STD-NMR in der Biokatalyse - Untersuchung nichtkovalenter Enzym-Substrat Bindungen

Lothar Brecker, Hannes Fasshuber, Markus Husa und Michael Vogl

Universitt Wien, Institute fr Organische Chemie, Whringer Strae 38, A-1090 Wien, Austria.

e-Mail: lothar.brecker@univie.ac.at

Saturation Transfer Difference NMR (STD NMR) wird seit ber 10 Jahren zur Untersuchung von Protein-Ligand Wechselwirkungen eingesetzt. Ein Einsatzgebiet ist das zeiteffiziente Screening von Substanzbibliotheken hinsichtlich der Bindung einzelner Komponenten an ausgewhlte Proteine. Weiterhin erlaubt die Methode auf molekularer Ebene umfangreiche Studien zu Bindungsmustern, die einen Einblick in die Grundlagen nichtkovalenter Protein-Ligand Bindungen geben. Das Haupteinsatzgebiet findet die STD NMR somit in der biochemischen Strukturanalytik sowie in der Biomedizin. [1]

Wir nutzen STD NMR zur Analyse der Wechselwirkungen von Enzymen mit Substraten, Intermediaten und Produkten whrend biokatalysierter Prozesse. Die Bindungsmuster werden dabei sowohl unter reinen Bindungsbedingungen, als auch whrend der Katalyse detektiert. Die Analyse von Enzym-Produkt Interaktionen findet im Reaktionsgleichgewicht statt und Enzym-Edukt Bindungen werden bei geringer katalytischer Aktivitt vermessen. Ein Ansatz bei hohen Umsatzraten und schneller Produktdissoziation ermglicht Bindungsstudien von Intermediaten, die die Enzyme erstmalig als neu gebildete Produkte verlassen. [2]

Die STD NMR erlaubt uns weiterhin die Untersuchung der zeitgleichen Bindung von Substraten und Co-Enzymen oder Co-Substraten. Hierbei werden nicht nur die Wechselwirkungen von organischen Moleklen (NADH, NAD+, etc.) im Detail studiert, sondern auch Einflsse detektierbar, die durch protonenfreie Co-Substrate (z.B. Phosphate) erzeugt werden. [3] Aktuell widmen wir uns den Effekten, die bei kurzzeitig auftretenden kovalenten Enzym-Intermediat Bindungen whrend der katalytischen Vorgnge vorliegen.

Neben dem Bindungsverhalten von Substraten an natrliche Wildtyp-Enzyme stehen vergleichende Wechselwirkungsstudien an Mutanten im Fokus der Untersuchungen. Dabei ist die Bindung unnatrlicher Substrate vor dem Hintergrund mglicher synthetischer Anwendungen ein wichtiger Aspekt. [3,4] Die Daten der STD-NMR Messungen erlauben somit in silico erstellte Bindungsmodelle zu verifizieren und zu verfeinern. [5] Ziel ist nicht nur die Beschreibung der reinen Substratbindung, sondern aller Bindungsvorgnge whrend des gesamten katalytischen Prozesses. Ein STD-NMR gefhrtes, zielgerichtetes Design von Enzym-Mutanten fr ausgewhlte katalytische Zwecke scheint somit knftig mglich.

[1] B. Meyer, T. Peters, Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 864-890. [2] L. Brecker, G.D. Straganz, C.E. Tyl, W. Steiner, B. Nidetzky, J. Mol. Catal. B.: Enzymatic 2006, 42, 85-89. [3] L. Brecker, A. Schwarz, C. Gdl, R. Kratzer, C.E. Tyl, B. Nidetzky, Carbohydr. Res. 2008, 343, 2153-2161. [4] A. Schwarz, L. Brecker, B. Nidetzky, FEBS J. 2007, 274, 5105-5115. [5] N.R. Krishna, V. Jayalakshmi, Prog. NMR Spectrosc. 2006, 49, 1-25.