Metody eksperymentalne w biofizyce Laboratorium Biofizyki

Prowadzący: dr Hanna Jurga-Nowak, hjurga@amu.edu.pldr Agnieszka Wilk, wilk@amu.edu.pl

Wymagania wobec studentów:

Na wejściu:Na pierwszych zajęciach należy wykazać się wiadomościami i umiejętnościami niezbędnymi do wykonywania podstawowych prac w laboratorium biofizycznym, takimi jak: liczenie stężeń i rozcieńczeń, przygotowywanie buforów, znajomość pojęć: pH, iloczyn jonowy wody, pK, bufor, pojemność buforowa, prawo Lamberta-Beera, spektroskopia absorpcyjna, hierarchiczna budowa biocząsteczek oraz zagadnień specyficznych dla ćwiczenia, podanych w opisie do ćwiczenia i (!) przez prowadzącego.Zdanie sprawdzianu jest warunkiem niezbędnym do dalszej realizacji ćwiczenia. Na wyjściu: krótka prezentacja (koło 10 - 15 minut, może być wspólna) przeprowadzonego doświadczenia i dyskusja wyników przed grupą studentów. Należy również przygotować jednostronicowy dokument przedstawiający wyniki w formie plakatu (każda osoba z pary przygotowuje plakat oddzielnie). Termin prezentacji ustalany z prowadzącym: ostatni poniedziałek w cyklu bądź kolejna środa.

Czas realizacji:

Poniedziałek I – szkolenie BHP, sprawdzian ustny/kolokwium wejściowe, omówienie ćwiczeń, przygotowanie roztworów,3-4 h

Środa – wykonanie ćwiczenia, 8-9 h lekcyjnych

Poniedziałek II – prezentacja wyników ćwiczenia, 3 h

Ćw. 1a.Dynamiczne rozpraszanie światła. Badanie związku między oddziaływaniami w roztworze  a ruchliwością i strukturalnymi

właściwościami białekdr Agnieszka Wilk

Białka i kwasy nukleinowe są polielektrolitami, czyli ich właściwości w roztworze są uwarunkowane również przez oddziaływania elektrostatyczne. W doświadczeniu badać będziemy wpływ oddziaływań elektrostatycznych, modyfikowanych poprzez zmianę siły jonowej bądź pH roztworu, na dynamikę roztworu białka. Zobaczymy jak zachowuje się białko w warunkach od fizjologicznych do bardzo ekstremalnych sił jonowych. Informacje te uzyskamy mierząc metodą dynamicznego rozpraszania światła współczynnik dyfuzji. Ze zmian w kształcie funkcji korelacji (pojawienie się dodatkowych członów) oraz zmianach w natężeniu światła rozproszonego będziemy mogli wysnuć wnioski na temat zmian w strukturze roztworu.

Zagadnienia:1. budowa białek (szczególnie 2- i 3-rzędowa)2. rozpraszanie światła: różnica między rozpraszaniem dynamicznym a statycznym, jakie

informacje uzyskujemy z obu metod; funkcja korelacji, długość wektora rozpraszania, dyfuzja, prawo Stokesa- Einsteina.

3. polielektrolity , potencjał Debye - Hueckela (bez wzorów), długość Debye'a.

Literatura:1. http://bio5.fizyka.amu.edu.pl/ZSFBiofizyka/index.html ,2. http://weitzlab.seas.harvard.edu/tutorials/dynamiclightscattering.pdf3. J.M. Berg, L. Stryer, J.L. Tymoczko, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa 2007. (wersja internetowa, po angielsku, na: stronie: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21154/)

Ćw. 1b.Dynamiczne rozpraszanie światła.Wpływ surfaktantów na stabilność konformacyjną białek

Związki białko - surfaktant są często spotykane w przemyśle spożywczym czy farmaceutycznym, stąd konieczność poznania właściwości tego typu układów. Ogólnie charakter powstałych kompleksów białkowo – surfaktantowych zależy od stężenia obu składników (przy odpowiednio dużych powstają agregaty micelo-podobne, mogą również powstać żele), a także od rodzaju surfaktantu (charakteru „głowy”, długości ogona) i parametrów fizykochemicznych jak temperatura czy pH. Jednym z możliwych efektów wiązania surfaktantu do białka jest jego denaturacja. Metoda dynamicznego rozpraszania światła posłuży do śeldzenia zmiany rozmiaru białka wynikającej z denaturacji i tworzenia kompleksów z surfaktantami, a także oszacowania ilości surfaktantów łączących się do pojedynczego białka.

Zagadnienia:1. budowa białek (szczególnie 2- i 3-rzędowa)2. rozpraszanie światła: różnica między rozpraszaniem dynamicznym a statycznym, jakie

informacje uzyskujemy z obu metod; funkcja korelacji, długość wektora rozpraszania, dyfuzja, prawo Stokesa- Einsteina.

3. denaturacja białek – co się dzieje ze strukturą, jakie czynniki ją wywołują, jak zmieniają się paramtetry fizykochemiczne białka.

4. surfaktanty (ogólnie budowa)

Literatura:1. http://bio5.fizyka.amu.edu.pl/ZSFBiofizyka/index.html ,2. http://weitzlab.seas.harvard.edu/tutorials/dynamiclightscattering.pdf3. J.M. Berg, L. Stryer, J.L. Tymoczko, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa 2007. (wersja internetowa, po angielsku, na: stronie: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21154/)

Ćw. 2a. Spektroskopia absorpcyjna. Denaturacja białek wywołana surfaktantamidr Agnieszka Wilk

Związki białko - surfaktant są często spotykane w przemyśle spożywczym czy farmaceutycznym, stąd konieczność poznania właściwości tego typu układów. Ogólnie, charakter powstałych kompleksów białkowo – surfaktantowych zależy od stężenia obu składników (przy odpowiednio dużych powstają agregaty micelo-podobne, mogą również powstać żele), a także od rodzaju surfaktantu (charakteru „głowy”, długości ogona) i parametrów fizykochemicznych jak temperatura czy pH. Jednym z możliwych efektów wiązania surfaktantu do białka jest jego denaturacja. W doświadczeniu badamy zmiany absorpcji globularnego białka BSA wywołane denaturacją wskutek dodawania surfaktantu. Analizujemy udział zdenaturowanego białka w roztworze w zależności od stężenia surfaktantu dla paru temperatur i na tej podstawie wyznaczamy wartości entalpii w funkcji stężenia surfaktantu. Możliwe jest również wykonanie pomiarów dla surfaktantu o innej długości łańcucha np.(np. SDS lub CTAB), innej hydrofobowości i zbadanie jak oddziaływania o charakterze hydrofobowym wpływają na proces denaturacji.Zagadnienia:

1. budowa białek (szczególnie 2- i 3-rzędowa)2. denaturacja białek – co się dzieje ze strukturą, jakie czynniki ją wywołują, jak

zmieniają się paramtetry fizykochemiczne białka.3. surfaktanty (ogólnie budowa)4. spektroskopia absorpcyjna.

Literatura:1. Z.Kęcki Spektroskopia molekularna,2. P.W. Atkins „Chemia fizyczna”.3. J.M. Berg, L. Stryer, J.L. Tymoczko, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa 2007. (wersja internetowa, po angielsku, na: stronie: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21154/)4. http://www4.irandoc.ac.ir/Staff-All/Gharibi/Data/2003_physicchemliq.pdf

Ćw. 2b: Spektroskopia absorpcyjna. Badanie kinetyki hydrolizy sacharozy oraz wpływu katalizatora na szybkość reakcji.

Dr Hanna Jurga-Nowak

Celem ćwiczenia jest zbadanie kinetyki hydrolizy sacharozy poprzez wyznaczenie rzędu reakcji, szybkości początkowej, stałej szybkości reakcji bez udziału enzymu katalizującego oraz jego obecności. Sacharoza – dwucukier złożony z glukozy i fruktozy, ulega hydrolizie w środowisku kwasowym. Inwertaza jest enzymem, ułatwiającym zerwanie wiązania glikozydowego. Enzym ten można uzyskać m.in. z komórek drożdży. Podczas ćwiczenia sporządza się mieszaninę reakcyjną złożoną z roztworu sacharozy i kwasu solnego. W kolejnych odstępach czasu blokuje się reakcję hydrolizy poprzez dodanie zasady sodowej do mieszaniny reakcyjnej. Przy użyciu spektrofotometru UV-VIS mierzy się stężenie glukozy, monitorując w ten sposób ilość powstałych substratów. Zmiany stężenia glukozy w funkcji czasu pozwalają wyznaczyć początkową szybkość reakcji. Zmiany te w zależności od warunków eksperymentu można obserwować dodatkowo np. w funkcji temperatury bądź w obecności enzymu katalizującego, czyli inwertazy drożdżowej. W dalszej części ćwiczenia przeprowadza się hydrolizę katalizowaną inwertazą drożdżową. Analizując dane

eksperymentalne należy wykazać wpływ inwertazy na szybkość początkową reakcji , wyznaczyć szybkość maksymalną reakcji i stałą Michaelisa.

Literatura:

1. L.Kłyszejko-Stefanowicz, „Ćwiczenie z biochemii” , Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 1999, str. 483-498.

2. Zgirski A., Gondko R. „Obliczenia biochemiczne”, Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 1998, str. 199-209.

3. J.M. Berg, L.Stryer, J.L.Tymoczko, „Biochemia”, Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 2007 (lub wersja internetowa w języku angielskim na stronie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21154/)

Ćw.3a Spektroskopia fluorescencyjna. Badanie wpływu pH rozpuszczalnika oraz jego typu na widma absorpcji i fluorescencji barwników

Dr Agnieszka Wilk

Celem ćwiczenia jest scharakteryzowanie zależności widm absorpcji i fluorescencji barwników od pH roztworu oraz rodzaju rozpuszczalnika. Sprawdzenie, jak obecność grup zdolnych do jonizacji wpływa na oba widma i czy w efekcie barwniki te mogą zostać użyte jako wewnętrzne wskaźniki fluorescencyjne (np. w celu pomiaru pH w komórce).Dodatkowo przeprowadzone zostaną badania wpływu jaki ma na wydajność kwantową rozpuszczalnik (np. obecność grup OH). Metody eksperymentalne : spektroskopia absorpcyjna i fluorescencyjna, miareczkowanie.

Zagadnienia:1. Diagram Jabłońskiego, zjawisko i widma absorpcji i fluorescencji, fosforescencja,

przesunięcie Stokesa, wydajność kwantowa2. pH, pK, barwniki organiczne (fluoresceina, rodamina)..3. zasada działania i schemat budowy spektrometru fluorescencyjnego i absorpcyjnego.

Literatura:

1. Z.Kęcki Spektroskopia molekularna,2. P.W. Atkins „Chemia fizyczna”3. W.W. Parson, Modern Optical Spectroscopy, Springer Verlag, Berlin Heidelberg 20074. http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials 5. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-

Handbook/pH-Indicators/Probes-Useful-at-Near-Neutral-pH.htmlhttp://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook/pH-Indicators/Probes-Useful-at-Near-Neutral-pH.html

Spektroskopia fluorescencyjna Charakterystyka spektralna barwników fotosyntetycznych.

Dr Krzysztof Gibasiewicz

Zasadniczym celem ćwiczenia jest zapoznanie się z właściwościami spektralnymi barwników fotosyntetycznych (chlorofilu a, chlorofilu b oraz beta-karotenu). W tym celu zostaną przeprowadzone pomiary widm absorpcji i fluorescencji:A) mieszaniny barwników fotosyntetycznych wyekstrahowanych z liści szpinaku (i ewentualnie innych roślin),B) izolowanych barwników fotosyntetycznych (chlorofilu a, chlorofilu b oraz beta-karotenu),C) chloroplastów szpinaku (i ewentualnie innych roślin).Metody eksperymentalne : spektroskopia absorpcyjna i fluorescencyjna, ekstrahowanie liści szpinaku.

Zagadnienia:1) Zjawiska absorpcji i fluorescencji. Prawo Lamberta-Beera. Widma absorpcji, emisji i wzbudzenia. Przesunięcie Stokesa.2) Barwniki fotosyntetyczne (chlorofil a, chlorofil b oraz beta-karoten) – struktura, widma absorpcji i emisji, schematy poziomów energetycznych.3) Proces fotosyntezy - ogólne równanie fotosyntezy,- budowa i funkcjonownie molekularnego aparatu fotosyntetycznego (chloroplasty, tylakoidy, błony fotosyntetyczne, fotosystem I, fotosystem II, cytochrom bc1, ATP-aza, przenoszenie energii i elektronów).4) Zasada działania i schemat budowy spektrometru fluorescencyjnego i absorpcyjnego

Literatura 1) R.E. Blankenship, Molecular mechanisms of photosynthesis, Blackwell Sciences, 2002.2) J.M. Berg, L. Stryer, J.L. Tymoczko, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007. (wersja internetowa, po angielsku, na: stronie: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21154/)3) L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z biochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999. Str. 571-573.4) W.W. Parson, Modern Optical Spectroscopy, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2007.5) C.A. Villee, E.P. Solomon, L.R. Berg, Biologia, Multico, 2006