы: по 500 и 1000 клеток на

сфероид.

Было выявлено, что уже спустя 5 часов культивирования кератоциты

формируют рыхлый агрегат, с постепенным статистически значимым

уменьшением их размеров при дальнейшем культивировании в течении 35 суток.

Срок культивирования сфероидов был выбран согласно данным полученным

Ghezzi C.E. с соавт. (Ghezzi C.E., Marelli B., Omenetto F.G., et al., 2017), которые

показали, что стромальные клетки роговицы способны к максимальному

образованию фибриллярного внеклеточного матрикса на пятой неделе

культивирования при добавлении L-аскорбиновой кислоты (Ghezzi C.E., Marelli B.,

Omenetto F.G., et al. 2017).

Анализируя полученные данные, нами было показано, что экспрессия

кератокана была стабильной в течение всего срока наблюдения, а экспрессия

кератансульфата постепенно увеличивалась. Выявленные результаты на 4-х

различных средах позволили определить, что наличие ФРФ не влияет на синтез и

накопление маркеров кератоцитов, что не соответствует результатам Chen J. (Chen

J., Wong-Chong J., Sundar Raj N. 2011), показавшем стимуляцию кератоцитов ФРФ

для накопления протеогликанов, включающих в себя кератокан и кератансульфат.

При компактизации сфероидов наблюдалось постепенное снижение

экспрессии люмикана в цитоплазме клеток, который отвечает за регуляцию

коллагеновых фибрилл в строме роговицы (Karamanou K., Perrot G., Maquart F.X.,

et al. 2018). Указанный факт уменьшения экспрессии люмикана, по-видимому,

связан с уменьшением объема цитоплазмы при компактизации сфероида. Стоит

отметить, что уровень экспрессии люмикана был статистически выше (р < 0,001) в

группах с добавлением L-аскорбиновой кислоты, а максимальная интенсивность

экспрессии детектировали в сфероидах, содержащих 1000 клеток.

113

Крайне важным является тот факт, что экспрессия а-гладкомышечного

актина и виментина постепенно уменьшалась к 35 суткам культивирования, что

свидетельствует о стабильности фенотипа кератоцитов.

При изучении формирования внеклеточного матрикса, было показано, что в

группах с добавлением L-аскорбиновой кислоты, наблюдается постепенное

увеличение экспрессии коллагена 1, 3, 5 и 6 типа, в отличии от групп не

содержащих L-аскорбиновую кислоту, где детектировалось постепенное снижения

экспрессии вышеуказанных маркеров.

Суммируя полученные данные можно сделать вывод, что для поддержания

синтеза люмикана и синтеза внеклеточного матрикса (коллагенов 1, 3, 5 и 6 типов)

необходимо добавление L-аскорбиновой кислоты в полную культуральную среду,

при этом наилучшие результаты были получены в группах, содержащих 1000

клеток в сфероиде.

Впервые нами была показана возможность получения жизнеспособных 3D

клеточных сфероидов из культуры клеток заднего эпителия роговицы. Было

отмечено, что 3D клеточные сфероиды образуются уже на первые сутки

культивирования, к 7 суткам - наблюдалась компактизация сфероидов, в

дальнейшем, к 14-м суткам, изменение размеров сфероидов было статистически

незначимым.

При анализе фенотипа полученных 3D клеточных сфероидов, было отмечено

отсутствие экспрессии а-гладкомышечного актина на всех сроках наблюдения, при

этом экспрессия характерных маркеров - Na/K АТФазы и люмикана была

взаимосвязана, выявлено уменьшение экспрессии Na/K АТФазы к 14 суткам

культивирования и увеличение экспрессии люмикана к тем же суткам наблюдения.

Данную тенденцию мы связываем со схожим механизмом клеточного ответа при

повреждении слоя нативных клеток заднего эпителия роговицы. Таким образом,

можно сделать вывод, что 3D клеточная структура в виде сфероида, позволяет

сохранить фенотип клеток и является более удобной для дальнейших манипуляций

при создании искусственной роговицы.

114

На четвертом этапе проводили изучение биосовместимости полимерных

материалов. Для этого были использованы различные полимерные и

биосинтетические материалы в виде «шайб» (Фиброин шелка, ГЭМА, ОУМА,

ПММА), которые помещались на дно культурального планшета. При 2Dклеточном

культивировании кератоцитов на отобранных материалах подсчитывали

количество клеток в контрольные сроки. На основании полученных данных делали

вывод о биосовместимости и адгезивных свойствах материала.

В каждой группе отмечалось планомерное увеличение количества клеток, что

свидетельствовало о нетоксичности изучаемых материалов. Исследование

пролиферативной активности было статистически достоверно ниже (р < 0,001) на

материалах ГЭМА и ОУМА, чем на фиброине шелка и ПММА. Полученные

результаты подтвердили потенциальную пригодность применения фиброина

шелка для создания слоистой структуры искусственной роговицы, однако, пока не

известна его способность формировать оптически прозрачные слои, при этом

возможно использовать в комбинации с оптически прозрачными материалами

ГЭМА и ОУМА - для создания оптической части искусственной роговицы, в

следствии их биосовместимости и прозрачности, а также низкой адгезии к клеткам,

что согласуется с данными литературы (Reichl F.X., Seiss M., Kleinsasser N. et al.

2008).

На пятом этапе создавали слоистую структуру, используя пленки из

фиброина шелка:

1-й блок исследования включал в себя изучение адгезии и распространения

2D и 3D клеточной культуры на поверхности пленки. Были использованы пленки

диаметром 16 мм, зафиксированные в специальных клипсах, в центр данной

конструкции добавлялась культура клеток. Спустя 7 суток культивирования,

жизнеспособность клеточной культуры оценивали методом «ДНК-комет». Было

выявлено отсутствие статистически значимых отличий в сравнении с клетками,

культивируемыми на пластике (контрольная группа). Так же было получено более

равномерное заполнение поверхности материала при использовании 3D клеточных

сфероидов.

115

2 блок включал в себя создание слоистой структуры на основе пленок

фиброина шелка и 3Dклеточных сфероидов. Для этого пленки со сфероидами

культивировали в течение 7 суток, затем извлекали из клипс, выкраивали фрагмент

d = 8 мм и наслаивали друг на друга. Полученную структуру через 7 суток

культивирования разбирали на слои и проводили оценку степени повреждения

клеток между слоями. Было выявлено, отсутствие статистически значимой

разницы между клетками, находящимися на верхнем и нижнем уровне, и клетками,

культивируемыми на пластике (контрольная группа), при этом отмечали

статистически значимое (р ≤ 0,05) более выраженное повреждение ДНК в клетках

культивируемых во внутреннем слое. Данный факт указывает на низкую диффузию

питательных веществ, что требует доработки специальных свойств материала, а

именно его проницаемости. Таким образом, впервые была показана возможность

создания слоистой структуры искусственной роговицы на основе пленок из

фиброина шелка и 3Dклеточных сфероидов кератоцитов.

116

ВЫВОДЫ

1. Разработанный протокол выделения кератоцитов позволяет увеличить

получаемое количество жизнеспособных клеток на 23%, в сравнении с широко

используемым протоколом (р ≤ 0,05). Оптимальным способом выделения

клеток заднего эпителия роговицы является эксплантационный метод

культивирования.

2. Установлено, для 2D культивирования кератоцитов среда на основе DMEM/F12

с добавлением 5% ЭТС и среда DMEM/F12 с добавлением 5% ЭТС и 10 нг/мл

ФРФ позволяют сохранить фенотип и поддержать пролиферативную активность

клеток, достоверной разницы между средами выявлено не было. Среда

DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТC является оптимальной для поддержания

клеток заднего эпителия роговицы в виде 2D клеточной культуры, а также,

способствует сохранению их гексагональной морфологии и экспрессии

характерных маркеров (Na/K АТФазы, люмикана, ZO-1).

3. Для сохранения фенотипа и функциональной активности кератоцитов при 3D

культивировании в течение 35 суток предпочтительной является среда

DMEM/F12 c добавлением 5% ЭТС, ФРФ и L-аскорбиновой кислоты, которая

способствует достоверно значимому (р ≤ 0,001) увеличению экспрессии белков

внеклеточного матрикса, а именно, коллагена 1, 3, 5 и 6 типов, кератансульфата

и выраженному снижению экспрессии а-гладкомышечного актина - маркера

миофибробластов. Экспрессия люмикана была достоверно выше (р ≤ 0,001) в

группе сфероидов с концентрацией 1000 клеток в сфероиде. Полная питательная

среда DMEM/F12 с добавлением 10% ЭТС при концентрации 500 клеток на

сфероид является оптимальной для сохранения фенотипа и функциональной

активности 3D клеточных сфероидов из клеток заднего эпителия роговицы.

4. При культивировании 2D и 3D клеточной культуры кератоцитов на пленках

фиброина шелка в течение 7 суток достоверной разницы в жизнеспособности

клеток не выявлено, 0.552 и 0.549 соответственно по индексу «ДНК-комет»; при

этом отмечалось более равномерное распространение клеточного слоя при

использовании в виде 3D сфероидов.

117

5. Для конструирования искусственной роговицы оптимальным полимерным

материалом является фиброин шелка, характеризующийся наилучшей

биосовместимостью как с 2D, так и 3D культурой кератоцитов, обусловленной

высокой адгезией и пролиферативной активностью клеток, а также

возможностью создания слоистой структуры, в сравнении с ГЭМА и ОУМА,

обладающими низкой адгезией для клеток роговицы.

118

Основные обозначения и сокращения

2D – анг. two-dimensional; двумерныи

3D – анг. three-dimensional; трехмерныи

ДМСО – анг. dimethyl sulfoxide; диметилсульфоксид

ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка

ФРФ – анг. fibroblast growth factor; фактор роста фибробластов

TGF – анг. transforming growth factor; трансформирующий фактор роста

TNF – анг. tumor necrosis factor; фактор некроза опухоли

IL – анг. interleukin; интерлеикин

αSMA – анг. α-smooth muscle actin; α-гладкомышечныи актин

ZO-1 – анг. zonula occludens-1; зона окклюденс-1

7AAD – анг. 7-Aminoactinomycin D; 7 – аминоактиномицин – Д

TUNEL – анг. Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling;

Терминальная дезоксинуклеотидтрансфераза

LASIK – анг. laser-assisted in situ keratomileusis; лазерный in situ кератомилез

ПММА – полиметилметакрилат

ПТФЭ - политетрафторэтилен

ГЭМА – гидроксиэтилметакрилат

ММР – матриксная металлопротеиназа

MEM – анг. Minimum Essential Medium; основная минимальная питательная среда

DMEM – анг. Dulbecco’s Modified Eagle Medium; питательная среда Игла в

модификации Дульбекко

DMEM/F12 – анг. Dulbecco’s Modified Eagle Medium / Ham’s F12; смесь

питательных сред – среды Игла в модификации Дульбекко и среды Хэма F12 в

соотношении 1:1

119

Библиография

1. Агапов И.И., Пустовалова О.Л., Мойсенович М.М., Богуш В.Г., Соколова

О.С., Севастьянова В.И., Дебабов В.Г., Кирпичников М.П. Трехмерный

матрикс из рекомбинантного белка паутины для тканевой инженерии

// Доклады Академии наук, издательство Наука (М.) - том 426. - № 1. - с. 115-

118.

2. Астахов Ю.С., Хапчаев Р.Т. Биоинегрируемый опорный элемент

кератопротеза из отечественного политетрафторэтилена // Офтальмология –

2005. - № 2. - С.38-42.

3. Борзенок С.А., Комах Ю.А., Мороз З.И. Роль Глазного тканевого банка в

трансплантации роговицы // Вестник Российской АМН. – 2007. - №8. - С. 20-

25.

4. Борзенок С.А. Медико-технологические и методологические основы

эффективной деятельности глазных тканевых банков России в обеспечении

операций по сквозной трансплантации роговицы // Дис. д-ра мед. наук. –

2008. - М.:306 с.

5. Борзенок C.А., Сабурина И.Н., Репин В.С., Кошелева Н.В., Горкун А.А.,

Комах Ю.А., Желтоножко А.А. Методологические и технологические

проблемы конструирования искусственной роговицы на базе 3D-клеточного

культивирования // Офтальмохирургия – 2012 - № 4 - С.12-17.

6. Вит В.В. Строение зрительной системы человека - учебное пособие //

Астропринт – 2003. - М.: 368 с.

7. Гундорова Р.А., Малаева Л.В., Удинцов Б.Е. Кератопротезирование //

Методическое письмо. – М., 1977

8. Калинников Ю.Ю. Оптическое биокератопротезирование ожоговых бельм //

Дис. канд. мед. наук. - 2005 - М.: 303 с.

9. Карлсон Б. Основы эмбриологии по Пэттену // Мир - 1983. - Т. 2 - М.: 390 с.

10. Краснов М.М., Орлова Е.М. Первый опыт имплантации и искусственной

роговицы (аллопластическое кератопротезирование) // Вестник

офтальмологии. – 1967 - №6. – С. 11-16

https://istina.msu.ru/journals/94839/

120

11. Либман Е.С., Калеева Э.В., Рязанов Д.П. Комплексная характеристика

инвалидности вследствие офтальмопатологии в Российской Федерации //

Российская офтальмология - 2012. – № 5 – С. 24-26.

12. Мороз З.И. Медико-технологическая система оптического

кератопротезирования // Дис. д-ра мед. наук. - 1987 - М.: 312 с.

13. Мороз З.И., Власова В.А., Ковшун Е.В. История кератопротезирования в

МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова //

Офтальмохирургия. — 2013. — № 4. — С. 50-55.

14. Федоров С.Н. Кератопротезирование как метод лечения иноперабельных и

эндотелиальной дистрофии // Республиканская научная конференция по

применению полимеров в хирургии, 2-я.-Киев. – 1969. – C.34-35

15. Федоров С.Н., Мороз З.И., Зуев В.К. Кератопротезирование // Медицина. -

1982. - М.:144с.

16. Филатов В.П. Руководство глазной хирургии // Мир - 1936. - Т. 2 – М.: С. 574-

597.

17. Фрешни Р.Я. Культура животной клетки: практическое руководство // Бином.

Лаборатория знаний – 2010 – 253с.

18. Якименко С.А. Методы оптического кератопротезирования, показания

возможности и результаты применения // Офтальм, журн. – 1985. - №3. – С.

134-137

19. Altman G.H., Diaz F., Jakuba C., Calabro T., Horan R.L., Chen J., Lu H.,

Richmond J., Kaplan D.L. Silk-based biomaterials // Biomaterials. - 2003 –

Vol.24(3) – P.401-416.

20. Amano S. Transplantation of cultured human corneal endothelial cells // Cornea –

2003 – Vol.22 – P.66–74.

21. Amano S., Mimura T., Yamagami S., Osakabe Y., Miyata K. Properties of corneas

reconstructed with cultured human corneal endothelial cells and human corneal

stroma // Jpn. J. Ophthalmol. – 2005 – Vol.49 – P.448–452.

22. Anseth A. Glycosaminoglycans in corneal regeneration // Exp Eye Res. – 1961 –

№ 1 - р.122-127.

121

23. Axelsson I., Heinegard D. Characterization of the keratan sulphate proteoglycans

from bovine corneal stroma // Biochem J. - 1978 – Vol. 1 - № 3 – P. 517-530.

24. Balda M. S., Matter K. Tight junctions at a glance // Journal of cell science. - 2008

- Vol. 121(22). - P. 3677-82. DOI:10.1242/jcs.023887.

25. Ballestri M., Caruso E., Guerrini A., Ferroni C., Banfi S., Gariboldi M., Monti E.,

Sotgiu G., Varchi G. Core-shell poly-methyl methacrylate nanoparticles

covalently functionalized with a non-symmetric porphyrin for anticancer

photodynamic therapy // J Photochem Photobiol B. – 2018 – Vol.25(186) – P. 169-

177. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2018.07.013.

26. Barraquer J. Surgical treatment of corneal disease // Amer. J. Ophthalmol. – 1965.

– Vol. 56(2) – P. 213-222

27. Baum J.L., Niedra R., Davis C., Yue B.Y.J.T. Mass culture of human corneal

endothelial cells // Arch. Ophthalmol. – 1979 – Vol.97 – P.1136–1140.

28. Bednarz J., Rodokanaki-von Schrenck A., Engelmann K. Different characteristics

of endothelial cells from central and peripheral human cornea in primary culture

and after subculture // Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. – 1998 – Vol.34 – P.149–153.

29. Benedek G.B. Theory of transparency of the eye // Appl Opt – 1971 – Vol.10 –

P.459-73.

30. Bi Y.L., Zhou Q., Du F., Wu M.F., Xu G.T., Sui G.Q. Regulation of functional

corneal endothelial cells isolated from sphere colonies by rho-associated protein

kinase inhibitor // Exp. Ther. Med. – 2013 - Vol.5 – P.433–437.

31. Binder H.F., Binder R.F. Experiments on plexiglass corneal implants // Am J

Ophthalmol. – 1956 – Vol.41(5). - P.793-797.

32. Blake D.A., Yu H., Young D.L., Caldwell D.R. Matrix stimulates the proliferation

of human corneal endothelial cells in culture // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. –

1997 – Vol.38 – P.1119–1129.

33. Bogush V.G., Sokolova O.S., Davydova L.I., Klinov D.V., Sidoruk K.V., Esipova

N.G., Neretina T.V., Orchanskyi I.A., Makeev V.Y., Tumanyan V.G., Shaitan

K.V., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P. A novel model system for design of

biomaterials based on recombinant analogs of spider silk proteins. // J

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%98%D0%B4%D0%B5%D0%BD%D1%82%D0%B8%D1%84%D0%B8%D0%BA%D0%B0%D1%82%D0%BE%D1%80_%D1%86%D0%B8%D1%84%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%BE%D0%B3%D0%BE_%D0%BE%D0%B1%D1%8A%D0%B5%D0%BA%D1%82%D0%B0

https://dx.doi.org/10.1242%2Fjcs.023887

122

Neuroimmune Pharmacol – 2009 – Vol.4(1) – P.17-27. doi: 10.1007/s11481-008-

9129-z.

34. Bourne W.M., Nelson L.R., Hodge D.O. Central corneal endothelial cell changes

over a ten-year period // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 1997 – Vol.38 – P.779–

782.

35. Bray L.J., George K.A., Ainscough S.L., Hutmacher D.W., Chirila T.V., Harkin

D.G., Human corneal epithelial equivalents constructed on Bombyx mori silk

fibroin membranes // Biomaterials - 2011 – Vol.32 – P.5086-9.

https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2011.03.068.

36. Bray L.J., George K.A., Hutmacher D.W., Chirila T.V., Harkin D.G. A dual-layer

silk fibroin scaffold for reconstructing the human corneal limbus // Biomaterials –

2012 – Vol.33 – P. 3529 – 31. https://doi.org/10.1016/j. biomaterials.2012.01.045.

37. Byun Y.S., Tibrewal S., Kim E., Yco L., Sarkar J., Ivanir Y., Liu C.Y., Sano

C.M., Jain S. Keratocytes derived from spheroid culture of corneal stromal cells

resemble tissue resident keratocytes // PLoS One. - 2014 – Vol.9(11) – P. 112781.

doi: 10.1371/journal.pone.0112781.

38. Calderón-Colón X., Xia Z., Breidenich J.L., Mulreany D.G., Guo Q., Uy

O.M., Tiffany J.E., Freund D.E., Mc Cally R.L., Schein O.D., Elisseeff

J.H., Trexler M.M. Structure and properties of collagen vitrigel membranes for

ocular repair and regeneration applications // Biomaterials. - 2012 – Vol.33(33) –

P.8286-95. doi: 10.1016/j.biomaterials.2012.07.062.

39. Cardona H. Keratoprosthesis: Acrilic optical cylinder with supporting intralamellar

plate // Amer. J. Ophthalmol. – 1962 -Vol.54(2). - P.284-294.

40. Cardona H. Plastic keratoprosthesis. A description of the plastic material and

comparative histologic study of recipient corneas // Amer. J. Ophthalmol. – 1964 -

Vol. 58(2) - P.247-252.

41. Cardona H. Nut and bolt mushroom transcorneal kerato-prosthesis // Amer. J.

Ophthal. – 1969. – Vol. 68(4) – P. 604-612

42. Castro-Muñozledo F., Meza-Aguilar D.G., Domínguez-Castillo R., Hernández-

Zequinely V., Sánchez-Guzmán E. Vimentin as a Marker of Early Differentiating,

123

Highly Motile Corneal Epithelial Cells // J Cell Physiol. - 2017 – Vol.232(4) –

P.818-830. doi: 10.1002/jcp.25487.

43. Caterson B., Melrose J. Keratan sulfate, a complex glycosaminoglycan with unique

functional capability // Glycobiology - 2018 – Vol.28(4) – P.182-206.

doi:10.1093/glycob/cwy003.

44. Chen K.H., Azar D., Joyce N.C. Transplantation of adult human corneal

endothelium ex vivo: A morphologic study // Cornea – 2001 – Vol.20 – P.731–

737.

45. Chen T.C., Chang S.W., Wang T.Y. Moxifloxacin modifies corneal fibroblast to

myofibroblast differentiation // Br J Pharmacol. - 2013 – Vol.168(6) – P.1341-54.

doi: 10.1111/bph.12015.

46. Chen J., Wong-Chong J., Sundar Raj N. FGF-2- and TGF-β1-induced

downregulation of lumican and keratocan in activated corneal keratocytes by JNK

signaling pathway // Invest Ophthalmol Vis Sci. – 2011 – Vol.52(12) – P.8957-64.

doi: 10.1167/iovs.11-8078.

47. Chen J., Zhang W., Backman L.J., Kelk P., Danielson P. Mechanical stress

potentiates the differentiation of periodontal ligament stem cells into keratocytes.

// Br J Ophthalmol. – 2018 – Vol.102(4) – P.562-569. doi: 10.1136/bjophthalmol-

2017-311150.

48. Cheong Y.K., Ngoh Z.X., Peh G.S., Ang H.P., Seah X.Y., Chng Z., Colman A.,

Mehta J.S., Sun W. Identification of cell surface markers glypican-4 and CD200

that differentiate human corneal endothelium from stromal fibroblasts. // Investig.

Ophthalmol. Vis. Sci. - 2013 – Vol.54 – P.4538–4547.

49. Chng Z., Peh G.S., Herath W.B., Cheng T.Y., Ang H.P., Toh K.P., Robson P.,

Mehta J.S., Colman A. High throughput gene expression analysis identifies reliable

expression markers of human corneal endothelial cells // PLoS ONE – 2013 –

Vol.8. doi: 10.1371/journal.pone.0067546.

50. Choi J.S., Williams J.K., Greven M., Walter K.A., Laber P.W., Khang G., Soker

S. Bioengineering endothelialized neo-corneas using donor-derived corneal

124

endothelial cells and decellularized corneal stroma // Biomaterials – 2010 – Vol.31

– P.6738–6745.

51. Choi J.S., Kim E.Y., Kim M.J., Giegengack M., Khan F.A., Khang G., Soker S. In

vitro evaluation of the interactions between human corneal endothelial cells and

extracellular matrix proteins // Biomed. Mater. – 2013 – Vol.8. doi:10.1088/1748-

6041/8/1/014108.

52. Choi J.S., Kim E.Y., Kim M.J., Khan F.A., Giegengack M., D’Agostino R.,

Criswell T., Khang G., Soker S. Factors affecting successful isolation of human

corneal endothelial cells for clinical use // Cell Transplant. – 2014 – Vol.23 –

P.845–854.

53. Choyce D.P. Results of keratoprosthetics in Britian // Ophthalmol. Surg. – 1973. –

Vol. 4 – P. 23-32

54. Chirilia T.V., Chen Y.C., Griffin B.J. Hydrophilic sponges based on 2-

hydroxyeethyl metacrylate. Effect of monomer mixture composition on the pore

size // Polym. International. – 1993 – Vol. 32(3) – P. 331-332.

55. Chirila T.V. An overview of the development of artificial corneas with porous

skirts and the use of PHEMA for such an application // Biomaterials. - 2001 –

Vol.22(24) – P.3311-7

56. Covre J.L., Cristovam P.C., Loureiro R.R., Hazarbassanov R.M., Campos

M., Sato É.H., Gomes J.Á. The effects of riboflavin and ultraviolet light on

keratocytes cultured in vitro // Arq Bras Oftalmol. - 2016 – Vol. 79(3) – P.180-5.

doi: 10.5935/0004-2749.20160052.

57. Crabb R.A., Chau E.P., Evans M.C., Barocas V.H., Hubel A. Biomechanical and

microstructural characteristics of a collagen film-based corneal stroma equivalent.

// Tissue Eng. - 2006 – Vol.12(6) – P.1565-75.

58. Dimmer F. Bericht uber die zwanzigste Versammlung der Ophthalmologische

Gesellschaft, Heidelberg // Ophthalmologische Gesellschaft. – 1889 – Vol.20 - P.

148–63

59. Dimmer F. Notiz uber Cornea arteficialis. // Klein Monatsbl Augenheilk. – 1891 -

Vol. 29 - P.104-105.

125

60. Dohlman C.N., Refojo M.F., Rose J. Synthetic polymers in corneal surgery //

Arch.Ophthalmol. – 1967. – Vol. 77 – P. 252.

61. Dreier B., Thomasy S.M., Mendonsa R., Raghunathan V.K., Russell P., Murphy

C.J. Substratum compliance modulates corneal fibroblast

to myofibroblast transformation // Invest Ophthalmol Vis Sci. – 2013. – Vol.54(8)

– P.5901-7. doi: 10.1167/iovs.12-11575.

62. Dua H.S., Faraj L.A., Said D.G., Gray T., Lowe J. Human corneal anatomy

redefined: a novel pre-Descemet's layer (Dua's layer) // Ophthalmology. – 2013 -

Vol. 120(9) – P.1778-1785. doi: 10.1016/j.ophtha.2013.01.018.

63. Engelmann K., Bohnke M., Friedl P. Isolation and long-term cultivation of human

corneal endothelial cells // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 1988 – Vol.29 –

P.1656–1662.

64. Engelmann K., Friedl P. Optimization of culture conditions for human corneal

endothelial cells // Vitro Cell. Dev. Biol. – 1989 – Vol.25 – P.1065–1072.

65. Engelmann K., Friedl P. Growth of human corneal endothelial cells in a serum-

reduced medium // Cornea – 1995 – Vol.14 – P.62–70.

66. Engelmann K., Bednarz J., Schafer H.J., Friedl P. Isolation and characterization of

a mouse monoclonal antibody against human corneal endothelial cells // Exp. Eye

Res. – 2001 – Vol.73. – P.9–16.

67. Enomoto K., Mimura T., Harris D.L., Joyce N.C. Age differences in cyclin-

dependent kinase inhibitor expression and RB hyperphosphorylation in human

corneal endothelial cells // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2006 – Vol.47 –

P.4330–4340.

68. Etheredge L., Kane B.P., Hassell J.R. The effect of growth factor signaling on

keratocytes in vitro and its relationship to the phases of stromal wound repair //

Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2009 – Vol. 50(7) – P. 3128-3136. doi:

10.1167/iovs.08-3077.

69. Fabricant R.N., Alpar A.J., Centifanto Y.M., Kaufman H.E. Epidermal growth

factor receptors on corneal endothelium // Arch. Ophthalmol. – 1981 -Vol.99 –

P.305–308.

126

70. Frikeche J., Maiti G., Chakravarti S. Small leucine-rich repeat proteoglycans in

corneal inflammation and wound healing // Exp Eye Res. - 2016 – Vol.(151) -

P.142-9. doi: 10.1016/j.exer.2016.08.015.

71. Fujita M., Mehra R., Lee S.E., Roh D.S., Long C., Funderburgh J.L., Ayares D.L.,

Cooper D.K., Hara H. Comparison of proliferative capacity of genetically-

engineered pig and human corneal endothelial cells. // Ophthalmic Res. – 2013 –

Vol.49 – P.127–138.

72. Funderburgh J.L., Funderburgh M.L., Mann M.M., Conrad G.W. Physical and

biological properties of keratan sulphate proteoglycan // Biochem Soc Trans. –

1991 – Vol.19(4) – P.871-6.

73. Funderburgh J.L. Keratan sulfate biosynthesis // IUBMB Life. – 2002 - Vol.54(4)

– P.187-94.

74. Funderburgh J.L., Mann M.M., Funderburgh M.L. Keratocyte phenotype mediates

proteoglycan structure: a role for fibroblasts in corneal fibrosis // J Biol Chem. –

2003 – Vol.278(46) – P. 45629-45637.

75. Funderburgh M.L., Du Y., Mann M.M., Sundar Raj N., Funderburgh J.L. PAX6

expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes // FASEB J. – 2005.

– Vol.19(10) – P.1371-3.

76. Funderburgh, J.L., Funderburgh, M. L., Mann, M. M., Corpuz, L., Roth, M. R.

Proteoglycan Expression during Transforming Growth Factor β- induced

Keratocyte-Myofibroblast Transdifferentiation. // Motor Control – 2009 – Vol. 27

– P.590–609.

77. Funderburgh J.L., Funderburgh M.L., Du Y. Stem Cells in the Limbal Stroma //

Ocul Surf. – 2016 – Vol. 14(2) – P.113-20. doi: 10.1016/j.jtos.2015.12.006.

78. Gallego-Muñoz P., Ibares-Frías L., Valsero-Blanco MC., Cantalapiedra-

Rodriguez R., Merayo-Lloves J., Martínez-García M.C. Effects of TGFβ1, PDGF-

BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation

during stromal repair // Cytokine. – 2017 – Vol. 96 – P.94-101. doi:

10.1016/j.cyto.2017.03.011.

127

79. Gallego-Muñoz P., Ibares-Frías L., Garrote J.A., Valsero-Blanco

M.C., Cantalapiedra-Rodríguez R., Merayo-Lloves J., Carmen Martínez-García

M. Human corneal fibroblast migration and ECM synthesis during stromal repair:

Role played by PDGF-BB, bFGF, and TGFβ1 // J Tissue Eng Regen Med. - 2018

– Vol.12(2) – P.737-746. doi: 10.1002/term.2360.

80. Gao Y., Zhou Q., Qu M., Yang L., Wang Y., Shi W. In vitro culture of human fetal

corneal endothelial cells // Graefe Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. – 2011 – Vol.249

– P.663–669.

81. Germain L., Auger F.A., Grandbois E., Guignard R., Giasson M., Boisjoly H.,

Guérin S.L. Reconstructed human cornea produced in vitro by tissue engineering.

// Pathobiology – 1999 – Vol.67(3) – P.140-147.

82. Ghezzi C.E., Marelli B., Omenetto F.G., Funderburgh J.L., Kaplan D.L.

3D Functional Corneal Stromal Tissue Equivalent Based on Corneal Stromal Stem

Cells and Multi-Layered Silk Film Architecture. // PLoS One. – 2017 – Vol.12(1)

– P.504-10. doi: 10.1371/journal.pone.0169504.

83. Giasson C.J., Deschambeault A., Carrier P., Germain L. Adherens junction

proteins are expressed in collagen corneal equivalents produced in vitro with

human cells // Mol. Vis. – 2014 – Vol.20 – P.386–394.

84. Gil E.S., Park S.H., Marchant J., Omenetto F., Kaplan D.L. Response of human

corneal fibroblasts on silk film surface patterns // Macromol. Biosci. – 2010 –

Vol.10 – P.664–673. https://doi.org/10.1002/mabi.200900452.

85. Gil E.S., Mandal B.B., Park S., Marchant J.K., Fiorenzo G., Kaplan D.L. Helicoidal

multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue

engineering // Biomaterials – 2010 – Vol.31 – P.8953–8963.

https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2010.08.017.

86. Gil E.S., Mandal B.B., Park S., Marchant J.K., Fiorenzo G., Kaplan D.L. Helicoidal

multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue

engineering // Biomaterials – 2010 – Vol.31 – P.8953–8963.

87. Girard L.J., Hawkins R., Nieves R. Keratoprosthesis: A 12-year follow up //

Trans.Amer.Acad.Ophthalmol.Otolaringol. – 1977. – Vol. 83(2) – P. 252-267.

128

88. Griffith M., Hakim M., Shimmura S., Watsky M.A., Li F., Carlsson D., Doillon

C.J., Nakamura M., Suuronen E., Shinozaki N., Nakata K., Sheardown H. Artificial

human corneas: scaffolds for transplantation and host regeneration. // Cornea. –

2002 – Vol.21(7) – P.54-61.

89. Guan L., Tian P., Ge H., Tang X., Zhang H., Du L., Liu P. Chitosan-functionalized

silk fibroin 3D scaffold for keratocyte culture // J. Mol. Histol. – 2013 – Vol.44 –

P.609-713 https://doi.org/10.1007/s10735-013-9508-5.

90. Guarnieri F.A. Corneal Biomechanics and Refractive Surgery. // Springer – 2015

– №7 – P.146.

91. Guo X., Sriram S., Tran J.A., Hutcheon A.E.K., Zieske J.D. Inhibition of

Human Corneal Myofibroblast Formation // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018 Jul

2;59(8):3511-3520. doi: 10.1167/iovs.18-24239.

92. Hanna C., O'Brien J.E. Cell production and migration in the epithelial layer of the

cornea // Arch Ophthalmol - 1960 – Vol.64 – P.536-539.

93. Hara H., Koike N., Long C., Piluek J., Roh D.S., Sundar Raj N., Funderburgh J.L.,

Mizuguchi Y., Isse K., Phelps C.J. Initial in vitro investigation of the human

immune response to corneal cells from genetically engineered pigs // Investig.

Ophthalmol. Vis. Sci. – 2011 – Vol.52 – P.5278–5286.

94. Harkin D.G., Chirila T.V. Silk fibroin in ocular surface reconstruction: what is its

potential as a biomaterial in ophthalmics? // Future Med Chem – 2012 – Vol.4 -

P.2145-7.

95. Harkin D.G., George K.A., Madden P.W., Schwab I.R., Hutmacher D.W., Chirila

T.V. Silk fibroin in ocular tissue reconstruction // Biomaterials – 2011 Vol.32 –

P.2445-58.

96. Hay E.D. Extra cellular matrix cell skeletons and embryonic development // AmJ

Med Genet – 1989 -Vol.34. – P.14–29.

97. He Z., Campolmi N., Ha Thi B.M., Dumollard J.M., Peoc’h M., Garraud O., Piselli

S., Gain P., Thuret G. Optimization of immunolocalization of cell cycle proteins in

human corneal endothelial cells // Mol. Vis. – 2011 – Vol.17 – P.3494–3511.

129

98. Hench L.L., Jones J.R. Biomaterials, artificial organs and tissue engineering //

Panminerva Med. – 2004 – Vol. 46(1) – P.1-11.

99. Hicks C.R., Chirilia T.V., Clayton A.B. Clinical results of implantation of the

Chirilia keratoprosthesis in rabbits // Ophthalmol. – 1998 – Vol. 82 – P. 18-25.

100. Hicks C.R., Crawford G.J., Lou X., Tan D.T., Snibson G.R., Sutton

G., Downie N., Werner L., Chirila T.V., Constable I.J. Corneal replacement using

a synthetic hydrogel cornea, AlphaCor: device, preliminary outcomes and

complications // Eye (Lond) – 2003 – Vol.17(3) – P.385-92.

101. Higa K., Takeshima N., Moro F., Kawakita T., Kawashima M., Demura M.

Porous silk fibroin film as a transparent carrier for cultivated corneal epithelial

sheets // J Biomater Sci Polym Ed – 2011 – Vol.22 – P.2261-76.

102. Hinz B., Mastrangelo D., Iselin C.E., Chaponnier C., Gabbiani G.

Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and

myofibroblast differentiation // Am J Pathol – 2001 – Vol. 159(3) – P.1009–1020.

[PubMed: 11549593]

103. Hinz B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair //

J Invest Dermatol. Mar – 2007 – Vol.127(3) – P.526–537. [PubMed: 17299435]

104. Hitani K., Yokoo S., Honda N., Usui T., Yamagami S., Amano S.

Transplantation of a sheet of human corneal endothelial cell in a rabbit model //

Mol. Vis.- 2008 – Vol.14 – P.1–9.

105. Hoppenreijs V.P., Pels E., Vrensen G.F., Treffers W.F. Basic fibroblast

growth factor stimulates corneal endothelial cell growth and endothelial wound

healing of human corneas // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 1994 – Vol.35 –

P.931–944.

106. Hsiue G.H., Lai J.Y., Chen K.H., Hsu W.M. A novel strategy for corneal

endothelial reconstruction with a bioengineered cell sheet // Transplantation – 2006

– Vol.81 – P.473–476.

107. Huang Y.C., Zhang M., Huang C., Chen B., Lam D.S., Zhang S., Congdon

N. Determinants of postoperative corneal edema and impact on goldmann

intraocular pressure. // Cornea. – 2011 – Vol.30(9) – P. 962-967.

130

108. Hyldahl L. Primary cell cultures from human embryonic corneas // J. Cell

Sci. – 1984 – Vol.66 – P.343–351.

109. Ide T., Nishida K., Yamato M., Sumide T., Utsumi M., Nozaki T., Kikuchi

A., Okano T., Tano Y. Structural characterization of bioengineered human corneal

endothelial cell sheets fabricated on temperature-responsive culture dishes //

Biomaterials – 2006 – Vol.27 – P.607–614.

110. Insler M.S., Lopez J.G. Transplantation of cultured human neonatal corneal

endothelium // Curr. Eye Res. – 1986 – Vol.5 – P.967–972.

111. Insler M.S., Lopez J.G. Microcarrier cell culture of neonatal human corneal

endothelium // Curr. Eye Res. – 1990 – Vol.9 – P.23–30.

112. Insler M.S., Lopez J.G. Heterologous transplantation versus enhancement of

human corneal endothelium // Cornea – 1991 – Vol.10 – P.136–148.

113. Insler M.S., Lopez J.G. Extended incubation times improve corneal

endothelial cell transplantation success // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 1991 –

Vol.32 – P.1828–1836.

114. Isaacson A., Swioklo S., Connon C.J. 3D bioprinting of a corneal stroma

equivalent // Exp Eye Res. – 2018. – Vol.173 – P.188-193. doi:

10.1016/j.exer.2018.05.010.

115. Ishino S.Y., Nakamura T., Connon C.J., Rigby H., Fullwood N.J., Kinoshita

S. Amniotic membrane as a carrier for cultivated human corneal endothelial cell

transplantation // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2004 – Vol.45 – P.800–806.

116. Ishino Y., Zhu C., Harris D.L., Joyce N.C. Protein tyrosine phosphatase-1B

(PTP1B) helps regulate EGF-induced stimulation of S-phase entry in human

corneal endothelial cells // Mol. Vis. – 2008 – Vol.14 – P.61–70.

117. Jester J.V., Petroll W.M., Barry P.A., Cavanagh H.D. Expression of alpha-

smooth muscle (alpha-SM) actin during corneal stromal wound healing // Invest

Ophthalmol Vis Sci. – 1995- Vol. 36(5) – P. 809–819. [PubMed: 7706029]

118. Jester J.V., Petroll W.M., Cavanagh H.D. Corneal stromal wound healing in

refractive surgery: the role of myofibroblasts // Prog Retin Eye Res. - 1999 – Vol.

18(3) – P. 311-356.

131

119. Jester J.V. Corneal crystallins and the development of cellular transparency.

// Semin Cell Dev Biol. - 2008 – Vol.19(2) – P.82-93.

120. Joko T., Nanba D., Shiba F., Miyata K., Shiraishi A., Ohashi Y.,

Higashiyama S. Effects of promyelocytic leukemia zinc finger protein on the

proliferation of cultured human corneal endothelial cells // Mol. Vis. – 2007 –

Vol.13 – P.649–658.

121. Joyce N.C., Meklir B., Joyce S.J., Zieske J.D. Cell cycle protein expression

and proliferative status in human corneal cells // Invest Ophthalmol Vis Sci. – 1996

- Vol. 37 - № 4 – Р. 645-655.

122. Joyce N.C., Zhu C.C. Human corneal endothelial cell proliferation: Potential

for use in regenerative medicine // Cornea – 2004 – Vol.23 – P.8–19.

123. Joyce N.C. Cell cycle status in human corneal endothelium // Exp Eye Res.

– 2005 – Vol.81(6) – P.629-38.

124. Joyce N.C., Harris D.L. Decreasing expression of the G1-phase inhibitors,

p21cip1 and p16INK4a, promotes division of corneal endothelial cells from older

donors // Mol. Vis. – 2010 – Vol.16 – P.897–906.

125. Joyce N.C. Proliferative capacity of corneal endothelial cells // Exp. Eye

Res. – 2012 – Vol.95 – P.16–23.

126. Ju C., Zhang K., Wu X. Derivation of corneal endothelial cell-like cells from

rat neural crest cells in vitro // PLoS ONE – 2012 – Vol.7(7) – P.42376

doi:10.1371/journal.pone.0042378.

127. Karamanou K, Perrot G, Maquart FX, Brézillon S. Lumican as a multivalent

effector in wound healing // Adv Drug Deliv Rev. - 2018 – Vol.129 – P. 344-351.

doi: 10.1016/j.addr.2018.02.011.

128. Kikuchi M., Zhu C., Senoo T., Obara Y., Joyce N.C. P27kip1 sirna induces

proliferation in corneal endothelial cells from young but not older donors //

Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2006 – Vol.47 – P.4803–4809.

129. Kim U.J., Park J., Kim H.J., Wada M., Kaplan D.L. Three-dimensional

aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. // Biomaterials. - 2005 –

Vol.26(15) – P.2775-2785.

132

130. Kimoto M., Shima N., Yamaguchi M., Amano S., Yamagami S. Role of

hepatocyte growth factor in promoting the growth of human corneal endothelial

cells stimulated by l-ascorbic acid 2-phosphate // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. –

2012 – Vol.53 – P.7583–7589.

131. Knust E., Bossinger O. Composition and formation of intercellular junctions

in epithelial cells // Science – 2002 – Vol.298 – P.1955-1959.

132. Konomi K., Zhu C., Harris D., Joyce N.C. Comparison of the proliferative

capacity of human corneal endothelial cells from the central and peripheral areas //

Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2005 -Vol.46 – P.4086–4091.

133. Konomi K., Joyce N.C. Age and topographical comparison of telomere

lengths in human corneal endothelial cells // Mol. Vis. – 2007 -Vol.13 – P.1251–

1258.

134. Koo S., Muhammad R., Peh G.S., Mehta J.S., Yim E.K. Micro- and

nanotopography with extracellular matrix coating modulate human corneal

endothelial cell behavior // Acta Biomater. – 2014 – Vol.10 – P.1975–1984.

135. Kopsachilis N., Tsinopoulos I., Tourtas T., Kruse F.E., Luessen U.W.

Descemet’s membrane substrate from human donor lens anterior capsule // Clin.

Exp. Ophthalmol. – 2012 – Vol.40. - P.187–194.

136. Kopsachilis N., Tsaousis K.T., Tsinopoulos I.T., Welge-Luessen U. Air

toxicity for primary human-cultured corneal endothelial cells: An in vitro model.

// Cornea – 2013 – Vol.32. – P.31–35.

137. Kurpakus Wheater M., Kernacki K.A., Hazlett L.D. Corneal cell proteins

and ocular surface pathology // Biotech Histochem. – 1999 – Vol.74(3) – P. 146-

59.

138. Lai J.Y., Lu P.L., Chen K.H., Tabata Y., Hsiue G.H. Effect of charge and

molecular weight on the functionality of gelatin carriers for corneal endothelial cell

therapy. // Biomacromolecules – 2006 – Vol.7 – P.1836–1844.

139. Lai J.Y., Chen K.H., Hsiue G.H. Tissue-engineered human corneal

endothelial cell sheet transplantation in a rabbit model using functional

biomaterials. // Transplantation. - 2007 – Vol. 84(10) – P.1222-1232.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hazlett%20LD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10416788

133

140. Lass J.H., Reinhart W.J., Skelnik D.L., Bruner W.E., Shockley R.P., Park

J.Y., Hom D.L., Lindstrom R.L. An in vitro and clinical comparison of corneal

storage with chondroitin sulfate corneal storage medium with and without dextran

// Ophthalmology – 1990 – Vol.97 – P.96–103.

141. Lawrence B.D., Marchant J.K., Pindrus M., Omenetto F., Kaplan L. Silk

film biomaterials for cornea tissue engineering // Biomaterials – 2009 – Vol.30 –

P.1299 – 303. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2008.11.018.

142. Le Roux S., Borbely G., Słoniecka M., Backman L.J. Transforming Growth

Factor Beta 1 Modulates the Functional Expression of the Neurokinin-1 Receptor

in Human Keratocytes Transforming Growth Factor Beta 1 Modulates the

Functional Expression // Curr. Eye Res. – 2015 – Vol.3683 – P.1035–1043.

143. Lee J.G., Song J.S., Smith R.E., Kay E.P. Human corneal endothelial cells

employ phosphorylation of p27(Kip1) at both Ser10 and Thr187 sites for FGF-2-

mediated cell proliferation via PI 3-kinase // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2011

– Vol.52 – P.8216–8223.

144. Legeais J.M., Renard G., Rossi C. Keratoprosthesis: A comparative study of

three different microporus polymer and first application in human eyes //

Ophtalmol. – 1991 – Vol. 32 (4) – P.778

145. Levis H.J., Peh G.S., Toh K.P., Poh R., Shortt A.J., Drake R.A., Mehta J.S.,

Daniels J.T. Plastic compressed collagen as a novel carrier for expanded human

corneal endothelial cells for transplantation // PLoS ONE – 2012 – Vol.7.

doi:10.1371/journal.pone.0050993.

146. Li F., Carlsson D., Lohmann C., Suuronen E., Vascotto S., Kobuch K.,

Sheardown H., Munger R., Nakamura M., Griffith M. Cellular and nerve

regeneration within a biosynthetic extracellular matrix for corneal transplantation

// Proc Natl Acad Sci – 2003 – Vol.100(26) – P.15346-51.

147. Li W., Sabater A.L., Chen Y.T., Hayashida Y., Chen S.Y., He H., Tseng

S.C. A novel method of isolation, preservation, and expansion of human corneal

endothelial cells // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2007 – Vol.48 – P.614–620.

134

148. Liu C.Y., Kao W.W. Lumican promotes corneal epithelial wound healing //

Methods Mol Biol. – 2012 – Vol. 836 – P.285-90. doi: 10.1007/978-1-61779-498-

8_18

149. Lwigale P.Y., Cressy P.A., Bronner-Fraser M. Corneal keratocytes retain

neural crest progenitor cell properties // Dev Biol. - 2005 – Vol. 288(1) – P.284-

293.

150. Lynch A.P., O'Sullivan F., Ahearne M. The effect of growth factor

supplementation on corneal stromal cell phenotype in vitro using a serum-free

media // Exp Eye Res. - 2016 - Vol.151 - P. 26-37 doi: 10.1016/j.exer.2016.07.015.

151. Madden P.W., Lai J.N., George K.A., Giovenco T., Harkin D.G., Chirila,

T.V. Human corneal endothelial cell growth on a silk fibroin membrane //

Biomaterials – 2011 – Vol.32 - P.4076–4084.

152. Mannagh J.J., Irving A. Human corneal endothelium: Growth in tissue

cultures // Arch. Ophthalmol. – 1965 -Vol.74 – P.847–849.

153. Matter K., Balda M.S. Functional analysis of tight junctions // Methods –

2003 – Vol.30 – P.228-234.

154. Maurice D.M. The structure and transparency of the cornea // J. Physiol. –

1957 – Vol. 136 – P. 263 -268.

155. Mc Intosh Ambrose W., Schein O., Elisseeff J. A tale of two tissues: stem

cells in cartilage and corneal tissue engineering // Curr Stem Cell Res Ther. – 2010

– Vol.5(1) – P.37-48.

156. Meek K.M., Leonard D.W. Ultrastructure of the corneal stroma: a

comparative study // Biophys J. – 1993 - Vol.64(1) – P. 273-280.

157. Meek K.M., Knupp C. Corneal structure and transparency // Prog Retin

Eye Res. - 2015 – Vol. 49 – P.1-16. doi: 10.1016/j.preteyeres.2015.07.001.

158. Mertens S., Bednarz J., Richard G., Engelmann K. Effect of perfluorodecalin

on human retinal pigment epithelium and human corneal endothelium in vitro //

Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. – 2000 – Vol.238 – P.181–185.

135

159. Mi S., Connon C.J. The formation of a tissue-engineered cornea using

plastically compressed collagen scaffolds and limbal stem cells // Methods Mol

Biol – 2013 – Vol.1014 – P.143 – 155.

160. Michelacci Y.M. Collagens and proteoglycans of the corneal extracellular

matrix // Braz J Med Biol Res. - 2003 – Vol.36(8) – P. 1037-1046.

161. Minami Y., Sugihara H., Oono S. Reconstruction of cornea in three-

dimensional collagen gel matrix culture // Invest Ophthalmol Vis Sci. – 1993 –

Vol.34(7) – P.2316-2324.

162. Mimura T., Joyce N.C. Replication competence and senescence in central

and peripheral human corneal endothelium // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. –

2006 -Vol.47 – P.1387–1396.

163. Mirazul I.M., Cėpla V., He C., Edin J., Rakickas T., Kobuch K., Ruželė Ž.,

Jackson W.B., Rafat M., Lohmann C.P., Valiokas R., Griffith M. Functional

fabrication of recombinant human collagen-phosphorylcholine hydrogels for

regenerative medicine applications // Acta Biomater. – 2015 -Vol.12 -P.70-80.

164. Miron-Mendoza M., Lin X., Ma L., Ririe P., Petroll W.M. Individual versus

collective fibroblast spreading and migration: regulation by matrix composition in

3D culture // Exp Eye Res. – 2012 -Vol.99 – P. 36-44.

165. Miron-Mendoza M., Graham E., Kivanany P., Quiring J., Petroll W.M The

Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective

Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments // Invest

Ophthalmol Vis Sci. - 2015 - Vol. 56(3) - P.2079-2090. doi: 10.1167/iovs.15-

16388.

166. Miyata K., Drake J., Osakabe Y., Hosokawa Y., Hwang D., Soya K., Oshika

T., Amano S. Effect of donor age on morphologic variation of cultured human

corneal endothelial cells // Cornea – 2001 – Vol.20 – P.59–63.

167. Miyai T., Maruyama Y., Osakabe Y., Nejima R., Miyata K., Amano S.

Karyotype changes in cultured human corneal endothelial cells // Mol. Vis. – 2008

– Vol.14 – P.942–950.

136

168. Moysidis S.N., Alvarez-Delfin K., Peschansky V.J., Salero E., Weisman

A.D., Bartakova A., Raffa G.A., Merkhofer R.M., Kador K.E., Kunzevitzky N.J.

Magnetic field-guided cell delivery with nanoparticle-loaded human corneal

endothelial cells // Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. – 2015 -Vol.11 – P.499–

509.

169. Muhammad R., Peh G.S., Adnan K., Law J.B., Mehta J.S., Yim E.K. Micro-

andnano-topography to enhance proliferation and sustain functional markers of

donor-derived primary human corneal endothelial cells // Acta Biomater. – 2015 –

Vol.19 – P.138–148.

170. Muller L.J., Pels E., Vrensen G.F. The specific architecture of the anterior

stroma accounts for maintenance of corneal curvature // Br. J. Ophthalmol – 2001

– Vol. 85 – P. 437 – 440.

171. Murphy A.R., Kaplan D.L. Biomedical applications of chemically-modified

silk fibroin // J Mater Chem – 2009 – Vol.19 – P.6443-50.

172. Murthy G.V.S., Johnson G.J. Chapter 1: prevalence, incidence and

distribution of visual impairment // The Epidemiology of Eye Disease – 2012 –

Vol. 3.

173. Myrna K.E., Pot S.A., Murphy C.J. Meet the corneal myofibroblast: the role

of myofibroblast transformation in corneal woundhealing and pathology // Vet

Ophthalmol. -2009 - Vol. 12(1) - P.25-7. doi: 10.1111/j.1463-5224.2009.00742.x.

174. Nakahara M., Okumura N., Kay E.P., Hagiya M., Imagawa K., Hosoda Y.,

Kinoshita S., Koizumi N. Corneal endothelial expansion promoted by human bone

marrow mesenchymal stem cell-derived conditioned medium // PLoS ONE - 2013

- Vol.8. doi: 10.1371/journal.pone.0069009.

175. Nayak S.K., Binder P.S. The growth of endothelium from human corneal

rims in tissue culture // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. - 1984 - Vol.25 - P.1213 -

1216.

176. Nazarov R., Jin H.J., Kaplan D.L. Porous 3-D scaffolds from regenerated

silk fibroin. // Biomacromolecules. - 2004 – Vol.5(3) – P.718-726.

137

177. Neil E., Capaldo C.T., Macara I.G. Zonula occludens-1 function in

the assembly of tight junctions in Madin-Darby canine kidneyepithelial cells //

Mol Biol Cell. – 2006 – Vol.17(4) – P.1922-32.

178. Newsome D.A., Takasugi M., Kenyon K.R., Stark W.F., Opelz G. Human

corneal cells in vitro: Morphology and histocompatibility (HL-A) antigens of pure

cell populations // Investig. Ophthalmol. – 1974 – Vol.13 – P.23–32.

179. Nieto-Nicolau N., Martinez-Conesa E.M., Casaroli-Marano R.P. Limbal

Stem Cells from Aged Donors Are a Suitable Source for Clinical Application //

Stem Cells. - 2016. – Vol. 30 – P.28-33. doi: 10.1155/2016/3032128.

180. Nishida T. Commanding roles of keratocytes in health and disease // Cornea

- 2010 – Vol.29 – P. 3-6.

181. Niu G., Choi J.S., Wang Z., Skardal A., Giegengack M., Soker S. Heparin-

modified gelatin scaffolds for human corneal endothelial cell transplantation //

Biomaterials – 2014 – Vol.35 – P.4005–4014.

182. Nucci P., Brancato R., Mets M.B., Shevell S.K. Normal endothelial cell

density range in childhood // Arch. Ophthalmol. – 1990 – Vol.108 – P.247–248.

183. Numata R., Okumura N., Nakahara M., Ueno M., Kinoshita S., Kanematsu

D., Kanemura Y., Sasai Y., Koizumi N. Cultivation of corneal endothelial cells on

a pericellular matrix prepared from human decidua-derived mesenchymal cells //

PLoS ONE – 2014 – Vol.9, doi: 10.1371/journal.pone. 0088169.

184. Nussbaum J.N. Cornea artificialis. // Munchen – 1863 - 220p.

185. Okumura N., Hirano H., Numata R., Nakahara M., Ueno M., Hamuro J.,

Kinoshita S., Koizumi N. Cell surface markers of functional phenotypic corneal

endothelial cells. // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2014 – Vol.55 – P.7610–7618.

186. Okumura N., Kakutani K., Numata R., Nakahara M., Schlotzer-Schrehardt

U., Kruse F., Kinoshita S., Koizumi N. Laminin-511 and -521 enable efficient in

vitro expansion of human corneal endothelial cells // Investig. Ophthalmol. Vis.

Sci. – 2015 – Vol.56 – P.2933–2942.

138

187. Orwin E.J., Hubel A. In vitro culture characteristics of corneal epithelial,

endothelial, and keratocyte cells in a native collagen matrix // Tissue Eng. – 2000

– Vol.6 – P.307–319.

188. Orwin E.J., Borene M.L., Hubel A. Biomechanical and optical

characteristics of a corneal stromal equivalent // J Biomech Eng. - 2003 – Vol.

125(4) – P. 439-444.

189. Pan H.W., Iakymenko S.C., Xu J.T., Hou G.H., Sun B.J., Zheng A.N.

Implantation of Iakymenko keratoprosthesis in patients with severe ocular injury //

Int. J. Ophthalmol. – 2012 – Vol.5(2) - P.167–171.

190. Panilaitis B., Altman G.H., Chen J., Jin H.J., Karageorgiou V., Kaplan D.L.

Macrophage responses to silk // Biomaterials – 2003 – Vol.24 – P.3079-85.

191. Parke-Houben R., Fox C.H., Zheng L.L., Waters D.J., Cochran J.R., Ta

C.N., Frank C.W. Interpenetrating polymer network hydrogel scaffolds for

artificial cornea periphery // J. Mater Sci Mater Med. – 2015 – Vol.26(2) – P.107.

192. Patel S.V., Bachman L.A., Hann C.R., Bahler C.K., Fautsch M.P. Human

corneal endothelial cell transplantation in a human ex vivo model // Investig.


193. Peh G.S., Toh K.P., Ang H.P., Seah X.Y., George B.L., Mehta J.S.

Optimization of human corneal endothelial cell culture: Density dependency of

successful cultures in vitro. // BMC Res. Notes – 2013 – Vol.6. doi:10.1186/1756-

0500-6-176.

194. Peh G.S., Chng Z., Ang H.P., Cheng T.Y., Adnan K., Seah X.Y., George

B.L., Toh K.P., Tan D.T., Yam G.H., Colman A., Mehta J.S.

Propagation of human corneal endothelial cells: a novel dual media approach //

Cell Transplant - 2015 - Vol. 24(2) - P. 287-304 doi:10.3727/096368913X675719.

195. Pellegata N.S., Dieguez-Lucena J.L., Joensuu T., Lau S., Montgomery

K.T., Krahe R., Kivelä T., Kucherlapati R., Forsius H., Chapelle A. Mutations in

KERA, encoding keratocan, cause cornea plana // Nat Genet. - 2000 - Vol. 25(1) -

P.91-5.

139

196. Pintucci S., Pintucci F., Ceccom M.S.C. The Pintucci dacron tissue kp: long

term results, postoperative care and revisions in dry eyes and eyes with tear

secretion // Anales del Instituto Barraquer. – 1999. – Vol. 31(2) – P. 20-25

197. Polisetti N., Islam M.M., Griffith M. The artificial cornea // Methods Mol

Biol – 2013 Vol.1014 – P.45-52.

198. Quantock A.J. Dynamic studies of human corneal fibroblasts // Invest

Ophthalmol Vis Sci. - 2015 – Vol.56(3) P.2091. doi: 10.1167/iovs.15-16836.

199. Reichl F.X., Seiss M., Kleinsasser N. et al. Distribution and excretion of

BisGMA in guinea pigs // J. Dent. Res. – 2008. – Vol. 87(4) – P. 378-380.

200. Ridley H.L. Late surgical results of use of the intraocular acrylic lens // J Int

Coll Surg. - 1956 – Vol. - 26(3) – P.335-41.

201. Roux S.L., Borbely G., Słoniecka M., Backman L.J., Danielson P.

Transforming Growth Factor Beta 1 Modulates the Functional Expression of the

Neurokinin-1 Receptor in Human Keratocytes // Curr Eye Res. – 2016 -Vol.41(8)

– P.1035-1043.

202. Saika S., Yamanaka O., Okada Y., Sumioka T. Modulation of Smad

signaling by non-TGFb components in myofibroblast generation during wound

healing in corneal stroma. // Exp. Eye Res. – 2016 – Vol.142 – P.40–48.

203. Samples J.R., Binder P.S., Nayak S.K. Propagation of human corneal

endothelium in vitro effect of growth factors // Exp. Eye Res. – 1991 – Vol.52 –

P.121–128.

204. Santhanam A., Torricelli A. A., Wu J., Marino G. K., Wilson, S. E.

Differential expression of epithelial basement membrane components nidogens

and perlecan in corneal stromal cells in vitro. // Semin Cell Dev Biol. – 2015 –

Vol.162 – P.1318–1327.

205. Sarenac T., Trapecar M., Gradisnik L., Rupnik M.S., Pahor D. Single-cell

analysis reveals IGF-1 potentiation of inhibition of the TGF-β/Smad pathway of

fibrosis in human keratocytes in vitro // Sci. Rep. – 2016 – Vol. 6 – P.373 - 387.

140

206. Sayers Z., Koch M.H., Whitburn S.B., Meek K.M., Elliott G.F. Synchrotron

x-ray diffraction study of corneal stroma // J. Mol. Biol. – 1982 – Vol. 160 – P.

593–607.

207. Schermer A., Galvin S., Sun T.T. Differentiation-related expression of a

major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal

epithelial stem cells // J Cell Biol. – 1986 -Vol.103(1) – P.49-62.

208. Schonthal A.H., Hwang J.J., Stevenson D., Trousdale M.D. Expression and

activity of cell cycle-regulatory proteins in normal and transformed corneal

endothelial cells // Exp. Eye Res. – 1999 – Vol.68 – P.531–539.

209. Shi L., Stachon T., Seitz B., Wagenpfeil S., Langenbucher A., Szentmáry N.

The Effect of Antiamoebic Agents on Viability, Proliferation and Migration of

Human Epithelial Cells, Keratocytes and Endothelial Cells, In Vitro. // Curr Eye

Res. – 2018 – Vol. 43(6) – P.725-733. doi: 10.1080/02713683.2018.1447674.

210. Shima N., Kimoto M., Yamaguchi M., Yamagami S. Increased proliferation

and replicative lifespan of isolated human corneal endothelial cells with l-ascorbic

acid 2-phosphate // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2011 – Vol.52 – P.8711–8717.

211. Sidney L.E., McIntosh O.D., Hopkinson A. Phenotypic Change and

Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal

Cells // Invest Ophthalmol Vis Sci. – 2015. – Vol.56(12) – P. 7225-35. doi:

10.1167/iovs.15-17810.

212. Sidney L.E., Hopkinson A. Corneal keratocyte transition to mesenchymal

stem cell phenotype and reversal using serum-free medium supplemented with

fibroblast growth factor-2, transforming growth factor-β3 and retinoic acid // J

Tissue Eng Regen Med - 2018 – Vol.12(1) – P.203-215. doi: 10.1002/term.2316.

213. Słoniecka M., Backman L.J., Danielson P. Acetylcholine enhances

keratocyte proliferation through muscarinic receptor activation // Int

Immunopharmacol. - 2015 – Vol.29(1) – P.57-62. doi:

10.1016/j.intimp.2015.05.039.

214. Song Z., Wang Y., Xie L., Zang X., Yin H. Expression of senescence-related

genes in human corneal endothelial cells // Mol. Vis. – 2008 – Vol.14 – P.161–170.

141

215. Steele C. Corneal wound healing: A review // Optom. Today – 1999 – Vol.25

– P.28–32.

216. Stone W.I., Herber E. Experimental study of plastic material as replacement

for the cornea. A preliminary report // Amer.J. Ophtalmol. – 1963.- Vol.89. –

P.1039-1044

217. Suh L.H., Zhang C., Chuck R.S., Stark W.J., Naylor S., Binley K.,

Chakravarti S., Jun A.S. Cryopreservation and lentiviral-mediated genetic

modification of human primary cultured corneal endothelial cells // Investig.


218. Sumide T., Nishida K., Yamato M., Ide T., Hayashida Y., Watanabe K.,

Yang J., Kohno C., Kikuchi A., Maeda N. Functional human corneal endothelial

cell sheets harvested from temperature-responsive culture surfaces // FASEB J. –

2006 – Vol.20 – P.392–394.

219. Takezawa T., Nishikawa K., Wang P.C. Development of a human corneal

epithelium model utilizing a collagen vitrigel membrane and the changes of its

barrier function induced by exposing eye irritant chemicals // Toxicol In Vitro.

– 2011 – Vol.25(6) – P.1237-1241. doi: 10.1016/j.tiv.2011.05.021.

220. Tchah H. Heterologous corneal endothelial cell transplantation - Human

corneal endothelial cell transplantation in lewis rats // J. Korean Med. Sci. – 1992

– Vol.7 – P.337–342.

221. Thomasy S.M., Raghunathan V.K., Miyagi H., Evashenk A.T., Sermeno

J.C., Tripp G.K., Morgan J.T., Murphy C.J. Latrunculin B and substratum stiffness

regulate corneal fibroblast to myofibroblast transformation // Exp Eye Res. – 2018

– Vol. 170 – P.101-107. doi: 10.1016/j.exer.2018.02.003.

222. Torres M., Rniz R. Implantation of the artificial cornea // Amer. J. Ophthal.

– 1963 - Vol.56(6). - P.937-941.

223. Trinkhaus-Randall V., Banwatt R., Cappechi J. In vitro fibroplasia in a porus

polymer in the cornea // Invest. Ophthalmol. – 1991. – Vol. 32. – P. 3245-3251.

224. Tripathi R.C., Tripathi B.J. Human trabecular endothelium, corneal

endothelium, keratocytes, and scleral fibroblasts in primary cell culture. A

142

comparative study of growth characteristics, morphology, and phagocytic activity

by light and scanning electron microscopy // Exp. Eye Res. - 1982 - Vol.35 - P.611-

624.

225. Van Essen T.H., Lin C.C., Hussain A.K. A fishs cale-derived collagen

matrix as artificial cornea in rats: properties and potential // Invest Ophthalmol. Vis

Sci - 2013 - Vol.54 - P.3224 - 3233.

226. Vázquez N., Chacón M., Rodríguez-Barrientos C.A., Merayo-Lloves

J., Naveiras M., Baamonde B., Alfonso J.F., Zambrano-Andazol I., Riestra

A.C., Meana Á. Human Bone Derived Collagen for the Development of an

Artificial Corneal Endothelial Graft. In Vivo Results in a Rabbit Model // PLoS

One. - 2016 - Vol.11(12) - P.75-78. doi: 10.1371/journal.pone.0167578.

227. Vianna L.M., Kallay L., Toyono T., Belfort R., Holiman J.D., Jun A.S. Use

of human serum for human corneal endothelial cell culture // Br. J. Ophthalmol. –

2015 – Vol.99 – P.267–271.

228. Walter M.N., Dehsorkhi A., Hamley I.W., Connon C.J. Supra-molecular

assembly of a lumican-derived peptide amphiphile enhances its collagen-

stimulating activity // Biomater Sci. - 2016 – Vol.4(2) – P. 346-54. doi:

10.1039/c5bm00428d.

229. Wang Y., Rudym D.D., Walsh A., Abrahamsen L., Kim H.J., Kim H.S. In

vivo degradation of three-dimensional silk fibroin scaffolds // Biomaterials – 2008

– Vol.29 – P.3415-28.

230. Watanabe R., Hayashi R., Kimura Y., Tanaka Y., Kageyama T., Hara S.,

Tabata Y., Nishida K. A novel gelatin hydrogel carrier sheet for corneal endothelial

transplantation // Tissue Eng. A – 2011 – Vol.17 – P.2213–2219.

231. West-Mays J.A., Dwivedi D.J. The keratocyte: corneal stromal cell with

variable repair phenotypes // Int J Biochem Cell Biol. – 2006 – Vol. 38(10) – P.

1625-1631.

232. Whitcher J.P., Srinivasan M., Upadhyay M.P. Corneal blindness: a global

perspective // Bulletin of the World Health Organization – 2001 – Vol. 79(3) –

P.214–221.

143

233. Wilson S.E., Netto M., Ambrósio R. Corneal cells: Chatty in development,

homeostasis, wound healing, and disease // Am. J. Ophthalmol. – 2003 – Vol.136

– P.530–536.

234. Wilson S.E. Corneal myofibroblast biology and pathobiology: generation,

persistence, and transparency // Exp Eye Res. - 2012 – Vol.99 – P. 78-88. doi:

10.1016/j.exer.2012.03.018.

235. World Health Organization. Prevention of Blindness and Visual Impairment.

Доступно по ссылке:

http://www.who.int/blindness/causes/priority/en/index8.html от 09/06- 2018г.

236. Wu J., Rnjak-Kovacina J., Du Y., Funderburgh M.L., Kaplan D.L.,

Funderburgh J.L. Corneal stromal bioequivalents secreted on patterned silk

substrates // Biomaterials – 2014 -Vol.35. – P. 3744–3755.

https://doi.org/10.1016/j. biomaterials.2013.12.078.

237. Wu J., Du Y., Mann M.M., Funderburgh J.L., Wagner W.R. Corneal

stromal stem cells versus corneal fibroblasts in generating structurally appropriate

corneal stromal tissue. // Exp Eye Res. - 2014 – Vol.120 – P.71-81. doi:

10.1016/j.exer.2014.01.005.

238. Xiao X., Pan S., Liu X., Zhu X., Connon C.J., Wu J., Mi S. In vivo study of

the biocompatibility of a novel compressed collagen hydrogel scaffold for artificial

corneas // J Biomed Mater Res A. - 2014 – Vol.102(6) – P.1782-7. doi:

10.1002/jbm.a.34848.

239. Yam G.H., Williams G.P., Setiawan M., Yusoff N.Z., Lee X.W., Htoon

H.M., Zhou L., Fuest M., Mehta J.S. Nerve regeneration by human corneal stromal

keratocytes and stromal fibroblasts // Sci Rep. – 2017 – Vol. 28 P.45396. doi:

10.1038/srep45396.

240. Yamaguchi M., Ebihara N., Shima N., Kimoto M., Funaki T., Yokoo S.,

Murakami A., Yamagami S. Adhesion, migration, and proliferation of cultured

human corneal endothelial cells by laminin-5. // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. –

2011 – Vol.52. – P.679–684.

144

241. Yamato M., Hayashida Y., Watanabe K., Yamamoto K., Adachi E., Nagai

S., Kikuchi A., Maeda N., Watanabe H., Okano T., Tano Y. Corneal reconstruction

with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal

epithelium. // N Engl J Med. – 2004 – Vol.351(12) – P.1187-1196.

242. Yoeruek E., Spitzer M.S., Tatar O., Aisenbrey S., Bartz-Schmidt K.U.,

Szurman P. Safety profile of bevacizumab on cultured human corneal cells //

Cornea – 2007 – Vol.26 – P.977–982.

243. Yoeruek E., Saygili O., Spitzer M.S., Tatar O. Bartz-Schmidt, K.U.;

Szurman, P. Human anterior lens capsule as carrier matrix for cultivated human

corneal endothelial cells // Cornea – 2009 – Vol.28 – P.416–420.

244. Yokoo S., Yamagami S., Yanagi Y., Uchida S., Mimura T., Usui T., Amano

S. Human corneal endothelial cell precursors isolated by sphere-forming assay //

Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2005 – Vol.46 – P.1626–1631.

245. Yoon J.J., Wang E.F., Ismail S., Mc Ghee J.J., Sherwin T. Sphere-

formingcellsfromperipheral cornea demonstrate polarity and directed cell

migration // Cell Biol. Int. – 2013 – Vol.37 – P.949–960.

246. Yoshida J., Oshikata-Miyazaki A., Yokoo S., Yamagami S., Takezawa

T., Amano S. Development and evaluation of porcine atelocollagen vitrigel

membrane with a spherical curve and transplantable artificial corneal endothelial

grafts // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2014 – Vol.55(8) – P.4975-4981. doi:

10.1167/iovs.14-14211.

247. Yoshida J., Yokoo S., Oshikata-Miyazaki A., Amano S., Takezawa

T., Yamagami S. Transplantation of Human Corneal Endothelial Cells Cultured

on BioEngineered Collagen Vitrigel in a Rabbit Model of Corneal Endothelial

Dysfunction // Curr Eye Res – 2017 – Vol. 42(11) – P.1420-1425.

doi:10.1080/02713683.2017.1351568.

248. Yue B.Y., Sugar J., Gilboy J.E., Elvart J.L. Growth of human corneal

endothelial cells in culture // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 1989 – Vol.30 –

P.248–253.

145

249. Zhihua Z., Guoguang N., Jin S.C., Matthew G., Anthony A., Shay S.

Bioengineered multilayered human corneas from discarded human corneal tissue

// Biomedical Materials -2003 – Vol. 10(3) – P. 234-243.

250. Zhu C., Joyce N.C. Proliferative response of corneal endothelial cells from

young and older donors // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2004 -Vol.45 – P.1743–

1751.

251. Zhu Y.T., Tighe S., Chen S.L., John T., Kao W.Y., Tseng S.C. Engineering

of Human Corneal Endothelial Grafts // Curr Ophthalmol Rep. – 2015 – Vol.3(3)

– P.207-217.

252. Zieske J.D., Mason V.S., Wasson M.E., Meunier S.F., Nolte C.J., Fukai N.,

Olsen B.R., Parenteau N.L. Basement membrane assembly and differentiation of

cultured corneal cells: importance of culture environment and endothelial cell

interaction // Exp Cell Res. – 1994 – Vol.214(2) – P.621-633.

253. Zieske J.D. Perpetuation of stem cells in the eye. // Eye (Lond). – 1994 –

Vol.8(2) – P.163-169.

254. Zieske J.D., Francesconi C.M., Guo X. Cell cycle regulators at the ocular

surface // Exp Eye Res. - 2004 – Vol. 78(3) - P.447-456.

255. Zieske, J.D. Corneal development associated with eyelid opening. // Int. J.

Dev. Biol. – 2004 -Vol.48 – P. 903–911.

256. Zhong J., Deng Y., Tian B., Wang B., Sun Y., Huang H., Chen L., Ling S.,

Yuan J. Hyaluronate Acid-Dependent Protection and Enhanced Corneal Wound

Healing against Oxidative Damage in Corneal Epithelial Cells // J Ophthalmol. –

2016 – Vol. 2016 – P. 10

257. Zhu Y.T., Hayashida Y., Kheirkhah A., He H., Chen S.Y., Tseng S.C.

Characterization and comparison of intercellular adherent junctions expressed by

human corneal endothelial cells in vivo and in vitro // Investig. Ophthalmol. Vis.

Sci. – 2008 – Vol.49 – P.3879–3886.

http://iopscience.iop.org/volume/1748-605X/10

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4848450/

N ? > ? J :Ь G H ? = H K M > : J K L < ? G G H ? Ю @ ? L...

Documents

Transcript of N ? > ? J :Ь G H ? = H K M > : J K L < ? G G H ? Ю @ ? L...